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Efectos del desarrollo de supersensibilidad en las respuestas dopaminérgicas D1 y D2 en sistema nervioso central de roedores
No full textFil: Rubinstein, Marcelo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Efectos del desarrollo de supersensibilidad en las respuestas dopaminérgicas D1 y D2 en sistema nervioso central de roedores
No full textFil: Rubinstein, Marcelo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Tissue specific expression of eucaryotic genes in transgenic mice: 1) 3.8 kilobases of the bovine beta-casein gene direct the expression of recombinant proteins to mammary gland and 2) Tissue-specific expression of the pro-opiomelanocortin gene in the Central Nervous System
No full textDurante este trabajo se estudio la regulación tejido especifica de dos genes mediante la utilización de ratonestransgénicos. l) Se estudio con que eficacia un fragmento de 3,8 kb del promotor bovino de β-caseina puede dirigir una expresióntejido especifica a la glándula mamaria. El patrón de expresión espacial, temporal y hormonal del gen de fusión,resultó altamente regulado y confinado estrictamente a celulas epiteliales de la glándula mamaria lactante. Enestudios previos realizados sobre una línea celualar de glándula mamaria de ratón, se había demostrado que con 1,7kb del promotor bovino de β-caseína era posible obtener expresión celular específica, a su vez reguladahormonalmente. Esta misma construcción no funcionó al intentar dirigir la expresión específica a glándula mamariade ratones transgénicos. En este trabajo utilizamos un promotor de mayor tamaño del mismo gen, 3.8 kb, paradireccionar la expresión del gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) a glándula mamaria de ratonestransgénicos. Por medio de un ensayo de Northern blot se determinó la presencia de ARNm de hGH únicamente englándula mamaria de hembras en período de lactancia. Este ARNm no se detectó en glándula mamaria de hembrasvírgenes. Un análisis durante el desarrollo de la glándula mamaria demostró que el transgén sigue un patrón deexpresión que se asemeja mucho más al bovino que al murino. En estudios de hibridización in situ, realizados sobresecciones de glándula mamaria, se observó que el patrón de expresión del transgén resultó homogeneo en todos loslóbulos, tanto en animales heterocigotas como homocigotas. La cantidad de granos de plata contados sobre tejidomamario se correlacionó áltamente con el contenido de hGH en leche, previamente determinado porradioinmunoensayo (r=0 996). Por lo tanto, las 3,8 kb del promotor bovino de β-caseína pueden direccionar altosniveles de expresión de proteínas terapéuticas a la glándula mamaria de ratones transgénicos con especificidadcelular y regulación correcta durante el desarrollo. 2) Se evaluó la expresión celular especifica del gen de Pro-Opiomelanocortin (POMC) en neuronas. El gen de POMC se expresa en una serie de neuronas del hipotálamo y tracto solitario, y en corticotrofos y melanotrofoshipofisarios. En estudios previos se determinó que una porción proximal del promotor de POMC de rata o ratón erasuficiente para dirigir expresión celula-específica, regulada hormonalmente y en forma correcta durante eldesarrollo, a melenotrofos y corticotrofos, pero no a neuronas. Más recientemente se identificó la presencia deposibles activadores de la transcripción dentro de una zona de 11 kb en la región 5’flanqueante del gen de POMC (entre —13kb y —2kb). En el presente trabajo, por medio de un análisis delecional se ubicó el elemento neuronalespecífico a una resolución de 4 kb. Se generaron 3 construcciones conteniendo secuencias genómicas de POMC (6kb de la unidad transcripcional y 2 kb de la región 3’flanqueante) con diferentes longitudes de la región 5’flanqueante, 13 kb (-13/+8POMC-EGFP), 9 kb (—9/+8POMC-EGFP) y 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). A estassecuencias se les introdujo en el exón 2, previo al sitio ATG, una versión mamiferizada de la proteína verdefluorescente de medusa (EGFP). Esta innovación permitió visualizar la expresión transgénica en el cerebro ehipófisis en forma inmediata luego de realizar los cortes de los tejidos. En tres de un total de cuatro lineas deanimales transgénicos generados para las construcciones -5/+8POMC-EGFP y -9/+8POMC-EGFP se observófluorescencia en corticotropos y melanotropos. Estos transgenes se expresaron en neuronas. Contrariamente, laconstruccion -13/+8POMC-EGFP se expresó correctamente en hipófisis y neuronas de POMC Este resultado nossugiere que la presencia del elemento neuronal específico buscado se encuentra entre —9 y —l3kb del inicio de latranscripción. En experimentos futuros, nuestro objetivo será clonar e identificar el factor de transcripción neuronalque interactúa con los elementos en cis. Nosotros proponemos