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Assessment of the effects of maxillary expansion on the upper airway using respiratory polygraphy
No full textTrabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina Dentária apresentado à Faculdade de MedicinaIntroduction: Obstructive Sleep Apnea Syndrome (OSAS) is a respiratory disorder affecting 1 to 5% of the pediatric population. It is characterized by episodes of apnea or hypopnea during sleep due to upper airway collapse. If untreated, it may affect a child's physical growth and neuropsychological development. Polysomnography is the gold standard for diagnosis, but its high cost and limited availability, have led to the development of alternative methods such as respiratory polygraphy. Maxillary expansion has been shown to be an effective treatment in children with OSAS, improving both airway dimensions and respiratory parameters. This study aimed to assess the effects of maxillary expansion on respiratory parameters and upper airway dimensions in children, using a home-based respiratory polygraphy device.Materials and Methods: This prospective clinical study included nine healthy pediatric patients undergoing rapid maxillary expansion at the Orthodontic Institute of the Faculty of Medicine, University of Coimbra (FMUC). Sleep tests were carried out at the patients' homes using the BTI-APNiA device over the course of one night. Recordings were obtained before expansion (T0) and, when possible, after the active phase of expansion (T1). The parameters analyzed were the Apnea-Hypopnea Index (AHI) and minimum oxygen saturation (SpO₂). Data were analyzed using descriptive statistics.Results: The paediatric population analysed, with a mean age of 10.1 ± 1.6 years, had a mean AHI of 1.6 ± 0.8 events/h and a minimum SpO2 of 93.9 ± 2.0% at T0. Of the participants, two underwent the assessment at T1, showing a mean AHI of 2.0 ± 1.2 events/h and minimum SpO2 of 95.5 ± 2.1%. Thus, no improvements were seen in the respiratory parameters assessed.Discussion: Although current literature supports positive outcomes of maxillary expansion in pediatric OSAS, this study did not reveal improvements in AHI or minimum SpO₂. The limited sample size, short follow-up, and use of a respiratory polygraphy device not validated for pediatric patients are important limitations that may have impacted the results.Conclusion: Rapid maxillary expansion did not show measurable improvements in the evaluated respiratory parameters. Further research with larger sample sizes and longer follow-up is necessary to validate respiratory polygraphy and to confirm the effectiveness of maxillary expansion in pediatric OSAS.Introdução: A Síndrome da Apneia Obstrutiva do Sono (SAOS) é uma patologia respiratória, que afeta 1 a 5% da população pediátrica, caracterizada por episódios de apneia ou hipopneia durante o sono, decorrentes do colapso das vias aéreas superiores. Se não for tratada, pode afetar negativamente o desenvolvimento físico e neuropsicológico da criança. A polissonografia, aliada ao exame físico, é o método gold-standard para o diagnóstico. Contudo, devido aos altos custos e à limitada disponibilidade desse exame, foram desenvolvidas alternativas diagnósticas, como aparelhos de poligrafia respiratória. A expansão maxilar tem demonstrado ser uma terapêutica eficaz em crianças com SAOS, demonstrando um aumento significativo nas dimensões das vias aéreas superiores bem como uma melhoria dos parâmetros respiratórios. Este estudo visa avaliar os efeitos da expansão maxilar nos parâmetros respiratórios e nas dimensões das vias aéreas superiores em crianças, utilizando um aparelho de poligrafia respiratória.Materiais e Métodos: Este estudo clínico prospetivo, avaliou 9 pacientes pediátricos saudáveis submetidos a expansão rápida maxilar no Instituto de Ortodontia da FMUC. Os exames do sono foram realizados no domicílio dos pacientes, por meio do dispositivo BTI-APNiA, durante uma noite. A poligrafia respiratória foi obtida antes da expansão (T0) e, sempre que possível, após a conclusão da fase ativa da expansão (T1). Os parâmetros analisados foram o Índice de Apneia-Hipopneia (IAH) e a saturação de oxigénio mínima (SpO2). A análise dos dados foi realizada através de estatísticas descritivas.Resultados: A população pediátrica analisada, com média de idade de 10,1 ± 1,6 anos, apresentou em T0, um IAH médio de 1,6 ± 0,8 eventos/h e a SpO2 mínima de 93,9 ± 2,0%. Dos participantes, dois realizaram a avaliação no momento T1, evidenciando um IAH médio de 2,0 ± 1,2 eventos/h e SpO2 mínima de 95,5 ± 2,1%. Desta forma, não foram observadas melhorias nos parâmetros respiratórios avaliados.Discussão: Apesar da literatura apresentar melhorias significativas após a expansão maxilar em crianças com SAOS, os resultados deste estudo não identificaram alterações favoráveis no IAH e na SpO2 mínima. A pequena amostra, o reduzido follow up e o uso de poligrafia respiratória não validada para a população pediátrica constituem limitações que podem ter comprometido os resultados encontrados.Conclusão: A expansão rápida maxilar não demonstrou melhorias nos parâmetros respiratórios avaliados. São necessários mais estudos, com amostras maiores e follow-up mais longos para validar a poligrafia respiratória e a eficácia da expansão na SAOS pediátrica
Análise Retrospetiva de Pacientes Submetidos a Teste Genético Germinativo para Cacro da Mama
No full textTrabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina apresentado à Faculdade de MedicinaIntroduction In 2022 breast cancer (BC) represented 28.2% of all female tumors, and 15.5% of cancer-related deaths among women, with hereditary BC accounting for approximately 5-10% of all cases. The detection of a pathogenic/likely pathogenic variant (P/LPV) may influence treatment in BC patients, and impact risk reducing strategies and surveillance. To optimize the efficiency of germline genetic testing for BC, the Unidade Local de Saúde (ULS) de Coimbra implemented the Mainstream Cancer Genetics (MCG) criteria in 2020.MethodsClinical, histological and genetic information from patients who underwent germline genetic testing for BC from 2020 to 2024 was retrieved by retrospective analysis of their medical records. All data was anonymized, and the cohort was described using descriptive statistics. ResultsThis study encompassed 535 individuals, 506 (94.6%) of which were affected. The detection rate (DR) in affected individuals was slightly higher than in healthy ones (8.5% vs 6.9%). The most frequently mutated gene was BRCA2 (23.9%), and the Portuguese founder mutation c.156_157insAlu was the most common P/LPV (8.7%). Variants of uncertain significance (VUS) had a DR of 18.5%, and two of them have been reclassified as LPV. Discussion This work highlights the importance of implementing germline genetic testing using cancer-based criteria and the importance of reevaluating VUSs regularly. The P/LPV DR of the MCG criteria may vary according to the studied population and it would be beneficial to evaluated P/LPV DR in other populations.IntroduçãoEm 2022, o cancro da mama (CM) correspondeu a 28,2% de todos os tumores em mulheres e a 15,5% de todas as mortes oncológicas em mulheres, sendo que o CM hereditário representa cerca de 5 a 10% destes casos. A deteção de variantes patogénicas ou provavelmente patogénicas influencia o tratamento de pacientes com CM, bem como as estratégias de redução de risco e de vigilância. De forma a otimizar a eficiência da testagem genética germinativa para CM, a Unidade Local de Saúde de Coimbra começou a aplicar os critérios Mainstream Cancer Genetics (MCG).MétodosA informação clínica, histológica e genética dos pacientes que realizaram teste genético germinativo entre 2020 e 2024 foi recolhida através da análise retrospetiva dos processos clínicos. Os dados foram anonimizados e estatística descritiva foi utilizada para os relatar. Resultados O presente estudo incluiu 535 indivíduos, dos quais 506 (94,6%) tiveram CM. A taxa de deteção (TD) em indivíduos afetados foi ligeiramente mais alta do que em indivíduos saudáveis (8,5% versus 6,9%). O maior número de variantes patogénicas/provavelmente patogénicas foi detetado no gene BRCA2 (24,45%) e a variante patogénica/provavelmente patogénica mais comum foi a mutação fundadora portuguesa c.156_157insAlu (8,7%). As variantes de significado clínico incerto tiveram uma TD de 18,5%, duas das quais foram reclassificadas como variantes provavelmente patogénicas.Discussão O presente trabalho destaca a importância da implementação de testes genéticos germinativos de acordo com critérios baseados nos antecedentes pessoais neoplásicos e a importância da reavaliação frequente de variantes de significado clínico incerto. A TD de variantes patogénicas/provavelmente patogénicas usando os critérios MCG pode variar de acordo com a população estudada e seria benéfico avaliar as TDs noutras populações
Análise Salivar de uma Amostra da População Adulta Obesa Portuguesa
