18 research outputs found
Ligand binding and mechanism of microsomal glutathione transferase 1
No full textThe homo-trimeric, membrane bound Microsomal Glutathione Transferase 1 (MGST1, EC. 2.5.1.18) belongs functionally to both the glutathione transferase family (GST) and the Membrane Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione Metabolism (MAPEG) superfamily. It is found in high amount in the liver, where it is localised to the endoplasmatic reticulum and the outer membrane of mitochondria. MGST1 possesses both glutathione transferase and peroxidase activity, thus protecting the organism against electrophilic, hydrophobic substances and lipid peroxidation.In this thesis, the rat MGST1 has been used both in purified form from rat livers, heterologously expressed in the bacteria E. coli BL21(DE3) strain and in stably transfected MCF7 cells over expressing the enzyme. MGST1 exhibits one-third-of-the-sites-reactivity towards glutathione, as it is capable of binding three GSH molecules but only stabilising one thiolate anion (GS-), the catalytically active form of GSH. Using electrospray mass spectrometry, binding of three GSH molecules was observed within the trimer while the monomer did not bind GSH, in agreement to the proposed binding sites at subunit interfaces (Holm, et al., (2006). J. Mol. Biol. 360(5): 934-945). The binding of GSH could be competed out with equimolar concentration of the inhibitor glutathione sulfonate.Using equilibrium dialysis three bound product molecules (GSDNB) with a global Kd of 320 μM were observed. Using the same technique analysing GSH binding confirmed previous results (Sun et al., (1997). Biochem. J. 326(Pt 1): 193-193) with one GSH bound with a Kd of 16 μM, while competition experiments using GSDNB as a marker for GSH binding showed complete exchange of GSDNB at a few mM GSH. Thus one GSH binds strongly to MGST1 while the other two bind more weakly. To obtain a Kd for more loosely bound GSH, stopped flow experiments were performed and the binding constant for the third GSH was determined to 2.5 mM.Hydrogen/deuterium (H/D) exchange has previously been used to determine GSH dependent dynamics in MGST1. GSH dependent changes were found to be localised largely in the cytosol facing regions of the enzyme (Busenlehner et al., (2004). Biochemistry 43(35): 11145-11152). Here, H/D exchange and H/D footprinting was used to further determine the binding sites for GSH and the two putative second substrate binding sites (the hydrophobic, electrophile binding site and the fatty acid/phospholipid binding site, respectively). The two latter sites were found to be localised in different parts of the enzyme and both bordered the GSH binding site. Site directed mutagenesis within the proposed GSH binding site confirmed its location.Other mutational studies revealed that two mutants (R72A and R73Q) lost saturation behaviour for GSH but had extremely high activity at high GSH concentration. These data are also consistent with the proposed GSH binding site location. Finally, a new fluorogenic substrate, based on release of a Rhodamine moiety, has been characterised with purified MGST1 and in MCF7 cells (or cell extracts) expressing MGST1 and was found to be a highly sensitive substrate for MGST1. In conclusion, the studies presented in this thesis yield a deeper understanding of the mechanism and structure of MGST1 as well as providing new experimental tools.List of scientific papersI. Svensson R, Alander J, Armstrong RN, Morgenstern R (2004). Kinetic characterization of thiolate anion formation and chemical catalysis of activated microsomal glutathione transferase 1. Biochemistry. 43(27): 8869-77 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15236595II. Busenlehner LS, Alander J, Jegerscöhld C, Holm PJ, Bhakat P, Hebert H, Morgenstern R, Armstrong RN (2007). Location of substrate binding sites within the integral membrane protein microsomal glutathione transferase-1. Biochemistry. 46(10): 2812-22. Epub 2007 Feb 13 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17297922III. Ålander J, Lengqvist J, Holm PJ, Svensson R, Gerbaux P, van den Heuvel RHH, Hebert H, Griffiths WJ, Armstrong RN, Morgenstern R (2009). Microsomal glutathione transferase 1 exhibits one-third-of-the-sites-reactivity towards glutathione. [Manuscript]IV. Ålander J, Johansson K, Dahlström Heuser V, Farebo H, Järvliden Hiroshi Abe J, Shibata A, Ito Y, Morgenstern R (2009). Characterisation of a New Fluorogenic Substrate for Microsomal Glutathione Transferase 1. [Submitted]</p