inmortalizar un linea celular neuronal que exprese POMC mediante oncogénesis dirigida en ratones transgénicos. Hemos generado 4 lienas de ratones transgénicoscon una construcción similar a —l3/+8POMC-EGFP, pero conteniendo una versión termo-sensible del antígeno Tlargo (AgT-tsA58) insertada en el segundo exón del gen de POMC de ratón. En estas 4 líneas se desarrollarontumores prematuramente en la región hipofisaria-lúpotalámica, a pesar de que la temperatura corporal del ratón esno permisiva. Tres de estos ratones murieron antes de reporoducirse. Sólo una líena pudo ser mantenida con unprograma de aparcamientos utilizando machos jóvenes. En estudio realizado con un Northern blot se observó unaexpresión considerable de POMC en esos tumores. En próximos experimentos evaluaremos la prsencia demarcadores neuronales e hipofisafios para determinar la naturaleza de dichos tumores.During this study the tissue specific regulation of two different promoter genes were studied using transgenic mice. 1) The ability of a 3.8-kilobase promoter of the bovine β-casein gene to drive cell specific expression to themammary gland was evaluated in transgenic mice. The spatial, temporal, and hormonal pattern of expression of thefusion gene is highly regulated and confined to the epithelial cells of the lactating mammary gland. Previous studieshave shown that l.7 kb of the bovine β-casein promoter were able to drive cell-specific and hormone-dependentexpression in a mouse mammary cell line but failed to induce accurate expression to the mammary gland oftransgenic mice. We investigated here the ability of a larger sequence consisting of 3.8 kb of the bovine β-caseingene promoter to drive the expression of the human growth hormone (hGH) gene in transgenic mice. A Northernblot analysis using total RNA obtained from different tissues of lactating and non lactating females revealed thepresence of hGH mRNA only in the mammary gland of lactating females. hGH mRNA was not detectable in themammary gland of Virgin females. A developmental analysis showed that hGH mRNA only peaked on parturition,resembling more closely the bovine β-casein temporal expression pattern rather than the murine. In situhybridization studies performed on mammary gland sections showed that the cellular pattern of hGH expression washomogeneous in all lobules from heterozygous and homozygous transgenic mice. Silver grain counts on the tissuesections highly correlated with the hGH contents in the milk determined by radio immunoassay (r = 0.996). Thus 3.8kb of the bovine β-casein promoter direct a high-level expression of therapeutic genes to the lactating mammarygland of transgenic mice in a tissue-specific and developmentally regulated manner. 2) The cell-specific expression of the Pro-Opiomelanocortin (POMC) gene in hypothalamic neurons was evaluatedin transgenic mice. The POMC gene is expressed in a subset of hypothalamic and hindbrain neurons and in pituitarymelanotrophs and conicotrophs. Previous studies demonstrated that the presence of a proximal promoter of the rat ormouse POMC gene was sufficient to drive cell-specific, developmentally and hormonally regulated expression inmelanotrophs and conicotrophs of transgenic mice, but not in neurons. More recently we identified the presence of aputative neuron-specific enhancer/s within 11 kb of 5‘flanking sequences of the mouse POMC gene (-l3 kb to —2kb). In the present work, by using a deletional analysis in transgenic mice we localised this site/s within a 4 kbresolution. Three different constructs were generated containing genomic sequences of the POMC gene (6 kb of thetranscription unit and 2 kb of the 3’flanking region) with different lengths of the 5’flanking region, 13 kb (-13/+ 8POMC-EGFP), 9 kb (-9/+8POMC-EGFP) and 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). We also introduced in the exon 2 ofthe POMC gene, previous to the ATG site, a “mammalianized” version of the green fluorescent protein (EGFP). This innovation allowed us to visualise transgenic expression in the brain and the pituitary immediately after tissuesectioning. Three out of four lines of transgenic mice generated with each of the constructs, -9/+8POMC-EGFP and -5/+8POMC-EGFP showed green fluorescence in pituitary melanotrophs and conicotrophs. These transgenes failedto direct expression of EGFP to POMC neurons. However, the construct —l3/+8POMC-EGFP showed correctexpression in pituitary and hypothalamic neurons, suggesting that a specific neurone element is located between -9kb and —l3 kb from the transcription initiation point. In future experiments our goal is to clone and identify theneuronal transcription factor that interacts with the cis-acting elements. We propose to immortalise neuronal celllines expressing POMC by targeted oncogenesis in transgenic mice. We have generated 4 transgenic mouse lineswith a construct similar to the —l3/+8POMC-EGFP, but containing the temperature sensitive version of theoncogenic large T antigen (tsA58-Tag) inserted into the second exon of the mouse POMC gene. These four linesshowed premature tumors in the pituitary-hypothalamic region despite the non-permissive temperature of the mousebody. Three of these mice died before breeding. Only one line could be maintained by mating young males. Interestingly, Northern blots experiments showed high POMC expression in these tumors. In further experiments weare going to evaluate the presence of neuronal and pituitary markers to establish the nature of these tumors.Fil: Cerdán, Marcelo Guido. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Tissue specific expression of eucaryotic genes in transgenic mice: 1) 3.8 kilobases of the bovine beta-casein gene direct the expression of recombinant proteins to mammary gland and 2) Tissue-specific expression of the pro-opiomelanocortin gene in the Central Nervous System
No full textDurante este trabajo se estudio la regulación tejido especifica de dos genes mediante la utilización de ratonestransgénicos. l) Se estudio con que eficacia un fragmento de 3,8 kb del promotor bovino de β-caseina puede dirigir una expresióntejido especifica a la glándula mamaria. El patrón de expresión espacial, temporal y hormonal del gen de fusión,resultó altamente regulado y confinado estrictamente a celulas epiteliales de la glándula mamaria lactante. Enestudios previos realizados sobre una línea celualar de glándula mamaria de ratón, se había demostrado que con 1,7kb del promotor bovino de β-caseína era posible obtener expresión celular específica, a su vez reguladahormonalmente. Esta misma construcción no funcionó al intentar dirigir la expresión específica a glándula mamariade ratones transgénicos. En este trabajo utilizamos un promotor de mayor tamaño del mismo gen, 3.8 kb, paradireccionar la expresión del gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) a glándula mamaria de ratonestransgénicos. Por medio de un ensayo de Northern blot se determinó la presencia de ARNm de hGH únicamente englándula mamaria de hembras en período de lactancia. Este ARNm no se detectó en glándula mamaria de hembrasvírgenes. Un análisis durante el desarrollo de la glándula mamaria demostró que el transgén sigue un patrón deexpresión que se asemeja mucho más al bovino que al murino. En estudios de hibridización in situ, realizados sobresecciones de glándula mamaria, se observó que el patrón de expresión del transgén resultó homogeneo en todos loslóbulos, tanto en animales heterocigotas como homocigotas. La cantidad de granos de plata contados sobre tejidomamario se correlacionó áltamente con el contenido de hGH en leche, previamente determinado porradioinmunoensayo (r=0 996). Por lo tanto, las 3,8 kb del promotor bovino de β-caseína pueden direccionar altosniveles de expresión de proteínas terapéuticas a la glándula mamaria de ratones transgénicos con especificidadcelular y regulación correcta durante el desarrollo. 2) Se evaluó la expresión celular especifica del gen de Pro-Opiomelanocortin (POMC) en neuronas. El gen de POMC se expresa en una serie de neuronas del hipotálamo y tracto solitario, y en corticotrofos y melanotrofoshipofisarios. En estudios previos se determinó que una porción proximal del promotor de POMC de rata o ratón erasuficiente para dirigir expresión celula-específica, regulada hormonalmente y en forma correcta durante eldesarrollo, a melenotrofos y corticotrofos, pero no a neuronas. Más recientemente se identificó la presencia deposibles activadores de la transcripción dentro de una zona de 11 kb en la región 5’flanqueante del gen de POMC (entre —13kb y —2kb). En el presente trabajo, por medio de un análisis delecional se ubicó el elemento neuronalespecífico a una resolución de 4 kb. Se generaron 3 construcciones conteniendo secuencias genómicas de POMC (6kb de la unidad transcripcional y 2 kb de la región 3’flanqueante) con diferentes longitudes de la región 5’flanqueante, 13 kb (-13/+8POMC-EGFP), 9 kb (—9/+8POMC-EGFP) y 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). A estassecuencias se les introdujo en el exón 2, previo al sitio ATG, una versión mamiferizada de la proteína verdefluorescente de medusa (EGFP). Esta innovación permitió visualizar la expresión transgénica en el cerebro ehipófisis en forma inmediata luego de realizar los cortes de los tejidos. En tres de un total de cuatro lineas deanimales transgénicos generados para las construcciones -5/+8POMC-EGFP y -9/+8POMC-EGFP se observófluorescencia en corticotropos y melanotropos. Estos transgenes se expresaron en neuronas. Contrariamente, laconstruccion -13/+8POMC-EGFP se expresó correctamente en hipófisis y neuronas de POMC Este resultado nossugiere que la presencia del