No full textTrabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina Dentária apresentado à Faculdade de MedicinaIntroduction: Obesity is a chronic medical condition with increasing global prevalenceand is linked to various systemic comorbidities. More recently, it has also beenassociated with changes in oral health, particularly increased risk of dental caries andperiodontal disease. These may be related to alterations in salivary parameters ofobese individuals such as pH, buffering capacity, and salivary flow, which are essentialfor maintaining oral homeostasis.Objective: To evaluate and compare salivary pH, buffering capacity, and flow rate in asample of the Portuguese obese adult population with those of a sample of adults witha normal Body Mass Index.Materials and Methods: The study was approved by the Ethics Committee of theFaculty of Medicine of the University of Coimbra. Participants were selected accordingto established inclusion and exclusion criteria (n=30/group). The test group wasrecruited from the Endocrinology Department of the Coimbra University Hospital, andthe control group consisted of companions of obese patients who met the eligibilitycriteria. Clinical data were collected (weight, height, and Body Mass Index) and an oralassessment was performed using the Decayed, Missing, and Filled Teeth (DMFT)Index. Stimulated saliva samples were collected for the analysis of salivary flow, pH,and buffering capacity. Statistical analysis was performed, considering a significancelevel of 5%.Results: There were no statistically significant differences between groups regardingsex, age, and height (p>0.05). The obese group presented more decayed (p0,05). O grupo de doentes com obesidadeapresentou mais dentes cariados (p<0,001), perdidos (p=0,030) erestaurados(p=0,011), bem como valores do índice oral mais elevados (p<0,001). Osvalores de pH, capacidade tampão e fluxo salivar foram significativamente inferioresno grupo de doentes com obesidade (p<0,001).Discussão: Verificaram-se alterações significativas nos parâmetros salivares emindivíduos obesos, possivelmente relacionadas com inflamação crónica e/ou uso demedicação associada a comorbilidades da doença. Estas alterações podemcomprometer os mecanismos naturais de proteção oral e contribuir para a maiorprevalência de patologias orais.Conclusão: Este estudo revelou uma associação entre a obesidade e alteraçõessalivares, como redução do pH, da capacidade tampão e do fluxo salivar. A adoção deestratégias preventivas que destacam elementos fundamentais como a manutençãode bons hábitos de higiene oral e consultas regulares de medicina dentária são pilaresfundamentais na prevenção de patologias orais, como a cárie dentária, em indivíduoscom obesidade
Soluções para ultrapassar as principais limitações da aplicação dos AAVs em terapias de base genética no sistema nervoso central
No full textTese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina apresentada ao Instituto de Investigação InterdisciplinarGene therapy using recombinant adeno-associated virus (AAV) as vectors provides, with a single treatment, sustained transgene expression, potentially of life-long duration. Remarkable successes were generated with AAV vectors in recent years due to their efficiency in targeting different tissues and their ability to achieve persistent expression. Nevertheless, there are still roadblocks preventing their widespread clinical application, specifically their low packaging capacity and the occasional adverse events caused by immune responses against these vectors. Importantly, a major obstacle for AAV-based gene therapy is the pre-existing immunity observed in a large proportion of the world population. Particularly, the presence of neutralizing antibodies (NAbs) can significantly reduce vector transduction and exacerbate immune responses, leading to patient exclusion from AAV treatments and limiting the re-administration of AAV-based therapies.The present thesis aimed to address some of these limitations by evaluating novel strategies for AAV delivery, specifically in the context of spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), also known as Machado-Joseph disease (MJD). First, we investigated the impact of peripheral NAbs on AAV transduction in the central nervous system (CNS) by intra-cerebrospinal fluid (CSF) administration. Our findings revealed that intra-CSF administration of AAVs effectively circumvents peripheral NAbs, enabling robust CNS transduction in wild-type mice. However, adult mice, specifically MJD/SCA3 mice exhibited reduced AAV transduction upon passive immunization, which was partially restored when co-administering an IgG-degrading enzyme (IdeS). Thus, our data suggest the existence of relevant differences in AAV immune response between wild-type and disease models, especially in a blood-brain barrier (BBB) disruption-associated context. In addition, IdeS pre-treatment partially circumvented AAV neutralization by antibodies and enhanced brain transduction, offering a potential strategy to facilitate AAV re-administration without loss of efficacy.Regardless of the aforementioned limitations, AAV vectors persist as the preferred delivery method, especially, for CNS diseases. Thus, we employed AAVs to deliver a novel therapeutic approach, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-based transcriptional activation (CRISPRa), aimed at ameliorating neuropathology in a mouse model of MJD/SCA3 mice.CRISPRa components were optimized to be delivered by AAVs in an MJD/SCA3 mouse model. To express Cas9 protein, both Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) and Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) were evaluated. Since spCas9 fused to transcriptional activators exceeds the packaging capacity of AAVs, we developed dual AAV constructs with split-inteins to express this Cas9 ortholog. Our results indicated that, while dual AAV approach successfully reconstitutes full-length spCas9, it leads to lower transcriptional activation compared to the single vector saCas9. Based on these findings, we proceeded with SaCas9 for further studies. Subsequently, the sgRNA screening and validation enabled the simultaneous upregulation of two distinct neuroprotective genes to enhance therapeutic potency. The combined CRISPRa-based activation led to a significant reduction of ataxin-3 protein aggregates, a hallmark of the MJD/SCA3 disease, and to an improvement in MJD/SCA3 neuropathological features. These findings highlight the potential of targeting neuroprotective genes using CRISPRa as a therapeutic strategy for MJD/SCA3 and possibly other polyglutamine or neurodegenerative disorders.In summary, this thesis provides valuable insights into overcoming key limitations in AAV-based gene therapy for CNS disorders, particularly on immune responses and transgene packaging constraints. The findings presented here pave the way for improving the clinical translation of gene therapy-based interventions for neurodegenerative diseases, particularly for the treatment of MJD/SCA3.As terapias com potencial de curar doenças neurodegenerativas têm sido um objetivo de longa data tanto para doentes, como para a comunidade científica. A terapia génica com vetores virais, tais como os vírus adeno-associados (AAV), oferece, com um único tratamento, níveis terapêuticos e duradouros de expressão de um transgene. Esta propriedade aliada à sua eficiência na transdução de diferentes tecidos permitiu alcançar sucessos notáveis no tratamento de patologias graves. No entanto, ainda existem desafios que impedem uma utilização mais ampla de AAVs no contexto clínico. Em particular, a sua reduzida capacidade de empacotamento e os potenciais efeitos secundários devidos a respostas imunológicas exacerbadas continuam a ser alvo de escrutínio pela comunidade científica. Um dos principais obstáculos da terapia génica com AAVs é, então, a presença de anticorpos específicos para estes vírus em grande parte da população mundial. Especificamente, a presença de anticorpos neutralizantes (NAbs) compromete significativamente a transdução pelos AAVs e exacerba a resposta imunológica. Esta questão resulta na exclusão de doentes de ensaios clínicos e tratamentos com AAVs. Para além disso, limita a possibilidade de readministração deste tipo de terapias.A presente tese teve como objetivo abordar algumas destas limitações, avaliando estratégias inovadoras para a aplicação de AAVs, especificamente no contexto da ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (SCA3), também conhecida como doença de Machado-Joseph (MJD).Inicialmente, investigámos o impacto de NAbs na transdução de AAVs no sistema nervoso central (SNC) por meio da administração destes vetores no líquido cefalorraquidiano (LCR). Os resultados revelaram que a administração intra-LCR contorna eficazmente a ação de NAbs periféricos, permitindo uma transdução robusta do SNC em murganhos. No entanto, murganhos adultos, especificamente do modelo animal de MJD/SCA3, apresentaram uma redução na transdução de AAVs após a imunização passiva. A utilização de uma enzima capaz de degradar imunoglobulinas, de nome IdeS, permitiu reestabelecer os níveis de transdução. Assim, estes dados sugerem a existência de diferenças relevantes na resposta imunológica a terapias baseadas em AAV entre animais saudáveis e modelos de doenças neurodegenerativas, especialmente quando associadas a disrupção da barreira hematoencefálica (BHE). Neste caso, o pré-tratamento com IdeS contornou parcialmente a ação de NAbs periféricos e melhorou a transdução do cérebro nos animais MJD/SCA3, demonstrando ser uma estratégia com potencial para permititr a readministração de AAVs sem perda de eficácia.Apesar das limitações mencionadas, os AAVs continuam a ser o principal vector utilizado na entrega de genes terapêuticos, especialmente para doenças do SNC. Assim, utilizámos AAVs para entregar uma abordagem inovadora baseada na ativação transcricional, também designada por Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRa), com o objetivo de mitigar a neuropatologia associada a MJD/SCA3.Os componentes necessários para aplicação de CRISPRa foram otimizados com