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Charakterisierung der Mono-Methylierung am Arginin 293 von TDP-43 im Kontext der Amyotrophen Lateralsklerose
No full textDie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch den progredienten Untergang von Neuronen und der damit einhergehenden Muskelschwäche innerhalb weniger Jahre zum Tod der Betroffenen führt. Dabei ist der gleichzeitige Befall von erstem und zweitem Motoneuron für die ALS spezifisch und essenziell für ihre Diagnostik. Ein geringer Prozentsatz der ALS-Fälle (ca. 10%) tritt familiär mit autosomal dominantem Erbgang auf, der Großteil ist jedoch sporadisch. Inzwischen konnten ca. 30 Gene identifiziert werden, die mit der ALS in Verbindung stehen. Dabei lassen sich ALS-assoziierte Mutationen in diesen Genen auch häufig in sporadischen Patienten finden, was die These unterstützt, dass die ALS viel häufiger einen familiären Hintergrund hat als bisher angenommen. Die vier wichtigsten Gene der ALS sind dabei Chromosome 9 open reading frame 72 (C9orf72), Superoxid Dismutase 1 (SOD1), fused in sarcoma (FUS) und TAR DNA binding Protein (TARDBP). TAR DNA-binding Protein 43 (TDP-43), das Produkt von TARDBP, bildet in den Motoneuronen von nahezu allen ALS-Patienten unlösliche Aggregate, die als neuropathologisches Merkmal der ALS anzusehen sind. Physiologisch findet sich das RNA-bindende Protein TDP-43 im Nukleus und ist hier in sämtliche Schritte des ribonucleic acid (RNA)-Metabolismus involviert. In der ALS kommt es zu einer Misslokalisation von TDP-43 ins Zytoplasma, sowie zur Aggregation. Bei der Ursachenforschung für diese Veränderungen ist der C-Terminus von TDP-43 besonders wichtig. In ihm finden sich fast alle der ca. 50 ALS-assoziierten Mutationen in TDP-43, er ist wichtig für nahezu alle Funktionen des Proteins und hat Anteil an seiner Lokalisation innerhalb der Zelle. Außerdem ist er entscheidend für die Aggregationsfähigkeit des Proteins und verleiht TDP-43 prion-ähnliche Eigenschaften. Auch wurde gezeigt, dass posttranslationale Modifikationen (PTMs) von TDP-43 in der ALS Pathogenese eine wichtige Rolle spielen.
In dieser Arbeit wurde eine bisher nicht näher charakterisierte PTM im C-Terminus von TDP-43 untersucht, die bereits in zahlreichen high-throughput Studien detektiert wurde, nämlich eine Mono-Methylierung am Arginin 293 (R293). Es sollte bestimmt werden, ob TDP-43 tatsächlich am R293 mono-methyliert wird, ob ein auffälliges Cluster an ALS-assoziierten Mutationen um das R293 diese Methylierung beeinflusst, und ob diese Methylierung eventuell im Zusammenhang mit der Aggregation von TDP-43 steht.
Zunächst konnte gezeigt werden, dass TDP-43 an R293 in vitro durch die Protein-Arginin-Methyl-Transferase (PRMT) 1 mono-methyliert werden kann, was sich in vivo, in human embryonic kidney cells 293 (HEK293) Zellen, bestätigte. Ein Austausch von R293 durch eine nicht-methylierbare Aminosäure (Lysin), zeigte außerdem, dass das R293 die einzige Stelle in TDP-43 ist, an der eine Methylierung stattfinden kann. Um zu untersuchen welche Auswirkungen ALS-assoziierte Mutationen auf die Methylierung von R293 haben, wurden Fusionsproteine aus GST und einem Fragment von TDP-43 (Aminosäure 263-310) in vitro durch die PRMT1 methyliert. Durch Vergleich mit dem wildtypischen TDP-43 Fragment konnte gezeigt werden, dass die Mutation G290A, G294V, G295S und G298S zu einer verringerten, und S292N zu einer verstärkten Methylierung an R293 führen. Zusätzlich wurde untersucht, wie sich die Mono-Methylierung unter Stressbedingungen verändert. Durch zellulären Stress induzierte, zytoplasmatische Granula, die sog. stress granules, könnten Vorläufer der zytoplasmatischen TDP-43 Aggregate in der ALS darstellen. Es wurden HEK293 Zellen 2 Stunden lang dem Stressor Sorbitol ausgesetzt, und die Mono-Methylierung von überexprimiertem TDP-43 untersucht. Hierbei konnte eine Zunahme der Methylierung nach Sorbitolbehandlung gezeigt werden. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Mono-Methylierung eine Funktion beim Einbau von TDP-43 in stress granules, und eventuell auch bei der Aggregatbildung in der ALS, hat.