elemento neuronal específico buscado se encuentra entre —9 y —l3kb del inicio de latranscripción. En experimentos futuros, nuestro objetivo será clonar e identificar el factor de transcripción neuronalque interactúa con los elementos en cis. Nosotros proponemos inmortalizar un linea celular neuronal que exprese POMC mediante oncogénesis dirigida en ratones transgénicos. Hemos generado 4 lienas de ratones transgénicoscon una construcción similar a —l3/+8POMC-EGFP, pero conteniendo una versión termo-sensible del antígeno Tlargo (AgT-tsA58) insertada en el segundo exón del gen de POMC de ratón. En estas 4 líneas se desarrollarontumores prematuramente en la región hipofisaria-lúpotalámica, a pesar de que la temperatura corporal del ratón esno permisiva. Tres de estos ratones murieron antes de reporoducirse. Sólo una líena pudo ser mantenida con unprograma de aparcamientos utilizando machos jóvenes. En estudio realizado con un Northern blot se observó unaexpresión considerable de POMC en esos tumores. En próximos experimentos evaluaremos la prsencia demarcadores neuronales e hipofisafios para determinar la naturaleza de dichos tumores.During this study the tissue specific regulation of two different promoter genes were studied using transgenic mice. 1) The ability of a 3.8-kilobase promoter of the bovine β-casein gene to drive cell specific expression to themammary gland was evaluated in transgenic mice. The spatial, temporal, and hormonal pattern of expression of thefusion gene is highly regulated and confined to the epithelial cells of the lactating mammary gland. Previous studieshave shown that l.7 kb of the bovine β-casein promoter were able to drive cell-specific and hormone-dependentexpression in a mouse mammary cell line but failed to induce accurate expression to the mammary gland oftransgenic mice. We investigated here the ability of a larger sequence consisting of 3.8 kb of the bovine β-caseingene promoter to drive the expression of the human growth hormone (hGH) gene in transgenic mice. A Northernblot analysis using total RNA obtained from different tissues of lactating and non lactating females revealed thepresence of hGH mRNA only in the mammary gland of lactating females. hGH mRNA was not detectable in themammary gland of Virgin females. A developmental analysis showed that hGH mRNA only peaked on parturition,resembling more closely the bovine β-casein temporal expression pattern rather than the murine. In situhybridization studies performed on mammary gland sections showed that the cellular pattern of hGH expression washomogeneous in all lobules from heterozygous and homozygous transgenic mice. Silver grain counts on the tissuesections highly correlated with the hGH contents in the milk determined by radio immunoassay (r = 0.996). Thus 3.8kb of the bovine β-casein promoter direct a high-level expression of therapeutic genes to the lactating mammarygland of transgenic mice in a tissue-specific and developmentally regulated manner. 2) The cell-specific expression of the Pro-Opiomelanocortin (POMC) gene in hypothalamic neurons was evaluatedin transgenic mice. The POMC gene is expressed in a subset of hypothalamic and hindbrain neurons and in pituitarymelanotrophs and conicotrophs. Previous studies demonstrated that the presence of a proximal promoter of the rat ormouse POMC gene was sufficient to drive cell-specific, developmentally and hormonally regulated expression inmelanotrophs and conicotrophs of transgenic mice, but not in neurons. More recently we identified the presence of aputative neuron-specific enhancer/s within 11 kb of 5‘flanking sequences of the mouse POMC gene (-l3 kb to —2kb). In the present work, by using a deletional analysis in transgenic mice we localised this site/s within a 4 kbresolution. Three different constructs were generated containing genomic sequences of the POMC gene (6 kb of thetranscription unit and 2 kb of the 3’flanking region) with different lengths of the 5’flanking region, 13 kb (-13/+ 8POMC-EGFP), 9 kb (-9/+8POMC-EGFP) and 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). We also introduced in the exon 2 ofthe POMC gene, previous to the ATG site, a “mammalianized” version of the green fluorescent protein (EGFP). This innovation allowed us to visualise transgenic expression in the brain and the pituitary immediately after tissuesectioning. Three out of four lines of transgenic mice generated with each of the constructs, -9/+8POMC-EGFP and -5/+8POMC-EGFP showed green fluorescence in pituitary melanotrophs and conicotrophs. These transgenes failedto direct expression of EGFP to POMC neurons. However, the construct —l3/+8POMC-EGFP showed correctexpression in pituitary and hypothalamic neurons, suggesting that a specific neurone element is located between -9kb and —l3 kb from the transcription initiation point. In future