o objetivo de serem entregues por AAVs num modelo animal de MJD/SCA3. Neste projeto, comparamos a atividade das proteínas Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) e de Staphylococcus aureus (SaCas9). Uma vez que o tamanho da SpCas9 excede a capacidade máxima de empacotamento de AAVs, desenvolvemos vetores de AAV duplos através de inteínas. De facto, embora a abordagem com vetores duplos resultasse na produção de uma proteína SpCas9 completa, estes vetores demonstraram uma menor ativação transcricional em comparação com a abordagem de vetor único com SaCas9. A validação subsequente de guias de RNA permitiu a ativação de dois genes neuroprotetores, visando aumentar a eficácia terapêutica. Assim, a estratégia terapêutica baseada em CRISPRa resultou numa redução significativa dos agregados da proteína ataxina-3 mutante, uma característica central da MJD/SCA3, além de uma redução da disfunção neuronal associada à doença. Estes resultados demonstram o potencial da ativação por CRISPRa como uma estratégia terapêutica para MJD/SCA3 e possivelmente para outras doenças neurodegenerativas associadas a poliglutaminas.Em resumo, esta tese produziu resultados relevantes para superar desafios-chave na terapia génica com AAVs para doenças do SNC, particularmente em relação às respostas imunológicas e às limitações de empacotamento dos vetores AAVs. Esta tese contribui, assim, para o progresso da aplicação clínica de intervenções baseadas em terapia génica para doenças neurodegenerativas, com foco especial no tratamento da MJD/SCA3.FC
Convivência em tempos de conflito: Caracterização das populações islámicas e cristãs em Portugal do Periodo Medieval ao Moderno com recurso à morfologia dentária
No full textTese de Doutoramento em Antropologia apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaDental anthropology can be defined as the study of humans and their close primate relatives based on evidence provided by teeth. Teeth have their own unique anatomy and physiology, which are different from the biology of the bones that make up the skeleton. They are also unique among the hard parts of archaeological and fossil remains, as they are exposed on the body’s surface throughout life. Therefore, dental anthropology can be studied both in the mouths of living people, as well as in museum collections, archaeological sites, and fossil assemblages. This doctoral thesis focuses on the analysis of dental morphology in 291 individuals from Islamic and Christian contexts of the Middle Ages and Early Modern Period in the Iberian Peninsula. The osteological samples come from eight archaeological sites: Cacela Velha, Vila Real de Santo António (CAC), Loulé, Algarve (LOU), Largo Cândido dos Reis, Santarém (LCR), Rua dos Barcos, Santarém (RDB), Convento de São Francisco, Santarém (CSF), São João de Almedina, Coimbra (SJA), Rua dos Lagares, Lisbon (RDL), and Mérida, Extremadura (Spain) (MER). The main objective of this research is to evaluate the variation in dental morphology of the Islamic and Christian populations that inhabited the Iberian Peninsula during the Middle Ages (8th-15th centuries) and the Early Modern period (15th-16th centuries). The Arizona State University Dental Anthropology System (ASUDAS) was employed to identify 39 discrete traits, and additional analysis was conducted on: the hypoplastic roots of the upper central incisors, the pit-tubercle of the lower molars, and the mesial bending of the upper lateral incisors. Statistical analysis included trait frequency and dental wear, as well as the evaluation of intra-observer error using weighted Cohen's Kappa. Principal Component Analysis (PCA) and the Mean Measure of Divergence (MMD) were used to assess biological affinities and distances between Islamic and Christian samples, along with other reference samples from different regions and periods. The results of the intra-observer error assessment proved consistent, with the dichotomised data generally reproducing accurately, and only four traits showing a decrease in Cohen's Kappa index near the threshold of acceptable concordance levels (≤ 0.600): Labial convexity (UI1), dental tubercle (UI2), Trigonid (LM1), and crest deviation (LM1). Furthermore, out of the 42 traits studied, four showed statistically significant differences: Hypocone in UM2 (p-value 0.022), the number of cusps in LM1 (p-value 0.009), and the "Y" pattern in LM2 (p-value 0.002), with higher frequencies in the Christian group, while the anterior fovea in LM1 (p-value 0.006) showed a higher frequency in the Islamic group. The Principal Component Analysis (PCA) and the Mean Measure of Divergence (MMD) indicate that Christian and Islamic samples share characteristics of the Eurodont dental complex. However, Islamic samples, particularly those from Loulé, Mérida, and Rua dos Lagares, display greater North African genetic influence, suggesting ongoing genetic exchange with this region during the Middle Ages and the Early Modern period. Additionally, the PCA reveals greater dispersion among the Christian samples, indicating higher biological variability, whereas the Islamic samples exhibit lower and more stable variability. This study highlights the significance of genetic flow from North Africa and its impact on Iberian populations in the context of the migrations that occurred during the Islamic conquest of the Iberian Peninsula. Furthermore, it underscores the need for a multidisciplinary approach to better understand the complex historical, biological, and social dynamics associated with this process.A antropologia dentária pode ser definida como o estudo das pessoas e dos seus parentes primatas próximos, a partir das evidências fornecidas pelos dentes. Os dentes têm uma anatomia e uma fisiologia próprias, diferentes da biologia dos ossos que compõem o esqueleto. Também são únicos entre as partes resistentes dos restos arqueológicos e fósseis por terem estado expostos na superfície do corpo ao durante toda a vida. Por conseguinte, a antropologia dentária pode ser estudada na boca de pessoas vivas, bem como em coleções de museus, sítios arqueológicos e conjuntos fósseis. Esta tese de doutoramento centra-se na análise da morfologia dentária de 291 indivíduos pertencentes a contextos islâmicos e cristãos da Idade Média e do Período Moderno na Península Ibérica. As amostras osteológicas provêm de oito sítios arqueológicos: Cacela Velha, Vila Real de Santo António (CAC), Loulé, Algarve (LOU), Largo Cândido dos Reis, Santarém (LCR), Rua dos Barcos, Santarém (RDB), Convento de São Francisco, Santarém (CSF), São João de Almedina, Coimbra (SJA), Rua dos Lagares, Lisboa (RDL) e Mérida, Extremadura (Espanha) (MER). O principal objetivo desta investigação é avaliar a variação da morfologia dentária das populações islâmicas e cristãs que habitaram na Península Ibérica durante a Idade Média (séculos VIII-XV) e os inícios da Idade Moderna (séculos XV-XVI). Foi utilizado o Sistema de Antropologia Dentária da Universidade Estadual do Arizona (ASUDAS) para identificar 39 caracteres discretos e foram analisadas adicionalmente: as raízes hipotróficas dos incisivos centrais superiores, o forâmen-tubérculo dos molares inferiores e o Bending mesial nos incisivos laterais superiores. A análise estatística incluiu a frequência dos caracteres e o desgaste dentário, bem como a avaliação do erro intra-observador através do índice de Kappa de Cohen. Foi utilizada a Análise de Componentes Principais (PCA) e a Medida Média de Divergência (MMD) para avaliar afinidades biológicas e distâncias entre amostras islâmicas e cristãs, juntamente com outras amostras de referência de diferentes regiões e cronologias. Os resultados obtidos na avaliação do erro intra observador demonstraram ser consistentes, onde os dados dicotomizados geralmente se reproduzem com precisão, e apenas quatro caracteres apresentaram uma diminuição no índice de Kappa de Cohen, ficando perto de não alcançar níveis aceitáveis de concordância (≤ 0.600): convexidade labial (UI1), tubérculo dentário (UI2), o trigónido (LM1) e o desvio da crista (LM1). Além disso, dos 42 caracteres estudados, quatro apresentaram diferenças estatisticamente significativas: o hipocono em UM2 (valor-p 0.022), o número de cúspides em LM1 (valor-p 0.009) e o padrão “Y” em LM2 (0.002), com frequências mais elevadas para o grupo cristão, e a fóvea anterior em LM1 (valor-p 0.006), com maior frequência no grupo islâmico. A Análise de Componentes Principais (PCA) e a Medida Média de Divergência (MMD) refletem que as amostras cristãs e islâmicas partilham características do complexo dentário Eurodonte. No entanto, as amostras islâmicas, especialmente as de Loulé, Mérida e Rua dos Lagares, revelam uma maior influência genética norte-africana, sugerindo um intercâmbio genético contínuo com esta região durante a Idade Média e o Período Moderno. Além disso, as PCAs indicam uma maior dispersão nas amostras cristãs, o que reflete uma maior variabilidade biológica, enquanto as populações islâmicas exibem uma variabilidade mais baixa. Este estudo sublinha a relevância do fluxo genético proveniente do norte de África e o seu impacto nas populações da Península Ibérica no contexto das migrações ocorridas durante a conquista islâmica neste território. Destaca ainda a necessidade de uma abordagem multidisciplinar para melhor compreender as complexas dinâmicas históricas, biológicas e sociais associadas a este processo.Outro - Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID) / Doctorado en el extranjero programa BecasChile 2020-7221033
