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Digital means for democratic research: Towards a design for mapping a Jewish Europe beyond the Holocaust
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Effekt des konstitutiv aktiven STING-Proteins auf die zerebrale Pathologie im SAVI-Mausmodell
No full textDie STING-Signalkaskade ist ein essentieller Bestandteil des angeborenen Immunsystems. Sie dient der zeitlich limitierten Initiierung einer proinflammatorischen Immunantwort nach Detektion zytoplasmatischer Fremd- oder körpereigener DNA. Mutationen im STING-Transmembranprotein führen zur konstitutiven Aktivierung der STING-Signalgebung, welche sich phänotypisch als STING-assoziierte Vaskulopathie oder SAVI-Syndrom (STING Associated Vasculopathy with Onset in Infancy) manifestiert. In der Literatur wurde bisher fokussiert die intensivierte entzündliche Aktivität in und an Blutgefäßen vor allem in pulmonalen Geweben diskutiert. In dieser Arbeit sollte die folgende Hypothese untersucht werden: im Zusammenhang der STING-assoziierten Vaskulopathie hat die konstitutive Aktivierung der STING-Signalkaskade proinflammatorischen Einfluss auf neuronale Prozesse, welche im Mausmodell einen proentzündlichen Phänotyp bedingen. Dieser proinflammatorische neuronale Phänotyp ist erstens nicht auf einen spezifischen Signalweg zurückzuführen und zeigt sich zweitens progredient über das Lebensalter.
Um den Einfluss der konstitutiven STING-Aktivierung auf neuroinflammatorische Prozesse feststellen zu können, wurden Kortex sowie Zerebellum von Mäusen mit Sting1-Variante (Sting-knock-in bzw. Sting-ki) auf proinflammatorische Marker untersucht. Dies geschah anhand von immunhistochemischer Färbung sowie Western-Blot- und mRNA-Genexpressionsanalyse. Die systematischen Untersuchungen wurden an adulten und juvenilen Mäusen der Sting-ki-C57BL/6N-Linie im Vergleich zu verschiedenen Knockoutstämmen durchgeführt.
In der Betrachtung adulter Mäuse mit konstitutiv aktiver Sting1-Variante zeigte sich im Vergleich zu Wildtypen desselben Stammes ein intensiviertes proinflammatorisches Genexpressionsprofil mit Akkumulation von interferonregulierten und -regulierenden Mediatoren. In der immunhistochemischen Färbung wurde das inflammatorische Profil von Sting-ki-Tieren durch das vermehrte Vorkommen von mikroglialen sowie astroglialen Strukturen bestätigt. In der weiterführenden Untersuchung von Tieren verschiedener Knockoutstämme konnten vergleichbare Ergebnisse gesichert werden: sowohl in Ifnar1-/-- als auch IP-10-/-- und Casp1-/--Individuen wurde Neuroinflammation in Form von Astro- und Mikrogliose sowie intensivierte proinflammatorische Genexpression in Sting-ki-Tieren verglichen zu Wildtyptieren derselben Stämme nachgewiesen. Sowohl in Ifnar1-/-- als auch IP-10-/--Individuen der genetischen Sting1-Variante zeigte sich die interferonassoziierte Signalgebung, beispielhaft nachgewiesen über Genexpression von Ifi44 und Mx1 oder Transkriptionsfaktoren wie STAT1 und STAT3, deutlich verringert im Vergleich zu Sting-ki-C57BL/6N-Individuen ohne Knockout. Zudem konnte eine Stimulation der NFB-assoziierten Signalkaskaden unter anderem über die erhöhte Expression des NFB-abhängigen mRNA-Transkripts TNF festgestellt werden: diese war in Ifnar1-/-- als auch IP-10-/--Individuen im Vergleich zu Sting-ki-C57BL/6N-Individuen ohne Knockout intensiviert. Bei der Betrachtung von Casp1-/--Individuen zeigte sich in dieser Arbeit unter anderem die erwartete Reduktion der inflammasomassoziierten Genexpression von IL-1. Zusätzlich zeigten Casp1-/--Individuen ein verringertes proinflammatorisches mRNA-Expressionsprofil der in dieser Arbeit untersuchten Gene im Vergleich zu Sting-ki-C57BL/6N-Tieren ohne Knockout. In der Untersuchung des Casp1-/--Stammes wurde eine erhöhte Expression von Proteinen, beispielsweise TBK1, sowie der astro- und mikrogliotischen Strukturen in Sting-ki- verglichen mit Wildtyptieren festgestellt. Insgesamt ist sowohl in Ifnar1-/-- als auch IP-10-/-- und Casp1-/--Individuen mit der genetischen Sting1-Variante die Entwicklung von Neuroinflammation unabhängig vom Knockout nachweisbar und entsteht entsprechend der Ergebnisse dieser Arbeit über die Stimulation alternativer Signalkaskaden oder durch eine Kombination der untersuchten Signalwege.
In der Betrachtung von juvenilen 5-Wochen alten Mäusen wiesen schon die Jungtiere mit genetischer Sting1-Variante verglichen mit Wildtypen vermehrt mikro- und astrogliale Strukturen auf. Auch die Untersuchung der Proteinexpression sowie mRNA-Expression wies ein proinflammatorisches Profil in Jungtieren mit Sting1-Mutation nach. Der Nachweis interferonassoziierter Signalgebung, beispielhaft anhand Ifi44 und Mx1 sowie im Zusammenhang mit der NFB-Signalkaskade anhand TNF, war in juvenilen Sting-ki-Tieren im Vergleich zu adulten Sting-ki-Individuen intensiviert. Im Gegensatz dazu erbrachte die Betrachtung der inflammasomassoziierten Signalgebung anhand des Casp1-mRNA- Nachweises signifikant niedrigere Expressionsraten in juvenilen gegenüber adulten Tieren mit der genetischen Sting1-Variante. Insgesamt präsentierte sich im Vergleich zwischen juvenilen und adulten Sting-ki-Tieren ein intensiviertes proinflammatorische Profil in adulten Sting-ki-Tieren. Entsprechend ist von einer progredienten neuroinflammatorischen Entwicklung über das Lebensalter auszugehen. Dabei suggerieren die Ergebnisse eine mit dem Lebensalter assoziierbare Veränderung der prominenten proinflammatorischen Prozesse, welche zur immunhistochemisch nachgewiesenen Neuroinflammation führen. In juvenilen Individuen werden interferonassoziierte Signalwege verstärkt exprimiert, während in adulten Individuen die Wichtigkeit des Inflammasoms überwiegt. Inwieweit inflammatorische Veränderungen bereits pränatal einsetzen, bleibt zu klären.