experiments our goal is to clone and identify theneuronal transcription factor that interacts with the cis-acting elements. We propose to immortalise neuronal celllines expressing POMC by targeted oncogenesis in transgenic mice. We have generated 4 transgenic mouse lineswith a construct similar to the —l3/+8POMC-EGFP, but containing the temperature sensitive version of theoncogenic large T antigen (tsA58-Tag) inserted into the second exon of the mouse POMC gene. These four linesshowed premature tumors in the pituitary-hypothalamic region despite the non-permissive temperature of the mousebody. Three of these mice died before breeding. Only one line could be maintained by mating young males. Interestingly, Northern blots experiments showed high POMC expression in these tumors. In further experiments weare going to evaluate the presence of neuronal and pituitary markers to establish the nature of these tumors.Fil: Cerdán, Marcelo Guido. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Especificidad tisular de la expresión de genes Eucariotas en ratones transgénicos : 1) 3,8 kilobases del promotor de beta-caseína bovino dirigen la expresión de proteínas recombinantes a la glándula mamaria y 2) expresión específica del gen de proopiomelanocortina en el sistema nervioso central
No full textDurante este trabajo se estudio la regulación tejido especifica de dos genes mediante la utilización de ratones transgénicos. l) Se estudio con que eficacia un fragmento de 3,8 kb del promotor bovino de β-caseina puede dirigir una expresión tejido especifica a la glándula mamaria. El patrón de expresión espacial, temporal y hormonal del gen de fusión, resultó altamente regulado y confinado estrictamente a celulas epiteliales de la glándula mamaria lactante. En estudios previos realizados sobre una línea celualar de glándula mamaria de ratón, se había demostrado que con 1,7 kb del promotor bovino de β-caseína era posible obtener expresión celular específica, a su vez regulada hormonalmente. Esta misma construcción no funcionó al intentar dirigir la expresión específica a glándula mamaria de ratones transgénicos. En este trabajo utilizamos un promotor de mayor tamaño del mismo gen, 3.8 kb, para direccionar la expresión del gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) a glándula mamaria de ratones transgénicos. Por medio de un ensayo de Northern blot se determinó la presencia de ARNm de hGH únicamente en glándula mamaria de hembras en período de lactancia. Este ARNm no se detectó en glándula mamaria de hembras vírgenes. Un análisis durante el desarrollo de la glándula mamaria demostró que el transgén sigue un patrón de expresión que se asemeja mucho más al bovino que al murino. En estudios de hibridización in situ, realizados sobre secciones de glándula mamaria, se observó que el patrón de expresión del transgén resultó homogeneo en todos los lóbulos, tanto en animales heterocigotas como homocigotas. La cantidad de granos de plata contados sobre tejido mamario se correlacionó áltamente con el contenido de hGH en leche, previamente determinado por radioinmunoensayo (r=0 996). Por lo tanto, las 3,8 kb del promotor bovino de β-caseína pueden direccionar altos niveles de expresión de proteínas terapéuticas a la glándula mamaria de ratones transgénicos con especificidad celular y regulación correcta durante el desarrollo. 2) Se evaluó la expresión celular especifica del gen de Pro-Opiomelanocortin (POMC) en neuronas. El gen de POMC se expresa en una serie de neuronas del hipotálamo y tracto solitario, y en corticotrofos y melanotrofos hipofisarios. En estudios previos se determinó que una porción proximal del promotor de POMC de rata o ratón era suficiente para dirigir expresión celula-específica, regulada hormonalmente y en forma correcta durante el desarrollo, a melenotrofos y corticotrofos, pero no a neuronas. Más recientemente se identificó la presencia de posibles activadores de la transcripción dentro de una zona de 11 kb en la región 5’flanqueante del gen de POMC (entre —13kb y —2kb). En el presente trabajo, por medio de un análisis delecional se ubicó el elemento neuronal específico a una resolución de 4 kb. Se generaron 3 construcciones conteniendo secuencias genómicas de POMC (6 kb de la unidad transcripcional y 2 kb de la región 3’flanqueante) con diferentes longitudes de la región 5’flanqueante, 13 kb (-13/+8POMC-EGFP), 9 kb (—9/+8POMC-EGFP) y 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). A estas secuencias se les introdujo en el exón 2, previo al sitio ATG, una versión mamiferizada de la proteína verde fluorescente de medusa (EGFP). Esta innovación permitió visualizar la expresión transgénica en el cerebro e hipófisis en forma inmediata luego de realizar los cortes de los tejidos. En tres de un total de cuatro lineas de animales transgénicos generados