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Generational differences in language use and language attitudes in a Lombard-speaking family
No full textSince the unification of Italy in 1861, an increasing number of Italians have been giving up their heritage languages in favour of Italian monolingualism. One of the languages concerned is Lombard, an endangered Gallo-Italic language spoken in the Italian region of Lombardy and the Swiss canton of Ticino. This thesis discusses language ideology and intergenerational language transmission in one bilingual Lombard family. Semi-structured interviews with five speakers of three generations provide insight into the influence of their Italian-centered family language policy on language use among the generations. The study compares each generation’s attitudes towards Lombard and explores the factors involved in their language choice in different contexts, taking into account each speaker’s social and linguistic background as well as the potential influence of language policy and planning strategies employed by authorities and activists. Most participants have a positive attitude towards Lombard and consider it essential to their community and identity, but some differences have been identified. It is also notable that Lombard is not used less by each subsequent generation. While the results of this study cannot be generalised to all Lombard-speaking families, they can provide insight into the dynamics of the language shift and the influence of micro-level behavioural patterns and attitudes of one generation on the next generation’s speech practices.:1 Introduction
2 The Lombard language
2.1 Vitality
2.2 Language history and the term dialetto
2.3 Language policy
2.4 Language planning
2.4.1 Corpus planning
2.4.2 Status planning
2.4.3 Acquisition planning
3 Methodology
3.1 Language attitude research
3.2 Semi-structured interviews
3.3 Selection of questions
3.4 Participants
4 Interview results
4.1 Intergenerational transmission
4.2 Language use
4.2.1 Associations and stigmatisation
4.2.2 Writing in Lombard
4.3 Language or dialetto
4.3.1 Diatopic variation
4.3.2 Abstand and ausbau
4.4 Emotional attachment
4.4.1 Lombard identity
4.4.2 Promotion and preservation
4.4.3 Language loss
4.5 Summary: Attitudes
5 Conclusio
Klassenzugehörigkeit in Tunesien: Die urbanen Mittelklassen nach 2011.
No full textModerne Einkaufszentren werden mit Lefebvre als Materialisierung der kapitalistischen gesellschaftlichen Organisation verstanden und als Zugang zur sowie auch als Ausdruck und Ergebnis der Mittelklassenzugehörigkeit im urbanen Raum Tunesiens betrachtet. Mittels eines Mixed-Methods-Ansatz wird die Struktur der endogenen Mittelklassenzugehörigkeit sowie die politische und räumliche Vermittlung ihrer Identifikation beleuchtet und eine objektivierende Berechnung ausgehend von ihrer Kapitalausstattung, Sicherheitsempfinden und Verwundbarkeit durchgeführt. Diskursive und ressourcenbasierte Mittelklassen werden in fünf unterschiedlichen Regionen hinsichtlich ihrer Vorstellungen von Klassen-zugehörigkeit sowie ihrer Ängste, Gesellschaftsbilder und politischer Mobilisierung in zeitlicher Perspektive 2010/2011-2017 untersucht.:Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis III
Tabellenverzeichnis V
Kurzzusammenfassung VII
Abstract VII
Danksagung VIII
Formale Hinweise IX
1. Einleitung 1
2. Klassenzugehörigkeit in Tunesien 7
2.1 Klasse als Grundbegriff sozialer Ungleichheit 8
2.2 Mittelklassen: Konnotationen und Ansätze 16
2.3 Mittelklassendebatten in Tunesien 28
3. Klassen im urbanen Raum 39
3.1 Alltagspraxis als Zugehörigkeitsanalyse: von Bourdieu zu Lefebvre 40
3.2 Das Einkaufszentrum: Verräumlichte Praktiken des Alltäglichen 42
3.3 Forschungsdesign 54
4. Orte der Befragung 66
4.1 Regionen Tunesiens 68
4.2 Metropolregion Grand Tunis 74
4.3 Nordwestliche Peripherie: El Kef 76
4.4 Zentrale Küstenregion: Sfax 78
4.5 Peripherie im Landeszentrum: Sidi Bouzid 79
4.6 Südliche Küstenregion: Gabès 81
5. Klassenzugehörigkeit: Perspektiven der Mittelklassen 83
5.1 Unsicherheit als Merkmal der Nicht-Zugehörigkeit 83
5.2 Mittelklassenzugehörigkeit durch Absicherung über Familie und Bildung 92
5.3 Mittelklassenzugehörigkeit als gefühlte Normalität 95
5.4 Mittelklassenzugehörigkeit durch Anpassungsfähigkeit 98
5.5 Mittelklassezugehörigkeit trotz angefochtenen sozialen Status 100
5.6 Zwischenfazit: diskursive Mittelklassen 102
6. Quantitative Charakterisierung der diskursiven Mittelklassen 104
6.1 Verhaltenes Konsumverhalten 109
6.2 Soziale Herkunft und Bildung zur Selbstverortung 113
6.3 Diverse Arbeitswelten 120
6.4 Quantifizierung der Kapitalausstattung 123
6.5 Ansätze zur Quantifizierung der Mittelklassenzugehörigkeit 130
6.6 Zwischenfazit: Unsichere Mittelklassen 144
7. Einstellungen und Orientierungsmuster der Mittelklassen 147
7.1 Binnenstruktur der Unsicherheit 148
7.2. Zukunftsängste und Unzufriedenheit 155
7.3 Fehlendes Vertrauen 166
7.4 Gesellschaftsbilder zu Staat und Markt 170
7.5 Mobilisierungserfahrung und Mobilisierungsbereitschaft 179
8. Fazit 192
9. Literaturverzeichnis 198
Anlagen 227
Anlage A: Zusammenfassung 227
Anlage B: Fragebogen – (Französisch und Arabisch) 230Modern shopping centers are understood with Lefebvre as a materialization of capitalist social organization and are approached as an access to as well as an expression and product of middle class affiliation in Tunisian urban space. Using a mixed-methods approach, the structure of endogenous middle class belonging as well as the political and spatial mediation of their identification is explored and an objectification is undertaken based on their capital endowment, sense of security and vulnerability. Discursive and resource-based middle classes are investigated in five different regions in terms of their notions of class membership as well as their anxieties, social perceptions and political mobilization in a temporal perspective 2010/2011-2017.
:Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis III
Tabellenverzeichnis V
Kurzzusammenfassung VII
Abstract VII
Danksagung VIII
Formale Hinweise IX
1. Einleitung 1
2. Klassenzugehörigkeit in Tunesien 7
2.1 Klasse als Grundbegriff sozialer Ungleichheit 8
2.2 Mittelklassen: Konnotationen und Ansätze 16
2.3 Mittelklassendebatten in Tunesien 28
3. Klassen im urbanen Raum 39
3.1 Alltagspraxis als Zugehörigkeitsanalyse: von Bourdieu zu Lefebvre 40
3.2 Das Einkaufszentrum: Verräumlichte Praktiken des Alltäglichen 42
3.3 Forschungsdesign 54
4. Orte der Befragung 66
4.1 Regionen Tunesiens 68
4.2 Metropolregion Grand Tunis 74
4.3 Nordwestliche Peripherie: El Kef 76
4.4 Zentrale Küstenregion: Sfax 78
4.5 Peripherie im Landeszentrum: Sidi Bouzid 79
4.6 Südliche Küstenregion: Gabès 81
5. Klassenzugehörigkeit: Perspektiven der Mittelklassen 83
5.1 Unsicherheit als Merkmal der Nicht-Zugehörigkeit 83
5.2 Mittelklassenzugehörigkeit durch Absicherung über Familie und Bildung 92
5.3 Mittelklassenzugehörigkeit als gefühlte Normalität 95
5.4 Mittelklassenzugehörigkeit durch Anpassungsfähigkeit 98
5.5 Mittelklassezugehörigkeit trotz angefochtenen sozialen Status 100
5.6 Zwischenfazit: diskursive Mittelklassen 102
6. Quantitative Charakterisierung der diskursiven Mittelklassen 104
6.1 Verhaltenes Konsumverhalten 109
6.2 Soziale Herkunft und Bildung zur Selbstverortung 113
6.3 Diverse Arbeitswelten 120
6.4 Quantifizierung der Kapitalausstattung 123
6.5 Ansätze zur Quantifizierung der Mittelklassenzugehörigkeit 130
6.6 Zwischenfazit: Unsichere Mittelklassen 144
7. Einstellungen und Orientierungsmuster der Mittelklassen 147
7.1 Binnenstruktur der Unsicherheit 148
7.2. Zukunftsängste und Unzufriedenheit 155
7.3 Fehlendes Vertrauen 166
7.4 Gesellschaftsbilder zu Staat und Markt 170
7.5 Mobilisierungserfahrung und Mobilisierungsbereitschaft 179
8. Fazit 192
9. Literaturverzeichnis 198
Anlagen 227
Anlage A: Zusammenfassung 227
Anlage B: Fragebogen – (Französisch und Arabisch) 23
Musik von einem fremden Planeten?: Variationen über Struktur, Wahrnehmung und Bedeutung in der Musik des 20. und 21. Jahrhunderts
No full textThe relationship between musical structure, perception and musical meaning can be understood as a key to the development of a theory of post-tonal music. Preliminaries of this theory are developed in three “variations”. First, a review of the difficult relationship between music theory and new music in the 20th century is explained by (1) an increasingly diverse compositional practice that has lead to a composer-centred “theory”, often amounting to nothing more than a scantily contextualized documentation of a composer’s intentions and techniques, and (2) the universalist and dogmatic tendency of music-theoretical discourse around 1900 which, however, has since developed into an “epistemological pluralism” (Nicholas Cook). The Graz research project “organisation of sound”, initiated and headed by the author, pursues just such a pluralistic methodology by integrating author- and listener-perspectives on post-tonal music based on a morpho-syntactical conceptual framework with references to gestalt theory. This approach emerged not least from the observation that new music, especially after 1945, has increasingly been conceived of “morphologically” with a strong focus on music perception, as argued in the second variation. The idea that musical structure, perception and “worldliness” [Welthaltigkeit] are inseparable allowed composers to retain the idea of musical auto-referentiality while at the same time claiming the social-political impact of contemporary music. This is illustrated by a short discussion of the relationship between structural coherence and (political) meaning in works by Brian Ferneyhough, Helmut Lachenmann and Salvatore Sciarrino. The third variation discusses these questions in more detail through an examination of two recent works by Chaya Czernowin and Isabel Mundry. In Czernowin’s Excavated Dialogues – Fragments Western and Chinese instruments are organized in a culturally hybrid space saturated with conflict emerging from a highly gestural material; in Mundry’s Ich und Du solo piano and orchestra go through several stages of an ambiguous identity discourse informed by an essay of Japanese philosopher Kitarō Nishida. Antinomies between the composers’ self-interpretations and the morpho-syntactical analysis can be understood as results of a music-specific polyvalence that should inform any theory of post-tonal music
Patient-specific identification of genome-wide methylation and expression differences between patientmatched intracranial and extracranial melanoma metastasis pairs using Hidden Markov Models
No full textHintergrund
Die Behandlung intrakranieller Metastasen von Melanompatienten stellen, im Gegensatz zu extrakraniellen Metastasen, trotz neuester Therapiemethoden immer noch eine große klinische Herausforderung dar. Demzufolge ist die Bildung von intrakraniellen Hirnmetastasen für Melanompatienten meistens tödlich. Die Identifikation von molekularen Mechanismen, die für Therapieresistenz von intrakraniellen Metastasen verantwortlich sein könnten, ist deshalb von großer Bedeutung. Auf Basis dieser Erkenntnis könnten neue Therapieziele und –ansätze definiert werden.
Fragestellung/Hypothese
Um die Mechanismen der Therapieresistenz von intrakraniellen Melanommetastasen zu verstehen, ist es zunächst erforderlich, molekulare Unterschiede zu extrakraniellen Metastasen zu identifizieren. Diese Erkenntnisse könnten letztlich die Basis für die Entwicklung innovativer Therapieansätze bilden. Es wurde gezeigt, dass intra- und extrakranielle Melanommetastasen in höchstem Maße patientenspezifisch sind und deshalb eine Analyse der Daten als patientenspezifische Metastasenpaare von entscheidender Bedeutung ist. Die hier vorliegende Arbeit vergleicht intra- und extrakranielle Melanommetastasen auf einem voll personalisierten Niveau. Sie untersucht drei wissenschaftliche Fragestellungen (RQ): Methylierungs- (RQ1) und Expressionsunterschiede (RQ2) von intrakraniellen und extrakraniellen Metastasenpaaren, sowie die interessantesten gemeinsamen Ergebnisse von beiden omics-Schichten (RQ3).
Material und Methode
Im Rahmen dieser Arbeit konnten Daten von insgesamt 23 Patienten ausgewertet werden. Bei jedem dieser Patienten manifestierte sich mindestens eine extrakranielle und eine intrakranielle Metastase. Insgesamt standen so DNA Methylierungsdaten für 24 Metastasenpaare von 14 Patienten und Genexpressiondaten für 21 Metastasenpaare von 16 Patienten zu Verfügung. Diese Metastasenpaare wurden auf Änderungen in der DNA-Methylierung oder in der Genexpresssion mittels eines Hidden-Markov Models geprüft. Dieses Modell sagte für jeden Messwert in jedem Metastasenpaar den wahrscheinlichsten von drei Zuständen voraus. Die drei möglichen Zustände lassen sich wie folgt beschreiben: (i) erhöhte Methylierung/Expression in der intrakraniellen Metastase, (ii) erniedrigte Methylierung/Expression in der intrakraniellen Metastase, (iii) unveränderte Methylierung/Expression in der intrakraniellen Metastase im Vergleich zur extrakraniellen Metastase. Der individualisierte Ansatz eöoffnete die Möglichkeit, eine erste personalisierte Analyse von krebs- und immunrelevanten Signalwegen in Melanom- Metastasenpaaren durchzuführen. Des Weiteren konnten Genkandidaten identifiziert werden, die eine differenziell erhöhte oder erniedrigte Methylierung/Expression in mehreren Patienten aufweisen. Diese könnten als potenzielle Therapieziele in weiteren experimentellen Studien validiert werden. Da die genaue Interaktion zwischen DNA-Methylierung aller genetischen Regionen und Genexpression noch nicht gänzlich erforscht ist, wurden beide Ebenen zuerst unabhängig voneinander analysiert. Die Ergebnisse der einzelnen Analysen wurden dann gemeinsam in dieser Arbeit diskutiert.
