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Die molekularen Mechanismen von aminerger Vesikelfreisetzung an Typ II synaptischen Terminalen von Drosophila melanogaster und die Effekte von Spermidin auf mitochondrialen Oxidationsstatus
No full textChemical synapses are fundamental for fast and reliable synaptic transmission and proves as fundamental basis needed for cognitive functions in higher organisms as well as in humans. The ability of synapses to communicate with each other by synaptic vesicle release of neurotransmitters enables them to create a big neuronal network responsible for information relay to other parts of the body. Communication from neuron to neuron happens through release of neurotransmitter-containing synaptic vesicles from presynapse to postsynapse. Synaptic vesicles must be tethered, primed, and then fused with the presynaptic membrane to fulfil their purpose. This is orchestrated by a complex proteinaceous machinery at dedicated cytomatrix sites at the presynapse, known as active zone (AZ). These active zones are essential for synaptic vesicle release and specific scaffolding proteins are needed to assemble and maintain this complex machinery. This synaptic vesicle release machinery has been observed in Drosophila melanogaster’s glutamatergic type I terminals and can be observed as an electron-dense structure in ultrastructural images. This is not the case for the smaller type II synaptic terminals that emerge from neuromodulatory ventral unpaired median (VUM) neurons in the ventral nerve cord (VNC). These VUM neurons extend their synaptic terminals towards the peripheric larval body wall muscles of Drosophila and innervate those muscles. The synapses of these neurons are in proximity of glutamatergic type I terminal neurons and are known to act neuromodulatory on the muscle. Contrary to type I terminals, type II terminals don’t possess an electron-dense structure and the synaptic vesicle release machinery is still widely unknown. Previously it has been shown that the presynaptic active zone protein BRP is present in type I as well as in type II terminals.
This thesis can confirm the presence of BRP in the neuromodulatory type II terminals via stimulated emission depletion (STED) microscopy and shows through larval locomotion analyser “IMBA” that other known type I terminal active zone proteins such as Unc13A, Unc13B and RBP are present in those neurons. The use of RNAi lines allowed for a knockdown (KD) of the tested AZ proteins, where different larval locomotive microbehaviour parameters were tested. Analysis of these data have shown that Unc13A, Unc13B and RBP KD mutants show an increased crawling speed via a decrease in “step interval”, while BRP KD mutants showed no such increase. Additionally, Unc13A and Unc13B KD mutants show an increase in lateral head movement that precedes a reorientation event, also known as head cast (HC) in Drosophila larvae. Furthermore, STED microscopy was used to check for the tested proteins in better resolution with immunohistochemical approaches , but this remained unsuccessful. STED images confirmed the presence of BRP spots in type II boutons, which were previously only seen through confocal microscopy. Overexpression and KD of BRP in octopaminergic/tyraminergic (OA/TA) neurons didn’t alter type II bouton morphology, but number of BRP spots per bouton. Additionally, this thesis inspects the possible interaction between type I and type II terminal neurons during pupal stages throughout the metamorphosis. Immunohistochemical approaches showed no obvious dependence on each other during metamorphosis for innervation target finding.
In the second part of my thesis, we extended our research from our master’s thesis and started working from there. Aging is a process that remains mainly ununderstood. Few theories have been proposed, and one of them is the “free radical theory of aging and radiation chemistry” by D. Harman, suggesting the involvement of reactive oxygen species (ROS) in aging. ROS are O2-derived free radicals that are, in high amount, capable of causing several intracellular damages ultimately leading to cell death. Most of the ROS are produced in mitochondria and are within physiological levels, used for intracellular signalling. To maintain a healthy intracellular redox equilibrium, redox couples to scavenge ROS are used in the cell. One of the dominant redox couples is the tripeptide glutathione (GSH) and its oxidized form glutathione disulphide (GSSG). The distribution of GSH/GSSG in cells are around 90% in the cytoplasm, 10% in the mitochondria and a low percentage in the endoplasmic reticulum. Mitochondria are very well known as “the powerhouse of the cell” as they are the main energy producer within cells and are an organelle with their own mitochondrial DNA (mtDNA). With age, mtDNA accumulates mutations, leading to defect in the respiratory chain and ultimately resulting into cell death. To counteract an accumulation of defective mitochondria, mitochondria are transported back to the soma for degradation through mitophagy. Axonal transport declines with age and impaired mitochondrial transport are a key pathogenic change in aging associated neurodegenerative diseases. Spermidine is a polyamine that has been shown to mediate anti-aging effects through boosting autophagy and acts as an amino-butyl group donor for hypusination of the eukaryotic initiation factor 5A (eIF5A) which has been shown to be involved in spermidine-mediated protection of mitochondrial functionality.