para las construcciones -5/+8POMC-EGFP y -9/+8POMC-EGFP se observó fluorescencia en corticotropos y melanotropos. Estos transgenes se expresaron en neuronas. Contrariamente, la construccion -13/+8POMC-EGFP se expresó correctamente en hipófisis y neuronas de POMC Este resultado nos sugiere que la presencia del elemento neuronal específico buscado se encuentra entre —9 y —l3kb del inicio de la transcripción. En experimentos futuros, nuestro objetivo será clonar e identificar el factor de transcripción neuronal que interactúa con los elementos en cis. Nosotros proponemos inmortalizar un linea celular neuronal que exprese POMC mediante oncogénesis dirigida en ratones transgénicos. Hemos generado 4 lienas de ratones transgénicos con una construcción similar a —l3/+8POMC-EGFP, pero conteniendo una versión termo-sensible del antígeno T largo (AgT-tsA58) insertada en el segundo exón del gen de POMC de ratón. En estas 4 líneas se desarrollaron tumores prematuramente en la región hipofisaria-lúpotalámica, a pesar de que la temperatura corporal del ratón es no permisiva. Tres de estos ratones murieron antes de reporoducirse. Sólo una líena pudo ser mantenida con un programa de aparcamientos utilizando machos jóvenes. En estudio realizado con un Northern blot se observó una expresión considerable de POMC en esos tumores. En próximos experimentos evaluaremos la prsencia de marcadores neuronales e hipofisafios para determinar la naturaleza de dichos tumores.During this study the tissue specific regulation of two different promoter genes were studied using transgenic mice. 1) The ability of a 3.8-kilobase promoter of the bovine β-casein gene to drive cell specific expression to the mammary gland was evaluated in transgenic mice. The spatial, temporal, and hormonal pattern of expression of the fusion gene is highly regulated and confined to the epithelial cells of the lactating mammary gland. Previous studies have shown that l.7 kb of the bovine β-casein promoter were able to drive cell-specific and hormone-dependent expression in a mouse mammary cell line but failed to induce accurate expression to the mammary gland of transgenic mice. We investigated here the ability of a larger sequence consisting of 3.8 kb of the bovine β-casein gene promoter to drive the expression of the human growth hormone (hGH) gene in transgenic mice. A Northern blot analysis using total RNA obtained from different tissues of lactating and non lactating females revealed the presence of hGH mRNA only in the mammary gland of lactating females. hGH mRNA was not detectable in the mammary gland of Virgin females. A developmental analysis showed that hGH mRNA only peaked on parturition, resembling more closely the bovine β-casein temporal expression pattern rather than the murine. In situ hybridization studies performed on mammary gland sections showed that the cellular pattern of hGH expression was homogeneous in all lobules from heterozygous and homozygous transgenic mice. Silver grain counts on the tissue sections highly correlated with the hGH contents in the milk determined by radio immunoassay (r = 0.996). Thus 3.8 kb of the bovine β-casein promoter direct a high-level expression of therapeutic genes to the lactating mammary gland of transgenic mice in a tissue-specific and developmentally regulated manner. 2) The cell-specific expression of the Pro-Opiomelanocortin (POMC) gene in hypothalamic neurons was evaluated in transgenic mice. The POMC gene is expressed in a subset of hypothalamic and hindbrain neurons and in pituitary melanotrophs and conicotrophs. Previous studies demonstrated that the presence of a proximal promoter of the rat or mouse POMC gene was sufficient to drive cell-specific, developmentally and hormonally regulated expression in melanotrophs and conicotrophs of transgenic mice, but not in neurons. More recently we identified the presence of a putative neuron-specific enhancer/s within 11 kb of 5‘flanking sequences of the mouse POMC gene (-l3 kb to —2 kb). In the present work, by using a deletional analysis in transgenic mice we localised this site/s within a 4 kb resolution. Three different constructs were generated containing genomic sequences of the POMC gene (6 kb of the transcription unit and 2 kb of the 3’flanking region) with different lengths of the 5’flanking region, 13 kb (-13/+ 8POMC-EGFP), 9 kb (-9/+8POMC-EGFP) and 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). We also introduced in the exon 2 of the POMC gene, previous to the ATG site, a “mammalianized” version of the green fluorescent protein (EGFP). This innovation allowed us to visualise transgenic expression in the brain and the pituitary immediately after tissue sectioning. Three out of four lines of transgenic mice generated with each of the constructs, -9/+8POMC-EGFP and -5/+8POMC-EGFP showed green fluorescence