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The Chemistry of Bone Tissue, Assessment of Bone Quality and Preservation by Spectroscopy
No full textDissertação de Mestrado em Antropologia Forense apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA antropologia forense procura estimar o perfil biológico de restos esqueléticos através de métodos bioantropológicos. No entanto, em alguns contextos, é um processo difícil e moroso que pode ser influenciado por fatores tafonómicos, não sendo possível aplicá-los adequadamente. Nestes casos é necessário recorrer a métodos fiáveis e desenvolvidos por outras áreas científicas. A diagénese é um processo complexo que provoca alterações químicas e/ou físicas e estruturais nas propriedades do tecido ósseo. Nesse sentido, o presente estudo teve como objetivo avaliar se os parâmetros wt% componente orgânica, Cal/PO4 e 1PO4/Amida I, obtidos por espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier - reflectância total atenuada (FTIR-ATR), são fiáveis na perceção da influência da diagénese. Para tal, selecionou-se a amostra analisada por Pedrosa (2019), e da qual fazem parte 80 fémures e úmeros pertencentes à Coleção de Esqueletos Identificados Século XXI (CEI/XXI). Utilizou-se ainda dados obtidos por Curate (2011), a DMO (total, colo femoral, grande trocânter, região intertrocantérica e a região de Ward); por Ferreira (2012), o índice de preservação geral (IPG) e a massa do fémur, e por Pedrosa (2019), o índice de cristalinidade (IC), o conteúdo carbonato para fosfato (C/P) e o conteúdo de colagénio (Am/P). Concluiu-se que os fémures dos homens apresentam valores de wt% componente orgânica e Cal/PO4 mais baixos, mas o 1PO4/Amida I aumenta. Estes parâmetros correlacionaram-se com o IPG. Verificou-se que com o aumento da idade à morte a degradação do colagénio diminuiu e a DMO total e das regiões de interesse relacionaram-se com os parâmetros wt% componente orgânica e Cal/PO4, e a DMO da região intertrocantérica mostrou ser a mais suscetível à ação da diagénese. O conteúdo carbonato para fosfato (C/P) diminuiu em prol do aumento do IC, do Cal/PO4 e do wt% componente orgânica, e o IC relacionou-se apenas com o Cal/PO4. As amostras analisadas não sofreram alterações diagenéticas extensivas, uma vez que se obteve valores elevados para a componente orgânica e valores baixos de degradação de colagénio e presença de calcite.Forensic anthropology seeks to estimate the biological profile of skeletal remains throught bioanthropological methods, However, in some contexts, it is difficult and time-consuming process that can be influenced by taphonomic factos, making it impossible to apply them properly. In these cases, i tis necessary to resort to reliable methods developed by other scientific áreas.Diagenesis is a complex process that causes chemical and/or physical and structural changes in the properties of bone tissue. In this sense, the presente study aimed to evaluate whether the parameters wt% organic componente, Cal/PO4 and 1PO4/Amide I, obtained by Fourier-transform infrared spectroscopy - attenuated total reflection (FTIR-ATR), are reliable in the perception of the influence of diagenesis. To this end, the sample analyzed by Pedrosa (2019) was selected, which includes 80 femur and humerus belonging to the 21st Century Identified Skeleton Collection (CEI/XXI).We also used data obtained by Curate (2011), BMD (totl, femoral neck, greater trochanter, intertrochanteric region and Ward’s region); by Ferreira (2012), the general preservation índex (GPI) and the mass of the femur, and by Pedrosa (2019), the crystallinity índex (CI), the carbonate to phosphate contente (C/P) and the collagen contente (Am/P).It was concluded that men’s femurs have lower wt% organic componente and Cal/PO4 values, but 1PO4/Amide I increases. These parameters correlated with the IPG. It was found that with increasing age at death, collagen degradation decreased and the total BMD and that of the regions of interest were related to the parameters wt% organic componente and Cal/PO4, and the BMD of the intertrochanteric region proved to be the most susceptible to the action of diagenesis.The carbonate to phosphate contente (C/P) decreased in favor of the incresse in CI, Cal/PO4 and wt% organic componente, and the CI was related only to Cal/PO4.The analyzed samples did not undergo extensive diagenetic alterations, since high values were obtained for the organic componente and low values for collagen degradation and presence of calcite
IDENTIFICATION OF PROGNOSIS BIOMARKERS IN ONCOLOGY THROUGH GENOMIC AND EPIGENETIC CHARACTERIZATION
No full textDissertação de Mestrado em Genética Clínica Laboratorial apresentada à Faculdade de MedicinaO cancro oral e o cancro do reto são causas significativas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo. Apesar da investigação científica exaustiva, ainda não foram identificados biomarcadores de prognóstico validados para estes tipos de cancro. Este estudo teve como objetivo identificar potenciais biomarcadores de prognóstico através da caracterização genómica e epigenética de amostras tumorais provenientes de doentes com cancro oral e cancro do reto. O estudo visou, também, caracterizar a linha celular WiDr, derivada de um adenocarcinoma colorrectal, como um modelo potencial para a investigação do cancro do reto. Adicionalmente, a quantificação de DNA livre (cfDNA) obtido a partir de biópsias líquidas foi explorada como potencial biomarcador de prognóstico e progressão no cancro oral. A análise da coorte do cancro oral envolveu a quantificação e análise de cfDNA extraído da urina e do plasma em vários momentos durante e após o tratamento, correlacionando-o com as características clínicas dos doentes. O perfil genómico e epigenético das amostras de tumores orais foi estabelecido utilizando as técnicas de Array Ccomparative Genomic Hybridization (aCGH) e de Methylation-Specific Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MS-MLPA). Os resultados revelaram aumentos significativos dos níveis de cfDNA após o tratamento, em comparação com os níveis basais, seguidos de diminuições subsequentes ao longo do tratamento. Alguns doentes com recidiva/metástases apresentaram níveis elevados de cfDNA após o tratamento. A análise por MS-MLPA identificou os genes MLH3 e GTSP1 como frequentemente amplificados, enquanto os genes CDKN2A e VHL foram os mais frequentemente deletados. O gene WT1 mostrou uma alta frequência de metilação. A análise por aCGH revelou ganhos frequentes no número de cópias nos cromossomas 3p, 14q e 15q, e perdas frequentes nos cromossomas 5q, Xp, 3p e 4p. Na análise preliminar da coorte de cancro do reto, os níveis basais de cfDNA foram avaliados em amostras de plasma, tendo sido observada uma grande discrepância entre os doentes. A análise por aCGH das amostras de tumores do reto revelou ganhos recorrentes em 13q e 20q, consistentes com estudos anteriores sobre cancro colorrectal. Tentou-se estabelecer culturas celulares primárias a partir de tecido tumoral do reto, o que foi dificultado devido ao crescimento excessivo de fibroblastos, sendo necessário ainda algumas optimizações. A caracterização da linha celular WiDr através de Citogenética Convencional demonstrou triploidia e vários rearranjos estruturais, nomeadamente del(4)(q32.1), der(5)t(5;13)(p15.3;q12), der(13;13)(q10;q10) e del(X)(p11.3). Será necessário complementar a caracterização molecular desta linha celular com outras técnicas como a Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). Além disso, a análise por aCGH da linha celular WiDr revelou ganhos em 13q e 20q, concordantes com os achados em doentes com cancro do reto. Este estudo fornece informações valiosas sobre a utilidade da quantificação do cfDNA para monitorizar a progressão do cancro oral e identifica características genómicas e epigenéticas frequentes no cancro oral. Além disso, abre caminho a uma caracterização molecular mais abrangente dos doentes com cancro do reto e a uma investigação mais aprofundada da linha celular WiDr, de modo a identificar potenciais biomarcadores de prognóstico para o cancro do reto.Oral cancer and rectal cancer are significant causes of morbidity and mortality worldwide. Despite extensive research, validated prognosis biomarkers for these cancers remain elusive. This study aimed to identify potential prognosis biomarkers through genomic and epigenetic characterization of tumour samples from oral cancer patients and rectal cancer patients. This study also aimed to characterize the WiDr cell line, derived from colorectal adenocarcinoma, as a potential model for rectal cancer research. Liquid biopsy-based quantification of cell-free DNA (cfDNA) was explored as a potential prognostic and progression biomarker in oral cancer. The oral cancer cohort analysis involved quantifying and analyzing cfDNA extracted from urine and plasma at various time points during and after treatment, correlating it with the patients´clinical