Försök till jämnförelse imellan Sveriges åkerbruk och folkmängd, hvilket, med bifall af juridiska faculteten vid kongl. academien i Upsala, til allmänn pröfning framställes af academie secreteraren Gustaf Flygare och Thuniska stipendiaten Carl Ålander i gustavianska större läresalen d. 18 april 1787, föremiddagen. [Elektronisk resurs]
No full text
The Janus face of alcohol dehydrogenase 3
No full textMany carbonyl metabolizing enzymes are equally involved in xenobiotic and endogenous metabolism, but few have been investigated in terms of substrate competition and interference between different cellular pathways. Mammalian alcohol dehydrogenase 3 (ADH3) represents the key enzyme in the formaldehyde detoxification pathway by oxidation of S-hydroxymethylglutathione [HMGSH; the glutathione (GSH) adduct of formaldehyde]. In addition, several studies have established ADH3 as S-nitrosoglutathione (GSNO) reductase in endogenous NO homeostasis during the last decade. GSNO depletion associates with various diseases including asthma, and evidence for a causal relationship between ADH3 and asthma pathology has been put forward. In a recent study, we showed that ADH3-mediated alcohol oxidation, including HMGSH oxidation, is accelerated in presence of GSNO which is concurrently reduced under immediate cofactor recycling [C.A. Staab, J. Ålander, M. Brandt, J. Lengqvist, R. Morgenstern, R.C. Grafström, J.-O. Höög, Reduction of S-nitrosoglutathione by alcohol dehydrogenase 3 is facilitated by substrate alcohols via direct cofactor recycling and leads to GSH-controlled formation of glutathione transferase inhibitors, Biochem. J. 413 (2008) 493–504]. Thus, considering the usually low cytosolic free NADH/NAD+ ratio, formaldehyde may trigger and promote GSNO reduction by enzyme-bound cofactor recycling. These findings provided evidence for formaldehyde-induced, ADH3-mediated GSNO depletion with potential direct implications for asthma. Furthermore, analysis of product formation as a function of GSH concentrations suggested that, under conditions of oxidative stress, GSNO reduction can lead to the formation of glutathione sulfinamide and its hydrolysis product glutathione sulfinic acid, both potent inhibitors of glutathione transferase activity
Produkt analys/utveckling av Kitewing
No full textArbetet är utfört för Kitewing Sports Ltd. där undertecknad har arbetat med produktionsuppgifter under en period på ca. 4 år. Avsikten var att analysera Kitewing produkten och identifiera utvecklingsmöjligheter. Produktens komponenter har analyserats. Fokus har varit på sådana komponenter som står för en betydande kostnadsandel och där det samtidigt finns potentiella möjligheter till förändringar. För valda komponenter har försök och beräkningar utförts. Grippmaterial, ytbehandlingsalternativ och materialval har utvärderats med försök. Man har även undersökt möjligheten att producera bommen i egen fabrik. Slutsatsen är att produkten redan är rätt väl optimerad. Det föreslås dock att ett starkare bommaterial (AL 6082 T6) skulle utvärderas mera ingående, för att minska på bommens vikt och eventuellt samtidigt öka på dess styrka. Det föreslås även att rakare lattor för hårdare vindar testas i praktiken. Billigare material för lattorna kunde också provas. Produktion av bommen i egen fabrik skulle vara möjlig utan större investeringar. Gummislang skulle vara ett bra alternativ till nuvarande gripmaterial (EVA) vid egenproduktion.Opinnäytetyö on tehty yhtiölle Kitewing Sports Ltd. Allekirjoittanut on neljän vuoden ajan ollut tuotantotehtävissä Kitewing Sportsilla. Tarkoituksena on ollut analysoida Kitewing tuote ja tunnistaa tuotteen kehittämismahdollisuudet. Tuotteen komponentit on analysoitu. Opinnäytetyössä on keskitytty sellaisiin komponentteihin joissa on potentiaalia muutoksiin ja joiden osuus kustannuksista ovat huomattavia. Valituille komponenteille on tehty kokeita ja laskelmia. Grip materiaali, pintakäsittely vaihtoehdot ja materiaali valinnat ovat arvioitu kokeilla. On myös tutkittu mahdollisuuksia puomien tuottamiseen omassa tehtaassa. Allekirjoittanut on tullut johtopäätökseen, että tuote on melko pitkälle kehitetty. Suositellaan vahvemman puomimateriaalin (AL 6082 T6) tarkempaa tutkimista puomin painon vähentämiseksi sekä mahdollisesti sen vahvuuden parantamiseksi. Suositellaan myös suorempien lattojen kokeilemista kovassa tuulessa käytännössä. Voisi myös