Explorar o sistema renina-angiotensina cerebral pela via intranasal para a prevenção e tratamento da doença de Alzheimer
No full textTese de Doutoramento em Ciências Farmacêuticas apresentada à Faculdade de FarmáciaAlzheimer’s disease (AD), a neurodegenerative disorder marked by amyloid β (Aβ) plaques and hyperphosphorylated Tau tangles, continues to pose challenges in research and drug development due to high failure rates of single-target approaches and late interventions. Vascular changes and cardiovascular risk factors, particularly Renin-Angiotensin System (RAS) dysregulation, are increasingly linked to AD. While the ACE1/Ang II/AT1R axis exacerbates oxidative stress, neuroinflammation, and blood-brain barrier (BBB) disruption, alternative RAS pathways (ACE2/Ang(1-7)/MasR, Ang IV/AT4R) exhibit neuroprotective properties. Clinical studies indicate a reduced AD risk among hypertensive patients treated with RAS-targeting drugs, such as angiotensin receptor blockers (ARBs) and angiotensin-converting enzyme inhibitors (ACE-Is). Moreover, preclinical research supports their ability to modulate inflammation, oxidative stress, and tau phosphorylation.Therefore, this PhD project was designed based on a reverse translation perspective considering the clinical efficacy of ARBs and ACE-Is on reducing the cognitive decline rate in patients with AD. As such, intranasal (IN) administration of RAS-targeting drugs in the context of AD was herein explored, in order to directly deliver the drug into the central nervous system, reducing drugs distribution to non-target peripheral sites.The project initiated with the screening of three ARBs (losartan, valsartan, irbesartan) and three ACE-Is (enalaprilat, lisinopril, captopril), which were previously selected based on their physicochemical properties and potency. Cell viability was assessed in five cell lines [RPMI-2650, A549, N2a-wt, N2a-APPswe, BV2], followed by evaluation of anti-inflammatory activity in BV2 cells exposed to LPS and neuroprotective effects in N2a-wt and N2a-APPswe cells. Ex vivo permeability studies were executed in parallel to predict the apparent permeability of the compounds through porcine nasal mucosa. Irbesartan emerged as the most effective and permeable compound, making it the ideal candidate for further testing in vivo. Thereafter, irbesartan was IN administered twice daily (40 mg/kg/day) during 10 days to C57/BL6 male mice injected with lipopolysaccharide (LPS) to induce neuroinflammation. This animal model was firstly used to study the role of neuroinflammation in AD as it is simpler and more cost-effective and often used in drug discovery before translation to more complex models like APP/PS1 animals. If a drug fails to show efficacy in LPS-induced inflammation, it is less likely to be well-succeed in APP/PS1 or other models. Thus, irbesartan improved memory and depressive-like behavior, through mechanisms that included increasing of dendritic spine density, improvement of synaptic function, and activation of the PI3K/AKT pathway. Furthermore, irbesartan also elevate the levels of antioxidant enzymes in the hippocampus [superoxide dismutase 2 (SOD2), glutathione peroxidase (Gpx)] and reduced LPS-induced astrogliosis.Moreover, in vivo comparative pharmacokinetic studies were performed in healthy mice IN or intravenously administered where Irbesartan revealed that the former significantly enhances brain exposure to irbesartan, with a 3-fold increase in maximum concentration (Cmax) and a 2.5-fold increase in the area under the curve (AUCt) in the brain. Irbesartan reached peak concentrations within 15 minutes post-administration, and achieved a brain targeting efficiency of 239.56%, with 58.26% of the drug being directly transported to the brain. Importantly, multidose administration indicated no systemic or tissue accumulation, and no significant olfactory toxicity was observed.Considering the results of the pharmacokinetic study and the LPS-neuroinflammation mice model, we next investigated the effects of irbesartan IN administration to the transgenic APP/PS1 mice, which is a well-established model of AD that more closely mimics the Aβ pathology and cognitive deficits seen in human. This allowed us to assess not only irbesartan potential to decrease neuroinflammation but also its effects on amyloid deposition, synaptic function, oxidative stress and long-term cognitive performance.Thus, the treatment effectively decreased oxidative stress, preserved BBB integrity, and inhibited both intrinsic and extrinsic apoptotic pathways. Additionally, irbesartan demonstrated strong anti-inflammatory effects by reducing microglial activation and pro-inflammatory signaling.In conclusion, the work underlying this PhD thesis highlights the potential of IN irbesartan for Alzheimer's disease, demonstrating its efficacy in reducing neuroinflammation, oxidative stress and cognitive deficits in both LPS and APP/PS1 animal models. By targeting brain RAS and taking advantage of the nose-to-brain delivery, irbesartan effectively modulated key pathological processes associated with AD, underscoring its promise as a viable candidate for further clinical development.A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa, caracterizada pela formação de placas de amiloide β (Aβ) e pela hiperfosforilação da Tau, que continua a ser extremamente desafiante devido às elevadas taxas de insucesso devido a abordagens centradas em alvos terapêuticos isolados ou em intervenções realizadas em fases tardias da doença. Além disso, estudos recentes têm estabelecido uma ligação entre alterações vasculares, particularmente a desregulação do Sistema Renina-Angiotensina (SRA), e o desenvolvimento da DA. Enquanto o eixo ACE1/Ang II/AT1R agrava o stress oxidativo, a neuroinflamação e a disrupção da barreira hematoencefálica (BHE), vias alternativas do SRA (ACE2/Ang(1-7)/MasR e Ang IV/AT4R) apresentam propriedades neuroprotetoras. Para além disso, indivíduos hipertensos tratados com antagonistas dos recetores da angiotensina II (ARAs) ou inibidores da enzima de conversão da angiotensina (IECAs), apresentam um risco menor de desenvolver DA. Para além disso, estudos in vitro e in vivo têm demonstrado o potencial destes fármacos para modular processos patológicos associados à DA, incluindo a inflamação, o stress oxidativo e a fosforilação da proteína Tau.Deste modo, este projeto foi concebido com base numa abordagem de translação reversa, partindo da eficácia clínica observada dos ARAs e IECAs na redução do declínio cognitivo em doentes com DA. Assim, esta tese explorou o potencial terapêutico da administração intranasal (IN) de fármacos dirigidos ao SRA no tratamento da DA. A via IN permitie a administração direta dos fármacos ao sistema nervoso central, minimizando a distribuição para locais periféricos, sendo por isso uma estratégia promissora.O projeto iniciou-se com a seleção de três ARAs (losartan, valsartan e irbesartan) e três IECAs (enalaprilato, lisinopril e captopril), com base nas suas propriedades físico-químicas. Avaliou-se a viabilidade celular em cinco linhas celulares [RPMI-2650, A549, N2a-wt, N2a-APPswe e BV2], seguida pela análise da atividade anti-inflamatória em células BV2 expostas a lipopolissacarídeo (LPS) e dos efeitos neuroprotetores em células N2a-wt e N2a-APPswe. Estudos de permeabilidade ex vivo foram realizados em paralelo, recorrendo à mucosa nasal de porcos, para prever a permeabilidade aparente dos compostos. O irbesartan revelou-se o composto mais eficaz e com maior permeabilidade, sendo selecionado como o candidato ideal para testes in vivo.Posteriormente, o irbesartan foi administrado IN, duas vezes ao dia (40 mg/kg/dia), durante 10 dias, a murganhos machos da linhagem C57/BL6 injetados com LPS para induzir neuroinflamação. Este modelo animal, simples e económico, é amplamente utilizado em fases iniciais da investigação de fármacos antes da transição para modelos mais complexos, como o modelo APP/PS1. O tratamento com irbesartan melhorou a memória e o comportamento depressivo, através de mecanismos que incluíram o aumento da densidade de espinhas dendríticas, a melhoria da função sináptica e a ativação da via PI3K/AKT. Verificou-se também um aumento nos níveis da superóxido dismutase 2 e glutationa peroxidase no hipocampo, assim como uma redução da astrogliose induzida por LPS.Para além disso, foram também realizados ensaios farmacocinéticos em murganhos saudáveis administrados com irbesartan por via IN ou intravenosa que demonstraram que a via IN aumentou significativamente a concentração cerebral do fármaco, com um aumento de 3 vezes na concentração máxima (Cmax) e de 2,5 vezes na área sob a curva. O irbesartan atingiu a Cmax cerebral 15 minutos após a administração e apresentou uma eficiência de transporte para o cérebro de 239,56%, com 58,26% do fármaco a ser diretamente transportado para o cérebro. Além disso, a administração repetida não mostrou acumulação sistémica, e não foram observados sinais de toxicidade olfativa.Deste modo, foi então investigado o efeito do irbesartan em murganhos transgénicos APP/PS1, um modelo de DA que mimetiza de forma fidedigna a patologia Aβ e o défice cognitivo observados em doentes. Este modelo permitiu avaliar o potencial do irbesartan não apenas na redução da neuroinflamação, mas também nos seus efeitos sobre a deposição de Aβ, a função sináptica, o stress oxidativo e o desempenho cognitivo.Os resultados demonstraram que o irbesartan reduziu eficazmente o stress oxidativo, preservou a integridade da BHE, inibiu vias apoptóticas e demonstrou efeitos anti-inflamatórios robustos, reduzindo a ativação microglial e a sinalização pró-inflamatória.Em conclusão, estes resultados sublinham o potencial terapêutico do irbesartan administrado por via IN no tratamento da DA. A eficácia demonstrada na redução da neuroinflamação, do stress oxidativo e na melhoria das funções cognitivas in vivo reforça o potencial deste fármaco como um candidato viável para desenvolvimento clínico. A administração IN do irbesartan surge assim como uma abordagem eficaz para modular os principais processos patológicos associados à DA.FC