characteristics. Genomic and epigenetic profiling of oral tumour samples was performed using Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) and Methylation-Specific Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MS-MLPA) techniques. The results revealed significant post-treatment increases in cfDNA levels compared to baseline, followed by subsequent decreases during treatment. Some patients with recurrence/metastasis exhibited elevated cfDNA levels post-treatment. MS-MLPA analysis identified MLH3 and GTSP1 as genes with frequent copy number gains, while CDKN2A and VHL exhibited frequent copy number losses. The WT1 gene showed frequent methylation. The aCGH analysis revealed frequent copy number gains on chromosomes 3p, 14q, and 15q, and frequent losses on chromosomes 5q, Xp, 3p, and 4p. In the preliminary analysis of the rectal cancer cohort, baseline cfDNA levels were measured in plasma samples, and a great discrepancy was observed between the patients. The aCGH analysis of rectal tumour samples revealed recurrent gains in 13q and 20q, consistent with previous colorectal cancer studies. Primary cell cultures from rectal tumour tissue were attempted but hampered by excessive fibroblast growth, and some optimization is still required. Characterization of the WiDr cell line through Conventional Cytogenetics demonstrated triploidy and structural rearrangements, such as del(4)(q32.1), der(5)t(5;13)(p15.3;q12), der(13;13)(q10;q10) e del(X)(p11.3). It will be necessary to further complete the molecular characterization of this cell line with other techniques such as Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH). Additionally, aCGH analysis of the WiDr cell line revealed gains in 13q and 20q, mirroring findings in rectal cancer patients. This study provides valuable insights into the utility of cfDNA quantification for monitoring oral cancer progression and identifies frequent genomic and epigenetic characteristics in oral cancer. Moreover, it paves the way for comprehensive molecular characterization of rectal cancer patients and further investigation of the WiDr cell line, to identify potential prognosis biomarkers for rectal cancer
SortingID: Identificação das proteínas axonais transportadas por endossomas dendríticos
No full textDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaEstablishment and maintenance of neuronal polarity are critical for the development and function of the nervous system. Therefore, neurons have developed sophisticated mechanisms to control the distribution of proteins to their cellular processes. Currently, only the polarization of dendritic membrane proteins is well understood. Dendritic cargoes are sorted into specific populations of vesicles in the Golgi Apparatus and then trafficked directly to the dendrites. On the other hand, the polarization of axonal membrane proteins still remains under intense debate. Golgi-to-axon transport has been proposed as the major trafficking pathway for the polarization of axonal cargoes, but this mechanism has only been demonstrated for a reduced number of proteins. Conversely, a growing number of studies support that axonal membrane proteins may be either first trafficked to the dendritic membrane and then translocated into the axonal domain or equally transported to both compartments, but selectively removed from the dendrites. In addition, loss of dendritic endosome-associated proteins was shown to impair the polarization of numerous axonal proteins, indicating a relevant role for dendritic endosomes in axonal polarization. Therefore, I hypothesize that dendritic endosomes are key sorting stations that direct the polarization of axonal cargoes. To address this question, I sought to identify the axonal cargoes that are trafficked via dendritic endosomes by performing proximity-dependent labeling (PDL) in neuronal cultures. Firstly, I generated plasmids expressing dendritic endosomal markers fused to the biotin ligase TurboID. After assembling the constructs, their biotin ligase activity and pattern of compartmentalization was assessed by western blot and immunocytochemistry. I observed that the fusion proteins colocalized with dendritic endosomes and showed biotin ligase activity in cortical neurons, confirming that they could be used to perform PDL in neuronal cultures. Finally, PDL was performed in dense cultured cortical neurons and the axonal proteins present in dendritic endosomes were identified by streptavidin-mediated pulldown and mass spectrometry (MS). MS followed by protein enrichment analysis identified a total of 58 axonal cargoes that may be trafficked through dendritic endosomes, including 34 membrane proteins. The number of proteins identified suggests a previously underestimated role for dendritic endosomes regarding the polarization of axonal cargoes. Among the membrane proteins identified, three of them, APP, Neurexin-1 and the neural cell adhesion molecule L1, have already been shown to undergo dendritic endosome-mediated transcytosis. Moreover, other members belonging to the family of these proteins were identified in the proteome of dendritic endosomes, indicating that transport through dendritic endosomes might be a conserved trafficking mechanism is these protein families. Lastly, some axonal proteins identified, notably APP, ApoE, Tau and Neurexin family members, have been strongly implicated in neurological disorders. These observations highlight the importance of studying the role of dendritic endosomes in axonal polarization, as it may help elucidating the pathological mechanisms of disease and contribute to the design of new therapies. In summary, I have developed new tools for proteomic analysis through PDL, which allowed me to uncover the axonal proteins that are present in dendritic endosomes, and are likely undergoing sorting in this subcellular compartment. This enhances our comprehension about the role of dendritic endosomes in axonal polarization, but also helps to uncover the trafficking pathways responsible for the polarization of axonal cargoes. Moreover, elucidating these trafficking pathways will be of uttermost importance to understand the mechanisms underlying the maintenance of neuronal polarity and normal brain function.O estabelecimento e a manutenção da polaridade neuronal são fundamentais para o desenvolvimento e função do sistema nervoso. Deste modo, os neurónios desenvolveram mecanismos sofisticados para controlar a distribuição de proteínas para os seus processos neuronais. Atualmente, apenas a polarização das proteínas membranares dendríticas é bem compreendida. As proteínas dendríticas são incorporadas em vesículas específicas no complexo de Golgi e depois são transportadas diretamente para as dendrites. Por outro lado, a polarização das proteínas membranares axonais continua a ser objeto de intensa investigação. O transporte direto do complexo de Golgi para o axónio tem sido proposto como a principal via de transporte que leva à polarização de proteínas axonais, mas este mecanismo apenas foi demonstrado para um número reduzido de proteínas. Por outro lado, um número crescente de estudos apoia a ideia de que as proteínas da membrana axonal são primeiro transportadas para a membrana dendrítica e só depois transcoladas para o axónio, ou igualmente transportadas para ambos os compartimentos, mas seletivamente removidas das dendrites. Para além disso, foi demonstrado que a deleção de proteínas associadas aos endossomas dendríticos contribui para a perda de polarização de numerosas proteínas axonais, indicando que os endossomas dendríticos poderão ter um papel mais relevante para a polarização axonal do que o que se julgava anteriormente. Tendo isto em conta, eu defini como hipótese para este estudo que os endossomas dendríticos são reguladores fundamentais da polarização de proteínas axonais. Para responder a esta questão, eu procurei identificar as proteínas axonais que são transportadas por dos endossomas dendríticos através de marcação dependente da proximidade (PDL) em culturas neuronais. Para isso, comecei por gerar plasmídeos que expressam marcadores de endossomas dendríticos fundidos com a ligase de biotina TurboID. Após a preparação das construções, a sua atividade de ligase de biotina e o padrão de compartimentação foram avaliados por western blot e imunocitoquímica. Eu observei que as proteínas de fusão colocalizavam com endossomas dendríticos endógenos e apresentavam atividade de ligase de biotina em neurónios corticais, confirmando que podiam ser utilizadas para realizar PDL em culturas neuronais. Por último, eu realizei PDL em culturas densas de neurónios corticais e as proteínas axonais presentes nos endossomas dendríticos foram identificadas por espetrometria de massa (MS). Análise do enriquecimento de proteínas dos resultados de MS levou à identificação de um total de 58 proteínas axonais que podem ser transportadas através de endossomas dendríticos, incluindo 34 proteínas