Ergebnisse
Die Analyse der DNA-Methylierungs- und Genexpressionsdaten mittels hierarchischem Clustering ergab, dass die Metastasendaten eine hohe Patientenabhängigkeit aufweisen, was darauf hinweist, dass die individuellen Eigenschaften der Patienten einen entscheidenden Einfluss auf die Daten haben. Daher wurden sie mittels eines Hidden-Markov Modells personalisiert analysiert. Trotz den Herausforderungen bei der direkten Verknüpfung von DNAMethylierung mit Genexpression zeigten unabhängige Analysen beider Ebenen vergleichbare Resultate. Auf beiden Ebenen konnten signifikante Veränderungen in den gleichen Signalwegen identifiziert werden. Dazu zählen der Zytokin-Rezeptor-Interaktionssignalweg, der Extrazellulärer-Matrix-Interaktionssignalweg, der PI3K/Akt-Signalweg sowie der Calcium-Signalweg. Des Weiteren wiesen beide Ebenen signifikante Veränderungen in Genen auf, die mit einem Hirn-assoziierten Phänotyp assoziiert sind. Andere Ergebnisse wurden allerdings lediglich auf einer der beiden Ebenen identifiziert. So ließ sich beispielsweise ein klarer Trend zu einer erniedrigten Methylierung in intrakraniellen Metastasen beobachten. Auf Genexpressionsebene konnte festgestellt werden, dass Gene mit erniedrigter Expression in ihrer Funktion häufig mit der Immunantwort assoziiert werden. Beide Analyseebenen bieten schließlich eine Liste von Kandidatengenen, die eine signifikante Veränderung der Methylierung oder Genexpression in mehreren Patienten zeigten. Diese Gene wurden zusätzlich mit ihrer Expression (für Gene mit differentieller Methylierung) und weiteren unabhängigen Studien validiert und bilden daher eine Grundlage für weitere experimentelle Studien.
Schlussfolgerungen
Das Ziel dieser Arbeit war die personalisierte Identifikation von molekularen Veränderungen zwischen behandelbaren extrakraniellen und intrakraniellen Melanommetastasen. Die Analyse wurde auf Basis zweier unterschiedlicher molekularer Ebenen, der DNA-Methylierung und Genexpression, unter Zuhilfenahme eines Hidden-Markov-Modells durchgeführt. Dieses Modell ermöglicht eine personalisierte Analyse, die trotz einer relativ kleinen Kohorte verlässliche Resultate liefern kann. Insbesondere die Ergebnisse, die in beiden molekularen Ebenen zu finden waren, sind sehr vielversprechend. Beispielsweise ist die Identifikation eines Hirnassoziierten Phänotyps in intrakraniellen Metastasen in beiden Ebenen zu finden. Außerdem bilden die identifizierten Signalwege und Kandidatengene eine vielversprechende Grundlage für weitere experimentelle Validierungen. Allerdings wurde diese Studie anhand von Bulk-Sequenzierungen an einer kleinen Patientenkohorte ausgeführt, weshalb die Ergebnisse im Weiteren noch auf Einzelzell-Ebene untersucht werden sollten. Nichtsdestotrotz tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zu einer verbesserten Charakterisierung und zum Verständnis veränderter molekularer Mechanismen zwischen intrakraniellen und extrakraniellen Melanommetastasen bei.:1 Introduction
1.1 Biological background
1.1.1 From genotype to phenotype
1.1.2 Gene expression
1.1.3 DNA methylation
1.1.4 Interaction between DNA methylation and gene expression
1.2 Melanoma
1.2.1 Development of melanoma
1.2.2 Melanoma metastases
1.2.3 Melanoma brain metastases (MBM)
1.3 State of the art
1.3.1 Melanoma brain metastases research
1.3.2 Hidden Markov Model
1.4 Available data
1.5 Open Research Question
2 Structure of the thesis
3 Publications
3.1 Methylation data analysis
3.1.1 Positioning of the paper
3.1.2 Contribution of the author
3.1.3 Original publication
3.1.4 Additional remarks to the study
3.1.5 Presentations at workshops and conferences
3.2 Expression data analysis
3.2.1 Positioning of the paper
3.2.2 Contribution of the author
3.2.3 Original publication
3.2.4 Presentations at workshops and conferences
4 Discussion
5 Bibliography
6 Appendix
6.1 Figure usage
6.2 AttachementsBackground
Despite the development of novel therapeutic interventions for melanoma metastases, intracranial metastases remain a major clinical challenge in comparison to extracranial metastases. Unfortunately, intracranial melanoma metastases are a common final stage for melanoma patients. Therefore, the identification of molecular mechanisms that may be responsible for treatment resistance of intracranial metastases is of great relevance in order to identify new potential therapeutic targets.
Research question
Identifying molecular differences between extracranial and intracranial melanoma metastases is an important step towards understanding of molecular mechanisms responsible for treatment-resistance of intracranial metastases. Samples from melanoma metastases have been shown to be highly patient-specific. It is therefore important to analyze pairs of intracranial and extracranial metastases from the same patient using paired data. This work provides the first fully personalized analysis of patient-matched melanoma metastases and predicts molecular differences on a patient-specific level. It identifies DNA methylation (RQ1) and gene expression (RQ2) differences of patient-matched metastasis pairs and presents the most interesting joint findings of both omics layers (RQ3).
Material and methods
A total of 23 patients which all developed extracranial and intracranial melanoma metastases were available for this work. DNA methylation data was measured for 24 patient-matched metastasis pairs of 14 patients and gene expression data was measured for 21 patient-matched metastasis pairs of 16 patients. All of the available metastasis pairs were analyzed for DNA methylation and gene expression changes in a personalized way using a Hidden Markov Model. This model predicted the most probable methylation or expression state for each individual CpG or gene in each metastasis pair taking either one of three states: (i) increased methylation/expression in intracranial metastases, (ii) decreased methylation/expression in intracranial metastases or (iii) unchanged methylation/expression in intracranial compared to extracranial metastases. This individualized analysis allowed the first personalized analysis of enrichment in different cancer- or immune-relevant pathways in each individual metastasis pair. In addition to the personalized enrichment, gene candidates that share increased or decreased methylation/expression in multiple patients provide good candidates for potential therapeutic targets and can be validated in further experimental studies. Since the interplay between DNA methylation and gene expression on gene-level is not fully understood for all regions within a gene, both analyses were performed separately from each other and results of the individual analyses are combined and discussed jointly in this thesis.
Results
Hierarchical clustering of DNA methylation and gene expression data revealed that metastatic samples are highly patient-specific. Therefore, the available data was analyzed on an individual level using a Hidden Markov Model. Despite the challenge of combining both omics layers on a gene-level, results of both studies showed agreement in multiple observations, including some shared results across both omics layers. In terms of cancer-relevant pathways, both omics layers revealed four shared pathways that are frequently significantly enriched in differential methylation and expression. These are the cytokine-cytokine receptor interaction pathway, the extracellular-matrix interaction pathway, the PI3K/Akt signaling pathway and the calcium signaling pathway. In addition to that, both omics layers showed differentially methylated for expressed genes to be involved in a brain-like phenotype. This brain-like phenotype was observed in both increased and decreased methylated genes and in increased expressed genes. Contrary, some results are only detectable on one of both omics layers: there was a clear trend towards decreased methylation in intracranial metastases, and analysis on expression level revealed that genes with lower expression in intracranial metastasis are frequently involved in immune response suggesting an immunosuppression of intracranial metastases. Finally, both studies provided a candidate gene set with differentially methylated/expressed genes. Candidate genes from the DNA methylation study were further explored using expression data of shared patients, while candidate genes from expression study were validated based on multiple closely related studies.