Person(s), corporeity(-ies) and disability(-ies): a interconstitutional approach
No full textTese de Doutoramento em Direito apresentada à Faculdade de DireitoNowadays, equality is an indispensable signifier in discourse, particularly in juridical and political discourse. Many might even say that inequality is a thing of the past, since so many steps have been taken to ensure that certain people, who were once excluded, have access to a relatively wide range of human and fundamental rights and freedoms. Nevertheless, the reality is disappointing. Not only has the vector of equality, in so many contexts, been reduced to an ‘empty formula’ with no substantive or material meaning, but the poor (re)distribution of wealth and the proliferation of relations and structures based on power and domination that fuel discrimination, oppression and marginalisation have turned every hope for a just and inclusive community into wishful thinking. In this context, this research aims to assess the role that Law – understood here as an order of validity which considers the person one of its constitutive conditions of emergence – can and should play in the construction of a community in which all people are recognised as such and treated accordingly, regardless of their differences. Hence, disability is mobilized as a case study, focussing in particular on how the perception and signification of certain bodies as ‘abnormal’ or ‘dysfunctional’ has been fuelling a spiral of exclusion which threatens the value of these people (the person-worth) and the value of the person itself (the value-person). The analysis is developed through the use of critical legal thinking with an interconstitutional basis which, on the one hand, mobilises key categories of Marxist-socialist theory as a way of understanding the meaning, foundations and rationale of Law in our current context, particularly within the framework of the capitalist economic system, whilst, on the other hand, paying attention to the transformations resulting from the ongoing phenomena of globalisation and worldisation within the framework of juridicity (in general), as well as constitutional law and jusfundamentality (in particular). The conclusion is that it will not be possible to build an inclusive interconstitutional community without a proper (re)understanding of the classic ‘liberty-equality-fraternity’ triad in the light of the so-called coordination models or theses. In particular, a truly substantive or material concept of equality presupposes the vital dimensions of recognition, distribution and representation, which have not yet been realised. This will only be possible if we come to recognise the countless weaknesses in the dominant Aristotelian egalitarian paradigm, a task to which the social or socio-anthropological model of disability and its ‘rights paradigm’ have made a significant contribution. In fact, the basic premises of this model challenge us to embrace a paradigm of equality for difference, striving for an equality which not only opposes exclusion, but advocates inclusion in itself. In our opinion, one of the strategies capable of operationalising this paradigm is the mobilisation of the ‘discourse of vulnerability’, which is committed to building a Law that is responsive to people's frailty(ies) and vulnerability(ies), therefore guaranteeing that every person has equal conditions to enable them to flourish and emancipate themselves, to ‘be able to be’ and to ‘be able to do’. Ultimately, the aim is to guarantee the jusfundamental parity which is implied in the value of personhood, which lies at the core of the normative principle itself. Based on this theoretical-dogmatic framework, three areas in which the discriminatory treatment of people with disabilities remains blatant are identified, thus reinforcing the thesis that the current Aristotelian-based egalitarian paradigm is incapable of ensuring the protection of the human and fundamental rights and freedoms of every person (especially those in situations or positions of greater vulnerability). From mental health care to political participation, and even within the affective-sexual, family and procreative fields, the everyday reality of people with disabilities continues to be one of ‘amputated citizenship’ and permanent confrontation with exclusion, violence, shame and fear. Only by modifying and, in some cases, repealing the legal-normative framework in force can we open the door to ‘inclusive citizenship’, thus allowing these people to feel and be treated as full members of the legal-political community. It may be that equality is too complex a challenge for humankind. However, it is worth remembering that the same skills employed to produce and preserve inequality(ies) – namely, through Law – can also be used to remedy it(them). Perhaps all that is needed is for us to engage in a dialogue, as virtuous as it is unsettling, with our own essence in order to find the genuine will to do so.Atualmente, a igualdade apresenta-se como um significante indispensável ao discurso, desde logo aquele de matriz jurídico-política. Muitos dirão, inclusive, que a desigualdade é coisa do passado, tantos foram os passos dados no sentido de assegurar a certas pessoas, outrora excluídas, o acesso a um círculo mais ou menos alargado de direitos e liberdades humanas e fundamentais. Acontece que a realidade desanima. Não só o vetor da igualdade tem sido, em tantos contextos, reduzido a uma ‘fórmula vazia’ e desprovida de qualquer conteúdo substantivo ou material, como a má (re)distribuição da riqueza e a proliferação de relações e estruturas de poder e dominação que alimentam fenómenos de discriminação, opressão e marginalização tornam toda a esperança na edificação de uma comunidade justa e inclusiva num mero devaneio onírico. Neste contexto, a presente investigação propõe-se aferir qual o papel que o Direito – aqui entendido como uma ordem de validade que encara a pessoa enquanto sua condição constitutiva de emergência – pode e deve ter na construção de uma comunidade onde todas as pessoas sejam reconhecidas como tal e tratadas em conformidade, independentemente das suas diferenças. Nessa senda, a deficiência é mobilizada como caso de estudo, desde logo tendo em conta o modo como a apreensão e significação de determinados corpos como ‘anormais’ ou ‘disfuncionais’ tem alimentado uma espiral de exclusão, pondo em causa o valor destas pessoas (a pessoa-valor) e a própria pessoa enquanto valor em si mesmo (o valor-pessoa). Tudo isto lançando mão de um pensamento crítico-jurídico de matriz interconstitucional, o qual, por um lado, mobiliza categorias basilares da teoria marxista-socialista como forma de compreender o sentido, fundamento e intenção do Direito no nosso atual contexto e, designadamente, no quadro do sistema económico capitalista; e, por outro lado, se revela atento às transformações advenientes dos fenómenos de globalização e mundialização em curso, quer no quadro da juridicidade (em geral) quer do Direito Constitucional e da jusfundamentalidade (em especial). Concluímos que a edificação de uma comunidade interconstitucional inclusiva não será possível sem a adequada (re)compreensão da tríade clássica ‘liberdade-igualdade-fraternidade’, à luz dos designados modelos ou teses de coordenação. Em particular, um conceito verdadeiramente substantivo ou material de igualdade haverá de pressupor importantes dimensões de reconhecimento, distribuição e representação, que não estão ainda concretizadas. Tal só será possível, designadamente, ante o reconhecimento das inúmeras insuficiências do paradigma igualitário de matriz aristotélica dominante, tarefa para a qual têm contribuído, de forma significativa, o modelo social ou socioantropológico de deficiência e o ‘paradigma dos direitos’ que lhe vem associado. Na verdade, as premissas básicas deste modelo desafiam-nos a abraçar um paradigma da igualdade para a diferença, pugnando-se por uma igualdade que não se contente em contrariar a exclusão, mas que se debata pela inclusão em si mesma. E note-se, na nossa opinião, uma das estratégias orientadas à operacionalização deste paradigma está na mobilização do ‘discurso da vulnerabilidade’, o qual se encontra centrado na edificação de um Direito responsivo à(s) fragilidade(s) e à(s) vulnerabilidade(s) das pessoas, assegurando-lhes iguais condições para florescerem e se emanciparem, para ‘poder ser’ e ‘poder fazer’. Em última instância, o objetivo será o de garantir a paridade jusfundamental que vem implicada no valor-pessoa, no qual surge inucleado o princípio normativo. Partindo deste quadro teorético-dogmático, são identificados três domínios onde o tratamento discriminatório de pessoas com deficiência continua a ser flagrante, assim se reforçando a tese de que o atual paradigma igualitário de matriz aristotélica é incapaz de assegurar a tutela dos direitos e liberdades humanas e fundamentais de todas as pessoas (em especial, daquelas em situação ou posição de maior vulnerabilidade). Da prestação de cuidados de saúde mental à participação política, e mesmo no quadro da vivência afetivo-sexual, familiar e procriativa, a realidade diária das pessoas com deficiência continua a ser a de uma ‘cidadania truncada’... de confronto permanente com a exclusão, a violência, a vergonha e o medo. Só a alteração e, em certos casos, a revogação do quadro jurídico-normativo vigente poderá abrir as portas a ‘cidadanias inclusivas’, transformando estas pessoas em membros de pleno direito da comunidade jurídico-política. Quiçá a igualdade seja um repto demasiado complexo para a humanidade. Sempre vale lembrar, porém, que o mesmo engenho empregue pelo Homem para produzir e conservar a(s) desigualdade(s) – designadamente, através do Direito – também poderá ser utilizado para a(s) consertar. Talvez só falte àquele encontrar, num diálogo tão virtuoso como desconcertante com a essência do seu ser, genuína vontade para que assim seja.FC