Die Untersuchungen zeigten in Tieren der Knockoutstämme tendenziell eine Reduktion des inflammatorischen Profils im Vergleich zu Mäusen ohne Knockout. Die Generierung von Defekten in proinflammatorischen Genen durch genetischen Knockout verhinderte jedoch nicht vollständig das Auftreten von Neuroinflammation. Die SAVI-Erkrankung im Mausmodell präsentiert sich somit als kombinierte Immundysregulation. Inwieweit die Signalkaskaden zu den hier beobachteten Veränderungen beitragen, sollte anhand weiterführender Forschung systematisch untersucht werden.:Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1. Angeborenes und erworbenes Immunsystem
1.1.1. Der cGAS-STING-Signalweg
1.1.2. Pathologie der Autoinflammation
1.1.2.1. Hereditäre periodische Fiebersyndrome
1.1.2.2. Typ-I-Interferonopathien
1.2. STING-associated vasculopathy with onset in infancy
1.2.1. Medizinische Aspekte
1.2.1.1. Charakteristika der klinischen Präsentation
1.2.1.2. Symptomorientierte medikamentöse Behandlungsmöglichkeiten
1.2.2. Molekulargenetische Veränderungen
1.2.3. SAVI-Mausmodell
1.3. Neuroinflammation
1.3.1. Komponenten und Mechanismen der Neuroinflammation
1.3.1.1. Mikroglia
1.3.1.2. Astroglia
1.3.1.3. Neuroinflammatorische Prozesse und Besonderheiten
1.3.1.4. Glianarbe
1.3.2. Ätiologie und Auswirkungen
1.3.2.1. Traumata, Stress und Alterungsprozess
1.3.2.2. Euflammation, Gedächtnis und Reparaturprozesse
2. Zielsetzung
3. Material und Methoden
3.1. Materialen
3.1.1. Chemikalien und Substanzen
3.1.2. Antikörper
3.1.3. Kits
3.1.4. Primer
3.1.5. Geräte und Software
3.1.6. Verbrauchsmaterialien
3.1.7. Gebrauchslösungen
3.2. Methoden
3.2.1. Ethische Erklärung
3.2.2. Versuchsmäuse
3.2.3. Präparation
3.2.4. Herstellung von Kryostatschnitten
3.2.4.1. Präparation und Fixierung
3.2.4.2. Kryoprotektion
3.2.4.3. Kryostatschnitte
3.2.5. Immunhistochemische Experimente an Kryostatschnitten
3.2.5.1. Antikörperfärbungen
3.2.5.2. Mikroskopische Auswertung
3.2.6. Proteinisolierung aus Kortex und Zerebellum
3.2.7. Western Blot
3.2.7.1. SDS-Page
3.2.7.2. Semi-dry-Blotting
3.2.7.3. Antikörperfärbung
3.2.8. RNA-Isolierung und cDNA-Synthese
3.2.9. Quantitative Real-Time-PCR
3.2.10. Analyse und statistische Auswertung
3.2.10.1. Immunhistochemie
3.2.10.2. Western Blots
3.2.10.3. Quantitative Real-Time-PCR
3.2.10.4. Statistische Auswertung (GraphPadPrism)
4. Ergebnisse
4.1. Phänotypische Charakterisierung
4.1.1. Erscheinungsbild
4.1.2. Verhaltensbeobachtungen
4.1.3. Sozialverhalten
4.2. Adulte Sting-ki-C57BL/6N-Individuen mit Sting1- oder Wildtypvariante: Immunhistochemische Analysen
4.2.1. Mikroskopie der kortikalen Präparate
4.2.1.1. Nachweis mikroglialer Strukturen
4.2.1.2. Nachweis astrozytärer Strukturen
4.2.2. Mikroskopie der zerebellären Präparate
4.2.2.1. Nachweis mikroglialer Strukturen
4.2.2.2. Nachweis astrozytärer Strukturen
4.3. Adulte Sting-ki-C57BL/6N-Individuen mit Sting1- oder Wildtypvariante: Western-Blot-Analysen
4.3.1. Charakteristika kortikaler Proteinanalysen
3.3.2. Charakteristika zerebellärer Proteinanalysen
4.4. Adulte Sting-ki-C57BL/6N-Individuen mit Sting1- oder Wildtypvariante: mRNA-Genexpressionsanalyse
3.4.1. Charakteristika kortikaler mRNA-Expressionsanalysen
4.4.2. Charakteristika zerebellärer mRNA-Expressionsanalysen
4.5. Adulte Sting-ki-C57BL/6N-Individuen der Knockoutstämme Ifnar1-/--, IP-10-/-- oder Casp1-/- mit Sting1- oder Wildtypvariante
4.5.1. Immunhistochemische Analysen
4.5.1.1. Mikroskopie der kortikalen Präparate
4.5.1.2. Mikroskopie der zerebellären Präparaten
4.5.2. Immundetektion von Proteinen mittels Western-Blot-Analysen
4.5.2.1. Charakteristika kortikaler Proteinanalysen
4.5.2.2. Charakteristika zerebellärer Proteinanalysen
4.5.3. Genexpressionsanalyse mittels quantitativer Real-Time-PCR
4.5.3. Charakteristika kortikaler mRNA-Expressionsanalysen
4.5.1.6. Charakteristika zerebellärer mRNA-Expressionsanalysen
4.6. Juvenile Sting-ki-C57BL/6N-Individuen mit Sting1- oder Wildtypvariante
4.6.1. Immunhistochemische Analyse
4.6.1.1. Mikroskopie der kortikalen Präparate
4.6.1.2. Mikroskopie der zerebellären Präparaten
4.6.2. Immundetektion von Proteinen mittels Western-Blot-Analysen
4.6.2.1. Charakteristika kortikaler Proteinanalysen
4.6.2.2. Charakteristika zerebellärer Proteinanalysen
3.6.3. Genexpressionsanalyse mittels quantitativer Real-Time-PCR
4.6.3.1. Charakteristika kortikaler mRNA-Expressionsanalysen
4.6.3.2. Charakteristika zerebellärer mRNA-Expressionsanalysen
5. Diskussion
5.1. Anatomische und behavoriale Unterschiede zwischen Wildtypen und Individuen der Sting1- Variante
5.2. Zerebrale Pathologie in Sting-ki-Individuen der Sting-ki-C57BL/6N-Mauslinie
5.2.1. Mikrogliale und astrogliale Veränderungen
5.2.2. Signaltransduktion ausgelöst durch konstitutiv aktives STING
5.2.2.1. Interferonassoziierte Signalgebung
5.2.2.2. NFB-assoziierte Signalgebung