membranares. O número de proteínas identificadas sugere um papel previamente subestimado dos endossomas dendríticos no que respeita à polarização de proteínas axonais. Entre as proteínas membranares identificadas, três delas, APP, Neurexina-1 e a molécula de adesão celular neural L1, são conhecidas por sofrer transcitose mediada por endossomas dendríticos. Além disso, outros membros pertencentes à família destas proteínas foram identificados no proteoma dos endossomas dendríticos, indicando que o transporte mediado por endossomas dendríticos pode ser um mecanismo de transporte conservado nestas famílias de proteínas. Por último, algumas das proteínas axonais identificadas, nomeadamente APP, ApoE, Tau e a família das Neurexinas, já foram implicadas em várias doenças neurológicas. Estas observações realçam a importância do estudo do papel dos endossomas dendríticos na polarização axonal, uma vez que pode ajudar a elucidar os mecanismos patológicos das doenças e contribuir para a conceção de novas terapias. Em resumo, eu desenvolvi novas ferramentas para a análise de proteomas através da PDL, o que me permitiu descobrir as proteínas axonais que estão presentes nos endossomas dendríticos e que, provavelmente, são transportadas por estes compartimentos subcelulares. Este trabalho vai contribuir para o aumento da nossa compreensão sobre o papel dos endossomas dendríticos na polarização axonal, mas também ajuda a descobrir as vias de tráfico responsáveis pela polarização das proteínas axonais. Para além disso, a elucidação destas vias de tráfico será de extrema importância para compreender os mecanismos responsáveis pela manutenção da polaridade neuronal e pelo normal funcionamento do cérebro.FCTFCTFCTOutro - Operational Program for Competitiveness and Internationalization, by a Marie Skłodowska-Curie Action Individual Fellowship (GA: 101031398) from the European Commissio
Avaliação da Inibição da ALDH em Células Estaminais do Cancro do Endométrio
No full textDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaEndometrial cancer (EC) is a malignant disease of the inner layer of the uterus. It is the most common gynaecological malignancy in females in developed countries. Cancer Stem Cells (CSC) represent a subpopulation of cells within a tumour that can initiate new tumours and have properties related to stem cells such as self-renewal, proliferative qualities, longevity, invasion, antitumor drug resistance, quiescence, recurrence, and dedifferentiation in several cell types from the tumour. As protein expression reflects physiological conditions despite the genes themselves, an untargeted approach using proteomic analysis will identify molecular fingerprints. The two main MS-based proteomic approaches currently used in biomarker research are top-down and bottom-up approaches.The main aim of this project was to unravel the impact of the Aldehyde dehydrogenase (ALDH) inhibition in the proteome profile of endometrial CSCs. Another goal of the project is to provide an overview of proteomic studies and find correlation with potential proteins found for CSC individualized approach and potential therapeutic targets in EC stemness pathways. As a second goal, we also aimed to investigate if ALDH inhibition can enhance endometrial response to chemotherapy.In ECC-1 and RL95-2, respectively, we found a total of 3,122 proteins and 2,536 proteins. We discovered that the majority of the proteins from this list of up-regulated proteins, specifically in the CSC, were present in the cytoplasm, nucleus, and membrane. Because they were discovered to be shared by ECC-1 CSC (E-CSC) and RL95-2 CSC, we paid particular attention to AAGAB, C7orf73, CEP85L, CIAPIN1, CLCN3, CLCN7, CLPTM1, COX7C, GSN, LSS, MOB3A, NPC2, PPP5C, PPP5D1, and SEC61G.We have only highlighted the top 10 most activated proteins identified in the volcano plot study, which comprise in CSC proteins associated to the nucleus and ribosome and in cell line are related to cell metabolism. Considering the proteins shared by E-CSC and R-CSC, those would be the ones that need additional literature research to analyse the work that has been done with them and determine whether any ground-breaking discoveries in CSC targeting have already been made. One of those, COX7C, has previously been a target in other malignancies. To test the anti-cancer effects of the DEAB-based pharmacological inhibition, we sensitized CSC from both cell lines using DEAB.Similar to many other cancer types, the goal in EC is to improve the chemosensitivity of cancer cells to the therapeutic medications currently being used in treatment by reversing the observed chemoresistance.As demonstrated, ALDH inhibition with DEAB provided an increase in chemosensitivity in ECC-1 and RL95-2 CSCs. These results contribute to the hypothesis of ALDH having an important role in chemoresistance in CSCs from EC.Given the similarities between the proteins found in E-CSC and in R-CSC, those would be the ones that need additional literature research to analyse the work that has been done with them and see whether any revolutionary CSC targeting discoveries have already been made. It can be observed that RL95-2 had more susceptible phenotype to the DEAB inhibition than ECC-1. Thus, these results allow to establish the potential status of DEAB as a chemosensitizer to overcome resistance. These discoveries established the status of DEAB as a potential chemotherapeutic reagent or at least a chemosensitizer to overcome drug resistance.O cancro de endométrio (CE) é uma doença maligna da camada interna do útero. É a doença maligna ginecológica mais comum em mulheres nos países desenvolvidos. As células estaminais cancerígenas (CSC) representam uma subpopulação de células dentro de um tumor que podem iniciar novos tumores e têm propriedades relacionadas às células estaminais, como autorrenovação, qualidades proliferativas, longevidade, invasão, resistência a drogas antitumorais, quiescência, recorrência e desdiferenciação em vários tipos de células do tumor.Como a expressão das proteína reflete as condições fisiológicas, mesmo apesar dos próprios genes, uma abordagem não direcionada usando a análise proteômica identificará impressões digitais moleculares mais verdadeiras. As duas principais abordagens proteômicas baseadas em MS atualmente usadas na pesquisa de biomarcadores são abordagens de cima para baixo e de baixo para cima.O principal objetivo deste projeto foi desvendar o impacto da inibição da aldeído desidrogenase (ALDH) no perfil do proteoma de CSCs endometriais. Outro objetivo do projeto é fornecer uma visão geral dos estudos proteômicos e encontrar correlação com potenciais proteínas encontradas para abordagem individualizada de CSC e potenciais alvos terapêuticos em vias da estaminalidade no CE. Como segundo objetivo, também queremos investigar se a inibição da ALDH pode aumentar a resposta endometrial à quimioterapia.Em ECC-1 e RL95-2, respectivamente, encontrámos um total de 3.122 proteínas e 2.536 proteínas. Descobrimos que a maioria das proteínas desta lista que se encontra up-regulated, especialmente nas CSC, estava presente no citoplasma, núcleo e membrana. Como foi descoberto que as proteinas são similares entre ECC-1 CSC (E-CSC) e RL95-2 CSC, prestamos atenção especial a AAGAB, C7orf73, CEP85L, CIAPIN1, CLCN3, CLCN7, CLPTM1, COX7C, GSN, LSS, MOB3A, NPC2, PPP5C, PPP5D1 e SEC61G.Destacamos apenas as 10 principais proteínas mais ativadas identificadas no estudo do vulcano plot, que compreendem as proteínas das CSC associadas ao núcleo e ribossoma e da linha celular estão relacionadas ao metabolismo celular. Considerando as proteínas similares entre E-CSC e R-CSC, essas seriam as de interesse para pesquisa adicional na literatura de modo a analisar o trabalho que foi feito com elas e determinar se alguma descoberta inovadora no direcionamento de CSC já foi feita. Uma das proteínas, COX7C, já foi alvo em outros cancros. Para testar os efeitos anticancerígenos da inibição farmacológica baseada em DEAB, sensibilizamos CSC de ambas as linhas celulares usando DEAB.Semelhante a muitos outros tipos de cancro, o objetivo no CE é melhorar a quimiossensibilidade das células cancerígenas aos medicamentos terapêuticos atualmente usados no tratamento, revertendo a quimiorresistência observada.Conforme demonstrado, a inibição da ALDH com DEAB proporcionou um aumento na quimiossensibilidade em CSC de ECC-1 e RL95-2. Estes resultados contribuem para a hipótese da ALDH ter um papel importante na quimiorresistência das CSC no CE.Dadas as semelhanças entre as proteínas encontradas em E-CSC e em R-CSC, essas seriam as que precisariam de pesquisa adicional na literatura para analisar o trabalho que foi feito com elas e ver se alguma descoberta revolucionária de direcionamento de CSC já foi feita.Pode-se observar que RL95-2 apresentou fenótipo mais suscetível à inibição de DEAB do que ECC-1. Assim, esses resultados permitem estabelecer o status potencial do DEAB como um quimiossensibilizador para vencer a resistência. Essas descobertas estabeleceram o status do DEAB como um potencial reagente quimioterapêutico ou, pelo menos, um quimiossensibilizador para superar a resistência aos medicamentos
