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O papel da ansiedade social como fator de risco no desenvolvimento de dependência das redes sociais em adultos: um estudo longitudinal sobre o papel mediador da inveja e da vergonha.
No full textDissertação de Mestrado em Intervenções Cognitivo-Comportamentais em Psicologia Clínica e da Saúde apresentada à Faculdade de Psicologia e de Ciências da EducaçãoA dependência das redes sociais, um subtipo da dependência da internet, caracteriza-se por um impulso incontrolável para o uso problemático e compulsivo dessas plataformas, que persiste mesmo diante de consequências negativas significativas, como o declínio da saúde mental. A literatura sugere que indivíduos com níveis mais elevados de ansiedade social tendem a preferir interações sociais via online em detrimento de interações sociais presenciais, o que aumenta a probabilidade de um uso mais frequente das redes sociais e promove o risco de desenvolver comportamentos problemáticos nas redes sociais. Este estudo longitudinal, com um acompanhamento de seis meses, teve como objetivo principal examinar os papéis mediadores da inveja maligna, vergonha externa e vergonha interna na relação entre ansiedade social e dependência das redes sociais. A amostra foi composta por 304 adultos portugueses (73% do sexo feminino), com média de idade de 28,12 anos, que completaram medidas de autorrelato que avaliaram a ansiedade social (Escala de Ansiedade na Interação Social – Versão Reduzida), inveja maligna (Escala da Inveja Benigna e Maligna Disposicional), vergonha externa e interna (Escala da Vergonha Externa e Interna) e dependência de redes sociais (Escala da Dependência das Redes Sociais - Versão Reduzida). Os resultados indicaram que níveis mais elevados de ansiedade social foram significativamente associados a níveis aumentados de inveja maligna, vergonha externa, vergonha interna e dependência de redes sociais. Além disso, inveja maligna, vergonha externa e vergonha interna mostraram-se mediadores significativos na associação entre ansiedade social e dependência de redes sociais. Estes resultados sugerem que fatores emocionais, como a inveja e a vergonha, desempenham um papel crucial na ligação entre ansiedade social e dependência de redes sociais em adultos. O estudo ressalta a importância da conscientização das emoções no contexto digital e integração de estratégias de regulação emocional em intervenções, como a Terapia Cognitivo-Comportamental ou a Terapia de Aceitação e Compromisso, para reduzir os sintomas de ansiedade social e promover um uso mais saudável e equilibrado das plataformas de redes sociais.Social media dependency, a subtype of internet dependency, involves an uncontrollable urge to problematic and compulsive use of social media platforms and a persistent engagement in this behavior despite experiencing negative consequences, such as reduced mental health. Previous research suggests that individuals with higher levels of social anxiety are more inclined to prefer online interactions over face-to-face encounters, which increases their likelihood of frequent social media use and heightens the risk of developing problematic social media behaviors. This longitudinal study, with a six-month follow-up, aimed to examine the mediating roles of malicious envy, external shame, and internal shame in the relationship between social anxiety and social media dependency. The sample consisted of 304 Portuguese adults (73% female) with a mean age of 28.12 years, who completed self-report measures assessing social anxiety (Social Interaction Anxiety Scale – Short Form), malicious envy (Dispositional Benign and Malicious Envy Scale), external and internal shame (External and Internal Shame Scale), and social media dependency (Social Media Disorder Scale - Short Form). Findings revealed that higher social anxiety was significantly associated with increased malicious envy, external shame, internal shame, and social media dependency. Moreover, malicious envy, external shame, and internal shame were significant mediators in the association between social anxiety and social media dependency. These results suggest that emotional factors, such as envy and shame, play a crucial role in linking social anxiety and social media dependency among adults. The study underscores the importance of emotional awareness in the context of social media use and the integration of emotion regulation strategies into interventions, such as Cognitive-Behavioral Therapy or Acceptance and Commitment Therapy, to reduce social anxiety symptoms and promote healthier social media engagement
EXPLORAR O PAPEL DO CCR5 NAS ALTERAÇÕES NEUROVASCULARES INDUZIDAS POR METANFETAMINA