Discussion
The objective of the studies presented in this thesis was to identify molecular alterations between treatable extracranial and treatment-resistant intracranial melanoma metastases at two different omics layers. The analysis of patient-matched metastasis pairs using a Hidden Markov Model made it possible to identify these alterations on a fully personalized level despite having a small sample cohort. Particularly promising are findings that were detectable at both omics layers. These shared findings include a brain-like phenotype of intracranial metastases. Additionally, shared cancer-relevant pathways and candidate genes derived from both omics layers provide a good basis for further experimental validation at the protein level. However, all results from this thesis were based on bulk-sequencing of a small sample size and should ideally be further investigated using single-cell sequencing data. Nonetheless, the results of this thesis contribute to a better characterization and understanding of mechanisms that distinguish intracranial from extracranial melanoma metastases.:1 Introduction
1.1 Biological background
1.1.1 From genotype to phenotype
1.1.2 Gene expression
1.1.3 DNA methylation
1.1.4 Interaction between DNA methylation and gene expression
1.2 Melanoma
1.2.1 Development of melanoma
1.2.2 Melanoma metastases
1.2.3 Melanoma brain metastases (MBM)
1.3 State of the art
1.3.1 Melanoma brain metastases research
1.3.2 Hidden Markov Model
1.4 Available data
1.5 Open Research Question
2 Structure of the thesis
3 Publications
3.1 Methylation data analysis
3.1.1 Positioning of the paper
3.1.2 Contribution of the author
3.1.3 Original publication
3.1.4 Additional remarks to the study
3.1.5 Presentations at workshops and conferences
3.2 Expression data analysis
3.2.1 Positioning of the paper
3.2.2 Contribution of the author
3.2.3 Original publication
3.2.4 Presentations at workshops and conferences
4 Discussion
5 Bibliography
6 Appendix
6.1 Figure usage
6.2 Attachement
Der Zusammenhang zwischen der olfaktorischen Funktion und atopischen Erkrankungen sowie der Lebensqualität im Kindes- und Jugendalter
No full textHintergrund: Atopische Erkrankungen wie die allergische Rhinitis und die atopische Dermatitis sind in der pädiatrischen Bevölkerung weit verbreitet und haben große Auswirkungen auf betroffene Kinder und Jugendliche. Insbesondere bei der allergischen Rhinitis konnten bereits negative Auswirkungen auf das olfaktorische System festgestellt werden, für die atopische Dermatitis fehlen dazu bislang Studien. Desweiteren kann eine eingeschränkte olfaktorische Funktion eine verminderte Lebensqualität zur Folge haben.
Fragestellung: Ziel dieser Studie war es, den Einfluss der allergischen Rhinitis und der atopischen Dermatitis im Kindes- und Jugendalter auf die olfaktorische Funktion zu untersuchen, mit gesunden Kindern und Jugendlichen zu vergleichen und den Einfluss der olfaktorischen Funktion auf die Lebensqualität zu beurteilen.
Material und Methoden: Insgesamt wurden die Daten von 149 Kindern und Jugendlichen im Alter von sechs bis 17 Jahren, die am Universitätsklinikum Carl Gustav Carus in Dresden getestet wurden, in dieser Studie ausgewertet. Neben der Erfassung von allgemeinen anamnestischen Daten wurden sowohl in der Kontrollgruppe (n = 49) als auch in den beiden Erkrankungsgruppen (jeweils n = 50) ein Pricktest sowie eine olfaktorische Testung für die Geruchsschwelle („Sniffin‘ Sticks“) und Geruchsidentifikation („U-Sniff“) durchgeführt. Zudem wurde jeweils ein Fragebogen zur Bedeutung von Geruchsinformationen (Children’s Personal Significance of Olfaction, ChiPSO) und zur Lebensqualität (Inventar zur Erfassung der Lebensqualität bei Kindern und Jugendlichen, ILK) angewandt. Bei den beiden Erkrankungsgruppen wurden zusätzlich noch krankheitsspezifische Fragebögen und Scores ermittelt, wobei bei Vorliegen einer allergischen Rhinitis die ARIA-Kriterien und der T4SS (Total Four Symptom Score) erhoben wurden und bei einer atopischen Dermatitis der SCORAD (Scoring of Atopic Dermatitis) herangezogen wurde.
Ergebnisse: Mädchen erzielten bessere Ergebnisse in der Geruchsidentifikationstestung als Jungen und es zeigte sich eine positive Korrelation des Alters zu den Ergebnissen der Geruchsidentifikationstestung. Bezüglich anamnestischer Parameter konnte lediglich festgestellt werden, dass sich die olfaktorische Testung bei Angabe einer spezifischen Immuntherapie statistisch signifikant von den Ergebnissen ohne diese Therapie abhob. Infektionen mit SARS-CoV-2, Vorerkrankungen, eingenommene Medikationen, Voroperationen im HNO-Bereich, sowie die Sensibilisierungen im Pricktest ergaben dementsprechend keine statistisch signifikanten Korrelationen zu den beiden olfaktorischen Tests. Von den krankheitsspezifischen Scores und Schweregraden in den Erkrankungsgruppen zeigten lediglich die Ergebnisse des T4SS bei Kindern und Jugendlichen mit allergischer Rhinitis eine negative Korrelation zur Geruchsidentifikationstestung.
Kinder und Jugendliche mit einer allergischen Rhinitis oder einer atopischen Dermatitis schnitten in der Geruchsidentifikationstestung statistisch signifikant schlechter ab als Testpersonen der Kontrollgruppe, nicht jedoch in der Geruchsschwellentestung.
Kinder und Jugendliche mit atopischer Dermatitis erreichten statistisch signifikant weniger Punkte bei der Bedeutung der Geruchsinformation als die Kontrollgruppe. Gleiches zeigte sich bei beiden Erkrankungsgruppen für die Untergruppe Soziales. Bei der Bedeutung der Geruchsinformation korrelierte der Gesamtwert mit der Geruchsidentifikationstestung, die Untergruppe Soziales mit beiden olfaktorischen Tests und die Untergruppe Umwelt ebenfalls mit der Geruchsidentifikationstestung.
Die Lebensqualität zeigte sich unbeeinflusst von der olfaktorischen Funktion. Eine Korrelation ergab sich hingegen teilweise zwischen der Bedeutung von Geruchsinformationen und Ergebnissen des Fragebogens zur Lebensqualität.
Schlussfolgerung: Sowohl die allergische Rhinitis als auch die atopische Dermatitis schienen einen negativen Einfluss auf Teile der olfaktorischen Testung, insbesondere der Geruchsidentifikationstestung zu haben. Ein Zusammenhang zwischen der olfaktorischen Funktion und der Lebensqualität zeigte sich nicht. Um insbesondere die olfaktorische Funktion bei der atopischen Dermatitis besser zu verstehen, sollten weitere Studien in diesem Gebiet durchgeführt werden.Background: Allergic rhinitis and atopic dermatitis are common diseases in the pediatric population and play a huge role in the life of children and adolescents. For allergic rhinitis, there are studies which show a negative influence of the disease on the olfactory function, but comparable studies have not yet been performed for atopic dermatitis. Furthermore, a deficient olfactory function can lead to an impaired quality of life.
Aim: The aim of this study was to examine the influence of allergic rhinitis and atopic dermatitis on the olfactory function of children and adolescents and in comparison to a healthy control group. Additionally, the influence of the olfactory function on the quality of life was analyzed.