in pituitary melanotrophs and conicotrophs. These transgenes failed to direct expression of EGFP to POMC neurons. However, the construct —l3/+8POMC-EGFP showed correct expression in pituitary and hypothalamic neurons, suggesting that a specific neurone element is located between -9 kb and —l3 kb from the transcription initiation point. In future experiments our goal is to clone and identify the neuronal transcription factor that interacts with the cis-acting elements. We propose to immortalise neuronal cell lines expressing POMC by targeted oncogenesis in transgenic mice. We have generated 4 transgenic mouse lines with a construct similar to the —l3/+8POMC-EGFP, but containing the temperature sensitive version of the oncogenic large T antigen (tsA58-Tag) inserted into the second exon of the mouse POMC gene. These four lines showed premature tumors in the pituitary-hypothalamic region despite the non-permissive temperature of the mouse body. Three of these mice died before breeding. Only one line could be maintained by mating young males. Interestingly, Northern blots experiments showed high POMC expression in these tumors. In further experiments we are going to evaluate the presence of neuronal and pituitary markers to establish the nature of these tumors.Fil:Cerdán, Marcelo Guido. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Molecular and functional genetics of the proopiomelanocortin gene, food intake regulation and obesity
No full textA specter is haunting the world, the specter of obesity. During the last decade, this pandemia has skyrocketed threatening children, adolescents and lower income families worldwide. Although driven by an increase in the consumption of ultraprocessed edibles of poor nutritional value, the obesogenic changes in contemporary human lifestyle affect people differently, revealing that some individuals are more prone to develop increased adiposity. During the last years, we performed a variety of genetic, evolutionary, biochemical and behavioral experiments that allowed us to understand how a group of neurons present in the arcuate nucleus of the hypothalamus regulate the expression of the proopiomelanocortin (Pomc) gene and induce satiety. We disentangled the neuronal transcriptional code of Pomc by identifying the cis-acting regulatory elements and primary transcription factors controlling hypothalamic Pomc expression and determined their functional importance in the regulation of food intake and adiposity. Altogether, our studies reviewed here shed light on the power and limitations of the mammalian central satiety pathways and may contribute to the development of individual and collective strategies to reduce the debilitating effects of the self-induced obesity pandemia.Fil: Rubinstein, Marcelo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; Argentina. University of Michigan; Estados UnidosFil: Low, Malcolm J.. University of Michigan; Estados Unido
Developmental single-cell transcriptomics of hypothalamic POMC neurons reveal the genetic trajectories of multiple neuropeptidergic phenotypes
No full textProopiomelanocortin (POMC) neurons of the hypothalamic arcuate nucleus are essential to regulate food intake and energy balance. However, the ontogenetic transcriptional programs that specify the identity and functioning of these neurons are poorly understood. Here, we use scRNAseq to define the transcriptomes characterizing Pomc-expressing cells in the developing hypothalamus and TRAP-seq to analyze the subsequent translatomes of mature POMC neurons. Our data showed that Pomc-expressing neurons give rise to multiple developmental pathways expressing different levels of Pomc and unique combinations of transcription factors. The predominant cluster, featured by high levels of Pomc and Prdm12 transcripts represents the canonical arcuate POMC neurons. Additional cell clusters expressing medium or low levels of Pomc mature into different neuronal phenotypes featured by distinct sets of transcription factors, neuropeptides, processing enzymes, cell surface and nuclear receptors. We conclude that the genetic programs specifying the identity and differentiation of arcuate POMC neurons are diverse and generate a heterogeneous repertoire of neuronal phenotypes early in development that continue to mature postnatally.Fil: Yu, Hui. University of Michigan; Estados UnidosFil: Rubinstein, Marcelo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; Argentina. University of Michigan; Estados Unidos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular; ArgentinaFil: Low, Malcolm J.. University of Michigan; Estados Unido
Leptin-Mediated Transcriptional Regulation of Pomc in Hypothalamic Neurons