O papel da stargazina na regulação da excitabilidade neuronal
No full textTese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina apresentada ao Instituto de Investigação InterdisciplinarA excitabilidade neuronal é uma propriedade fundamental dos neurónios, que lhes confere a capacidade de gerarem impulsos eléctricos em resposta a estímulos, e que está na base da comunicação neuronal. A corrente-M é um tipo de corrente de potássio de limiar baixo que controla a excitabilidade dos neurónios, contribuindo para a diminuição do disparo consecutivo de potenciais de ação. Os canais M associam-se em tetrâmeros que podem ser homo ou heteroméricos e são alvo de várias formas de neuromodulação. Mutações no gene KCNQ2, que codifica a subunidade Kv7.2 deste canais, são responsáveis por várias formas de epilepsia e doenças do neurodesenvolvimento. Apesar das correntes-M serem críticas na regulação da excitabilidade e a sua disfunção ser causa de epilepsia, são ainda pouco conhecidas formas de regulação destas correntes. Neste trabalho identificou-se um novo interactor da subunidade Kv7.2, a proteína stargazina, uma proteína já caracterizada como proteína auxiliar os receptores de glutamato do tipo AMPA. Neste trabalho, foi caracterizada a nova interação entre stargazina e Kv7.2 e foi testado o seu impacto na modulação da excitabilidade neuronal.Através de ensaios de co-immunoprecipitação e de ligação de proximidade verificámos que a stargazina interage com canais Kv7.2 em neurónios. A co-expressão de stargazina com Kv7.2 aumentou a expressão do canal à superfície da célula e potenciou as correntes mediadas por Kv7.2, sem causar alterações na resposta dependente de voltagem. Quando a expressão de stargazina foi silenciada em neurónios, ensaios eletrofisiológicos revelaram diminuição das correntes-M, e ensaios de microscopia de super-resolução evidenciaram alterações da nano-organização do canais-M-Kv7.2. O impacto de uma mutação na stargazina associada a défice intelectual na regulação de canais-M-Kv7.2 foi também avaliado. Esta variante da stargazina não potenciou as correntes mediadas pelos canais de Kv7.2, e os neurónios do subículo de um modelo murganho knock-in para esta forma mutada da stargazina apresentam as correntes-M diminuídas e baixa hiperpolarização do potencial de membrana após indução de disparos consecutivos. Estes animais apresentaram também uma maior susceptibilidade à indução de convulsões com pentilenetetrazol.Conjuntamente com a diminuição de disparos consecutivos, as correntes-M regulam a plasticidade estrutural do segmento inicial do axónio (AIS), um compartimento neuronal onde há um enriquecimento em canais iónicos sensíveis a voltagem que estão na génese de potenciais de ação. A morfologia do AIS e a sua plasticidade têm um papel muito importante na regulação da excitabilidade neuronal. Verificámos que ao silenciar a stargazina em neurónios, estes apresentaram um AIS mais longo e com uma posição mais distal em relação ao soma. Já os neurónios de murganhos knock-in para a mutação de stargazina apresentaram também um AIS mais longo, mas localizado mais próximo do soma. Os neurónios onde a stargazina foi silenciada não apresentaram plasticidade homeostática do AIS em resposta a atividade neuronal prolongada. Assim, a stargazina revela-se uma proteína importante para os mecanismos de plasticidade do AIS.Este trabalho apresenta um conjunto de dados que sugerem uma nova função da stargazina no controlo da excitabilidade neuronal por duas vias, através da modulação dos canais-M-Kv7.2 e através a regulação da plasticidade do AIS. Esta nova função da stargazina pode estar alterada em doenças do neurodesenvolvimento com origem genética.Neuronal excitability refers to the ability of neurons to generate a change in membrane voltage in response to stimuli, and it is a fundamental characteristic of neurons at the basis of neuronal communication. The M-current is a low-threshold potassium current that determines neuronal excitability and contributes to dampening repetitive neuronal firing. M-channels assemble as tetramers of homomeric Kv7.2 or heteromeric Kv7.2-7.3 subunits and are targets of neuromodulation. Mutations in the KCNQ2 gene, encoding for Kv7.2 subunits, are responsible for epilepsy and neurodevelopmental disorders. Although M-currents critically contribute to neuronal excitability, and their dysfunction is a common epileptogenic mechanism, little is known about how M-channels are regulated. We have identified stargazin, a well-known regulator of AMPA receptors trafficking and gating, as a new interactor of the Kv7.2 subunit of M-channels. Here, we characterized the Kv7.2-stargazin interaction and tested its functional relevance for regulating neuronal excitability.Co-immunoprecipitation and proximity ligation assays revealed that the stargazin-Kv7.2 interaction occurs in neurons. Co-expression of stargazin with Kv7.2 increased the channel surface expression and potentiated Kv7.2-mediated currents, without changing their voltage dependence. Conversely, stargazin silencing in cultured cortical neurons decreased current sensitivity to the M-channel specific blocker XE-991 and reduced the hyperpolarization induced by the M-channel activator retigabine, indicating decreased neuronal M-currents in the absence of stargazin. Stargazin depletion in neurons also impacted the cluster organization of Kv7.2 channels at the nano-structure level, as determined by super-resolution microscopy. Interestingly, a variant of stargazin associated with intellectual disability failed to potentiate M-currents when co-expressed with Kv7.2. Additionally, a knock-in mouse model harbouring this stargazin variant showed decreased M-currents and reduced medium after burst-hyperpolarization in pyramidal subiculum neurons and enhanced susceptibility to pentylenetetrazol-induced seizures.In addition to their contribution to dampening repetitive firing, M-currents impact the organization and position of the axon initial segment (AIS), a structure responsible for clustering voltage-gated ion channels, and which mediates action potential generation. The AIS morphology and plasticity have a critical role in setting proper neuronal excitability. Stargazin knock-down induced a lengthening of the AIS and its distal positioning away from the soma in cultured cortical neurons, and knock-in animals harbouring the intellectual disability-associated form of stargazin displayed abnormal size and positioning of the AIS in subiculum neurons. Moreover, neurons depleted from stargazin showed impaired AIS plasticity upon chronic activity stimulation. These results suggest that stargazin is implicated in the organization and plasticity of the AIS.Collectively, our data support a novel function for stargazin in the control of neuronal excitability through the regulation of M-channel activity and of structural plasticity of the AIS. This role of stargazin may be impaired in neurodevelopmental disorders associated with genetic disruption of stargazin.FCTFCTFCTFCTFCTOutro - COMPETE 2020 - Operational Programme for Competitiveness and Internationalisation and Portuguese national funds via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, LA/P/0058/2020Outro - Potassium channel dysfunction in models of
neurodevelopmental disorders
“la Caixa” Foundation (ID 100010434), and FCT, I.P under the project code LCF/PR/HP20/5230000
O Papel dos Mecanismos de Transporte Nucleocitoplasmático na Patogénese da Doença de Machado-Joseph