Here, we show through the use of in vivo imaging of adult fly wings, that mitochondrial transport and transport velocity were not affected with age in flies, regardless of dietary spermidine supplementation. We also showed that mitochondrial GSH/GSSG ratio was not affected with age or spermidine supplementation, through the use of an engineered green fluorescent protein (roGFP), containing a disulfide switch with different excitation maxima depending on its oxidation status. Lastly, we used the same construct investigate mitochondrial glutathione redox status to measure the effects of a deoxyhypusine synthase (DHPS) knockdown mutant on mitochondrial GSH/GSSG equilibrium. We saw no significant changes in our control groups, but a significant increase in mid-aged flies when DHPS was genetically reduced, which absent in flies with dietary spermidine supplementation.Chemische Synapsen sind fundamental für schnelle und zuverlässige synaptische Transmission und bilden daher eine fundamentale Basis gebraucht für kognitive Funktionen in höheren Organismen, als auch in Menschen. Die Fähigkeit der Synapsen, miteinander zu kommunizieren durch synaptische Vesikelfreisetzung von Neurotransmittern, ermöglicht es ihnen ein großes, neuronales Netzwerk, welches für Informationübertragung zu anderen Körperteilen verantwortlich ist, zu erstellen. Kommunikation zwischen Neuronen entsteht durch die Freisetzung von Neurotransmitterhaltigen synaptischen Vesikeln von der Präsynapse an die Postsynapse. Synaptische Vesikel müssen für die Freisetzung vorbereitet werden, um mit der präsynaptischen Membran zu fusionieren. Dies geschieht mithilfe einer komplexen, proteinerge Maschinerie, die sich an spezialisierten Seiten in der Zytomatrix, die aktiven Zonen (AZ) genannt werden, befinden. Diese aktiven Zonen sind essenziell für die Freisetzung von synaptischen Vesikel und spezielle Gerüstproteine sind notwendig, um diese proteinerge Maschinerie zusammenzubauen und zu erhalten. Diese synaptische Vesikelfreisetzungsmaschinerien wurden in glutamatergen Typ I Terminalen in Drosophila melanogaster entdeckt und zeichnen sich in elektronmikroskopischen Aufnahmen als eine elektronendichte Struktur aus. Dies ist nicht der Fall in den kleineren Typ II synaptischen Terminalen, die von neuromodulatorischen ventral ungepaarte mediale (VUM) Neuronen aus dem Strickleiternervensystem stammen. Diese VUM-Neuronen erstrecken ihre synaptischen Terminale bis hin zur peripheren larvalen Körperwandmuskeln von Drosophila und innerviert diese Muskeln. Die Synapsen dieser Neuronen sind in proximaler Nähe von glutamatergen Typ I Terminalen und agieren neuromodulatorisch auf diese Muskeln. Im Gegenteil zu Typ I Terminalen, besitzen Typ II Terminale keine elektronendichte Struktur und die Maschinerie für synaptische Vesikelfreisetzung ist immernoch unbekannt. Frühere Studien zeigen, dass das präsynaptische Gerüstprotein „Bruchpilot“ (BRP) in beiden Terminalen vorkommt.
Diese Doktorarbeit kann die Präsenz von BRP in den neuromodulatorischen Typ II Terminalen mittels „stimulated emission depletion“ (STED) Mikroskopie bestätigen und zeigt durch larvale Lokomotionanalysierer „IMBA“ andere Gerüstproteine, sowie Unc13A, Unc13B und RBP in diesen Neuronen vorhanden sind. Das Nutzen von RNAi Linien ermöglicht den Gen-Knockdown von den getesteten AZ-Proteine, an welche lokomotorische Mikroverhalten getestet wurden. Die Analyse dieser Daten zeigten, dass durch Gen-Knockdown von Unc13A-, Unc13B- und RBP zu erhöhten Kriechgesschwindigkeit durch eine Verringerung des „Schrittintervalls“ führten, währen die BRP-Mutanten keines solche Erhöhung zeigte. Zudem zeigten Unc13A- und Unc13B-Mutanten einen Anstieg in laterale Kopfbewegung, die vor einer Reorientierungsereignis, die auch als „head cast“ (HC) in Drosophila Larven bekannt ist. Zudem wurde STED-Mikroskopie genutzt um die getesteten Proteine mit einer immunohistochemischen Ansatz, welches jedoch unerfolgreich bleib. STED-Aufnahmen zeigen die Präsenz von BRP-Signalen in Typ II Boutons, welche vorher nur in konfokalen Mikroskopen gesehen wurden. Die Überexpression und der Gen-Knockdown von BRP in octopaminergen/tyraminergen (OA/TA) Neurone veränderte nicht die Boutonmorphologie, aber die Anzahl der BRP-Signale pro Bouton. Zusätzlich untersucht diese Doktorarbeit mögliche Interaktionen zwischen Neuronen mit Typ I oder Typ II Terminalen während der Metamorphose. Immunohistochemische Ansätze zeigten keine öffentliche Abhängigkeit für die Findung von Innervationszielen in den Puppenstadien.
Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit haben wir meine Masterarbeit fortgeführt. Das Altern ist ein immer noch unverstandener Prozess. Einige Theorien wurden vorgeschlagen, wobei eine von denen die „Freie Radikalen Theorie des Alterns und der Strahlungschemie“ von D. Harman ist, welche Involvierung von reaktiven Sauerstoffspezien (ROS) vorschlägt. ROS sind Sauerstoff abstammende freie Radikale, die in größerer Menge in der Lage sind, intrazelluläre Schaden hervorzurufen und letztendlich zum Zelltod führen kann. Die Mehrzahl der ROS entsteht in Mitochondrien, welche innerhalb von physiologischen Mengen für intrazelluläre Signalisierungen benutzt werden. Um eine gesunde intrazelluläre Redoxgleichgewicht zu behalten, werden sogenannte Redoxpaare in der Zelle benutzt. Eines der dominanten Redoxpaare ist das Tripeptid Glutathione (GSH) und dessen oxidierte Form Glutathiondisulfid (GSSG). Die Verteilung von GSH/GSSG innerhalb der Zelle liegt in etwa 90% im Zytoplasma, 10% in den Mitochondrien und ein kleiner Prozentsatz im endoplasmatischen Retikulum. Mitochondrien sind weitbekannt als „Kraftwerk der Zelle“, da sie die Hauptproduzenten von Energie innerhalb der Zelle sind und sind Organellen mit eigener mitochondrialen DNA (mtDNA). Im Alter akkumulieren sich Mutationen in der mtDNA an, welche zu Defekten in der Atmungskette führen können, die ultimativ zum Zelltod führen. Um die Akkumulierung von defekten Mitochondrien zu verhindern, transportieren die Zellen die defekten Mitochondrien zurück ins Soma, zur Degradierung mittels Mitophagie. Axonaler Transport verschlechtert sich im Alter und defekter Transport von Mitochondrien sind einer der Hauptsymptome in altersassoziierten neurodegenerativen Krankheiten. Spermidin ist ein Polyamin, welche Effekte gegen das Altern durch das Verbessern von Autophagie erzielen kann und agiert zusätzlich als Aminobutyl-Gruppen Donor für die Hypusinierung vom eukaryotischen Initiationsfaktor 5A (eIF5A), welche involviert in dem Spermidin-vermittelten Schutz der mitochondrialen Funktionalität ist.
In dieser Doktorarbeit zeigen wir durch in vivo Aufnahmen in adulten Fliegenflügeln, dass mitochondrialer Transport und dessen Geschwindigkeit nicht vom Alter beeinflusst werden. Wir zeigen außerdem, dass der mitochondriale GSH/GSSG Verhältnis im Alter und durch Spermidinfütterung nicht beeinflusst wird mithilfe einer konstruierten grünen Fluoreszenzprotein (roGFP), welches einen Disulfid-Schalter mit verschiedenen Erregungsmaxima, welche abhängig von dem Oxidationszustand des Disulfides ist, besitzt. Zuletzt haben wir das gleiche Konstrukt benutzt um den Redoxstatus mitochondrialer Glutathione und Effekte einer genetisch-bedingten Reduzierung von Deoxyhypusin-Synthase (DHPS) auf den mitochondrialen GSH/GSSG Gleichgewicht zu messen. Hier haben wir keine signifikanten Veränderungen in unserer Kontrollgruppe beobachten können, aber eine signifikante Erhöhung in Fliegen mittleren Alters beim genetischen Knockdown von DHPS. Diese Steigerung des GSH/GSSG Verhältnis wurde durch Spermidinfütterung wieder abwesend
eIF5A hypusination, boosted by dietary spermidine, protects from premature brain aging and mitochondrial dysfunction
No full textSummary
Mitochondrial function declines during brain aging and is suspected to play a key role in age-induced cognitive decline and neurodegeneration. Supplementing levels of spermidine, a body-endogenous metabolite, has been shown to promote mitochondrial respiration and delay aspects of brain aging. Spermidine serves as the amino-butyl group donor for the synthesis of hypusine (Nε-[4-amino-2-hydroxybutyl]-lysine) at a specific lysine residue of the eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A). Here, we show that in the Drosophila brain, hypusinated eIF5A levels decline with age but can be boosted by dietary spermidine. Several genetic regimes of attenuating eIF5A hypusination all similarly affect brain mitochondrial respiration resembling age-typical mitochondrial decay and also provoke a premature aging of locomotion and memory formation in adult Drosophilae. eIF5A hypusination, conserved through all eukaryotes as an obviously critical effector of spermidine, might thus be an important diagnostic and therapeutic avenue in aspects of brain aging provoked by mitochondrial decline
Polymer-based or Polymer-free Stents in Patients at High Bleeding Risk.