Material and methods: 149 children and adolescents aged 6 to 17 years were included in the analysis and therefore assessed at Carl Gustav Carus University Hospital in Dresden. Besides common anamnestic data, both for the control group (n = 49) and the two disease groups (n = 50 each), a skin prick test and two olfactory assessments for olfactory threshold (“Sniffin’ Sticks”) and odor identification (“U-Sniff”) were applied, as well as questionnaires about the significance of olfaction (Children’s Personal Significance of Olfaction, ChiPSO) and the quality of life (Inventar zur Erfassung der Lebensqualität bei Kindern und Jugendlichen, ILK). Additionally, in both disease groups disease severity was measured with suitable scoring systems. Therefore, the ARIA-Classification and Total Four Symptom Score (T4SS) were used for allergic rhinitis, Scoring of Atopic Dermatitis (SCORAD) for atopic dermatitis.
Results: Girls scored lower in odor identification and there was a positive correlation between age and results of odor identification. Regarding anamnestic data, only specific immunotherapy resulted in better olfactory scores, olfactory threshold and odor identification both. Infections with SARS-CoV-2, previous illnesses, medications taken, previous ENT surgeries, and sensitizations in the skin prick test did not show any statistically significant correlations with the two olfactory tests. Compared to healthy children and adolescents, those with allergic rhinitis and atopic dermatitis scored lower in odor identification, but not in olfactory threshold. Only for the T4SS, a negative correlation to odor identification scores could be detected, and other disease severity scores did not show correlation towards olfactory function.
Children and adolescents with atopic dermatitis scored lower results regarding personal significance of olfaction as the control group. Same results showed up for both disease groups in the social subscale of the ChiPSO questionnaire. For personal significance of olfaction there was a correlation between the overall score and odor identification, between the social subscale and both olfactory assessments as well between the environmental subscale and odor identification.
Olfactory function did not correlate with the quality of life. However, parts of the ChiPSO questionnaire showed a correlation with the results of the ILK questionnaire.
Conclusion: Allergic rhinitis and atopic dermatitis both seem to have a negative influence on olfactory function, especially on odor identification. No correlation was found between olfactory function and the quality of life. Further studies should follow up these findings about atopic dermatitis and the olfactory function in children and adolescents with this disease
Designer recombinase-mediated reactivation of fetal hemoglobin for the treatment of ß-hemoglobinopathies
No full textHemoglobinopathies are among the most common inherited monogenic disorders worldwide, with sickle cell disease (SCD) and ß-thalassemia (ß-thal) resulting from mutations in the ß-globin gene. These mutations impair or prevent ß-globin production, leading to severe clinical outcomes. Although allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is curative, it is limited by low donor availability and the risk of immunological complications. Genetically modified autologous HSCT is an emerging alternative, with reactivation of fetal hemoglobin (HbF) being a major therapeutic strategy. Persistent HbF expression, as seen in hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH), mitigates disease severity, making it an attractive target for genome editing.
Site-specific recombinases (SSRs) offer a double-strand break-free genome editing platform with high specificity and predictable outcomes between a pair of defined target sites, as they re-ligate DNA independently of host repair pathways. However, engineering SSRs to recognize new genomic targets is technically challenging. To overcome this, directed evolution approaches have been employed to generate recombinases with altered DNA specificity.
In this thesis, I present the successful development of a novel dual recombinase system targeting the BCL11A locus, a key repressor of gamma-globin (HBG) expression. Using substrate-linked directed evolution (SLiDE) in E. coli, I evolved a modular AA-BB heterodimeric recombinase system to recognize loxBCL11A target sites. High-throughput deep-sequencing-based screening identified variants with strong on-target activity. When transiently delivered as mRNA, these recombinases demonstrated activity in HeLa reporter cells, albeit with reduced efficiency compared to E. coli-based assays and a progressive decline in the proportion of edited cells over time.
To enhance functionality, two strategies were explored: fusion with zinc finger DNA-binding domains (ZFDs) and counter-selection-based evolution against known off-target sequences. While ZFD fusion did not enhance performance, counter-selection approach yielded improved recombinases including variant 229, which achieved approximately 70% editing efficiency in HeLa reporter cells. Importantly, it also mediated precise and seamless excision of the ~11.4 kb fragment at the endogenous BCL11A locus.
Variant 229 was further validated in the HUDEP-2 human erythroid progenitor cell line, demonstrating approximately 40% editing efficiency in reporter assays. During erythroid differentiation of wild-type HUDEP-2 cells, variant 229 enabled precise editing at the endogenous BCL11A locus, leading to BCL11A downregulation and robust HBG upregulation at the transcript level and a milder effect at the protein level. Bulk RNA-sequencing of recombinase treated HUDEP-2 cells revealed widespread transcriptional changes, including immune activation and membrane-associated stress responses, indicating cytotoxic effects. Furthermore, specificity profiling of variant 229, using a library of over 6000 computationally predicted human genomic off-target sites in a plasmid-based bacterial assay, showed high fidelity: approximately 97% of sites exhibited little to no recombination. However, a small subset showed higher activity than the intended target, often containing AT-rich motifs with high sequence similarity to the on-target site.
These findings highlight both the therapeutic potential and safety challenges associated with designer recombinases. In this thesis, I present a novel, modular dual-recombinase system capable of mediating precise deletion at the endogenous BCL11A locus, resulting in a therapeutically relevant functional response. Despite this progress, limitations remain, including suboptimal target selection, potential for off-target activity, and cytotoxicity. Overcoming these challenges will require refined evolution strategies in eukaryotic systems, unbiased off-target profiling, and computationally guided protein engineering. Overall, this work establishes SSRs as precise and adaptable genome editing tools and provides a strong foundation for advancing designer recombinase-based gene therapy strategies for the treatment of ß-hemoglobinopathies.:TABLE OF CONTENTS 1
ABBREVIATIONS 5
LIST OF FIGURES 8
LIST OF TABLES 9
1. INTRODUCTION 10
1.1 ß-hemoglobinopathies 10
1.1.1 Description and global prevalence 10
1.1.2 Molecular basis and pathophysiology 11
1.1.3 Treatment options 12
1.1.3.1 Symptomatic management 13
1.1.3.2 Curative therapies 14
1.2 Control of globin gene expression: basis for development of gene therapies 16
1.3 The protective contribution of fetal hemoglobin 17
1.4 BCL11A - an important HbF repressor 18
1.5 Therapeutic genome modifications for ß-hemoglobinopathies 19
1.5.1 Lentivirus-based transgene integration 19
1.5.2 Targeted genome editing approaches 21
1.6 Genetic engineering with tyrosine site-specific recombinases 25
1.6.1 Mechanism of the Cre/loxP recombination system 25
1.7 Tyrosine site-specific recombinases as genome editing tools for therapy 27
1.7.1 Principles of directed molecular evolution 28