No full textTese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina apresentada ao Instituto de Investigação InterdisciplinarA doença de Machado-Joseph (DMJ) é uma doença neurodegenerativa caracterizada por uma expansão anormal do número de trinucleótidos CAG no gene ATXN3, traduzindo-se cadeia excessivamente longa de glutaminas na proteína ataxina-3. A formação de agregados nucleares de ataxina-3 em regiões específicas do cérebro é uma característica importante da neuropatologia e progressão desta doença. Os mecanismos celulares de transporte nucleocitoplasmático têm vindo a ganhar atenção na área das doenças neurodegenerativas uma vez que podem explicar a má localização e disfunção de, não apenas proteínas aberrantes associadas a cada doença, mas também de outras macromoléculas que intervêm noutras vias neuronais afetadas. A fim de clarificar o papel das proteínas de transporte nucleocitoplasmáticas na DMJ, um total de 34 proteínas de transporte nucleocitoplasmáticas foram seleccionadas e avaliadas quanto à sua capacidade de modular a agregação de Atxn3 por técnicas de filter trap e análise de fracionamento celular e uma proteína foi selecionada para prosseguir com análises in vitro e in vivo mais detalhadas. A análise de neuropatologia e comportamento num modelo transgênico Q69 de ratinho foi também realizada para avaliar o efeito modulador da proteína de transporte nucleocitoplasmático selecionada. Os nossos resultados demonstraram que o silenciamento da do gene IPO8 (gene que codifica a Importina-8, Imp8) reduz a agregação da Ataxina-3, prevenindo assim a disfunção neuronal e morte celular. O silenciamento do gene Ipo8 in vivo no cerebelo de murganhos transgênicos 69Q levou à melhoria do seu equilíbrio e coordenação motora, apresentando-se como uma estratégia eficiente para retardar a progressão da doença. Adicionalmente, os nossos dados sugerem que a Imp8 pode exercer seu efeito protetor modulando a expressão e atividade de duas outras proteínas, o fator de transcrição p65 da via de sinalização NF-kB (NF-kB/p65) e a Argonauta-2 (Ago2), que também já foram associadas à DMJ. Em conclusão, os nossos dados fornecem evidências de que a Imp8 é uma proteína moduladora da neuropatologia da DMJ, retardando a agregação da ataxina-3 e prevenindo a perda neuronal ao intervir em múltiplas vias neuropatológicas, apresentando-se assim como uma estratégia terapêutica promissora para a doença.Machado–Joseph disease (MJD) is a neurodegenerative disorder characterized by an abnormal expansion of the number of CAG triplets in the ATXN3 gene, translating into an elongated polyglutamine tract within the ataxin-3 protein. The formation of nuclear ataxin-3 aggregates in neurons of specific brain regions is an important hallmark for disease neuropathology and progression. Accordingly, the nucleocytoplasmic transport mechanisms are gaining increasing attention in the field of the neurodegenerative disorders as they can explain the mislocalization and dysfunction not only of the disease-associated aberrant proteins, but also of other macromolecules intervening in the affected neuronal pathways. In order to understand the role of nucleocytoplasmic transport proteins in MJD, we screened a total of 34 nucleocytoplasmic transport proteins for their capacity to modulate Atxn3 aggregation by filter trap and fractionation analysis and selected an efficient candidate to proceed with further in vitro and in vivo analysis. Neuropathology and behaviour analysis was also performed to evaluate the modulatory effect of the selected nucleocytoplasmic transport protein in the Q69 transgenic MJD mouse model. Our results confirmed that downregulation of Ipo8 (Importin-8 coding gene) reduces Ataxin-3 aggregation, preventing neuronal dysfunction and death. Importantly, in vivo silencing of Ipo8 in the cerebellum of 69Q transgenic mice led to the alleviation of balance and motor coordination impairments, standing as an efficient strategy to delay disease progression. In addition, our data suggest that Importin-8 may exert its protective effect by modulating the expression and activity of two Imp8 described cargos, the Transcription factor 65 of the NF-kB signaling pathway and Argonaute-2, that have also been previously linked with MJD. Overall, our results provide evidence that Imp8 is a modulator of Machado-Joseph neuropathology, and that its silencing delays ataxin-3 aggregation and prevents neuronal loss by intervening in multiple neuropathological pathways, thus, standing as a promising therapeutic strategy for the disease.FC
Dissecção do papel dos neurônios inibidores positivos para a parvalbumina nos fenótipos celulares e comportamentais associados à deleção de Gprasp2
No full textTese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina apresentada ao Instituto de Investigação InterdisciplinarGprasp2 is a member of the G protein-coupled receptor associated sorting protein (GPRASP) family of genes. Deletion of Gprasp2 in mice leads to cognitive dysfunction, perturbed synaptic communication, and a broad range of behavioral alterations. Considering there is an enrichment of Gprasp2 in GABAergic cells, we aimed to explore the consequences of Gprasp2 deletion in the hippocampal inhibitory circuit. Our electrophysiological characterization in adult mice with global Gprasp2 deletion pointed to changes in GABA-mediated miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSC) in CA1 pyramidal neurons, which supports a functional role for this gene in inhibitory synapses.Since Gprasp2 is highly enriched in a subset of parvalbumin (PV)-positive inhibitory neurons, we generated a conditional knockout of Gprasp2 only in PV+ neurons to elucidate its function. To achieve this, we crossed (i) ROSA26 loxP-STOP-loxP-tdTomato mice with a (ii) PV-Cre driver line and (iii) our conditional Gprasp2 mice.Behavioral assessment in this line showed that Gprasp2 deletion in PV inhibitory neurons is sufficient to disrupt performance in tasks associated with working memory, associative memory, or social memory. Electrophysiological recordings also showed alterations in inhibitory synaptic circuits in the hippocampus, including altered mIPSC amplitude in CA1 pyramidal neurons and altered mIPSC in PV+ neurons in the stratum oriens and stratum pyramidale. However, our data analysis suggests that the observed electrophysiology phenotype could arise from circuit adaptations – compensatory mechanisms – following Gprasp2 deletion in PV+ neurons. To further explore the primary role and mechanism of Gprasp2 in vivo, we then performed a preliminary assay aimed at provoking an acute and sparse deletion of Gprasp2 in inhibitory neurons in the hippocampus. This was achieved via the local delivery of AVVs carrying a Cre payload under the control of mDlx5/6 promoter. This should lead to a small number of Gprasp2 knockout inhibitory neurons surrounded by mostly non-deleted cells.Altogether, our work shows an important functional role for Gprasp2 in PV+ inhibitory neurons and highlights the relevance, not only of this gene, but of an intact PV+ inhibitory system, in the appearance of phenotypes associated with cognitive and memory dysfunction and alterations in social behaviors.Gprasp2 é um membro da família de genes associados a recetores acoplados a proteínas G (GPRASP). A deleção deste gene num modelo de murganhos desencadeia vários fenótipos, tais como disfunção cognitiva, perturbações na comunicação sináptica e alterações comportamentais. Tendo em consideração a elevada expressão de Gprasp2 nos neurónios GABAérgicos, neste trabalho pretendeu-se explorar as consequências da deleção de Gprasp2 no circuito inibitório do hipocampo. A deleção global da Gprasp2 desencadeia alterações nos registos eletrofisiológicos de correntes pós-sinápticas inibitórias, mediadas por recetores inotrópicos de GABA, nos neurónios piramidais no hipocampo, em murganhos adultos. Este resultado destaca o papel relevante deste gene nas sinapses inibitórias. Como a Gprasp2 é altamente expressa em neurónios inibitórios positivos para parvalbumina (PV), um subconjunto de neurónios inibitórios, este trabalho teve ainda como objetivo explorar a função da Gprasp2 nestes neurónios. Para tal, foi gerado um modelo animal com a deleção condicional da Gprasp2 apenas nos neurónios PV+, através do cruzamento de (i) murganhos ROSA26 loxP-STOP-loxP-tdTomato com uma (ii) linha PV-Cre e (iii) os murganhos condicionais para o gene Gprasp2.A caracterização comportamental deste modelo revelou que a deleção de Gprasp2 em neurónios PV+ é suficiente para desencadear alterações no desempenho de tarefas associadas a memória, nomeadamente memória associativa e social. Adicionalmente, os registos eletrofisiológicos indicam alterações nos circuitos inibitórios no hipocampo, nomeadamente alterações nas correntes inibitórias em neurónios excitatórios e PV+ de diferentes camadas do hipocampo dorsal. De uma forma geral, os resultados indicam que os fenótipos eletrofisiológicos observados podem ser uma consequência de uma adaptação do circuito, através de mecanismos compensatórios, após a deleção de Gprasp2 nos neurónios que expressam PV. Para explorar mais detalhadamente a função e os mecanismos associados à Gprasp2 in vivo, foram realizados ensaios preliminares com a deleção aguda e espacialmente dispersa da Gprasp2 em neurónios inibitórios do hipocampo através da injeção estereotaxia de vírus adeno-associados (AAV) com Cre, sob o controlo do promotor mDlx5/6. Através do uso desta estratégia foi possível a deleção da Gprasp2 num pequeno número de neurónios inibitórios, que se encontram num ambiente no qual a maioria das células envolventes expressa Gprasp2. Em suma, com este trabalho mostrámos o papel funcional da Gprasp2 nos neurónios inibitórios que expressam PV e destacámos a relevância deste gene e do normal funcionamento do sistema inibitório, para o desempenho de funções cognitivas e de memória, bem como comportamentos sociais.FC
Revestimentos de base biológica para melhoria das propriedades de impressão e barreira de papéis