No full textDissertação de Mestrado em Neurociências Molecular e de Translação apresentada à Faculdade de MedicinaDrug use disorder is a major global concern affecting millions of individuals. Among several drugs, methamphetamine (METH) is known to exert stimulating effects on the central nervous system (CNS) and is associated with a wide range of neurological and psychiatric disorders. Notably, we have previously shown that METH disrupts the blood-brain barrier (BBB) via different mechanisms. This specialized barrier selectively allows the entry of essential nutrients into the brain while blocking the passage of toxins and other harmful substances from the bloodstream. Thus, alterations in the BBB can compromise its integrity, facilitating the entry of typically excluded substances, including immune cells, into the brain. Central to this process is the CCR5-CCL5 axis. CCR5, a chemokine receptor, plays a pivotal role in the recruitment of immune cells, such as monocytes, to sites of inflammation. Importantly, METH exposure has been shown to upregulate CCR5 expression in immune cells, such as the THP1 human macrophage cell line, suggesting the involvement of this receptor in METH-induced neuroinflammation. CCL5, also known as RANTES (Regulated upon Activation, Normal T Cell Expressed and Presumably Secreted), is a key ligand for CCR5. While CCL5 is essential for normal immune responses, its overexpression has been associated with various neuroinflammatory and neurodegenerative conditions.Our primary objective was to evaluate the effects of METH and CCL5 on BBB integrity and monocyte transmigration, as well as to assess the protective effect of the CCR5 antagonist maraviroc (MVC) under the abovementioned conditions. For that, we employed two distinct cellular models: the hCMEC/D3 endothelial cell line, a well-established in vitro model of the BBB, and the THP-1 monocyte cell line. Specifically, we investigated the impact of METH and CCL5 on barrier permeability by using the hCMEC/D3 model. Our results demonstrated that METH (1 μM and 100 μM) significantly compromised BBB integrity, promoting endothelial permeability. Similarly, CCL5 (100 ng/mL) also enhanced barrier permeability. Pre-treatment with MVC (100 nM and 1 μM) successfully countered the CCL5-induced permeability. Additionally, using the THP-1 model we also assessed monocyte transmigration across the BBB. We observed that METH, particularly at 1 μM, promoted monocyte transmigration, and MVC (1 μM) significantly inhibited that transmigration. Furthermore, MVC effectively prevented METH-induced downregulation of VE-cadherin immunostaining and its mislocalization, which are critical for BBB integrity. CCL5 also facilitated monocyte transmigration, which was prevented by MVC.Our study highlights the detrimental impact of METH and CCL5 on BBB integrity and favouring monocyte transmigration. Importantly, MVC proves to be a promising therapeutic agent in mitigating the harmful effects of CCL5 and METH. Despite interesting and promising results, more studies are needed to clarify better the cellular mechanisms that underlie METH and CCL5 effects on BBB, as well as the MVC protective effect.A dependência de substâncias ilícitas (drogas) é uma preocupação global significativa que afeta milhões de indivíduos. Entre várias drogas, a metanfetamina (MET) é conhecida por exercer efeitos estimulantes no sistema nervoso central (SNC) e está associada a uma variedade de distúrbios neurológicos e psiquiátricos. O nosso grupo de investigação mostrou anteriormente que a MET desregula a barreira hematoencefálica (BHE) através de diferentes mecanismos. Esta barreira especializada permite a entrada seletiva de nutrientes essenciais ao cérebro, enquanto bloqueia a passagem de toxinas e outras substâncias nocivas provenientes da corrente sanguínea. Deste modo, alterações na BHE podem comprometer a sua integridade, facilitando a entrada de substâncias que normalmente são excluídas do cérebro, tais como as células imunológicas. Central para este processo é o eixo CCR5-CCL5. O CCR5, um recetor de quimiocinas, desempenha um papel fundamental no recrutamento de células imunológicas, como monócitos, para os locais de inflamação. Importa referir que a exposição à MET tem demonstrado aumentar a expressão de CCR5 em células imunológicas, como a linha celular de macrófagos humanos THP-1, sugerindo o envolvimento deste recetor na neuroinflamação induzida pela MET. O CCL5, também conhecido como RANTES (Regulated upon Activation, Normal T Cell Expressed and Presumably Secreted), é o ligando principal do CCR5. Embora o CCL5 seja essencial para as respostas imunes fisiológicas, a sua sobreexpressão tem sido associada a várias condições neuroinflamatórias