1.7.2 Directed evolution of tyrosine site-specific recombinases 29
1.7.3 Therapeutic application of designer recombinases 30
2. AIM OF THE THESIS 32
3. MATERIALS AND METHODS 34
3.1 Target site identification and off-target prediction 34
3.2 Molecular cloning methods 34
3.2.1 DNA isolation and purification 35
3.2.2 Polymerase chain reaction (PCR) 35
3.2.3 Restriction enzyme digestion 36
3.2.4 DNA gel electrophoresis 36
3.2.5 Ligation 37
3.2.6 Preparation of electrocompetent E. coli cells 37
3.2.7 E. coli transformation 37
3.2.8 Sanger sequencing 38
3.3 Plasmid construction 38
3.3.1 pEVO plasmids 38
3.3.2 Mammalian expression plasmids 38
3.3.3 Mammalian reporter plasmids 39
3.4 SLiDE-based evolution of designer recombinases 39
3.5 DNA shuffling for recombinase library diversification 40
3.6 Deep-sequencing-based high-throughput screening using DEQSeq 41
3.6.1 Unique molecular identifier (UMI) preparation 41
3.6.2 Barcoding of recombinase library 42
3.6.3 Nanopore sequencing and data analysis 42
3.6.4 Validation of selected recombinase variants 43
3.7 mRNA synthesis using in vitro transcription (IVT) 43
3.8 Cell culture 44
3.8.1 Cell culture maintenance 44
3.8.2 HUDEP-2 cell line differentiation 44
3.8.3 Lentivirus production 45
3.8.4 Generation of reporter cell lines 45
3.8.5 mRNA transfection 46
3.8.6 mRNA electroporation 46
3.8.7 Flow cytometry 47
3.9 PCR-based detection of genomic excision 47
3.9.1 Excision on the integrated reporter cassette 48
3.9.2 Excision on the endogenous BCL11A locus 48
3.10 Reverse Transcription - quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) 48
3.11 Biochemistry 49
3.11.1 SDS-PAGE 49
3.11.2 Western blotting 50
3.12 Endogenous zinc finger domain generation and cloning 50
3.13 RNA sequencing and analysis 51
3.14 Off-target profiling of recombinase variant 229 51
3.14.1 Target site library construction 51
3.14.2 Cloning and preparation for deep sequencing 52
3.14.3 Data analysis 54
4. RESULTS 55
4.1 Recombinase-mediated excision on asymmetric target sites 55
4.1.1 Target site identification for recombinase-mediated knockout of BCL11A 55
4.1.2 Substrate-linked directed evolution of a recombinase heterodimer 58
4.1.3 Substrate-linked directed evolution of a recombinase heterotetramer 61
4.2 Deep-sequencing-based high-throughput screening of heterodimer library 64
4.3 Activity evaluation of heterodimer recombinase variants in human cells 67
4.3.1 Potential causes of recombinase-induced toxicity in mammalian cells 71
4.4 Zinc finger domain-recombinase fusions to increase on-target specificity 73
4.4.1 Evaluation of ZFD-recombinase fusions in bacterial cells 75
4.4.2 Evaluation of ZFD-recombinase fusions in mammalian cells 76
4.5 Counter-selection based directed evolution 79
4.6 Evaluation of counter-selected variants in HeLa reporter cell line 82
4.6.1 Characterization of recombinase variant 229 83
4.7 The HUDEP-2 cell line: a valuable tool in ß-hemoglobinopathy gene therapy development 86
4.7.1 Evaluation of designer recombinase performance in HUDEP-2 reporter cell line 86
4.7.2 Characterization of recombinase variant 229 88
4.8 Functional evaluation of designer recombinase 229 in HUDEP-2 WT cells 91
4.9 Transcriptional profiling of recombinase treated HUDEP-2 WT cells 94
4.10 Off-target profiling of designer recombinase variant 229 97
5. DISCUSSION 100
5.1 Overview of the work 100
5.2 Interpretation of key findings 101
5.2.1 Directed evolution of heteromeric designer recombinases 101
5.2.2 Screening and validation of evolved variants 102
5.2.3 Optimization of recombinase properties 104
5.2.4 Functional evaluation of recombinase-mediated genome editing 107
5.3 Limitations and challenges of the study 109
5.4 Conclusion and outlook 112
5.4.1 Current landscape and future directions 112
5.4.2 Future of gene therapy 114
6. SUMMARY 116
7. ZUSAMMENFASSUNG 118
8. SUPPLEMENTARY INFORMATION 120
8.1 Supplementary figures 120
8.2 Supplementary tables 133
9. REFERENCES 141
10. ACKNOWLEDGMENTS 160
Anlage 1 162
Anlage 2 164Hämoglobinopathien gehören weltweit zu den häufigsten monogenen Erbkrankheiten. Die Sichelzellkrankheit (SCD) und die ß-Thalassämie (ß-thal) entstehen durch Mutationen im ß-Globin-Gen. Diese Mutationen beeinträchtigen oder verhindern die Produktion von ß-Globin, was zu schweren klinischen Folgen führt. Obwohl die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSZT) heilend wirken kann, ist sie durch die geringe Verfügbarkeit von Spendern und das Risiko immunologischer Komplikationen limitiert. Genetisch modifizierte autologe HSZT stellen eine neue Alternative dar, wobei insbesondere die Reaktivierung von fetalem Hämoglobin (HbF) im therapeutsichen Fokus steht. Die anhaltende Expression von HbF, wie sie bei der hereditären Persistenz fetalen Hämoglobins (HPFH) zu beobachten ist, mildert den Schweregrad der Erkrankung und macht HbF damit zu einem attraktiven Ziel für Genome-Editierungen.
Ortsspezifische Rekombinasen (SSRs) bieten eine doppelstrangbruchfreie Genom-Editierungsplattform mit hoher Spezifität und vorhersehbaren Ergebnissen zwischen zwei definierten Zielorten, da sie die DNA unabhängig von Reparaturwegen der Zelle neu ligieren. Die Entwicklung von SSRs zur Erkennung neuer genomischer Ziele ist jedoch eine technische Herausforderung. Um dies zu überwinden, wurden Ansätze der gerichteten Evolution eingesetzt, um Rekombinasen mit veränderter DNA-Spezifität zu erzeugen.
In dieser Arbeit berichte ich über die Entwicklung eines neuartigen dualen Rekombinasesystems, das auf den BCL11A-Lokus abzielt, einen wichtigen Repressor der gamma-Globin (HBG)-Expression. Unter Verwendung von substratgebundener gerichteter Evolution (SLiDE) in E. coli wurde das modulare AA-BB heterodimere Rekombinasesystem entwickelt, um die loxBCL11A-Zielstellen zu rekombinieren. Durch ein Deep-Sequencing-Screening mit hohem Durchsatz in E. coli wurden Varianten mit starker On-Target-Aktivität identifiziert. Bei transienter Verabreichung als mRNA zeigten ausgewählte Rekombinasen Aktivität in HeLa-Reporterzellen, allerdings mit reduzierter Effizienz im Vergleich zu auf E. coli basierenden Tests und einem fortschreitenden Rückgang des Anteils der editierten Zellen im Laufe der Zeit.
Zur Verbesserung der Funktionalität wurden zwei Strategien verfolgt: die Fusion mit Zinkfinger-DNA-Bindungsdomänen (ZFDs) und die auf Gegenselektion basierende Evolution gegen bekannte Off-Target-Sequenzen. Während die ZFD-Fusion nicht die erhofften Ergebnisse brachte, resultierten aus der Gegenselektion die Identifikation verbesserter Rekombinasen, darunter die Variante 229, die in HeLa-Reporterzellen eine Editierungseffizienz von etwa 70% erreichte und darüber hinaus die präzise und nahtlose Exzision des etwa 11.4 kb großen Fragments am endogenen BCL11A-Lokus ermöglichte.
Die Variante 229 wurde in der menschlichen erythroiden Vorläuferzelllinie HUDEP-2 weiter validiert und zeigte in Reporter-Assays eine Editierungseffizienz von etwa 40%. Während der erythroiden Differenzierung von Wildtyp-HUDEP-2-Zellen ermöglichte die Variante 229 eine präzise Editierung am endogenen BCL11A-Lokus, was zu einer Herunterregulierung von BCL11A und einer robusten Hochregulation von HBG auf der Transkriptionsebene sowie zu einem milderen Effekt auf der Proteinebene führte. Die Bulk-RNA-Sequenzierung rekombinasebehandelter HUDEP-2-Zellen ergab weitreichende transkriptionelle Veränderungen, einschließlich Immunaktivierung und membranassoziierter Stressreaktionen, was auf zytotoxische Wirkungen hindeutet. Darüber hinaus zeigte das Spezifitätsprofils der Variante 229 unter Verwendung einer Bibliothek von über 6000 rechnerisch vorhergesagten genomischen Off-Target-Stellen in einem plasmidbasierten Bakteriensystem eine hohe Präzision: Etwa 97% der Off-Target-Stellen wiesen nur eine geringe bis keine Rekombination auf. Eine kleine Untergruppe zeigte jedoch sogar eine höhere Aktivität im Vergleich zur Zielstelle und enthielt häufig AT-reiche Motive mit hoher Sequenzähnlichkeit zur Zielstelle.