No full textTese de Programa Doutoral em Biorrefinarias apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaO revestimento da superfície do papel com o objetivo de melhorar algumas das suas propriedades é uma prática comum na indústria papeleira. Para tornar o processo de revestimento mais sustentável é importante que as indústrias considerem a substituição dos componentes de revestimento baseados em petróleo por recursos renováveis. Materiais naturais de origem vegetal, tais como a celulose e o amido, são comumente utilizados na indústria do papel; no entanto, estes materiais também podem ser modificados para melhorar a sua utilidade no fabrico de papel. O amido catiónico (CS), um derivado do amido, é amplamente utilizado como floculante e aditivos de resistência a seco e a húmido. Além disso, os materiais celulósicos de tamanho nanométrico permitem aumentar a resistência, reter cargas, melhorar a qualidade de impressão e aumentar as propriedades de barreira.Neste estudo foi desenvolvida uma nova metodologia para sintetizar betainato de amido (SB), usando cloreto de betaina (BetHCl), com o objetivo de reduzir as preocupações ambientais sobre o uso atual de reagentes catiónicos para sintetizar CS. Este processo, de transesterificação, envolve a reação do amido com cloreto de metilbetainato (MeBetCl) em meio aprótico ou no estado sólido, sob condições alcalinas ou ácidas. Os SBs resultantes, com um grau de substituição (DS) de até 0,4, em solução, foram caracterizados usando várias técnicas. A transesterificação oferece uma alternativa promissora aos éteres convencionais para a produção de CS.O potencial de amidos catiónicos altamente substituídos para melhorar a qualidade de impressão do papel foi investigado. Amido catiónico obtido a partir decloreto de 3-cloro-2-hidroxipropil trimetil amónio (CHPTAC) (referido como "éter de amido catiónico altamente substituído (HCS)") e também obtido por transesterificação (referido como "SB com um DS de 0,3) foram aplicados em papéis base. Tanto o HCS quanto o SB melhoraram as propriedades de impressão; no entanto, a presença de HCS reduziu o efeito do agente branqueador ótico (OBA). Uma vantagem do SB é que este efeito sobre o OBA não foi observado quando o SB foi usado nas formulações.Este estudo também examinou o efeito, na qualidade de impressão, da combinação de CSs (tanto HCS quanto SB) com copolímeros de tribloco (Pluronics-P123 e F127) e com carbonato de cálcio precipitado (PCC). O uso destes componentes mostrou um efeito significativo na química da superfície do papel, com um equilíbrio entre hidrofobicidade e hidrofilicidade benéfico para melhorar a qualidade de impressão.Foram também avaliados os efeitos de diferentes concentrações de micro/nanofibrilas de celulose (M/NFCs), preparadas com vários métodos de pré-tratamento, nas propriedades de impressão de papel. O estudo apresenta uma abordagem não convencional para preparar formulações de revestimento uniformes usando M/NFCs. Verificou-se que a viscosidade e a tensão de escoamento aumentaram com o aumento da concentração de M/NFCs devido ao aumento do entrelaçamento de fibras. Quando aplicadas em superfícies de papel, formulações com concentrações mais baixas de M/NFCs e com viscosidade e tensão de corte intermédias revelaram-se adequadas para obter revestimentos uniformes.M/NFCs, especialmente a celulose microfibrilada produzida mecanicamente (m-MFC) e a produzida enzimaticamente (e-MFC), mostraram ser eficazes para melhorar a qualidade de impressão e foram usadas em combinação com outros componentes de revestimento, como o amido, SB, BetHCl, P123, PCC e OBA. Essas combinações aumentaram a qualidade de impressão e a brancura do papel, sendo o BetHCl particularmente eficaz quando usado com m-MFC, PCC e Pluronics. Já a celulose nanofibrilada produzida cationicamente, assim como a produzida por oxidação mediada por TEMPO, não se revelaram adequadas devido aos efeitos negativos na brancura e ao custo adicional de pré-tratamento químico, respectivamente.Para revestimentos com propriedades de barreira, os materiais baseados em celulose são uma alternativa para materiais de embalagem revestidos com plástico, devido à sua biodegradabilidade, reciclabilidade e compatibilidade com alimentos. No entanto, o seu uso na indústria de embalagem de alimentos é limitado devido aos custos mais elevados associados à sua produção. As microfibrilas de celulose (MFCs) são uma alternativa potencialmente mais económica devido aos seus custos de produção mais baixos e à sua capacidade de serem usadas com alto teor de sólidos, o que reduz o custo de secagem. No entanto, as MFCs apresentam uma fraca adesão à superfície, heterogeneidade e viscosidade elevadas, e, portanto, um modificador reológico como a carboximetilcelulose (CMC) é geralmente necessário para facilitar a sua aplicação em revestimentos e promover uma boa dispersão. Este estudo revelou ainda que os revestimentos de MFCs/CMC aplicados com lâmina conduzem a boas propriedades de barreira ao oxigénio, sendo melhores os revestimentos de e-MFC/CMC do que os de m-MFC/CMC.The coating of paper surfaces is a common practice in the paper industry that aims to improve the properties of the paper. In order to make the coating process more sustainable, it is important for industries to consider replacing petroleum-based coating components with renewable resources. Bio-based materials, such as cellulose and starch, are commonly used in the paper industry to produce paper, but these materials can also be modified to improve their usefulness in the papermaking process. Cationic starch (CS), a derivative of starch, is widely used in the paper industry as a dry and wet strengthening and flocculant agent. Additionally, nanoscale cellulosic materials have been shown to enhance strength, retain fillers, improve printing quality, and increase barrier properties.A new method for synthesizing cationic starch ester (starch betainate (SB)) using betaine hydrochloride (BetHCl) has been developed to reduce the environmental concerns associated with the current use of cationic reagents for synthesizing CS. This process, called transesterification, involves reacting starch with methyl betainate chloride (MeBetCl) in aprotic media or in the solid state, under both alkaline and acidic conditions. The resulting SBs were characterized using various techniques, and the process achieved a degree of substitution (DS) of up to 0.4 in solution. Transesterification offers a promising alternative to conventional ethers for the production of CS.The potential of highly substituted CS for improving paper printing quality was investigated. Both CSs obtained by 3-chloro-2-hydroxypropyl trimethyl ammonium chloride (CHPTAC) (referred to as “highly substituted cationic starch ether (HCS)”) and by transesterification (referred to as “SB”) with a DS of 0.3 were applied to base papers. Both HCS and SB improved printing properties. However, the presence of HCS reduced the effect of optical brightening agent (OBA), often known as OBA quenching. An advantage of SB is that this effect on OBA was not observed when SB was used in the formulations.This study also examined the effect of combining CSs (both, HCS and SB) with triblock copolymers (Pluronics®-P123 and F127) and precipitated calcium carbonate (PCC) on printing quality of paper. The use of these coating components on the paper surface, improved printing quality. The applied components also showed a significantly effect on the surface chemistry of the paper, with a balance between hydrophobicity and hydrophilicity being beneficial for im- proving paper printing quality. Increasing the concentration of CS, PCC, and triblock copolymers decreased hydrophobicity and increased water penetration.The effects of different concentrations of micro/nanofibrillated celluloses (M/NFCs) prepared using various pretreatment methods on the printing properties of paper were also evaluated. The study also presents an unconventional approach for preparing uniform coating formulations using M/NFCs. It was found that the shear viscosity and yield stress increased with increasing M/NFCs concentration due to increased fiber entanglement. When applied to paper surfaces, lower concentrations of M/NFCs with intermediate shear viscosity and yield stress were found to be suitable for achieving uniform coatings.M/NFCs, particularly mechanically produced microfibrillated cellulose (m-MFC) and enzymatically produced microfibrillated cellulose (e-MFC), were found to be effective in im- proving printing quality and were used in combination with other coating components such as starch, SB, BetHCl, P123, PCC and OBA. These combinations enhanced the printing quality and whiteness of the paper, with BetHCl being particularly effective when used with m-MFC, PCC, and Pluronics. However, cationic produced nanofibrillated cellulose (c-NFC) and TEMPO mediated oxidation produced nanofibrillated cellulose (t-NFC) were not recommended due to their negative effects on whiteness and the added cost of chemical pretreatment, respectively.In the context of barrier coatings, cellulosic-based materials are a widely accepted alternative to plastic-based packaging materials due to their biodegradability, recyclability, and compatibility with food. However, their use in the food packaging industry is limited due to the higher costs associated with their production. Microfibrillated celluloses (MFCs) are a potentially more cost-effective alternative due to their lower production costs and ability to be used with high solids content, which reduces the cost of drying. However, MFCs have poor adhesion, heterogeneity and high inherent viscosity, so a rheology modifier like carboxymethyl cellulose (CMC) is often required to improve their film-making properties and disperse them evenly in coating formulations. This study found that MFCs/CMC coatings applied with a casting knife showed good oxygen barrier properties and that e-MFC/CMC coatings had particularly good oxygen barrier properties compared to m-MFC/CMC coatings.Outro - Project Inpactus – innovative products and technologies from eucalyptus, Project N.º 21874 funded by Portugal 2020 through the European Regional Development Fund (ERDF) in the framework of COMPETE 2020 nº246/AXIS II/201