5.2.2.3. Inflammasomassoziierte Signalgebung
5.2.3. Pathologische Differenzen in Kortex und Zerebellum
5.3. Zerebrale Pathologie in Knockoutstämmen der Sting-ki-C57BL/6N-Mauslinie
5.3.1. Individuen des Ifnar1-/--Stammes
5.3.2. Individuen des IP-10-/--Stammes
5.3.3. Individuen des Casp1-/--Stammes
5.3.4. Bedeutung von Ifnar1-/--, IP-10-/-- und Casp1-/--Tieren
5.4. Altersbasierte Progression zerebraler Pathologie
5.5. Therapeutische Konsequenzen und Ausblick
6. Zusammenfassung
7. Summary
8. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
8.1. Abbildungen
8.2.Tabellen
9. Literaturverzeichnis
Danksagung
Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens
Anlage 2: Bestätigung über Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgabe
Targeting fibroblast growth factor receptors in head and neck cancers: Identifying therapeutic vulnerabilities for radiochemosensitization and overcoming adaptive resistance
No full textBackground
Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) remains a critical oncological challenge, particularly in human papillomavirus (HPV)-negative cases. These tumors are characterized by poor patient survival rates and high recurrence rates, attributed mainly to the development of therapy resistances. The mechanisms underlying these resistances are complex and multifactorial, including phenotypic plasticity driven by epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), and cooperative pro-survival signaling via receptor tyrosine kinases (RTKs) and integrin adhesion receptors. While dual inhibition of the frequently overexpressed epidermal growth factor receptor (EGFR) and β1 integrin has demonstrated promising preclinical efficacy, non-responsiveness in certain models suggests the involvement of additional oncogenic signaling networks.
Hypothesis
This study aims to identify novel RTK/β1 integrin-based vulnerabilities in HPV-negative HNSCC. It is hypothesized that combined inhibition of a specific RTK and β1 integrin elicits superior cytotoxic and radiochemosensitizing effects in HPV-negative HNSCC models compared to monotherapy. Furthermore, it is hypothesized that targeting kinases upregulated in response to initial therapy effectively circumvents emerging resistance mechanisms.
Methods
The cytotoxic and radiochemosensitizing efficacy of targeting 10 distinct RTKs, alone or in conjunction with β1 integrin, was evaluated in up to 20 three-dimensional laminin-rich extracellular matrix (3D lrECM)-cultured HNSCC cell models. RNA interference and pharmacological-based targeting approaches were utilized in cell viability and clonogenic survival assays complemented by single doses of 6 Gy X-rays and/or cisplatin treatment. Molecular profiling was performed by RNA sequencing and protein-based biochemical assays. Cell viability-based drug screening with 36 kinase inhibitors was employed to identify resistance-deactivating targets. Clinical relevance was assessed by transferring the resistance signature to HPV-negative HNSCC cohorts using machine learning and pathway analysis. Network analyses integrating drug screening and clinical cohort data were conducted to identify key determinants of resistance.
Results
Among the examined RTKs, depletion of the fibroblast growth factor receptor (FGFR) family exhibited the most pronounced cytotoxic and radiosensitizing effects. Dual pharmacological targeting, using the pan-FGFR inhibitor erdafitinib (FGFRi) and the anti-β1 integrin antibody AIIB2, enhanced radiochemosensitization across a heterogeneous panel of HNSCC cell models. However, a subset of models exhibited a profound radioprotective resistance to FGFRi. Transcriptomic analyses revealed that FGFRi treatment elicited mesenchymal-to-epithelial transition (MET) in sensitive UT-SCC 33 cells, whereas FGFRi-induced resistance in UM-SCC 10a cells was associated with an EGFR-driven partial EMT (pEMT) phenotype. Mechanistically, a feedback loop involving ERK1/2 hyperphosphorylation upon FGFR3 deactivation was implicated in this adaptive pEMT resistance. Kinase inhibitor screening confirmed that EGFR inhibition effectively abrogated FGFRi resistance in UM-SCC 10a cells. Additionally, novel kinase targets, including Fyn, PAK1-3, and PKCα, were identified, demonstrating the capacity to either reverse FGFRi resistance or enhance FGFRi efficacy in other HNSCC models. Transferring the pEMT-related resistance signature to patient cohorts confirmed its prognostic significance and highlighted overexpressed and druggable genes, including PLAU, HBEGF, and ITGA5. Integrating drug screening and clinical signature results into network analyses underscored their close interconnection and emphasized the central role of EGFR as a key mediator of pEMT-related resistance, thus offering targetable vulnerabilities for therapeutic intervention.