Insgesamt konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Mono-Methylierung an R293 von TDP-43 tatsächlich stattfindet, und eventuell in der Pathogenese der ALS von Bedeutung ist. Es sind jedoch weitere Untersuchungen notwendig, um diese Ergebnisse zu bestätigen und die genaue Funktion dieser Methylierung aufzuklären
Do organoids dream of neurodegenerative sheep? Investigating C9orf72–ALS/FTD as a synaptopathy using hiPSC-derived cerebral and spinal organoids
No full textAmyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a late onset, progressive, motor neuron disease (MND) that involves degeneration of the upper motor neurons (UMNs) of the motor cortex and the lower motor neurons (LMNs) of the spinal cord, leading to the rapid, relentless atrophy of muscles. ALS is often co-morbid with frontotemporal dementia (FTD) and can be either sporadic or familial in origin where a sprawling heterogeneity in genetic mutations, including C9orf72, act via divergent yet interconnected molecular pathomechanisms leading to a convergent disease phenotype at symptom onset, as detected by clinical diagnosis and post-mortem studies. However, by this point in time any chance of therapeutic intervention has been rendered ineffective so far.
Synaptic dysfunction is a consistently reoccurring motif based on a wide array of molecular, electrophysiological, and high-throughput techniques in patients in vivo, post-mortem tissue and 2D neuronal cultures in vitro, where mounting evidence indicates that ALS could very well be a synaptopathy.
The C9orf72-hexanucleotide repeat (HRE) mutation, which accounts for 38% of familial ALS cases, has been hypothesized to lead to neurodegeneration by one of three mechanisms: loss-of-function by haploinsufficiency of the protein, toxic gain-of-function leading to intranuclear RNA foci accumulation, and cytoplasmic dipeptide repeat (DPR) aggregation. Regardless of the mechanism, various pathophysiologies are implicated in neurodegeneration such as mislocalization and aggregation of proteins, impairment of autophagy, induction of apoptosis, accumulation of DNA damage, dysfunction of organelles such as mitochondria, deficits in axonal integrity, dysregulation in synaptic gene and protein expression, and altered neuronal excitability.
Two decades of research using human induced pluripotent stem cell (hiPSC) derived motor neurons (MNs) from patients have been employed to elucidate the presence and nature of sub-clinical, pre-symptomatic molecular pathomechanisms that eventually lead to ALS/FTD.
In this thesis, initial experiments done in primary rat cortical neurons over-expressing the poly(GA) DPR and hiPSC-MNs inherently carrying the mutation revealed that the effect of the C9orf72 HRE was sufficient to significantly reduce synaptic colocalization. This was further accentuated by a significant down-regulation in synaptic enrichment in the synaptosomes of these MNs based on proteomic analysis.
In the past decade, the exponential rise of hiPSC-derived organoid models that could capture the complex in vivo cytoarchitecture and neuronal networks of central nervous system (CNS) tissue regions in 3D more accurately than in 2D neuronal cultures has seen a dramatic increase in disease modelling and drug screening panels, and the advent of multi-organoid assembloids has further revitalized this research field.
Since studies using organoids to model ALS/FTD were a rarity, this thesis primarily focussed on evaluating whether these 3D systems could resemble their CNS tissue counterparts in terms of cellular composition and complexity, and whether they could recapitulate disease pathomechanisms that are otherwise inaccessible in patients and are terminal in post-mortem tissues.
Cerebral organoids modelling the cortical component of C9orf72-ALS/FTD showed an overall down-regulation of the excitatory synaptic machinery, along with a significant decrease in the number of CTIP2+ deep layer neurons (DLNs), hinting at pre-symptomatic loss in synaptic activity. However other neurodegenerative markers such as autophagic flux deficits, apoptosis, mitochondrial disruption, DNA damage, axonal protein impairment, C9orf72 protein expression and TDP-43 mislocalization were absent.