e neurodegenerativas.O nosso principal objetivo foi avaliar os efeitos da MET e do CCL5 na integridade da BHE e na transmigração de monócitos, bem como avaliar o efeito protetor do antagonista de CCR5, maraviroc (MVC), contra esses tratamentos. Utilizámos dois modelos celulares distintos: a linha celular endotelial hCMEC/D3, um modelo in vitro bem estabelecido da BHE, e a linha celular de monócitos THP-1. Especificamente, investigámos o impacto da METH e do CCL5 na permeabilidade da barreira utilizando o modelo hCMEC/D3. Os nossos resultados demonstraram que a MET (1 μM e 100 μM) comprometeu significativamente a integridade da BHE, promovendo a permeabilidade endotelial. De forma semelhante, o CCL5 (100 ng/mL) também aumentou a permeabilidade da barreira. O pré-tratamento com MVC (100 nM e 1 μM) bloqueou a permeabilidade induzida pelo CCL5. Adicionalmente, utilizando o modelo THP-1, avaliámos a transmigração de monócitos através da BHE. Observámos que a MET, particularmente a 1 μM, promoveu a transmigração de monócitos, e que o MVC (1 μM) inibiu significativamente essa transmigração. Além disso, o MVC preveniu eficazmente a diminuição da imunoreactividade da VE-caderina, bem como a sua desorganização celular induzida pela METH, ambos elementos críticos para a integridade da BHE. O CCL5 também facilitou a transmigração de monócitos, o que foi prevenido apenas pelo MVC.O nosso estudo destaca o impacto prejudicial da MET e do CCL5 na integridade da BHE, favorecendo a transmigração de monócitos. Importa salientar que o MVC se revelou um agente terapêutico promissor na mitigação dos efeitos nocivos do CCL5 e da MET. Apesar dos resultados interessantes e promissores, são necessários mais estudos para esclarecer melhor os mecanismos celulares subjacentes aos efeitos da METH e do CCL5 na BHE, bem como o efeito protetor do MVC.FCTFCTOutro - CENTRO-01-0145-FEDER-000008Outro - EXPL_MED-PAT_0660_2021Outro - POCI-01-0145-FEDER-00744
O PAPEL DA IMUNIDADE INTESTINAL NA PATOGÉNESE DA ESQUIZOFRENIA
No full textDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaSchizophrenia is a severe and complex neurodevelopment disorder that significantly impacts both individuals and society. This study examines the influence of gut immunity on the progression of schizophrenia using the Maternal Immune Activation (MIA) model. The primary objective was to characterize the intestinal immune landscape, with a particular focus on the subpopulations of intraepithelial lymphocytes (IELs) and the activation profiles of interleukins associated with both pro- and anti-inflammatory responses.To achieve this, we activated maternal immunity by administering lipopolysaccharide (LPS) to pregnant mice at embryonic day 12.5. Anxiety-related behavior was evaluated in the offspring at 8 weeks of age through the administration of behavioral assessments, including the Elevated Plus Maze. Subsequently, the offspring were sacrificed, and their small and large intestines were analyzed for intraepithelial lymphocyte populations and interleukin expression. Immunohistochemical techniques were employed to examine the co-localization of CD8 T cells within ileum and colon tissues, thereby providing insights into the spatial distribution and potential functional implications of these immune cells in gut tissue.Our findings revealed significant behavioral differences, particularly in anxiety profiles, between the MIA-exposed and control groups. Furthermore, distinct alterations in the subpopulations of TCRαβ, CD8aa, CD8αβ, CD4, and TCRγδCD8aa lymphocytes were observed, with sex-specific differences evident in both the small and large intestines. Furthermore, interleukin profiles demonstrated variations between males and females within the MIA group, indicating a differential immune response that may contribute to the pathophysiology of schizophrenia. These results underscore the intricate interplay between gut immunity and neuropsychiatric disorders, emphasizing the significance of intestinal immune regulation in schizophrenia pathogenesis and potentially opening new avenues for targeted therapeutic strategies.A esquizofrenia é um distúrbio do neuro desenvolvimento que impacta significativamente tanto os indivíduos quanto a sociedade. Neste estudo avaliamos a influência da imunidade intestinal na progressão da esquizofrenia utilizando o modelo de Ativação da Imunidade Materna (MIA). O objetivo principal foi caracterizar o perfil imunológico intestinal, com ênfase particular nas subpopulações de linfócitos intraepiteliais (IELs) e nos perfis de ativação de interleucinas associadas tanto às respostas pró-inflamatórias quanto anti-inflamatórias.Para isso, ativamos a imunidade materna através da administração de