Conclusions
This study highlights the therapeutic potential of targeting the FGFR family in HPV-negative HNSCC, while also revealing the risk of adaptive resistance. FGFR inhibition induced a spectrum of responses, ranging from beneficial radiochemosensitization, enhanced by concurrent β1 integrin blockade, to pronounced cyto- and radioprotective effects. Notably, the dynamics of EMT were significantly influenced by FGFRi treatment across this spectrum. The adaptive pEMT-related resistance appears to be of clinical significance and can be therapeutically exploited through rational combination strategies targeting FGFR, EGFR, and associated kinases. As FGFR inhibitors gain clinical traction in other cancer types, further investigation into predictive biomarkers and adaptive resistance mechanisms will be essential for their optimal application in HNSCC. The identified FGFRi resistance network provides a foundation for the development of personalized and adaptable therapeutic approaches aimed at achieving durable treatment responses in HNSCC.Hintergrund
Das Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereichs (HNSCC) stellt nach wie vor eine schwierige onkologische Herausforderung dar, insbesondere bei humanen Papillomavirus (HPV)-negativen Fällen. Diese Tumore zeichnen sich durch niedrige Überlebenschancen und hohe Rezidivraten aus, was im Wesentlichen auf die Entwicklung von Therapieresistenzen zurückzuführen ist. Die zugrundeliegenden Resistenzmechanismen sind komplex und vielschichtig und basieren unter anderem auf der durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) angetriebene phänotypische Plastizität, sowie einer kooperativen und überlebensfördernden Signalübertragung durch Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) und Integrin-Adhäsionsrezeptoren. Die duale Hemmung des häufig überexprimierten epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und β1-Integrin zeigte eine vielversprechende präklinische Wirksamkeit. Jedoch deutet das Nichtansprechen in bestimmten Modellen auf die Beteiligung weiterer onkogener Signalnetzwerke hin.
Fragestellung/Hypothese
Ziel dieser Studie ist es neue RTK/β1-Integrin-basierte therapeutische Angriffspunkte bei HPV-negativem HNSCC zu identifizieren. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass die kombinierte Hemmung eines spezifischen RTKs und β1-Integrin in HPV-negativen HNSCC-Modellen eine stärkere zytotoxische und radiochemosensibilisierende Wirkung zeigt als die jeweilige Einzeltherapie. Darüber hinaus wird angenommen, dass die Inaktivierung von Kinasen, welche als Reaktion auf die primäre Therapie hochreguliert werden, aufkommende Resistenzmechanismen wirkungsvoll unterbindet.
Material und Methode
Die zytotoxische und radiochemosensibilisierende Wirksamkeit der Inhibition von 10 verschiedenen RTKs, allein oder in Kombination mit β1-Integrin, wurde in bis zu 20 HNSCC Zellmodellen, kultiviert in dreidimensionaler lamininreicher extrazellulärer Matrix (3D lrECM), untersucht. RNA-Interferenz- und pharmakologische Targeting-Ansätze wurden in Zellviabilitäts- und klonogenen Überlebenstests eingesetzt, ergänzt durch Einzeldosen von 6 Gy Röntgenstrahlung und/oder Cisplatin-Behandlung. Molekulare Charakterisierungen wurden mittels RNA-Sequenzierung und proteinbasierten biochemischen Assays durchgeführt. Ein auf Zellviabilität basierendes Medikamentenscreening mit 36 Kinaseinhibitoren wurde verwendet, um resistenzdeaktivierende Ziele zu identifizieren. Die klinische Relevanz wurde durch Übertragung der Resistenzsignatur auf HPV-negative HNSCC-Kohorten mittels maschinellen Lernens und Signalwegsanalyse bewertet. Die Daten aus dem Medikamentenscreening und klinischen Kohorten wurden in Netzwerkanalysen, zur Bestimmung der wichtigsten Resistenzfaktoren, zusammengeführt.
Ergebnisse
Unter den untersuchten RTKs zeigte die Depletion der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (FGFR)-Familie die ausgeprägtesten zytotoxischen und radiosensibilisierenden Effekte. Die duale pharmakologische Hemmung mit dem pan-FGFR-Inhibitor Erdafitinib (FGFRi) und dem anti-β1-Integrin-Antikörper AIIB2 verstärkte die Radiochemosensibilisierung über viele heterogene HNSCC-Zellmodelle hinweg. Eine Untergruppe von Modellen wies jedoch eine starke radioprotektive Resistenz gegenüber FGFRi auf. Transkriptomanalysen ergaben, dass die FGFRi-Behandlung in sensitiven UT-SCC 33-Zellen eine mesenchymale-zu-epitheliale Transition (MET) auslöste, während die FGFRi-induzierte Resistenz in UM-SCC 10a-Zellen mit einem EGFR-gesteuerten partiellen EMT-Phänotyp (pEMT) assoziiert war. Mechanistisch kann für die adaptive pEMT-Resistenz eine Feedback-Schleife, ausgelöst durch FGFR3-Deaktivierung und anschließender ERK1/2 Hyperphosphorylierung, angenommen werden. Das Medikamentenscreening bestätigte, dass die EGFR-Hemmung die FGFRi-Resistenz in UM-SCC 10a-Zellen effektiv aufhob. Darüber hinaus wurden neue Kinase-Zielstrukturen wie Fyn, PAK1-3 und PKCα identifiziert, deren Inhibition ebenfalls die FGFRi-Resistenz neutralisierte oder die FGFRi-Wirksamkeit in anderen HNSCC-Modellen verbesserte. Die Übertragung der pEMT-bezogenen Resistenzsignatur auf Patientenkohorten bestätigte ihre prognostische Bedeutung und hob überexprimierte und medikamentös angreifbare Gene wie PLAU, HBEGF und ITGA5 hervor. Die Integration der Ergebnisse aus dem Medikamentenscreening und den klinischen Signaturen in Netzwerkanalysen unterstrich deren enge Verknüpfung und betonte die zentrale Rolle von EGFR als Hauptvermittler der pEMT-bezogenen Resistenz, wodurch sich gezielte Schwachstellen für therapeutische Interventionen ergeben.