Spinal organoids modelling the spinal component of C9orf72-ALS/FTD exhibited an overall impairment in either protein-binding to autophagosomes or a hyperactive protein clearance by autophagy, along with a selective MN-specific increase in apoptosis induction and DNA damage accumulation in a significantly decreased population of ISL1+ MNs. Other mechanisms such as mitochondrial dysfunction, axonal protein deficits, C9orf72 protein levels and TDP-43 mislocalization were unchanged.
Despite inherent variations with the culture protocols and within and across patients and their respective hiPSC lines, the fact that all these phenotypes were robustly and significantly expressed in C9orf72-ALS/FTD emphasized the intrinsic relevance of these findings within the context of disease pathophysiology, highlighting a potentially differential, CNS-model specific sequence of sub-clinical molecular events and synaptic dysregulation leading to neurodegeneration.
The limitation posed by culturing these organoid types independently of each other, as is also the case with 2D monocultures, is that they are not functionally congruent with the complete in vivo corticospinal tract innervating muscle fibres, thereby adding a dimension of variability to these findings, which can be overcome by the fusion of cerebral and spinal organoids into assembloids capable of developing corticospinal projections that span from the cerebral component to the spinal component.
Future improvements to hiPSC-organoids and assembloids such as optimal neuronal sustenance and maturation over prolonged culture periods, inducing development of microglia and vascular endothelium, incorporating a muscular component to form a complete motor unit in vitro, analysis of synaptic density and expression using 3D microscopy techniques, functional assessment of network activity by electrophysiological recordings, and delineation of disease phenotypes using high-throughput omics-based approaches would all indisputably contribute towards a better understanding of the enigmatic molecular mechanisms and synaptic underpinnings of not only C9orf72 pathology, but all of ALS/FTD
Mitochondrion to endoplasmic reticulum apposition length in zebrafish models of Alzheimer´s disease
No full textAlzheimer´s disease (AD) is a neurodegenerative disease and the most common type of dementia. In the last decade, increasing evidence argues against the amyloid cascade hypothesis stating that accumulation of amyloid beta in diseased brains is the toxic agent in AD. Alternatively, a central role of “mitochondria-associated endoplasmic reticulum (ER) membranes” (MAMs) is discussed. MAMs regulate key events of AD pathogenesis, such as mitochondrial dysfunction, autophagy, calcium homeostasis, and others. A previous study indicates that the length of M-ER appositions is increased in fibroblasts of patients suffering from both familial AD (fAD) and sporadic AD (sAD), as well as in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) lacking expression of two genes associated with fAD (PSEN1-/-/PSEN2-/-). These findings, among others, suggest increased MAM activity in AD, and an easily accessible and manipulable in vivo model organism suitable for further research on the role of MAMs in AD would be of high interest. Therefore, in this study, M-ER apposition lengths were measured in differentially treated zebrafish (Danio rerio) embryos 48 hours post fertilization (hpf). Treatments were related to AD and included injection of antisense morpholino oligonucleotides that inhibit expression of the zebrafish orthologues of PSEN1 and PSEN2, mimicking hypoxia with sodium azide, as well as inhibition of the γ-secretase with DAPT. M-ER apposition lengths were analyzed in a presumably proliferative neural cell type in the spinal cord using transmission electron microscopy (TEM) followed by image analysis with Image J software. However, none of the different treatments led to significant differences in M-ER apposition lengths. The results of this study confirm that it is possible to reproducibly measure the M-ER apposition length in zebrafish embryos, but also revealed limitations of zebrafish embryos for studying AD-related changes in MAMs. Nevertheless, the results of this thesis provide a basis for future research definitely answering the question if zebrafish are a suitable model organism for studying the role of MAMs in AD
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Untersuchungen an einem zellfreien Proteinsynthesesystem basierend auf S30 Extrakten von Escherichia coli
Full text linkDie zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einer wichtigen Methode der Proteinexpression entwickelt, die viele Vorteile gegenüber der in vivo Expression von Proteinen bietet. Ein Grund, warum die zellfreie Proteinsynthese die in vivo Expression noch nicht als Standardmethode zur Herstellung rekombinanter Proteine abgelöst hat, ist in der vergleichsweise geringen Produktivität dieser Systeme zu finden. Intensive Bemühungen der letzten Jahre konnten zwar die Ausbeute der zellfreien Proteinsynthese stark erhöhen, dennoch sind die erzielten Mengen noch weit von dem entfernt, was theoretisch möglich sein könnte. Aus diesem Grund wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Ansätze verfolgt, die Ausbeute der zellfreien Proteinsynthese, am Beispiel eines Systems, das auf S30 Extrakten von Escherichia coli basiert, zu erhöhen. Darüber hinaus sollte dieses System als Teil eines von der GENEART AG entwickelten in vitro Evolutionssystems eingesetzt werden.