Diese Ergebnisse unterstreichen sowohl das therapeutische Potenzial als auch die Sicherheitsprobleme von Designer-Rekombinasen. In dieser Arbeit präsentiere ich ein neuartiges, modulares duales Rekombinasesystem vorgestellt, das gezielt einen endogenen BCL11A-Lokus entfernen kann und damit eine funktionelle, therapeutisch relevante Reaktion auslöst. Trotz dieses Fortschritts bleiben Einschränkungen bestehen, darunter eine suboptimale Zielstellen-Auswahl, potenzielle Off-Target-Aktivität und Zytotoxizität. Um diese Herausforderungen zu meistern, sind verfeinerte Evolutionsstrategien in eukaryontischen Systemen, eine unvoreingenommene Off-Target-Profilierung und ein computergestütztes Protein-Engineering erforderlich. Insgesamt etabliert diese Arbeit SSRs als präzise und anpassungsfähige Genom-Editierwerkzeuge und bietet eine solide Grundlage für die Weiterentwicklung von Designer-Rekombinase-basierten Gentherapiestrategien zur Behandlung von ß-Hämoglobinopathien.:TABLE OF CONTENTS 1
ABBREVIATIONS 5
LIST OF FIGURES 8
LIST OF TABLES 9
1. INTRODUCTION 10
1.1 ß-hemoglobinopathies 10
1.1.1 Description and global prevalence 10
1.1.2 Molecular basis and pathophysiology 11
1.1.3 Treatment options 12
1.1.3.1 Symptomatic management 13
1.1.3.2 Curative therapies 14
1.2 Control of globin gene expression: basis for development of gene therapies 16
1.3 The protective contribution of fetal hemoglobin 17
1.4 BCL11A - an important HbF repressor 18
1.5 Therapeutic genome modifications for ß-hemoglobinopathies 19
1.5.1 Lentivirus-based transgene integration 19
1.5.2 Targeted genome editing approaches 21
1.6 Genetic engineering with tyrosine site-specific recombinases 25
1.6.1 Mechanism of the Cre/loxP recombination system 25
1.7 Tyrosine site-specific recombinases as genome editing tools for therapy 27
1.7.1 Principles of directed molecular evolution 28
1.7.2 Directed evolution of tyrosine site-specific recombinases 29
1.7.3 Therapeutic application of designer recombinases 30
2. AIM OF THE THESIS 32
3. MATERIALS AND METHODS 34
3.1 Target site identification and off-target prediction 34
3.2 Molecular cloning methods 34
3.2.1 DNA isolation and purification 35
3.2.2 Polymerase chain reaction (PCR) 35
3.2.3 Restriction enzyme digestion 36
3.2.4 DNA gel electrophoresis 36
3.2.5 Ligation 37
3.2.6 Preparation of electrocompetent E. coli cells 37
3.2.7 E. coli transformation 37
3.2.8 Sanger sequencing 38
3.3 Plasmid construction 38
3.3.1 pEVO plasmids 38
3.3.2 Mammalian expression plasmids 38
3.3.3 Mammalian reporter plasmids 39
3.4 SLiDE-based evolution of designer recombinases 39
3.5 DNA shuffling for recombinase library diversification 40
3.6 Deep-sequencing-based high-throughput screening using DEQSeq 41
3.6.1 Unique molecular identifier (UMI) preparation 41
3.6.2 Barcoding of recombinase library 42
3.6.3 Nanopore sequencing and data analysis 42
3.6.4 Validation of selected recombinase variants 43
3.7 mRNA synthesis using in vitro transcription (IVT) 43
3.8 Cell culture 44
3.8.1 Cell culture maintenance 44
3.8.2 HUDEP-2 cell line differentiation 44
3.8.3 Lentivirus production 45
3.8.4 Generation of reporter cell lines 45
3.8.5 mRNA transfection 46
3.8.6 mRNA electroporation 46
3.8.7 Flow cytometry 47
3.9 PCR-based detection of genomic excision 47
3.9.1 Excision on the integrated reporter cassette 48
3.9.2 Excision on the endogenous BCL11A locus 48
3.10 Reverse Transcription - quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) 48
3.11 Biochemistry 49
3.11.1 SDS-PAGE 49
3.11.2 Western blotting 50
3.12 Endogenous zinc finger domain generation and cloning 50
3.13 RNA sequencing and analysis 51
3.14 Off-target profiling of recombinase variant 229 51
3.14.1 Target site library construction 51
3.14.2 Cloning and preparation for deep sequencing 52
3.14.3 Data analysis 54
4. RESULTS 55
4.1 Recombinase-mediated excision on asymmetric target sites 55
4.1.1 Target site identification for recombinase-mediated knockout of BCL11A 55
4.1.2 Substrate-linked directed evolution of a recombinase heterodimer 58
4.1.3 Substrate-linked directed evolution of a recombinase heterotetramer 61
4.2 Deep-sequencing-based high-throughput screening of heterodimer library 64
4.3 Activity evaluation of heterodimer recombinase variants in human cells 67
4.3.1 Potential causes of recombinase-induced toxicity in mammalian cells 71
4.4 Zinc finger domain-recombinase fusions to increase on-target specificity 73
4.4.1 Evaluation of ZFD-recombinase fusions in bacterial cells 75
4.4.2 Evaluation of ZFD-recombinase fusions in mammalian cells 76
4.5 Counter-selection based directed evolution 79
4.6 Evaluation of counter-selected variants in HeLa reporter cell line 82
4.6.1 Characterization of recombinase variant 229 83
4.7 The HUDEP-2 cell line: a valuable tool in ß-hemoglobinopathy gene therapy development 86
4.7.1 Evaluation of designer recombinase performance in HUDEP-2 reporter cell line 86
4.7.2 Characterization of recombinase variant 229 88
4.8 Functional evaluation of designer recombinase 229 in HUDEP-2 WT cells 91
4.9 Transcriptional profiling of recombinase treated HUDEP-2 WT cells 94
4.10 Off-target profiling of designer recombinase variant 229 97
5. DISCUSSION 100
5.1 Overview of the work 100
5.2 Interpretation of key findings 101
5.2.1 Directed evolution of heteromeric designer recombinases 101
5.2.2 Screening and validation of evolved variants 102
5.2.3 Optimization of recombinase properties 104
5.2.4 Functional evaluation of recombinase-mediated genome editing 107
5.3 Limitations and challenges of the study 109
5.4 Conclusion and outlook 112
5.4.1 Current landscape and future directions 112
5.4.2 Future of gene therapy 114
6. SUMMARY 116
7. ZUSAMMENFASSUNG 118
8. SUPPLEMENTARY INFORMATION 120
8.1 Supplementary figures 120
8.2 Supplementary tables 133
9. REFERENCES 141
10. ACKNOWLEDGMENTS 160
Anlage 1 162
Anlage 2 16
Regulation of the CD163-HO-1 Pathway in Macrophages of Patients with Abdominal Aortic Aneurysm
No full textAbdominal aortic aneurysms (AAA) denote a pathological dilation of the aorta and a rupture is associated with a high mortality. Currently, surgery is the only treatment option and no medical therapy exists. Development of targeted therapies requires in-depth knowledge of the underlying mechanisms leading to AAA development. Hemorrhage associated with the intraluminal thrombus (ILT) and particularly from leaky neovessels results in hemoglobin release upon hemolysis. Unbound hemoglobin promotes the formation of reactive oxygen species (ROS), contributing to vessel wall degeneration. For detoxification, hemoglobin is bound to haptoglobin and internalized by the scavenger receptor CD163, which is expressed exclusively on monocytes and macrophages. Internalized heme is degraded by heme-oxygenase-1 (HO-1, gene: HMOX1) thereby producing the anti-oxidative mediators biliverdin, carbon monoxide (CO), and ferrous ions. Increased expression of CD163 and HO-1 are hallmarks of MHem macrophages, which are shown to be atheroprotective. However, nothing is known about