Schlussfolgerungen
Diese Studie verdeutlicht das therapeutische Potenzial einer gezielten Inhibition der FGFR-Familie bei HPV-negativem HNSCC, zeigt jedoch auch das Risiko adaptiver Resistenzen auf. Die FGFR-Hemmung induzierte ein Spektrum von Reaktionen, das von vorteilhafter Radiochemosensibilisierung, verstärkt durch gleichzeitige β1-Integrin-Blockade, bis hin zu ausgeprägten zyto- und radioprotektiven Effekten reichte. Bemerkenswerterweise wurde die EMT-Dynamik durch die FGFRi-Behandlung über dieses Spektrum hinweg wesentlich beeinflusst. Die adaptive pEMT-assoziierte Resistenz scheint von klinischer Bedeutung zu sein und kann durch rationale Kombinationsstrategien, die auf FGFR, EGFR und damit verbundene Kinasen abzielen, therapeutisch genutzt werden. Da FGFR-Inhibitoren in anderen Krebsarten klinisch an Bedeutung gewinnen, wird eine weitere Untersuchung prädiktiver Biomarker und adaptiver Resistenzmechanismen entscheidend für ihre optimale Anwendung in HNSCC sein. Das identifizierte FGFRi-Resistenznetzwerk bietet eine Grundlage für die Entwicklung personalisierter und anpassungsfähiger Therapieansätze, mit welchen dauerhafte Behandlungserfolge in HNSCC erzielt werden könnten
Development of impedance-based sensing systems
No full textThis work demonstrates how impedance-based sensors can be transformed into adaptable biomedical tools, emphasizing the need to rethink how emerging technologies are integrated into healthcare systems. The future of diagnostics is moving away from centralized laboratory settings toward decentralized, accessible solutions that are versatile, customizable, and easily integrated into both clinical workflows and individual health management. This thesis presents the development, characterization, and validation of three impedance-based sensing platforms: a nanocytometer for label-free discrimination of subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and myeloblasts, a nanobiosensor for the detection of antigens and antibodies of SARS-CoV-2, and a flexible pH sensor for real-time monitoring of microphysiological systems (MPSs). First, the nanocytometer, based on interdigitated gold nanowires (Au NWs) placed in a microfluidic channel, discriminated between PBMCs subpopulations and myeloblasts according to their inherent dielectric properties, offering a prospective tool for hematological malignancy diagnosis. Next, the nanobiosensor, also using the Au NWs and a functionalization approach base on a selfassembled monolayer and EDC/NHS chemistry, enabled the detection of SARS-CoV-2 antigens and antibodies, with the addition of an on-chip calibration technique for semi-quantitative analysis. Finally, the flexible pH sensor, fabricated with a chemiresistive PEDOT:PSS film, provided continuous pH monitoring in MPS environments, demonstrating seamless integration into various in vitro cell culture platforms. These sensing platforms address some of the main limitations in biosensing, including miniaturization, sensitivity, and real-time analysis, and demonstrate the versatility of impedance-based technologies in diagnostics and in vitro monitoring. By bridging the fields of materials science, micro- and nanofabrication, and biology, this work contributes to the advancement of impedance-based sensing, promoting the development of more accessible, rapid, and reliable biomedical sensing solutions. The unique features of these technologies unlock new possibilities, not as standalone solutions but as integral components of a larger network of innovations. This combined approach promises to accelerate biomedical research, enhance diagnostic precision, and, ultimately, redefine the future of healthcare.:Acknowledgements i
Statement of authorship iii
Abstract v
Zusammenfassung vi
Acronyms xi
1 Introduction 1
1.1 Motivation and scope 4
1.2 Objectives 7
1.2.1 Accomplishments 7
2 Background 10
2.1 Fundamentals of impedance-based sensing: principles and techniques 10
2.1.1 Electrical impedance spectroscopy 12
2.1.2 Impedance flow cytometry 15
2.1.3 Impedance-based pH sensing 19
2.2 Applications of impedance-based sensing systems in diagnostics and in vitro biomedical platforms 21
2.2.1 Detection of biomolecules using impedance sensors 22
2.2.2 Impedance flow cytometry for single-cell analysis 23
2.2.3 Impedance-based sensors for pH monitoring in biomedical research 24
2.2.4 Impedance-based sensors monitoring microphysiological systems 25
2.3 Fabrication of impedance-based sensing systems for biomedical applications 26
2.3.1 Material selection 27
2.3.2 IDEs for impedance biosensing 27
2.3.3 Fabrication methods for IDEs 28
2.3.4 Functionalization strategies for impedance-based sensing and selectivity enhancement 29
2.3.5 Assembly and integration approaches 30
2.4 Challenges, limitations, and future directions in impedance-based biosensing technologies 31
3 Materials and methods 33
3.1 Materials and reagents 33
3.2 Substrate cleaning 34
3.3 Sensor fabrication 35
3.3.1 Nanocytometer 35
3.3.2 Nanobiosensor 38
3.3.3 Flexible pH sensor 38
3.4 Functional layer 39
3.4.1 Nanobiosensor functionalization 40
3.4.2 pH sensitive layer 41
3.5 Sensor characterization 42
3.5.1 Scanning electron microscopy 42
3.5.2 Optical miscrocopy 43
3.5.3 Electrical characterization 43
3.6 Experiments with the sensing platforms 45
3.6.1 Nanocytometer 45
3.6.2 Nanobiosensor 47
3.6.3 Flexible pH sensor 49
4 Nanocytometer for the detection of peripheral blood mononuclear cells and myeloblasts 51
4.1 Fabrication of the nanocytometer and measuring setup 52