Zu Beginn wurde ein Protokoll zur Herstellung der S30 Extrakte und zur Durchführung von zellfreien Proteinsynthesereaktionen optimiert, um ein solides und modernes Testsystem für weitere Versuche zur Verfügung zu haben. Dabei konnte sowohl der Zellaufschluss durch Sonifikation, als auch die Präinkubationsmethode als kritische Einflussfaktoren der Syntheseleistung identifiziert werden. Auch zeigte sich die Verwendung eines RNase E-defizienten E. coli Stammes für die Herstellung der Extrakte, sowie die Erhöhung der Konzentration an DTT in der Synthesereaktion als förderlich für die erzielten Proteinausbeuten. Insgesamt führten die Optimierungen zu der Etablierung eines Systems, dessen Produktivität nun sowohl mit den Systemen anderer Autoren, als auch mit kommerziell erhältlichen vergleichbar ist.
Das optimierte zellfreie Proteinsynthesesystem sollte als Teil eines in vitro Evolutionssystems eingesetzt werden, wobei unter Anwesenheit der S30 Extrakte die Produktbildung einer reversen Transkriptase, die essentiell für eine Amplifikationsreaktion dieses Systems war, inhibiert wurde. Intensive Untersuchungen führten zu dem Schluss, dass zu viele Proteine in den S30 Extrakten, wie beispielsweise RNasen und DNA Polymerasen, dafür verantwortlich sind. Der Einsatz isolierter Ribosomen unterschiedlicher Reinheit war nicht möglich, da Translationsaktivität und Produktbildung der reversen Transkriptase nicht vereinbar schienen.
Im Zusammenhang der Erhöhung der Produktivität konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Translationsmaschinerie in den S30 Extrakten optimal rekonstituiert ist. Dazu testete man alle Faktoren des Translationsapparates einzeln auf ihren Einfluss auf die Synthese eines Testproteins. Es wirkten sich jedoch nur die Elongationsfaktoren Tu und Ts positiv aus, wobei die Erhöhung der Syntheseleistung mit 13% bzw. 6% jedoch zu gering ausfiel, um von limitierenden Faktoren zu sprechen. Darüber hinaus wurden auch zellfreie Proteinsynthesereaktionen mit geringeren Konzentrationen an Translationsfaktoren durchgeführt. Jedoch konnte auch hier keine Steigerung der Syntheseleistung erzielt werden. Dies, zusammen mit den obigen Ergebnissen, erlaubt die Aussage der optimalen Rekonstitution der Translationsmaschinerie in S30 Extrakten von Escherichia coli.
Desweiteren behandelte diese Arbeit das Problem der Sekundärstrukturbildung der mRNA, das mehrere Autoren als Grund für eine limitierte Proteinausbeute sehen. Durch den Einsatz der verschiedensten RNA Chaperone der unterschiedlichsten Klassen wurde versucht, auf die Translation inhibitorisch wirkende Sekundärstrukturen der mRNAs aufzulösen und diese Limitation zu überwinden, wodurch jedoch keine Steigerung der Syntheseleistung erreicht werden konnte. Die erstmalige Verwendung einer miRNA in einem zellfreien System, die durch Hybridisierung mit der 5‘ untranslatierten Region der mRNA regulatorische Sequenzen freilegen sollte, führte zu einer etwa 13%igen Steigerung der Syntheseleistung.