the role of CD163 and HO-1 in AAA yet. To investigate this, aortic tissue was collected from electively treated patients with AAA, patients with AAA rupture, and patients with arterial occlusive disease that served as controls, and expression of CD163, HMOX1, and further anti-inflammatory genes (NQO1, NFE2L2) was determined. To explore potential differences in monocyte subsets involved in AAA pathogenesis, blood was collected from patients with AAA and patients with varicose veins that served as controls, and circulating monocyte subsets were determined. Moreover, primary monocytes from patients with AAA and varicose controls were differentiated autologously or under stimulation with hemin and analyzed for their CD163 and HMOX1 mRNA expression, ROS formation, lipidperoxidation, migration, phagocytosis, and cytokine secretion. An erythrocytelysate was added to the MHem macrophages to assess the effect of hemorrhage. The regulation of the CD163-HO-1 pathway was studied in vitro using healthy monocytes. The effects of the HO-1 products biliverdin, CO, and iron were investigated. HO 1 was pharmacologically inhibited, while both CD163 and HO-1 were genetically silenced by CRISPR-Cas9. Additionally, the effect of the enzymatically inactive, but gene regulatory truncated version of HO 1 (t-HO-1) was tested in MHem macrophages.
Patients with AAA showed a lower proportion of classical monocytes, whereas non-classical and intermediate monocytes were higher. Non-classical monocytes were associated with AAA volume and diameter, whereas intermediate monocytes correlated with ILT thickness. This illustrates the pronounced role of monocytes and macrophages in AAA pathogenesis. CD163+ cells were localized to hemorrhagic areas in the aortic tissue and showed an inverse correlation with erythrocyte presence. In addition, CD163 mRNA expression showed a positive association with anti-oxidative genes (HMOX1, NQO1, NFE2L2) assuming a protective nature in AAA. However, CD163 mRNA expression was increased in ruptured patients. To assess the effect of hemorrhage, an in vitro experiment was performed which resulted in increased CD163 mRNA upon hemin stimulation, indicating its responsiveness to hemorrhage. Subsequent analysis focused on monocyte-derived macrophages from patients with AAA to study their role in detail. Autologously differentiated macrophages showed an AAA-specific increase in CD163 mRNA, while HMOX1 was unaffected. Interestingly, there was a positive correlation between CD163 and HMOX1 in AAA macrophages. Assessing macrophage functionality revealed a reduced H2O2 release compared to controls. In hemin-differentiated MHem macrophages there was again an AAA-specific increase in CD163 mRNA, while CD163 protein expression was decreased. HO-1 protein was only induced in MHem macrophages from patients with AAA. In addition, these cells showed reduced H2O2 release, immune cell recruitment, and an altered cytokine profile. Hemin was not able to induce the positive correlation between CD163 and HMOX1 mRNA, thus different mediators may be responsible for that. These data suggest an impaired function of MHem macrophages in AAA and a functional interaction between HO-1 and CD163. However, stimulation of MHem macrophages with an erythrocytelysate resulted in increased anti-inflammatory IL10 and decreased pro-inflammatory CCL3 expression, revealing that they are still able to respond to hemorrhage. CD163 mRNA expression not altered by stimulation with erythrocytelysate, whereas HMOX1 was only induced in vehicle-differentiated but not in hemin-differentiated macrophages, suggesting a potential saturation. To investigate the regulation of CD163 and HO 1 in detail, the effects of HO-1 products were analyzed. Biliverdin and iron did not affect CD163 and HO-1, whereas CO induced HMOX1 mRNA in MHem macrophages, but showed no other effects. Given this, none of the HO-1 products appear to be suitable molecular targets. To elucidate the direct regulatory linkage between CD163 and HO-1, the effect of pharmacological and genetic inhibition of both were analyzed. Pharmacological inhibition of HO 1 activity resulted in a compensatory increase of HMOX1 mRNA and HO 1 protein expression, whereas CD163 mRNA and protein expression were decreased. Of importance, pharmacological inhibition of HO-1 activity dramatically decreased the glutathione/glutathione disulphide (GSH/GSSG) ratio, an indicator of oxidative stress. This reflects the importance of HO-1 activity in MHem macrophages. Genetic inhibition revealed that the loss of HO-1 protein did not affect CD163 expression and vice versa. Taken together with the pharmacological inhibition results, this indicates that the downregulation of CD163 requires the presence of HO 1 protein even if its activity is reduced. Notably, the increase in HMOX1 mRNA in HMOX1-deficient macrophages as well as the decrease in CD163 protein following CD163 knock-out only became apparent after hemin stimulation. This corresponds to the findings from the pharmacological inhibition, highlighting an important role of heme accumulation in the regulation of the CD163-HO-1 pathway. Interestingly, after inhibition of HO 1 activity, a second protein band appeared in the Western blot, presumably the truncated variant of HO-1 (t-HO-1). Functional analyses of t-HO-1 showed a partial involvement in the regulation of CD163 and HMOX1 mRNA expression as well as the nuclear localization of HO-1. Furthermore, t-HO-1 regulated NQO1 and NFE2L2 mRNA expression, highlighting its importance in the regulation of anti-oxidative genes.
In conclusion, CD163+ cells were localized to hemorrhagic regions and inversely correlated with erythrocytes in human end-stage AAA. This suggests a potential protective role for CD163+ macrophages. Hemin-differentiated macrophages of patients with AAA exhibit altered expression profiles of HO-1 and CD163, along with limitations in their macrophage-typical function. Nevertheless, they seem to be capable of responding to additional hemorrhage. Further experiments should therefore clarify whether targeted activation of HO-1 or CD163 can achieve an improvement in function that can impede or slow down the progression of AAA. Signaling pathway analysis revealed that the CD163-HO-1 pathway was primarily regulated by heme. Of interest, CD163 expression is regulated downstream of HO-1 activity. The truncated form of HO 1 may present an important contributor, either to HO-1 expression or to the regulation of other anti-oxidant genes. In summary, the CD163-HO 1 pathway represents a promising target for the development of novel treatment options
Die Sächsische Gartenakademie: Informations- und Weiterbildungsangebot 2022
No full textDie Gartenakademie des Sächsischen Landesamtes für Umwelt, Landwirtschaft und Geologie wendet sich mit einem vielfältigen Weiterbildungsangebot an alle Freizeitgärtnerinnen und Freizeitgärtner. Der Flyer bietet einen Überblick über das gesamte Angebot der Gartenakademie im Jahr 2022.
Redaktionsschluss: 26.11.202