4.2 Electrical characterization of the sensing system 55
4.3 Detection of cells in peripheral blood samples 56
4.3.1 Detection of lymphocytes and monocytes 57
4.3.2 Detection of myeloblasts 58
4.4 Detection of peripheral blood mononuclear cells in acute myeloid leukemia
patients 60
4.5 Detection of peripheral blood cells with different flow rates 62
5 Nanobiosensor for the detection of SARS-CoV-2 antigens and antibodies 64
5.1 Fabrication and operation principle of the nanobiosensor 66
5.2 Functionalization strategy for the detection of SARS-CoV-2 antigens and antibodies 68
5.2.1 Verification of the functionalization strategy with surface plasmon resonance 69
5.2.2 Functionalization of the Au NWs 70
5.3 Detection of SARS-CoV-2 antigens and antibodies in PBS 72
5.3.1 Capacitance analysis and impedance model fitting 73
5.4 Detection of SARS-CoV-2 antibodies in clinical samples 74
5.4.1 On-chip calibration and clinical sample testing of S1 antibodies 74
5.4.2 Estimation of antibody levels in clinical samples 76
5.5 Reproducibility of sensing response: intra-chip variability 79
6 Flexible pH sensors for the development of monitoring platforms for in vitro studies 83
6.1 Fabrication of flexible pH sensors 85
6.2 Characterization of pH sensor performance 86
6.2.1 Sensor response to pH variations 87
6.2.2 Solvent screening to obtain a pH sensitive layer 89
6.2.3 Real-time pH monitoring 91
6.3 Microphysiological system: PC3 spheroids in PEGDA gel beads 92
6.4 pH monitoring of microphysiological systems 93
6.4.1 pH monitoring in an inverted microscope incubation chamber 94
6.4.2 pH monitoring in a confocal microscope incubation chamber 96
6.4.3 pH monitoring in a standard cell incubator 97
6.5 Versatile integration of flexible sensors for in vitro studies 98
7 Conclusion and further work 100
7.1 Outlook 101
7.2 Concluding remarks 104
Bibliography 105
List of Figures 124
A Publication list 126
B Scientific conferences 127
C Annex 128In dieser Arbeit wird gezeigt, dass impedanzbasierte Sensoren zu anpassungsfähigen und schnell einsetzbaren biomedizinischen Werkzeugen weiterentwickelt werden können und hebt die Notwendigkeit des Überdenkens der Integration neuer Technologien in Gesundheitssysteme hervor. Die Zukunft der Diagnostik geht weg von zentralisierten Laboreinrichtungen und somit hin zu dezentralen, zugänglichen Lösungen, die vielseitig, anpassbar und nahtlos in klinische Arbeitsabläufe sowie in das individuelle Gesundheitsmanagement integriert werden können. Diese Dissertation präsentiert die Entwicklung, Charakterisierung und Validierung von drei impedanzbasierten Sensortechnologien: einem Nanocytometer zur markierungsfreien Unterscheidung von Subpopulationen peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs) und Myeloblasten, einem Nanobiosensor zur Detektion von SARS-CoV-2-Antigenen und -Antikörpern sowie einem flexiblen pH-Sensor zur Echtzeitüberwachung mikrophysiologischer Systeme (MPSs). Das Nanozytometer, basierend auf in einem mikrofluidischen Kanal eingebetteter interdigitalen Gold-Nanodrähten (Au NWs), ermöglichte die Unterscheidung zwischen PBMC-Subpopulationen und Myeloblasten aufgrund ihrer intrinsischen dielektrischen Eigenschaften und bietet damit ein potenzielles Instrument für die Diagnose hämatologischer Malignome. Der Nanobiosensor, der ebenfalls auf Au NWs basiert und eine funktionalisierte Oberfläche auf Grundlage einer selbstorganisierten Monoschicht (SAM) und EDC/NHS-Chemie nutzt, ermöglichte die Detektion von SARS-CoV-2-Antigenen und -Antikörpern, ergänzt durch eine neuartige On-Chip-Kalibrierungstechnik zur semiquantitativen Analyse. Der flexible pH-Sensor, hergestellt mit einer chemiresistiven PEDOT:PSS-Schicht, ermöglichte eine kontinuierliche pH-Überwachung in MPS-Umgebungen und zeigte eine nahtlose Integration in verschiedene In-vitro-Zellkultursysteme. Diese Sensortechnologien adressieren einige der zentralen Herausforderungen in der Biosensorik, darunter Miniaturisierung, Sensitivität und Echtzeitanalyse, und unterstreichen die Vielseitigkeit impedanzbasierter Methoden in der Diagnostik und in vitro-Überwachung. Durch die Verknüpfung der Fachgebiete Materialwissenschaften, Mikro- und Nanofabrikation sowie Biologie trägt diese Arbeit zur Weiterentwicklung der impedanzbasierten Biosensorik bei und fördert die Entwicklung zugänglicher, schneller und zuverlässiger biomedizinischer Sensorlösungen. Die einzigartigen Eigenschaften dieser Technologien eröffnen neue Möglichkeiten, nicht als eigenständige Lösungen, sondern als integrale Bestandteile eines größeren Innovationsnetzwerks. Dieser kombinierte Ansatz verspricht, die biomedizinische Forschung zu beschleunigen, die diagnostische Präzision zu erhöhen und letztlich die Zukunft der Gesundheitsversorgung neu zu definieren.:Acknowledgements i
Statement of authorship iii
Abstract v
Zusammenfassung vi
Acronyms xi
1 Introduction 1
1.1 Motivation and scope 4
1.2 Objectives 7
1.2.1 Accomplishments 7
2 Background 10
2.1 Fundamentals of impedance-based sensing: principles and techniques 10
2.1.1 Electrical impedance spectroscopy 12
2.1.2 Impedance flow cytometry 15
2.1.3 Impedance-based pH sensing 19
2.2 Applications of impedance-based sensing systems in diagnostics and in vitro biomedical platforms 21
2.2.1 Detection of biomolecules using impedance sensors 22
2.2.2 Impedance flow cytometry for single-cell analysis 23
2.2.3 Impedance-based sensors for pH monitoring in biomedical research 24
2.2.4 Impedance-based sensors monitoring microphysiological systems 25