Entrega de fármacos e imagiologia fotoacústica
No full textTese de Doutoramento em Química apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaO futuro da medicina passa pela medicina personalizada com agentes terapêuticos específicos para cada paciente, potenciando o efeito terapêutico. Isto só é possível combinando poderosas técnicas de imagem molecular e tratamentos individualizados.A tomografia fotoacústica (PAT, do inglês photoacoustic tomography) é uma técnica de imagiologia inovadora desenvolvida nas últimas décadas. A PAT explora o efeito termoelástico para transformar a energia de um feixe de luz em ondas de pressão. A hemoglobina pode ser utilizada como agente de contraste endógeno para visualizar estruturas vasculares, mas a translação da PAT para a clínica requer o desenvolvimento de melhores agentes de contraste. Nomeadamente, os macrociclos tetrapirrólicos reúnem as características certas para serem utilizados em PAT, e a sua combinação com agentes de contraste de mudança de fase pode aumentar a sua eficiência. As nanogotículas são partículas metastáveis compostas por um núcleo de perfluorocarbono que podem sofrer uma transição de fase quando sujeitas a alterações de temperatura ou pressão, levando a um aumento da intensidade das ondas fotoacústicas (PAW, do inglês photoacoustic wave) resultantes.Neste estudo, nanogotículas, preparadas com perfluoropentano e albumina, foram usadas para incorporar macrociclos tetrapirrólicos e gerar PAWs mais intensas após a mudança de fase. Para modular a solubilidade dos macrociclos tetrapirrólicos em perfluoropentano, foram adicionadas diferentes cadeias laterais às moléculas sintetizadas. Os metais usados para as reações de complexação são paramagnéticos uma vez que promovem o decaimento não-radiativo. A vaporização destas estruturas após absorção de luz laser pulsada foi analisada utilizando calorimetria fotoacústica, comparando o sinal fotoacústico produzido com uma solução de albumina de referência, para avaliar se estávamos na presença de um processo de vaporização. O sinal fotoacústico é mais intenso nas nanogotículas em comparação com as soluções BSA, sugerindo que o contraste na PAT pode ser melhorado através do uso destas estruturas.As PAWs podem ser geradas utilizando um material piezofotónico que converte eficientemente a energia de um laser pulsado em pulsos de pressão. Uma das aplicações destas PAWs é permeabilizar transientemente as camadas externas da pele ou células. Uma vez que o microambiente tumoral se caracteriza por um sistema de circulação sanguínea ineficiente, que tem impacto na perfusão e distribuição de fármacos, investigámos a possível utilização de PAWs em priming fotoacústico de tumores. O priming pode aumentar a permeação de fármacos, desde moléculas pequenas a macromoléculas, e uniformizar a sua distribuição por todo o tumor. Uma das aplicações do priming tumoral é na entrega de fotossensibilizadores (PS, do inglês photosensitizer), para melhorar a eficácia da terapia fotodinâmica (PDT, do inglês photodynamic therapy), ou de anticorpos monoclonais (mAb, do inglês monoclonal antibody), para imunoterapia. Os mAbs ou PSs têm tipicamente um peso molecular elevado e, apesar de beneficiarem do efeito de maior retenção e permeação no tumor, não se distribuem uniformemente no mesmo. O modelo tumoral 4T1 é um modelo agressivo de cancro da mama metastático, que apresenta uma pobre perfusão de fármacos e maus resultados terapêuticos. Os tratamentos de PDT e imunoterapia com este modelo levam a pequenas melhorarias na sobrevivência dos animais, mas não resultam em curas A redaporfin é um PS em ensaios clínicos para cancro avançado da cabeça e pescoço e tem sido estudada para PDT vascular em vários modelos animais. Pode também ser utilizada em PAT para visualizar a distribuição no tumor antes do tratamento. A PDT com redaporfin aumentou a sobrevivência e as curas em murganho numa variedade de tumores subcutâneos, mas isto não é verdade para tumores ortotópicos 4T1. Da mesma forma, o uso de inibidores de checkpoints imunológicos (ICB, do inglês immune checkpoint blockers) foi estudado em diferentes tipos de cancro e não trouxe melhorias significativas neste modelo de cancro da mama.Para melhorar os resultados da PDT utilizámos priming fotoacústico antes do protocolo de iluminação. As imagens PAT para deteção da redaporfin mostraram um sinal aumentado nos tumores expostos a PAWs, culminando numa maior taxa de sobrevivência. O priming fotoacústico foi também utilizado com o ICB anti antígenio-4 do linfócito T citotóxico (CTLA-4, do inglês cytotoxic T-lymphocyte associated molecule 4) levando a um aumento da sobrevivência global em 13 dias, mas sem efeitos na taxa de cura. Este trabalho tenta resolver problemas relacionados com a penetração de fármacos em tumores sólidos, que é uma das principais razões para o insucesso de muitos tratamentos. As PAWs podem aumentar a permeação de fármacos através das barreiras biológicas do tumor, aumentando a concentração final e potenciando o seu efeito terapêutico.Personalized medicine is the future of medical treatment, with specific therapeutic agents for each patient that will lead to better outcomes. This is only possible with the combination of powerful molecular imaging techniques and individualized treatments. Photoacoustic tomography (PAT) is an emerging imaging technique. It exploits the thermoelastic effect to transform pulsed laser light into pressure waves. PAT was introduced in preclinical research to visualize vascular structures using haemoglobin as endogenous contrast agent. Its translation to clinical settings requires the development of contrast agents with enhanced resolution and contrast. Tetrapyrrolic macrocycles properties make them good candidates for PAT and their combination with phase-change contrast agents can increase the final contrast. Nanodroplets are metastable particles with a perfluorocarbon core that can undergo a phase transition upon small temperature or pressure changes, increasing the intensity of the resulting photoacoustic waves (PAWs).In this work, nanodroplets were used to carry a tetrapyrrolic contrast agent to increase the photoacoustic contrast upon activation. Nanodroplets were prepared with a perfluoropentane core and an albumin shell. To modulate solubility in perfluoropentane, new porphyrins and phthalocyanines were synthetized with different side chains. Varying paramagnetic metals were used for complexation with the macrocycles to increase the generation of photoacoustic signals. To evaluate the vaporization of these structures after pulsed laser light absorption, a photoacoustic calorimetry apparatus was used. The photoacoustic signal produced by nanodroplets was compared with that of a reference BSA solution, to evaluate the occurrence of a vaporization process. Enhanced photoacoustic signals were detected after the excitation of the contrast agents in nanodroplets in comparison with BSA solutions, suggesting that the contrast in PAT can be enhanced by using these structures.PAWs can be generated using a piezophotonic material that efficiently converts the energy from a pulsed laser into pressure pulses. One of the applications of such pressure pulses is to transiently permeabilize the outer layers of skin or cell membranes. Tumor microenvironments are characterized by an inefficient blood circulation system, which has impact on drug permeability and distribution, ultimately influencing the treatment outcome. With a view to increase drug infiltration in solid tumors, we investigated the use of PAWs in photoacoustic tumor priming. Enhanced treatment can be achieved with the infiltration of drugs in the entire tumor volume. Photoacoustic tumor priming was used to increase the delivery of a photosensitizer (PS), leading to an improvement