No full textBACKGROUND
Polymer-free drug-coated stents provide superior clinical outcomes to bare-metal stents in patients at high bleeding risk who undergo percutaneous coronary intervention (PCI) and are treated with 1 month of dual antiplatelet therapy. Data on the use of polymer-based drug-eluting stents, as compared with polymer-free drug-coated stents, in such patients are limited.
METHODS
In an international, randomized, single-blind trial, we compared polymer-based zotarolimus-eluting stents with polymer-free umirolimus-coated stents in patients at high bleeding risk. After PCI, patients were treated with 1 month of dual antiplatelet therapy, followed by single antiplatelet therapy. The primary outcome was a safety composite of death from cardiac causes, myocardial infarction, or stent thrombosis at 1 year. The principal secondary outcome was target-lesion failure, an effectiveness composite of death from cardiac causes, target-vessel myocardial infarction, or clinically indicated target-lesion revascularization. Both outcomes were powered for noninferiority.
RESULTS
A total of 1996 patients at high bleeding risk were randomly assigned in a 1:1 ratio to receive zotarolimus-eluting stents (1003 patients) or polymer-free drug-coated stents (993 patients). At 1 year, the primary outcome was observed in 169 of 988 patients (17.1%) in the zotarolimus-eluting stent group and in 164 of 969 (16.9%) in the polymer-free drug-coated stent group (risk difference, 0.2 percentage points; upper boundary of the one-sided 97.5% confidence interval [CI], 3.5; noninferiority margin, 4.1; P = 0.01 for noninferiority). The principal secondary outcome was observed in 174 patients (17.6%) in the zotarolimus-eluting stent group and in 169 (17.4%) in the polymer-free drug-coated stent group (risk difference, 0.2 percentage points; upper boundary of the one-sided 97.5% CI, 3.5; noninferiority margin, 4.4; P = 0.007 for noninferiority).
CONCLUSIONS
Among patients at high bleeding risk who received 1 month of dual antiplatelet therapy after PCI, use of polymer-based zotarolimus-eluting stents was noninferior to use of polymer-free drug-coated stents with regard to safety and effectiveness composite outcomes. (Funded by Medtronic; ONYX ONE ClinicalTrials.gov number, NCT03344653.)
Origins of ion energy distribution function (IEDF) in high power impulse magnetron sputtering (HIPIMS) plasma discharge
No full textThe ion energy distribution function (IEDF) in high power impulse magnetron sputtering (HIPIMS) discharges was studied by plasma sampling energy-resolved mass spectroscopy. HIPIMS of chromium (Cr), titanium (Ti) and carbon ( C) targets in argon (Ar) atmosphere was analysed. Singly and doubly charged ions of both the target and the gas were detected. Time-averaged IEDFs were measured for all detected ions at the substrate position at a distance of 150mm from the target. The effects of target current and discharge pressure on the IEDF were investigated. Measurements were done at two pressures and for three peak discharge currents. The IEDF of both the target and the gas ions was found to comprise two Maxwellian distributions. Quantitative analysis of target IEDFs at a low pressure showed that the main peak had a lower average energy with an approximate value of E-AV = 1 eV which is attributed to collisions with thermalized gas atoms and ions. The higher energy distribution has a tail extending up to 70 eV, which is assumed to originate from a Thompson distribution of sputtered metal atoms which, due to collisions, are thermalized and appear as a Maxwell distribution. The proportion of high energy IEDFs for metal ions increases monotonically as a function of Id. The effective ion temperature k(B)T, extracted from the main low energy peak, showed a weak dependence on peak current. The effective ion temperature extracted from the high energy tail showed a strong correlation with the change in Id. The IEDF at high pressure shows that a proportion of high energy IEDFs was very low and dominated by a low energy main peak. The gas IEDF at high pressure was completely thermalized. The metal-ion-to-gas-ion ratio was found to increase with Id and with the sputtering yield of the target material