Desenvolvimento de uma nova geração de poliuretanos para aplicação em aglomerados na indústria alimentar
No full textTese de Doutoramento em Engenharia Química apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaPolyurethanes (PU) are highly versatile polymers widely used in various applications. However, their production involves the reaction between isocyanates and polyols, which are typically derived from non-renewable sources, posing a disadvantage due to the finite nature of these resources. Additionally, isocyanates present significant health risks. To address these drawbacks, isocyanate-free polyurethanes (Non-Isocyanate Polyurethanes, NIPUs) have emerged, gaining significant attention within the scientific community.NIPUs are obtained from the reaction of cyclic carbonates (CC) with (poly)amines and present a hydroxyl group (-OH) on the β-carbon of the urethane bond, and, because of this, they are commonly referred to as polyhydroxyurethanes (PHU). These materials possess highly attractive properties and, like PU, can be used in a wide range of applications, such as adhesives and coatings.This work aimed to develop a set of NIPUs derived from renewable raw materials for application as adhesives. PHU-based films were prepared using different CCs and (poly)amines, and their properties were evaluated, focusing on mechanical properties and their changes under moist environments.First, crosslinked films were prepared from the reaction of biobased CCs and hyperbranched polyethyleneimine (PEI). The CCs, referred here as BisCC, were synthesized from sebacic acid (SB), azelaic acid (AZ), and adipic acid (AD) derivatives, with high yields (SB BisCC: 91%; AZ BisCC: 90%; AD BisCC: 89%). The films were analyzed in terms of their thermal and mechanical properties, which were found to depend on the chain length of the BisCC. Absorption tests revealed the films' capacity to absorb water (immersion test) or humidity (in an atmosphere with 56% relative humidity, RH). In the 56% RH test, absorption values ranged between 6% and 8%. Despite these low absorption levels, a loss in mechanical properties was observed. To address this issue, the -OH groups at the surface of the films were modified with a stearic acid derivative. The surface modification allowed a recovery of the films' mechanical properties after exposure to a humid atmosphere and subsequent drying.Next, more hydrophobic PHU films were developed using branched CCs derived from trimethylolpropane (TMP), glycerol, and vegetable oil-based polyamines. Both the CCs and polyamines were successfully obtained, and crosslinked films were prepared, and their thermal and mechanical properties were evaluated. The properties of the films primarily depended on the polyamine used in their formulation. Regarding the interaction with water or moist environments, the films absorbed water, although to a lesser extent compared to BisCC/PEI films. Mechanical properties decreased under humid conditions. To mitigate the effect of water, blocked isocyanates based on toluene diisocyanate and diphenylmethane diisocyanate were incorporated into the formulation. The inclusion of blocked isocyanates improved the films' mechanical properties and their recovery after exposure to humid environments.The results for the PHU films suggest that the -OH groups on the β-carbon of the urethane bond are responsible for water/humidity absorption. Consequently, the research proceeded with the use of linear carbonates instead of CCs, as the reaction between linear carbonates and (poly)amines does not generate -OH groups. Linear carbonates were synthesized by the reaction of -OH groups from various polyols with dimethyl carbonate (DMC). However, the quantitative conversion of polyol -OH groups to carbonate groups was not achieved in any case. Attempts to prepare NIPUs using one of the linear carbonates with higher functionality and PEI resulted in materials containing urethane bonds, but these presented as highly viscous pastes, impossible to handle.In summary, this research demonstrated the feasibility of obtaining crosslinked PHU films with distinct properties from various CCs and renewable source-derived (poly)amines. Strategies were also developed to reduce the loss of mechanical properties in PHU films caused by water/humidity absorption.Os poliuretanos (PU) são polímeros muito versáteis, amplamente utilizados em diversas aplicações. No entanto, sua produção envolve a reação entre isocianatos e polióis, que geralmente provêm de fontes não-renováveis, representando uma desvantagem devido à finitude desses recursos. Além disso, os isocianatos apresentam riscos significativos para a saúde. Para colmatar estas desvantagens, surgem os PU isentos de isocianato (Non Isocyanate Polyurethanes (NIPUs)), que têm ganho lugar de destaque na comunidade científica. Os NIPUs são obtidos a partir da reação de carbonatos cíclicos (CC) com (poli)aminas e apresentam um grupo hidroxilo (-OH) no carbono-β da ligação uretana, sendo comummente designados por polihidroxiuretanos (PHU). Estes apresentam um conjunto de características muito interessantes e, tal como os PU, podem ser usados numa vasta gama de aplicações, nomeadamente em adesivos ou revestimentos. Assim, este trabalho de doutoramento teve como objetivo o desenvolvimento de um conjunto de NIPUs a partir de matérias-primas de origem renovável, com vista à sua aplicação como adesivos. Foram preparados filmes de base NIPU, mais especificamente PHU, a partir de diferentes CC e (poli)aminas e avaliadas as suas propriedades, com especial enfoque nas propriedades mecânicas e sua alteração quando os filmes são sujeitos a ambientes húmidos. Primeiramente, foram preparados filmes reticulados a partir da reação de CC biobaseados e polietilenimina (PEI) hiper-ramificada. Os CC, aqui designados por BisCC, foram sintetizados a partir de derivados do ácido sebácico (SB), ácido azelaico (AZ) e ácido adípico (AD), com rendimentos elevados (SB BisCC: 91%; AZ BisCC: 90%; e AD BisCC: 89%). Os filmes foram analisados quanto às suas propriedades térmicas e mecânicas, tendo-se verificado que estas dependiam do tamanho da cadeia dos BisCC. Testes de absorção mostraram que os filmes apresentavam a capacidade de absorverem água (teste de imersão) ou humidade (em atmosfera com 56% HR). No caso do teste em atmosfera com 56% HR, os valores de absorção situaram-se entre 6% e 8%. Apesar destes baixos valores de absorção, verificou-se que os filmes apresentaram uma perda das propriedades mecânicas. Para contornar este problema, procedeu-se à modificação dos grupos -OH à superfície dos filmes com um derivado do ácido esteárico. Verificou-se que a modificação foi bem-sucedida, tendo contribuído para uma melhoria das propriedades mecânicas dos filmes, após serem sujeitos à atmosfera húmida e secos. De seguida foram desenvolvidos filmes de PHU mais hidrofóbicos usando CC ramificados, obtidos a partir de derivados do trimetilolpropano (TMP), do glicerol e (poli)aminas de base óleo vegetal. Os CC e as poliaminas foram obtidos com sucesso. Procedeu-se, de seguida, à preparação dos filmes reticulados. Os filmes foram caracterizados térmica e mecanicamente, tendo-se verificado que as propriedades dos filmes dependiam essencialmente da poliamina usada na formulação. Relativamente à interação dos filmes com água ou ambientes húmidos, verificou-se que estes absorviam água, apesar desta absorção não ser tão alta quando comparada com os filmes de BisCC/PEI. Avaliando as propriedades mecânicas dos filmes sujeitos a atmosfera húmida, verificou-se um decréscimo das mesmas. Para reduzir a influência da ação da água nas propriedades dos filmes, optou-se por incluir na formulação, isocianatos bloqueados de base diisocianato de tolueno e diisocianato de difenilmetano. Com a inclusão dos isocianatos bloqueados, houve uma melhoria das propriedades mecânicas dos filmes, bem como da recuperação das mesmas após estes serem expostos a ambientes húmidos. Os resultados obtidos para os filmes de PHU sugerem que a presença dos grupos -OH no carbono β da ligação uretana são responsáveis pela absorção de água/humidade, pelo que o trabalho prosseguiu com a utilização de carbonatos lineares ao invés de CC, uma vez que a reação entre os carbonatos lineares e (poli)aminas não origina grupos -OH. Primeiramente, sintetizaram-se carbonatos lineares, através da reação dos grupos -OH de diferentes polióis com o dimetilcarbonato (DMC). Em nenhum dos casos foi possível obter uma conversão quantitativa dos grupos -OH dos polióis em grupos carbonato. Tentou-se a preparação de NIPUs a partir de um dos carbonatos lineares (com maior funcionalidade) com a PEI. Apesar de se verificar presença das ligações uretana nos produtos obtidos, todos estes se apresentaram sob a forma de uma pasta altamente viscosa, sem qualquer possibilidade de manuseio. Resumindo, os resultados deste trabalho mostraram que é possível obter filmes de PHU reticulados com propriedades distintas, a partir da utilização de diferentes CC e (poli)aminas derivadas de fonte renovável, tendo sido também desenvolvidas estratégias que permitiram diminuir a perda de propriedades mecânicas dos filmes de PHU, devido à absorção de água/humidade