of photodynamic therapy (PDT) efficacy, or monoclonal antibodies (mAb) for immunotherapy. PS or mAbs typically present high molecular weight and, although they benefit from the enhanced permeation retention effect, are not evenly distributed in the tumors which can limit the treatment outcome. The 4T1 model was selected as a target. It is an aggressive metastatic breast cancer model where drug distribution is hampered culminating in poor therapeutic outcomes. PDT and immunotherapy treatments with this challenging model have limited impact in tumor progression and do not result in cures. Redaporfin is a photosensitizer that is in clinical trials for advanced head and neck cancer and has been studied for vascular-PDT in several animal models. This PS can also be used in PAT, which allows its visualization in the tumor before therapy. Redaporfin-PDT was shown to increase the cures in mice with a variety of subcutaneous tumors. However, orthotopic 4T1 tumors, proved to be challenging to treat. Similarly, the use of immune checkpoint blockers (ICBs) has been studied for different cancers and showed poor results in this breast cancer model. To improve PDT results, the animals were exposed to photoacoustic tumor priming as part of the vascular redaporfin-PDT protocol. The PAT images showed an increased signal in the tumors exposed to PAWs that resulted in a higher survival rate. Photoacoustic tumor priming combined with the ICB cytotoxic T lymphocyte-associated molecule-4 (CTLA-4) increased the overall survival by 13 days but did not impact the cure rate. This work is a contribution to overcome the poor drug infiltration into solid tumors, that is recognized as one of the major reasons for the failure of many treatments. PAWs can increase the permeabilization in tumor biological barriers leading to an increase of the drug in the tumor and a better treatment outcome.FCTFCTFCTFC
Produção de açucares e bioetanol celulósicos
No full textTese de Programa Doutoral em Biorrefinarias apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaO sistema de produção atual baseia-se num fluxo linear de recursos insustentável, que conduz a problemas ambientais e compromete as gerações futuras. Conscientes desta problemática, os governos e outras entidades internacionais têm definido metas globais com o objetivo de acelerar a transição do uso de recursos fósseis para renováveis, ambicionando a neutralidade carbónica e promovendo o modelo de economia circular. Os biocombustíveis avançados são reconhecidos como uma fonte de energia renovável com potencial para garantir a segurança do aprovisionamento energético e permitir que o sector dos transportes cumpra as metas de descarbonização a médio prazo. Apesar de toda a investigação nesta área, a produção de etanol celulósico à escala industrial é praticamente negligenciável, principalmente devido aos elevados custos de investimento e de produção. Neste sentido, a integração desta abordagem no contexto de uma biorrefinaria multiproduto poderá ser a chave para aumentar a sua competitividade. A indústria de pasta e papel é um sector estratégico para ser convertido numa biorrefinaria de base florestal, tendo como vantagens competitivas o know-how, as infraestruturas existentes e operações logísticas já bem estabelecidas para lidar diariamente com elevado volume de resíduos florestais. A espécie Eucalyptus globulus é a mais utilizada no sector nacional de produção de pasta de papel, uma vez que as suas excelentes propriedades papeleiras resultam em produtos de qualidade premium. O descascamento da madeira é uma etapa essencial, uma vez que a casca tem um impacto negativo no rendimento do processo de cozimento, conduzindo a tempos de reação prolongados e comprometendo a qualidade da pasta. Assim, a casca de Eucalyptus globulus é um resíduo industrial abundante e é, na sua maioria, queimado para fins energéticos. No entanto, tem surgido um interesse crescente em converter a casca de eucalipto em produtos de maior valor acrescentado, no âmbito do modelo de negócio de economia circular de base florestal. A produção de açúcares celulósicos é uma via promissora para a valorização da casca de eucalipto, que pode ser convertida numa ampla gama de bioprodutos e biocombustíveis, nomeadamente bioetanol. A inexistência de etanol celulósico em Portugal é a força motriz para o enfoque nesta alternativa de valorização. Neste sentido, o principal objetivo desta tese de doutoramento consistiu em demonstrar a viabilidade técnica da produção de açúcares celulósicos e etanol a partir da casca de Eucalyptus globulus pré-tratada através do cozimento kraft. Neste sentido, foram avaliadas duas configurações distintas: a hidrólise e fermentação em separado e em simultâneo. Por um lado, a configuração separada permitiu valorizar com sucesso um dos principais subprodutos dos processos fermentativos, a biomassa pós-fermentação. A biomassa pós-fermentação mostrou ter potencial para ser reutilizada como inóculo em, pelo menos, onze ensaios de fermentação consecutivos. Além disso, o autolisado obtido a partir deste subproduto provou ser uma excelente alternativa à suplementação do meio de fermentação com extrato de levedura comercial. Por outro lado, a configuração integrada permitiu aumentar consideravelmente a produção de etanol celulósico e o desempenho global. Além disso, os custos associados às operações unitárias intermédias de preparação do hidrolisado são evitadas, uma vez que ambos os bioprocessos ocorrem em simultâneo no mesmo biorreator. Ambas as abordagens parecem ser promissoras, com potencial para reduzir custos e aumentar a competitividade, constituindo um novo paradigma para o sector da pasta e do papel.The current production system is based on an unsustainable linear flow of resources, leading to environmental concerns and compromising future generations. Aware of these issues, governments and other international entities have set global targets to accelerate the transition from fossil to renewable resources, striving for carbon neutrality and promoting the circular economy model. Advanced biofuels are recognized as a renewable energy source, potentially ensuring energy supply security and enabling the transport sector to meet medium-term decarbonization targets. Despite all the studies in this research field, cellulosic ethanol production at an industrial scale is almost negligible, mainly due to the high investment and production costs. Therefore, integrating this approach into multi-product biorefineries may be the key to enhancing its competitiveness. The pulp and paper industry is a strategic sector to be converted into a forest-based biorefinery, taking advantage of know-how, existing infrastructures and well-established logistic operations to deal daily with a high volume of forest residues. Eucalyptus globulus species is the most widely used wood source in Portuguese pulp and paper mills since its excellent papermaking properties resulted in premium quality products. Debarking wood is an essential step since bark has a negative impact on the yield of the pulping process, leading to extended reaction times and compromising pulp quality. Thus, Eucalyptus globulus bark is an industrial residue widely available at the pulp site and is mainly burned for energy purposes. Nevertheless, there has been a growing interest in upgrading bark into value-added products within the forest-based circular economy business model. The production of cellulosic sugars is a promising pathway for upgrading bark, which can be converted into biochemicals and biofuels, namely bioethanol. The lack of cellulosic ethanol in Portugal is another driving force for focusing on this valorization pathway. This PhD thesis aims to provide relevant insights on technical feasibility regarding producing cellulosic sugars and ethanol from Eucalyptus globulus bark previously pretreated by kraft pulping. For this purpose, two approaches were evaluated: separate saccharification and fermentation (SHF) and simultaneous saccharification and fermentation (SSF). On the one hand, the separated setup allowed to successfully valorize one of the main by-products of the fermentative processes, the spent yeast. The spent yeast was shown to have the potential to be reused as inoculum in, at least, eleven consecutive fermentation experiments. Furthermore, the laboratorial autolysate from spent yeast proved to be an excellent alternative to commercial yeast extract supplementation. On the other hand, the integrated configuration allowed for a considerable increase in cellulosic ethanol production and overall performance. Moreover, the costs associated with intermediate unit operations to prepare the hydrolysate are avoided, since both bioprocesses occur simultaneously in the same bioreactor. Both approaches investigated may represent significant cost-savings and enhanced competitiveness, constituting a new paradigm for the pulp and paper sector.Outro - POCI -01-0247-FEDER-02187