Die größten Steigerungen der Syntheseleistung des zellfreien Systems aus E. coli erreichte man in dieser Arbeit durch die Erniedrigung der Reaktionstemperatur, wodurch unerwünschte Nebenreaktionen reduziert werden sollten. Dabei war der Einsatz der 5‘ untranslatierten Region eines Kälteschockgens nötig, um bei niedrigeren Temperaturen eine effiziente Proteinsynthese zu gewährleisten. Die Auswirkungen dieser 5‘ untranslatierten Region auf die zellfreie Expression mehrerer Proteine wurde getestet, wobei bei 60% sowohl eine erhöhte Ausbeute, beispielsweise 20% im Falle der Chloramphenicol Acetyltransferase, als auch eine einheitliche optimale Expressionstemperatur von 25°-30° C festgestellt werden konnte.
Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit mehrere vielversprechende Ansätze identifiziert werden, die Syntheseleisung von zellfreien Proteinsynthesesystemen aus E. coli zu verbessern, sowie einige bedeutende Hinweise zum besseren Verständnis dieser Methode geliefert werden
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Spectrum and frequency of genetic variants in sporadic amyotrophic lateral sclerosis
No full textAbstract Therapy of motoneuron diseases entered a new phase with the use of intrathecal antisense oligonucleotide therapies treating patients with specific gene mutations predominantly in the context of familial amyotrophic lateral sclerosis. With the majority of cases being sporadic, we conducted a cohort study to describe the mutational landscape of sporadic amyotrophic lateral sclerosis. We analysed genetic variants in amyotrophic lateral sclerosis-associated genes to assess and potentially increase the number of patients eligible for gene-specific therapies. We screened 2340 sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients from the German Network for motor neuron diseases for variants in 36 amyotrophic lateral sclerosis-associated genes using targeted next-generation sequencing and for the C9orf72 hexanucleotide repeat expansion. The genetic analysis could be completed on 2267 patients. Clinical data included age at onset, disease progression rate and survival. In this study, we found 79 likely pathogenic Class 4 variants and 10 pathogenic Class 5 variants (without the C9orf72 hexanucleotide repeat expansion) according to the American College of Medical Genetics and Genomics guidelines, of which 31 variants are novel. Thus, including C9orf72 hexanucleotide repeat expansion, Class 4, and Class 5 variants, 296 patients, corresponding to ∼13% of our cohort, could be genetically resolved. We detected 437 variants of unknown significance of which 103 are novel. Corroborating the theory of oligogenic causation in amyotrophic lateral sclerosis, we found a co-occurrence of pathogenic variants in 10 patients (0.4%) with 7 being C9orf72 hexanucleotide repeat expansion carriers. In a gene-wise survival analysis, we found a higher hazard ratio of 1.47 (95% confidence interval 1.02–2.1) for death from any cause for patients with the C9orf72 hexanucleotide repeat expansion and a lower hazard ratio of 0.33 (95% confidence interval 0.12–0.9) for patients with pathogenic SOD1 variants than for patients without a causal gene mutation. In summary, the high yield of 296 patients (∼13%) harbouring a pathogenic variant and oncoming gene-specific therapies for SOD1/FUS/C9orf72, which would apply to 227 patients (∼10%) in this cohort, corroborates that genetic testing should be made available to all sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients after respective counselling
FUS mutations dominate TBK1 mutations in FUS/TBK1 double-mutant ALS/FTD pedigrees
No full textMutations in FUS and TBK1 often cause aggressive early-onset amyotrophic lateral sclerosis (ALS) or a late-onset ALS and/or frontotemporal dementia (FTD) phenotype, respectively. Co-occurrence of mutations in two or more Mendelian ALS/FTD genes has been repeatedly reported. However, little is known how two pathogenic ALS/FTD mutations in the same patient interact to shape the final phenotype. We screened 28 ALS patients with a known FUS mutation by whole-exome sequencing and targeted evaluation for mutations in other known ALS genes followed by genotype–phenotype correlation analysis of FUS/TBK1 double-mutant patients. We report on new and summarize previously published FUS and TBK1 double-mutant ALS/FTD patients and their families. We found that, within a family, mutations in FUS cause ALS while TBK1 single mutations are observed in FTD patients. FUS/TBK1 double mutations manifested as ALS and without a manifest difference regarding age at onset and disease duration when compared to FUS single-mutant individuals. In conclusion, TBK1 and FUS variants do not seem to interact in a simple additive way. Rather, the phenotype of FUS/TBK1 double-mutant patients appears to be dominated by the FUS mutation
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