2.3 Fabrication of impedance-based sensing systems for biomedical applications 26
2.3.1 Material selection 27
2.3.2 IDEs for impedance biosensing 27
2.3.3 Fabrication methods for IDEs 28
2.3.4 Functionalization strategies for impedance-based sensing and selectivity enhancement 29
2.3.5 Assembly and integration approaches 30
2.4 Challenges, limitations, and future directions in impedance-based biosensing technologies 31
3 Materials and methods 33
3.1 Materials and reagents 33
3.2 Substrate cleaning 34
3.3 Sensor fabrication 35
3.3.1 Nanocytometer 35
3.3.2 Nanobiosensor 38
3.3.3 Flexible pH sensor 38
3.4 Functional layer 39
3.4.1 Nanobiosensor functionalization 40
3.4.2 pH sensitive layer 41
3.5 Sensor characterization 42
3.5.1 Scanning electron microscopy 42
3.5.2 Optical miscrocopy 43
3.5.3 Electrical characterization 43
3.6 Experiments with the sensing platforms 45
3.6.1 Nanocytometer 45
3.6.2 Nanobiosensor 47
3.6.3 Flexible pH sensor 49
4 Nanocytometer for the detection of peripheral blood mononuclear cells and myeloblasts 51
4.1 Fabrication of the nanocytometer and measuring setup 52
4.2 Electrical characterization of the sensing system 55
4.3 Detection of cells in peripheral blood samples 56
4.3.1 Detection of lymphocytes and monocytes 57
4.3.2 Detection of myeloblasts 58
4.4 Detection of peripheral blood mononuclear cells in acute myeloid leukemia
patients 60
4.5 Detection of peripheral blood cells with different flow rates 62
5 Nanobiosensor for the detection of SARS-CoV-2 antigens and antibodies 64
5.1 Fabrication and operation principle of the nanobiosensor 66
5.2 Functionalization strategy for the detection of SARS-CoV-2 antigens and antibodies 68
5.2.1 Verification of the functionalization strategy with surface plasmon resonance 69
5.2.2 Functionalization of the Au NWs 70
5.3 Detection of SARS-CoV-2 antigens and antibodies in PBS 72
5.3.1 Capacitance analysis and impedance model fitting 73
5.4 Detection of SARS-CoV-2 antibodies in clinical samples 74
5.4.1 On-chip calibration and clinical sample testing of S1 antibodies 74
5.4.2 Estimation of antibody levels in clinical samples 76
5.5 Reproducibility of sensing response: intra-chip variability 79
6 Flexible pH sensors for the development of monitoring platforms for in vitro studies 83
6.1 Fabrication of flexible pH sensors 85
6.2 Characterization of pH sensor performance 86
6.2.1 Sensor response to pH variations 87
6.2.2 Solvent screening to obtain a pH sensitive layer 89
6.2.3 Real-time pH monitoring 91
6.3 Microphysiological system: PC3 spheroids in PEGDA gel beads 92
6.4 pH monitoring of microphysiological systems 93
6.4.1 pH monitoring in an inverted microscope incubation chamber 94
6.4.2 pH monitoring in a confocal microscope incubation chamber 96
6.4.3 pH monitoring in a standard cell incubator 97
6.5 Versatile integration of flexible sensors for in vitro studies 98
7 Conclusion and further work 100
7.1 Outlook 101
7.2 Concluding remarks 104
Bibliography 105
List of Figures 124
A Publication list 126
B Scientific conferences 127
C Annex 12
Two Studies in Fluid Mechanics: Advection-Enhanced Diffusion and Scale-Invariant Instability Bounds
No full textThe dissertation explores two distinct problems in fluid mechanics.
The first problem investigates the interaction between advection and diffusion in an active scalar problem, specifically the IPM equation with diffusion. We begin by demonstrating the presence of an advection-enhanced diffusion regime under certain symmetry assumptions on the initial data. To capture the intense competition between advection and diffusion, we develop an approximate model and discuss the existence of weak solutions to this model within a geometric framework.
The second study focuses on deriving robust uniform-in-regularization a-priori bounds for equations modeling instabilities in fluid mechanics. This approach provides optimal scaling laws and predictions of the macroscopic structure of turbulent flows
Virtual Collaborative Learning to Foster Digital Competences in Higher Education
No full textThe increasing digitalization of work and education has profoundly transformed the skills required for participation in professional and social life. In a world characterized by volatility, uncertainty, complexity, and ambiguity, higher education institutions are under growing pressure to prepare graduates not only with subject-specific knowledge but also with transversal competences, particularly digital competences that enable lifelong learning, collaboration, and adaptability. Responding to this challenge, this dissertation explores how higher education can design and implement didactical formats that effectively foster digital competences in students.
The central research question guiding this work is: How can a Virtual Collaborative Learning (VCL) arrangement be designed and implemented to foster the acquisition of digital competences in higher education?
To address this question, the dissertation integrates theoretical analysis, empirical research, and practical design into a coherent framework. It combines Design Science Research and Action Research into a merged methodological approach that connects scientific rigor with educational practice. This dual perspective allows the researcher to act simultaneously as a designer of innovative learning formats and as an observer and analyst of their implementation and impact.
The work proceeds in five main studies, each addressing a critical component of the research process.