O Papel do Colesterol na Fertilidade Masculina
No full textTese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina apresentada ao Instituto de Investigação InterdisciplinarCholesterol and calcium (Ca2+) homeostasis are pivotal for sperm function, particularly in the processes of capacitation and fertilisation. Spermatozoa from obese and infertile men tend to exhibit elevated cholesterol levels, which may impair acrosome reaction. With obesity and infertility becoming increasingly prevalent, it is vital to understand the mechanisms underlying the association between them, a subject which remains to be fully elucidated. Novel findings on this topic might also offer a foundation for developing strategies to enhance sperm fertilisation potential. Capacitation, a process involving Ca2+ mobilisation, is regulated by various mechanisms, including cholesterol, and store-operated Ca2+ channels (SOCs, e.g. STIM-Orai complex). In the female reproductive system, cholesterol efflux is facilitated by high-density lipoproteins and albumin. Although cholesterol efflux activates the STIM-Orai complex in somatic cells, this mechanism remains unknown in human sperm cells. This thesis explores the role of cholesterol in male fertility, with a focus on human sperm capacitation and fertilisation potential through in vivo and in vitro strategies, integrating clinical and basic research. The in vivo study examined the relationship between male obesity and infertility using a considerable cohort, of 2,356 and 465 samples, which were utilised for the assessment of both standard and non-conventional sperm parameters, and the analysis of Assisted Reproductive Technologies (ART) outcomes, respectively. The participants were grouped based on their body mass index (BMI). The standard semen analysis revealed no differences between groups; however, spermatozoa from excess weight men (both overweight and obese) exhibited functional deterioration and a lack of cholesterol efflux after in vitro capacitation, in parallel with reduced fertilisation rates following ART procedures.In order to manipulate the plasma membrane cholesterol content and evaluate its role over sperm function, specifically on Ca2+ signalling and SOCs activity, two in vitro approaches were used. Firstly, the well-recognised cholesterol acceptor, bovine serum albumin (BSA), was employed; secondly, methyl-β-cyclodextrin (CD) and cyclodextrin-loaded cholesterol (CLC) were utilised in order to induce cholesterol removal and adding, respectively.Incubation with increasing concentrations of BSA (0–20%) revealed toxicity at high concentrations (≥10%), while lower concentrations enhanced mitochondrial membrane potential and progressive motility - both of which are essential for sperm fertilisation. Surprisingly, BSA did not affect cholesterol efflux or other capacitation-related markers. Additionally, while it did not affect intracellular Ca2+ concentration levels, it increased Ca2+ influx in response to progesterone (P4) at 0.3-0.5% BSA. The findings suggest that the function of albumin in capacitation extends beyond its known role as cholesterol acceptor. The second in vitro approach focused on the regulatory role of cholesterol and the STIM-Orai complex on sperm Ca2+ signalling, as well as the potential connection between cholesterol efflux and SOCs activity. STIM (stromal interaction molecule) and Orai proteins were identified mainly in the sperm midpiece and tail, not suffering redistribution during in vitro capacitation. Cholesterol modulation by CD and CLC revealed that an excess of cholesterol can effectively abolish the sperm’s ability to generate a Ca2+ signal in response to P4, independently of the STIM-Orai complex. This finding suggests the presence of alternative mechanism(s) for SOC regulation and the potential compartmentalisation of signalling pathways, enabling precise coordination of Ca2+-related events. This thesis emphasised the pivotal role of cholesterol homeostasis in male fertility, proposing that the absence of cholesterol efflux in sperm cells of men with excess weight impairs capacitation, resulting in reduced fertilisation rates. Contemporary reports on human sperm cell capacitation incorporates theoretical concepts that are now being contested, particularly those concerning the role of albumin and the regulation of cholesterol efflux during capacitation. Our research underscores the necessity for further studies to fully map the intricate role of cholesterol in sperm function and capacitation.A homeostase do colesterol e do cálcio (Ca2+) são cruciais para a função do espermatozoide, sobretudo nos processos de capacitação e fertilização. Os espermatozoides de indivíduos obesos e inférteis tendem a apresentar níveis elevados de colesterol, o que poderá comprometer a reação acrossómica. Face ao aumento da prevalência da obesidade e da infertilidade, é crucial compreender os mecanismos subjacentes que conduzem à associação entre ambos, uma questão que permanece em grande parte por esclarecer. Os resultados desta investigação podem fornecer uma base para o desenvolvimento de estratégias para otimizar o potencial de fertilização do espermatozoide. A capacitação, um processo que envolve a mobilização de Ca2+, é regulada por diversos mecanismos, incluindo o colesterol e store-operated Ca2+ channels (SOCs; p. ex. complexo STIM-Orai). No sistema reprodutor feminino, o efluxo de colesterol é facilitado por lipoproteínas de alta densidade e pela albumina. Embora o efluxo de colesterol ative o complexo STIM-Orai em células somáticas, este mecanismo permanece inexplorado em espermatozoides humanos.Esta tese aborda o papel do colesterol na fertilidade masculina, centrando-se na capacitação e no potencial de fertilização dos espermatozoides humanos, recorrendo a estratégias in vivo e in vitro, integrando métodos de investigação clínica e básica. O estudo in vivo examinou a relação entre a obesidade masculina e infertilidade, usando uma coorte considerável de 2.356 e 465 amostras, utilizadas para a avaliação de parâmetros standard e não convencionais, bem como para a análise dos resultados de técnicas de Procriação Medicamente Assistida (PMA), respetivamente. Os participantes foram divididos em grupos de acordo com o seu índice de massa corporal (IMC). A análise convencional do sémen não revelou diferenças entre os grupos; contudo, os espermatozoides dos indivíduos com excesso de peso e obesidade demonstraram deterioração funcional e ausência de efluxo de colesterol após capacitação in vitro, e em paralelo uma redução da taxa de fertilização após PMA.Com o objetivo de manipular o conteúdo de colesterol na membrana plasmática e avaliar o seu papel na função do espermatozoide, especialmente na sinalização de Ca2+ e atividade dos SOCs, foram utilizadas duas abordagens in vitro. Inicialmente, foi usada a albumina sérica bovina (BSA), reconhecida como aceitador de colesterol, e posteriormente, foram utilizadas a metil-β-ciclodextrina (CD) e a ciclodextrina associada ao colesterol (cyclodextrin-loaded cholesterol; CLC), de modo a induzir a remoção e adição de colesterol, respetivamente.A incubação com concentrações crescentes de BSA (0-20%) revelou-se tóxica a concentrações altas (≥10%), enquanto que concentrações baixas conduziram ao aumento do potencial de membrana mitocondrial e à mobilidade progressiva – ambos essenciais para a fertilização pelo espermatozoide. Surpreendentemente, BSA não afetou o efluxo de colesterol ou outros marcadores da capacitação. Adicionalmente, embora não tenha afetado a concentração intracelular de Ca2+, a incubação com BSA causou o aumento do influxo de Ca2+ em resposta à progesterona (P4) nas condições de 0,3-0,5% BSA. Estes resultados sugerem que a função da albumina na capacitação ultrapassa o seu papel como aceitador de colesterol.A segunda estratégia in vitro centrou-se no papel regulador do colesterol e do complexo STIM-Orai na sinalização de Ca2+ do espermatozoide, bem como na potencial conexão entre o efluxo de colesterol e a atividade dos SOCs. As proteínas STIM (stromal interaction molecule) e Orai foram identificadas na peça intermédia e cauda do espermatozoide, sem que houvesse uma redistribuição durante a capacitação in vitro. A modelação de colesterol pela CD e a CLC demonstrou que um excesso de colesterol pode eficazmente suprimir a capacidade do espermatozoide gerar sinais de Ca2+ em resposta à P4, independentemente do complexo STIM-Orai. Estes resultados sugerem a existência de mecanismos alternativos para a regulação do SOC e uma potencial compartimentalização das vias de sinalização, permitindo a coordenação precisa de eventos dependentes de Ca2+.Esta tese sublinha a importância da homeostase do colesterol na fertilidade masculina, sugerindo que a ausência de efluxo de colesterol nos espermatozoides de indivíduos com excesso de peso e obesidade é prejudicial para a capacitação, resultando na diminuição das taxas de fertilização. Estudos contemporâneos sobre a capacitação dos espermatozoides humanos incorporam conceitos teóricos que estão agora a ser contestados, nomeadamente no que diz respeito ao papel da albumina e à regulação do efluxo de colesterol durante o processo de capacitação. A investigação realizada indica a necessidade de estudos complementares para uma compreensão mais aprofundada do papel complexo do colesterol na função e capacitação do espermatozoide.FC