No full textAlthough it is well accepted that the adipostatic hormone leptin activates Pomc expression inhypothalamic neurons, the mechanisms controlling this interaction remain unexplored. In thebrain, leptin binds to the long form of the leptin receptor stimulating the intracellularphosphorylation of STAT3 which acts as a transcription factor of several genes by acting on STAT3binding motifs. We have detected that the neuronal Pomc enhancer 1 (nPE1) contains twocanonical STAT3 binding motifs (5?-TTCCNGGAA-3?) which are highly conserved in mammals. Tochallenge the hypothesis that these sites participate in leptin´s induced Pomc expression wegenerated mutant mice lacking both STAT3 sites from nPE1 using CRISPR/Cas9 technology. Tomaximize leptin´s effect on hypothalamic Pomc expression we previously reduced circulatingleptin levels using two different experimental strategies. Our first approach was to study the effectof refeeding on mice previously fasted for 24 h and analyze body weight variations andhypothalamic Pomc mRNA levels. Our preliminary results indicate a greater weight loss in micelacking STAT3 sites after fasting and a more rapid regain of previous body weight. The secondapproach involves crossing nPE1(STAT3-less) mice with leptin-deficient (ob/ob) mice. Furtherprogress of these experiments will give us the possibility to evaluate the implication of STAT3binding sites in the regulation of hypothalamic expression of POMC induced by leptin.Fil: Hael, Clara Ercilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Rubinstein, Marcelo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaXXXIII Congress of the Argentine Society for Research in NeuroscienceCordobaArgentinaSociedad Argentina de Investigaciones en Neurociencia
Marcelo dascal and the literal meaning debates
No full textWhat role does literal meaning play in people’s understanding of indirect and figurative language? Scholars from many disciplines have debated this issue forseveral decades. This chapter describes these debates, especially focusing on the arguments between the author and Marcelo Dascal. I suggest that Dascal’s defense of “moderate literalism” may have some validity, contrary to some of my earlier arguments against this point of view. The chapter acknowledges the strong contribution that Marcelo Dascal has made to interdisciplinary discussions on language and thought
Study of the cranio facial manifestations of patients with Rubinstein-Taybi syndrome.
No full textA Síndrome de Rubinstein-Taybi foi primeiramente descrita em 1963 pelos médicos Jack Rubinstein & Hooshang Taybi e está relacionada à microdeleção cromossômica na região 16p13. Suas principais características são retardo mental baixa estatura, nariz pontudo, polegares largos e angulados e problemas cardíacos. As características bucais têm sido relatadas na literatura através de casos esporádicos e incluem retrognatia, palato fendido, má-formação e apinhamento dentário. Foram estudadas as características clínicas de relevância para a odontologia, de 13 pacientes portadores da SRT que procuraram o CAPE para tratamento odontológico do período de 1998 a 2004. O manejo clínico do paciente em ambulatório foi possível na maioria dos casos apesar do comprometimento intelectual. As manifestações bucais mais frequentemente encontradas foram: gengivite e periodontite, ptose do palato mole e presença de palato ogival, malformação dos dentes incisivos laterais superiores, e alterações oclusais como retrusão mandibular e mordida cruzada posterior. Foi salientada a importância do cirurgião dentista conhecer as implicações da síndrome para que possa previní-las através de orientação aos cuidadores e intervenções precoces, especialmente no que se refere à ortodontia e periodontia.The Rubinstein-Taybi syndrome was first report in 1963 by Jack Rubinstein and Hooshang Taybi and its related with the chromossomal microdelection in the region 16p13. The main characteristics are mental retardation, low stature, pointed nose, broad thumbs and toes and cardiac alterations. The buccal characteristics are reported in the literature by sporadic cases and includes retrognathia, fissured palate and dental malformation. It was studied the clinical characteristics with significance for the dentistry in 13 patients with RTS that seek treatment at the Special Care Dentristy Center during the period from 1998 to 2004. The ambulatorial clinical attendance was possible in the majority cases although the intelectual compromissing. The buccal manifestations frequently found were gingivitis and periodontitis, soft palate ptosis and ogival palate, talon cusps and oclusal alterations, like mandibular retrusion and posterior crossbite. It was accentuated the importance for the dentristry to know the implications from the syndrome to prevent them through directions for the relatives and previous interventions, especially orthodontics and periodontics
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