Paper 1 analyses the current need for suitable learning formats to foster 21st-century skills. A large-scale student survey (n = 705) and quantitative data analysis reveal a clear mismatch between traditional teaching formats and the competences required in the digital labor market. The study introduces a “match matrix” that visualizes how Virtual Collaborative Learning aligns with these needs and identifies VCL as a promising format for 21st-century skill acquisition.
Paper 2 develops the theoretical foundation of VCL by synthesizing existing research through a systematic literature review, focus group discussions, and qualitative content analysis. This results in a refined and expanded definition of Virtual Collaborative Learning and a comprehensive fact sheet outlining its core design dimensions: realistic case studies, a suitable technical platform, professionalized pedagogical support, and learning analytics. The study also highlights emerging challenges and opportunities in implementing VCL and positions it as a learner-centered, problem-based approach for higher education.
Paper 3 investigates the assessment of learning outcomes in VCL environments. Based on a systematic literature review and focus group discussions, this paper identifies and categorizes assessment formats that align with the principles of constructive alignment, ensuring coherence between learning objectives, activities, and evaluation. The resulting table of suitable assessment methods serves as a practical reference for educators aiming to implement VCL.
Paper 4 focuses on didactical design patterns for VCL case studies. Using pattern mining and iterative development with students under the “students-as-partners” approach, the study defines six core design patterns—Objective, Context, Cover Story, Tasks, Artifacts, and Materials. These patterns enable educators to design authentic, competency-oriented case studies and have been made available as open educational resources (OER), including implementation examples, rubrics, and templates.
Paper 5 integrates the results of the previous studies into a holistic course design entitled “License for Digital Competence.” This course serves as the central artifact of the dissertation and embodies the principles derived from the earlier research. It was developed, implemented, and iteratively evaluated over several semesters at TU Dresden.
The course development followed a systematic, ten-step process corresponding to the phases of Design Science Research: knowledge base, design, testing relevance, redesign, and testing rigor. The process included defining learning goals aligned with the European Commission’s DigComp 2.2 framework, designing and piloting six authentic learning tasks, conducting pretests and focus group discussions, and implementing a mixed-methods evaluation approach.
Two surveys and qualitative analyses provide evidence of competence growth among participants. Survey 1 measured competence development over three time points—before, during, and after the course—using a Likert scale based on Salas-Velasco (2014). The results indicate an emerging network of competence enhancement, though statistical significance could not be established due to the limited sample size. Survey 2, a comprehensive post-course assessment covering all 21 competences of DigComp 2.2, suggests overall positive effects on students’ digital competence acquisition. Complementary focus group interviews, analyzed using Mayring’s qualitative content analysis, support and enrich these findings.
The outcomes of the License for Digital Competence demonstrate that Virtual Collaborative Learning is a viable and powerful format for developing digital and transversal competences. Students benefited from an experimental and safe learning environment, transparent assessment guidelines, and process-oriented feedback that emphasized growth over grading. They learned to collaborate, create digital artifacts, and reflect critically on their work, all within authentic, problem-based contexts.
For educators, the course provides structured support: detailed rubrics, open case study templates, and a guide for designing and assessing collaborative online learning. By offering these materials as open educational resources (OER), the dissertation contributes to broader dissemination and scalability within higher education.
Taken together, the five studies provide a systematic pathway from identifying a societal and educational need to designing, implementing, and evaluating an evidence-based solution. The dissertation thus bridges the gap between theory and practice and offers both scientific insights and concrete didactical tools.
The work contributes to ongoing discussions in digital education, competence-oriented learning, and higher education reform by demonstrating that educational innovation can be both theoretically grounded and empirically validated. The combined DSR–AR approach exemplifies how educators can act as reflective practitioners who generate new knowledge through iterative design and evaluation in their teaching practice.
While the empirical studies are limited by small sample sizes and the specific institutional context of TU Dresden, the conceptual and methodological outcomes offer a solid foundation for future research. Further studies could extend this work to other universities, educational systems, and learner groups, apply the framework on a larger scale, and explore the integration of artificial intelligence as tutorial support or for individualized learning pathways.
Ultimately, this dissertation shows that Virtual Collaborative Learning is more than a teaching method—it is a pedagogical framework that empowers students and educators alike. It creates a collaborative, reflective, and competence-oriented learning culture that embodies the principles of the so-called “Collaborative University.”
By systematically linking research and practice, this work contributes to the transformation of higher education toward a model that values collaboration, digital competence, and authentic learning as key pillars for the future of academic teaching.:Preface i
Acknowledgments iii
List of Abbreviations v
List of Figures vi
List of Tables vii
1 Introduction 1
1.1 Motivation and Research Gap . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Theoretical Background . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.3 Structure of the Synopsis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2 Research Design 9
2.1 Epistemological Position . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2 Overarching Research Framework . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.3 Research Objectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.4 Research Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3 Publications 17
3.1 21st-Century Skills in Higher Education – A Quantitative Analysis of Current
Challenges and Potentials at a University of Excellence . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.2 Design Dimensions of Virtual Collaborative Learning – Synthesizing Iterative
Research . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.3 Assessment Formats for Virtual Collaborative Learning . . . . . . . . . . . . . . 26
3.4 Didactical Design Patterns – Case Study Design for Virtual Collaborative Learn-
ing to Foster the Acquisition of Digital Competences . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.5 License For Digital Competence: Presentation and Evaluation of an Interdisci-
plinary Virtual Collaborative Learning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4 Contributions and Conclusion 37
4.1 Theoretical Contributions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2 Practical Contributions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.3 Limitations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.4 Further Research . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
Bibliography 43
Appendix 5
Jahresbericht der unabhängigen Messstelle ... / Staatliche Betriebsgesellschaft für Umwelt und Landwirtschaft, Freistaat Sachsen: Emissions- und Immissionsüberwachung sowie sanierungsbegleitende behördliche Kontrollmessungen für die Standorte der Wismut GmbH
No full text