kokeilla halvempaa materiaalia lattoihin. Puomin tuotanto olisi ilman suurempia investointeja mahdollista omassa tehtaassa. Kumiletku olisi hyvä vaihtoehto grip materiaalille (EVA) omassa tuotannossa.The degree thesis is commissioned by Kitewing Sports Ltd, where the author has been working for 4 years within the production line. The aim has been to analyze the Kitewing product and identify the development possibilities for it. The components of the product have been analyzed. The focus has been on components that largely affect the cost of the product and also have high potential for development. Tests and calculations have been made for the chosen components. Grip material, surface treatment alternatives and chosen materials have been evaluated by testing. The possibility of production of the boom in the own factory has also been investigated. The conclusion is that the product already is quite well optimized. Nevertheless, it is still recommended that a stronger material for the boom (AL 6082 T6) could be further evaluated to reduce the weight of the boom and possibly increase its strength. It is also recommended that straighter battens for stronger winds should be tested in practice. Cheaper material for the battens could also be tested. Production of the boom could be possible in the own factory without large investments. A rubber hose is a good alternative for the current grip material (EVA) in case of in house production
Cross-linking of transmembrane helices in proton-translocating nicotinamide nucleotide transhydrogenase from Escherichia coli: implications for the structure and function of the membrane domain
No full textAbstractProton-pumping nicotinamide nucleotide transhydrogenase from Escherichia coli contains an α and a β subunit of 54 and 49 kDa, respectively, and is made up of three domains. Domain I (dI) and III (dIII) are hydrophilic and contain the NAD(H)- and NADP(H)-binding sites, respectively, whereas the hydrophobic domain II (dII) contains 13 transmembrane α-helices and harbours the proton channel. Using a cysteine-free transhydrogenase, the organization of dII and helix–helix distances were investigated by the introduction of one or two cysteines in helix–helix loops on the periplasmic side. Mutants were subsequently cross-linked in the absence and presence of diamide and the bifunctional maleimide cross-linker o-PDM (6 Å), and visualized by SDS-PAGE.In the α2β2 tetramer, αβ cross-links were obtained with the αG476C-βS2C, αG476C-βT54C and αG476C-βS183C double mutants. Significant αα cross-links were obtained with the αG476C single mutant in the loop connecting helix 3 and 4, whereas ββ cross-links were obtained with the βS2C, βT54C and βS183C single mutants in the beginning of helix 6, the loop between helix 7 and 8 and the loop connecting helix 11 and 12, respectively. In a model based on 13 mutants, the interface between the α and β subunits in the dimer is lined along an axis formed by helices 3 and 4 from the α subunit and helices 6, 7 and 8 from the β subunit. In addition, helices 2 and 4 in the α subunit together with helices 6 and 12 in the β subunit interact with their counterparts in the α2β2 tetramer. Each β subunit in the α2β2 tetramer was concluded to contain a proton channel composed of the highly conserved helices 9, 10, 13 and 14
Concentrations of brominated flame retardants (HBB, PBEB, BTBPE, DBDPE, PBDEs and HBCD) in blood serum from first-time mothers in Uppsala 1996-2017 [Elektronisk resurs]
No full textSedan 1996 har Livsmedelsverket regelbundet samlat in prover från förstföderskor i Uppsala för analys av persistenta halogenerade organiska miljöföroreningar (POP). I följande rapport redovisas halterna av de bromerade flamskyddsmedlen (BFR) PBDE och HBCD i samlingsprover av serum (3 samlingsprover per provtagningsår) insamlade 2016-2017. Dessutom har halterna av fyra nya BFR analyserats i proverna 2016-2017, det vill säga hexabrombensen (HBB), pentabrometylbensen (PBEB), 1,2-bis(2,4,6-tribromfenoxy)etan (BTBPE) and dekabromdifenyletan (DBDPE). De nya data används också för att uppdatera tidstrender för samtliga BFR för åren 1996-2017.Halterna av HBB, PBEB, BTBPE och DBDPE i de årliga samlingsproverna låg alla under detektionsgränsen (LOD). För HBB, BTBPE och PBEB låg LOD på 0,15 ng/g fett och för DBDPE på 3,1 ng/g fett.För BTBPE hade 8 årspooler halter över LOQ (1,2-6,5 ng/g fett), och 23 årspooler detekterbara halter (0,04-0,98 ng/g fett) under tidsperioden 