lipopolissacarídeo (LPS) a murganhos no 125º dia de gestação. O comportamento relacionado à ansiedade foi avaliado com 8 semanas de idade por meio de testes comportamentais, como o Elevated Plus Maze. Posteriormente, os descendentes foram sacrificados, e os seus intestinos (delgado e grosso) foram analisados quanto às populações de linfócitos intraepiteliais e à expressão de interleucinas. Técnicas de imunohistoquímica foram realizadas para avaliar a co-localização de células T CD8 nos tecidos do leum e cólon, fornecendo assim informações sobre a distribuição espacial e as potenciais implicações funcionais dessas células imunológicas no tecido intestinal.Nossos resultados revelaram diferenças comportamentais significativas, especialmente nos perfis de ansiedade, entre os grupos expostos à MIA e os grupos controle. Além disso, foram observadas alterações distintas nas subpopulações de linfócitos TCRαβ, CD8aa, CD8αβ, CD4 e TCRγδCD8aa, com diferenças específicas de entre fêmeas e machos, tanto no intestino delgado quanto no intestino grosso. Ademais, os perfis de interleucinas demonstraram variações entre machos e fêmeas no grupo MIA, sugerindo uma resposta imune diferenciada que pode contribuir para a fisiopatologia da esquizofrenia. Esses resultados destacam a complexa interação entre a imunidade intestinal e os transtornos neuropsiquiátricos, enfatizando a importância da regulação imunológica intestinal na patogénese da esquizofrenia e, potencialmente, abrindo novas vias para estratégias terapêuticas direcionadas
Complicated Congenital Cholesteatoma: a clinical case
No full textTrabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina apresentado à Faculdade de MedicinaIntroduction: Cholesteatoma is a benign tumor that is characterized by the formation of a keratinized epithelium in the middle ear, that can show an aggressive phenotype and be destructive with important intra and extracranial complications.Case report: Female patient, 67 years, previously diagnosed with a large “epidermoid cyst” on the left lateral base of the skull, comes to the emergency department at ULS Coimbra with a 24-hour history of headaches and neck pain. Complementary medical imaging exams revealed the presence of a vast tumor lesion located at the level of the left rock, at thecerebellopontine angle, with marked bone destruction and molding of the brain stem. The patient was diagnosed with sizeable congenital cholesteatoma complicated with meningitis and ipsilateral cerebellar abscess, with an unfavorable evolution.Conclusion: Otoscopy has an important role in the diagnosis of congenital cholesteatoma and is commonly found in the anterosuperior quadrant of the tympanic membrane. The treatment of cholesteatoma is surgical after its diagnosis, otherwise it can develop potentially deadly complications. Cholesteatoma treatment can comprise several surgical approaches depending on location, extent, and possible associated complications. The goal of treatmentis to eliminate the disease, isolate the middle ear from the outside (anatomically) andpreserve hearing. Introduction: Cholesteatoma is a benign tumor that is characterized by the formation of a keratinized epithelium in the middle ear, that can show an aggressive phenotype and be destructive with important intra and extracranial complications.Case report: Female patient, 67 years, previously diagnosed with a large “epidermoid cyst” on the left lateral base of the skull, comes to the emergency department at ULS Coimbra with a 24-hour history of headaches and neck pain. Complementary medical imaging exams revealed the presence of a vast tumor lesion located at the level of the left rock, at thecerebellopontine angle, with marked bone destruction and molding of the brain stem. The patient was diagnosed with sizeable congenital cholesteatoma complicated with meningitis and ipsilateral cerebellar abscess, with an unfavorable evolution.Conclusion: Otoscopy has an important role in the diagnosis of congenital cholesteatoma and is commonly found in the anterosuperior quadrant of the tympanic membrane. The treatment of cholesteatoma is surgical after its diagnosis, otherwise it can develop potentially deadly complications. Cholesteatoma treatment can comprise several surgical approaches depending on location, extent, and possible associated complications. The goal of treatmentis to eliminate the disease, isolate the middle ear from the outside (anatomically) andpreserve hearing.Introdução: O colesteatoma é um tumor benigno que se carateriza pela formação de um epitélio queratinizado ao nível do osso temporal, podendo apresentar um fenótipo agressivo e destrutivo, com importantes complicações intra e extracranianas.Caso clínico: Doente do sexo feminino, de 67 anos de idade, previamente diagnosticada com um “quisto epidermoide” de grandes dimensões da base lateral esquerda do crânio, recorre ao serviço de urgência da ULS Coimbra com um quadro de cefaleias e cervicalgias com 24h de evolução. Os exames complementares de imagem médica revelaram a presença de uma vasta lesão tumoral situada a nível do rochedo esquerdo, do ângulo pontocerebeloso, com marcada destruição óssea e moldagem do tronco cerebral. A doente é diagnosticada com colesteatoma congénito de grandes dimensões complicado com meningite e abcesso cerebeloso ipsilateral, tendo evoluído de forma desfavorável.Conclusão: A otoscopia tem um papel fundamental no diagnóstico desta doença, sendo o quadrante anterossuperior da membrana timpânica o local mais comum para o aparecimento do colesteatoma congénito. O tratamento do colesteatoma é cirúrgico após o diagnóstico do mesmo, caso contrário poderá evoluir com complicações potencialmente mortais. O tratamento do colesteatoma pode compreender várias abordagens cirúrgicas dependendo da localização, extensão e possíveis complicações associadas. O objetivo do tratamento passa por eliminar a doença, isolar o ouvido médio do exterior (anatomicamente) e se possível preservar a audição Introdução: O colesteatoma é um tumor benigno que se carateriza pela formação de um epitélio queratinizado ao nível do osso temporal, podendo apresentar um fenótipo agressivo e destrutivo, com importantes complicações intra e extracranianas.Caso clínico: Doente do sexo feminino, de 67 anos de idade, previamente diagnosticada com um “quisto epidermoide” de grandes dimensões da base lateral esquerda do crânio, recorre ao serviço de urgência da ULS Coimbra com um quadro de cefaleias e cervicalgias com 24h de evolução. Os exames complementares de imagem médica revelaram a presença de uma vasta lesão tumoral situada a nível do rochedo esquerdo, do ângulo pontocerebeloso, com marcada destruição óssea e moldagem do tronco cerebral. A doente é diagnosticada com colesteatoma congénito de grandes dimensões complicado com meningite e abcesso cerebeloso ipsilateral, tendo evoluído de forma desfavorável.Conclusão: A otoscopia tem um papel fundamental no diagnóstico desta doença, sendo o quadrante anterossuperior da membrana timpânica o local mais comum para o aparecimento do colesteatoma congénito. O tratamento do colesteatoma é cirúrgico após o diagnóstico do mesmo, caso contrário poderá evoluir com complicações potencialmente mortais. O tratamento do colesteatoma pode compreender várias abordagens cirúrgicas dependendo da localização, extensão e possíveis complicações associadas. O objetivo do tratamento passa por eliminar a doença, isolar o ouvido médio do exterior (anatomicamente) e se possível preservar a audiçã
Frontend e Modelo de Otimização para o Nexus Haulier Capacity Matching
No full textDissertação de Mestrado em Engenharia Informática apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaThe increasing concerns over CO2 emissions and inefficiencies in hauliers' truck routes underscore the urgent need for smart, sustainable solutions. NEXUS Digital Green Solutions has initiated the development of a state-of-the-art software that leverages artificial intelligence (AI) and optimization models to address these challenges specifically at the Port of Sines.This master's thesis, conducted by Samuel dos Santos Carinhas as part of the Informatics Engineering program at the University of Coimbra's Department of Informatics Engineering, contributes significantly to this innovative project. The primary objective of this work is to develop an optimization model that addresses inefficiencies at the Port of Sines. Additionally, it aims to create a frontend application that seamlessly interacts with the backend solution, thereby improving system accessibility and usability through a user-friendly interface (UI).The thesis presents a comprehensive optimization model designed to tackle truck route inefficiencies. It provides a detailed explanation of the scientific background, problem definition, and the proposed solution. Furthermore, it outlines the development of a frontend application, discussing the current state of the art, the application's architecture, and its implementation.The outcome of this dissertation is a proof of concept for the Port of Sines, which enables various stakeholders to utilize the developed optimization model efficiently from their computers or smartphones. The solution is integrated within a combinatorial optimization framework named NASF4NIO, demonstrating its practical applicability and potential for significant environmental and operational improvements.As crescentes preocupações com as