Engenharia de Vesículas Extracelulares para Entrega de Ferramentas de Edição Genómica
No full textTese de Doutoramento em Ciências Farmacêuticas apresentada à Faculdade de FarmáciaExtracellular vesicles (EVs) are membrane-enclosed particles secreted by all cell types, with a role in intercellular communication. The cellular crosstalk mediated by EVs is a result of the transfer of proteins, lipids and nucleic acids and the interaction with surface receptors - a process conserved throughout evolution. The ability of EVs to transfer functional cargo and cross biological barriers has prompted interest in engineering these particles as next-generation drug delivery systems.EVs are a promising platform to deliver large therapeutic proteins and ribonucleoproteins, such as gene editing enzymes. However, given the complexity of gene editing technologies and major bottlenecks in efficiently delivering protein-based payloads transiently, further advancements are needed to establish EVs as next-generation drug delivery systems. To address these challenges, this project aims to engineer EVs to efficiently load gene editing enzymes, optimize cargo release and improve their cellular uptake - ultimately achieving high levels of gene editing in vitro and in the context of Spinocerebellar Ataxia Type 3 (SCA3).In chapter 3, we focused on identifying novel proteins enriched in EVs using mass spectrometry analysis. We aimed at identifying cell-type specific scaffolds enriched in EVs derived from neuronal and mesenchymal cells, broadening the ability to engineer these cells to endogenously load therapeutic proteins. We started by optimizing a protocol based on density gradient ultracentrifugation to isolate highly pure EV samples. After establishing a proteomics pipeline, we identified a subset of proteins highly enriched in mesenchymal-derived EVs and neuronal-derived EVs. These scaffolds are promising candidates for generating recombinant proteins with the ability to endogenously loading proteins of interest in EVs.In chapter 4, we engineered the outer surface of EVs to improve cell uptake and delivery efficiency of gene editing enzymes. To do this, we engineered tetraspanin CD63, a known hallmark of small EVs, to display an arginine- and lysine-rich outer surface, named SPARK. We showed that SPARK EVs have a 6.6-fold improvement in cell uptake. SPARK EVs expressing VSV-G – generating virus-like particles (VLPs) - efficiently deliver Cre recombinase in hard-to-transfect cell types. We demonstrate that SPARK VLPs are able to mediate EMX1 gene knockout in vitro. Additionally, to the best of our knowledge, we are the first to demonstrate VLP-mediated delivery of Bxb1 serine recombinase to facilitate a large gene insertion of a 4kb construct provided by lipid nanoparticles (LNP) mediated delivery.In chapter 5, we developed a controllable release system to deliver CRISPR-Cas9 RNPs in EVs as a therapeutic strategy for treating the monogenic neurodegenerative disorder Spinocerebellar Ataxia Type 3 (SCA3). SCA3 is characterized by an expanded CAG triplet repeat in the ATXN3 gene. For this purpose, we engineered an EV-sorting palmitoylation signal with a photocleavable linker, PhoCl, to promote the loading and light-triggered release of CRISPR-Cas9 RNPs from EVs. We showed that this system efficiently packages SpCas9 nuclease and sgRNAs into EVs. Upon blue light activation, EVs deliver more efficiently CRISPR-Cas9 RNPs to recipient cells, reducing ATXN3 levels in vitro. Finally, we demonstrated that CRISPR-Cas9 loaded EVs expressing VSV-G effectively target mutATXN3 in two mouse models of SCA3.In summary, this project provides significant contributions to the engineering of EVs as next-generation drug delivery systems. By addressing key EV bottlenecks, we developed new tools to: 1) improve protein loading in EVs in a cell-type specific manner; 2) modify the EV surface for improved cell delivery; 3) optimize the controlled release of therapeutic cargo from EVs; 4) deliver functional gene editing payloads, such as Cre recombinase, CRISPR-based systems and Bxb1 recombinase; 5) demonstrate the therapeutic efficacy of EVs in neurodegenerative diseases, namely SCA3. EV-based delivery systems represent a promising platform for delivering gene editing technologies, offering the potential to revolutionize the field.As vesículas extracelulares (EVs) são partículas com um envelope membranar segregadas por todos os tipos de células, com um papel na comunicação intercelular. A interação celular mediada pelas EVs é o resultado da transferência de proteínas, lípidos e ácidos nucleicos e da interação com recetores de superfície, sendo um processo conservado ao longo da evolução. A capacidade das EVs para transferir componentes funcionais e atravessar barreiras biológicas despertou o interesse na engenharia destas partículas como sistemas de administração de fármacos de última geração.As EVs são uma plataforma promissora para entregar proteínas terapêuticas de elevada dimensão e ribonucleoproteínas, como enzimas de edição genética. No entanto, dada a complexidade das tecnologias de edição genética e os principais obstáculos na entrega eficiente destes componentes proteicos de forma transitória, o desenvolvimento das EVs como sistemas de administração de fármacos de última geração ainda requer desenvolvimento significativo. Por este motivo, o objetivo deste projeto foi desenvolver EVs para transportar enzimas de edição genética de forma eficiente, otimizar a libertação de carga e melhorar o seu envolvimento com as células alvo, alcançando elevados níveis de edição genética in vitro e no contexto da Ataxia Espinocerebelosa de Tipo 3.No capítulo 3, focámo-nos na identificação de novas proteínas enriquecidas em EVs por análise de espectrometria de massa. Procurámos identificar sinais de empacotamento específicos para EVs derivadas de células neuronais e mesenquimatosas, alargando a capacidade destes tipos de células para incorporar proteínas terapêuticas a nível endógeno. Começámos por otimizar um método de ultracentrifugação por gradiente de densidade que nos permitiu isolar EVs com elevada pureza. Após o estabelecimento de um pipeline de proteómica, identificámos um subconjunto de proteínas altamente enriquecidas em EVs derivadas de células mesenquimatosas e em EVs derivadas de neurónios. Estas proteínas são candidatas promissoras para desenvolver proteínas recombinantes com a capacidade de empacotar de forma endógena proteínas de interesse nas EVs.No capítulo 4, concebemos a superfície externa das EVs com vista a melhorar a internalização nas células-alvo e a eficiência de entrega das enzimas de edição genética. Para tal, modificamos a tetraspanina CD63, um marcador conhecido de EVs de pequeno tamanho, de forma que esta exibisse uma superfície externa rica em argininas e lisinas, denominado SPARK. Mostrámos que as EVs SPARK têm um desempenho 6.6 vezes superior a nível de internalização nas células recetoras. As EVs SPARK com expressão de VSV-G – originando partículas tipo vírus (VLPs) - entregam a Cre recombinase de forma mais eficiente a tipos celulares de difícil transfecção. Demonstramos ainda que as VLPs SPARK são capazes de mediar o knockout do gene EMX1 in vitro. Além disso, tanto quanto sabemos, somos os primeiros a demonstrar a entrega da recombinase Bxb1 mediada por VLPs que resulta na integração genética de um vetor de 4kb entregue por nanopartículas lipídicas (LNPs).No capítulo 5, desenvolvemos um sistema de libertação controlada para administrar RNPs CRISPR-Cas9 em EVs como estratégia terapêutica para tratar uma doença neurodegenerativa monogénica, a Ataxia Espinocerebelosa de Tipo 3 (SCA3). A SCA3 é caracterizada por uma expansão de repetições de CAG no gene da ATXN3. Para este efeito, fundimos um sinal de palmitoilação com uma proteína fotoclivável, PhoCl, para promover o empacotamento e a libertação induzida pela luz de RNPs CRISPR-Cas9 das EVs. Mostramos que este sistema é capaz de empacotar eficientemente a nuclease SpCas9 e as sgRNAs nas EVs. Após ativação por luz azul, as EVs entregam as RNPs CRISPR-Cas9 de forma mais eficiente às células recetoras, reduzindo os níveis de ATXN3 in vitro. Por fim, demonstrámos que as EVs carregadas com CRISPR-Cas9 e que expressam VSV-G são capazes de atingir eficientemente a mutATXN3 em dois modelos de murganho de SCA3.Em resumo, este projeto fornece contribuições significativas para a engenharia de EVs como sistemas de administração de fármacos de última geração. Ao abordar os principais desafios na área das EVs, desenvolvemos novas ferramentas para: 1) melhorar a incorporação de proteínas nas EVs de uma forma específica para cada tipo de célula; 2) modificar a superfície das EVs para uma melhor distribuição nas células alvo; 3) otimizar a libertação controlada de carga terapêutica das EVs; 4) entregar componentes funcionais de edição genética, como a recombinase Cre, sistemas baseados em CRISPR e a recombinase Bxb1; 5) demonstrar eficácia das EVs terapêuticas no contexto de doenças neurodegenerativas, nomeadamente na SCA3. Os resultados obtidos sugerem que os veículos de entrega baseados em EVs são uma plataforma promissora para entregar tecnologias de edição genética com potencial para revolucionar a área.FC