1996-2017. Medianhalten för hela perioden 1996-2017 uppskattades till 0,46 ng/g fett, och halterna tycktes inte förändras under perioden.Bland PBDE förekom BDE-209 i högst halter under hela studieperioden (median 1,0 ng/g fett), följt av BDE-153 (0,85 ng/g fett), BDE-47 (0,70 ng/g fett), BDE-99 (0,40 ng/g fett), HBCD (0,35 ng/g fett) och BDE-100 (0,29 ng/g fett). Den uppdaterade tidstrenden för BDE-209 visar på en statistiskt signifikant minskning av halterna under studieperioden med 2,5 % per år. Koncentrationerna av BDE-153 ökade med 2 % per år. BDE-47, -99 och -100 har sjunkit med 6-8 % per år mellan 1996 och 2017. Även för HBCD detekterades en statistiskt säkerställd tidstrend med 4 % minskning per år.För år 2015-2017 har också BFR-halter i poolade prover jämförts med halter i de enskilda prover som ingår i poolerna. Resultaten visade att 22 av 90 individer hade halter som var 3 gånger högre än värdet för poolen för en eller flera BFR. Det finns således en risk att individer med hög exponering inte noteras om enbart poolade prover analyseras.</p
Concentrations of brominated flame retardants (HBB, PBEB, BTBPE, DBDPE, PBDEs and HBCD) in blood serum from first-time mothers in Uppsala 1996-2017
No full textSedan 1996 har Livsmedelsverket regelbundet samlat in prover från förstföderskor i Uppsala för analys av persistenta halogenerade organiska miljöföroreningar (POP). I följande rapport redovisas halterna av de bromerade flamskyddsmedlen (BFR) PBDE och HBCD i samlingsprover av serum (3 samlingsprover per provtagningsår) insamlade 2016-2017. Dessutom har halterna av fyra nya BFR analyserats i proverna 2016-2017, det vill säga hexabrombensen (HBB), pentabrometylbensen (PBEB), 1,2-bis(2,4,6-tribromfenoxy)etan (BTBPE) and dekabromdifenyletan (DBDPE). De nya data används också för att uppdatera tidstrender för samtliga BFR för åren 1996-2017. Halterna av HBB, PBEB, BTBPE och DBDPE i de årliga samlingsproverna låg alla under detektionsgränsen (LOD). För HBB, BTBPE och PBEB låg LOD på 0,15 ng/g fett och för DBDPE på 3,1 ng/g fett. För BTBPE hade 8 årspooler halter över LOQ (1,2-6,5 ng/g fett), och 23 årspooler detekterbara halter (0,04-0,98 ng/g fett) under tidsperioden 1996-2017. Medianhalten för hela perioden 1996-2017 uppskattades till 0,46 ng/g fett, och halterna tycktes inte förändras under perioden. Bland PBDE förekom BDE-209 i högst halter under hela studieperioden (median 1,0 ng/g fett), följt av BDE-153 (0,85 ng/g fett), BDE-47 (0,70 ng/g fett), BDE-99 (0,40 ng/g fett), HBCD (0,35 ng/g fett) och BDE-100 (0,29 ng/g fett). Den uppdaterade tidstrenden för BDE-209 visar på en statistiskt signifikant minskning av halterna under studieperioden med 2,5 % per år. Koncentrationerna av BDE-153 ökade med 2 % per år. BDE-47, -99 och -100 har sjunkit med 6-8 % per år mellan 1996 och 2017. Även för HBCD detekterades en statistiskt säkerställd tidstrend med 4 % minskning per år. För år 2015-2017 har också BFR-halter i poolade prover jämförts med halter i de enskilda prover som ingår i poolerna. Resultaten visade att 22 av 90 individer hade halter som var 3 gånger högre än värdet för poolen för en eller flera BFR. Det finns således en risk att individer med hög exponering inte noteras om enbart poolade prover analyseras
Försök till jämnförelse imellan Sveriges åkerbruk och folkmängd, hvilket, med bifall af juridiska faculteten vid kongl. academien i Upsala, til allmänn pröfning framställes af academie secreteraren Gustaf Flygare och Thuniska stipendiaten Carl Ålander i gustavianska större läresalen d. 18 april 1787, föremiddagen.
No full textLevels of chlorinated naphthalenes in mother’s milk from first-time mothers in Uppsala, Sweden: results from year 2012 to 2017.
No full textSedan 1996 har Livsmedelsverket regelbundet samlat in modersmjölk från förstföderskor i Uppsala för analys av persistenta halogenerade organiska miljöföroreningar (POP), i studien POPUP (Persistent Organic Pollutants in Uppsala Primiparas). I följande rapport redovisas halterna av polyklorerade naftalener (PCN) i poolade bröstmjölksprover från 2012 till 2017, ett samlingsprov per år (n=6). Resultaten visar inte på någon statistiskt signifikant trend under tidsperioden. Adderas tidigare analyserad data av polyklorerade naftalener i bröstmjölk från förstföderskor i Uppsala under åren 1997 – 2011 (Haglund, Liljelind et al. 2014) till ovanstående data erhålles en statistiskt signifikant nedgång (p <0,001) för total PCN, med en halveringstid på 14 år