emissões de CO2 e as ineficiências nas rotas dos camiões de transporte sublinham a necessidade urgente de soluções inteligentes e sustentáveis. A NEXUS Digital Green Solutions iniciou o desenvolvimento de um produto que utiliza inteligência artificial (IA) e modelos de otimização para enfrentar estes desafios, especificamente no Porto de Sines.Esta tese de mestrado, realizada por Samuel dos Santos Carinhas como parte do programa de Engenharia Informática do Departamento de Engenharia Informática da Universidade de Coimbra, contribui significativamente para este projeto inovador. O objetivo principal deste trabalho é desenvolver um modelo de otimização que resolva as ineficiências do Porto de Sines, bem como desenvolver uma aplicação frontend que interaja com a solução backend, melhorando a acessibilidade e usabilidade do sistema por via de uma interface de utilizador (UI).A tese apresenta um modelo de otimização abrangente projetado para resolver as ineficiências das rotas de camiões. Fornece uma explicação detalhada do contexto científico, definição do problema e a solução proposta. Além disso, a tese descreve o desenvolvimento de uma aplicação frontend, discutindo o estado da arte atual, a arquitetura da aplicação e a sua implementação.O resultado desta dissertação é uma prova de conceito para o Porto de Sines, que permite aos diversos stakeholders utilizarem o modelo de otimização desenvolvido de forma eficiente a partir dos seus computadores ou telemóveis. A solução está integrada numa framework de otimização combinatória, NASF4NIO, demonstrando a sua aplicabilidade prática e potencial para melhorias ambientais e operacionais significativas.Outro - Conteúdo produzido no âmbito da Agenda “NEXUS - Pacto de Inovação – Transição Verde e Digital para Transportes, Logística e Mobilidade”, financiado pelo Plano de Recuperação e Resiliência (PRR) Português, com o n.º C645112083-00000059 (projeto de investimento n.º 53)
Sinais de ROS e autofluorescência na presença de hipóxia na área CA3 do hipocampo
No full textDissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA hipóxia, que consiste na redução na disponibilidade de oxigénio pelos tecidos e células, pode levar a graves consequências para o funcionamento do sistema nervoso central, particularmente no hipocampo. Durante a hipóxia, a produção excessiva de espécies reativas de oxigénio (“reactive oxygen species” - ROS) pode originar estresse oxidativo, contribuindo para danos celulares e disfunção neuronal. As ROS são moléculas altamente reativas que desempenham um papel importante na biologia celular, estando envolvidas em processos de sinalização e regulação de atividade das células. No entanto, quando seus níveis aumentam além de um ponto crítico, a sua acumulação pode dar origem a danos celulares e a doenças neurodegenerativas. A maioria dos estudos que caracterizam a formação de ROS foram realizados no contexto de isquémia, a qual é induzida pela privação simultânea de oxigénio e de glicose, sendo que existe relativamente pouca informação sobre o papel da hipóxia na formação de ROS em condições menos agressivas para as células. Estudos anteriormente efetuados apontam para a existência de alterações na formação de ROS induzidas por hipóxia, possivelmente associadas ao zinco livre, que é muito abundante no cérebro dos mamíferos e desempenha um papel importante nos processos de sinalização no sistema nervoso central. Apesar do conhecimento existente sobre a geração de ROS por estimulação sináptica, algumas questões ainda precisam ser esclarecidas, nomeadamente o efeito de diferentes graus de hipóxia na formação de ROS e também o papel de vários mecanismos envolvidos nesse processo, dentro ou fora das mitocôndrias. Estes organelos, além de serem os mais importantes geradores de ROS, são também a principal fonte de autofluorescência associada a flavoproteínas (FAD) nos neurónios, que é um indicador de atividade celular e transmissão sináptica. Também não existe muita informação sobre a ligação entre a hipóxia e a autofluorescência de FAD. Deste modo, o principal objetivo deste trabalho foi estudar a formação de ROS em neurónios em condições de hipóxia, bem como a sua dependência em relação à ativação de mecanismos tais como os componentes da cadeia respiratória da mitocôndria (“mitochondrial respiratory chain” - MRC), oxidases, recetores de glutamato e a entrada de cálcio e de zinco na mitocôndria. As experiências foram realizadas em fatias de hipocampo de rato (350 μm de espessura), na área CA3. O indicador permeante diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA, 10 µM) foi usado para medir a formação de ROS. O componente da autofluorescência que está associado à ativação do FAD foi subtraído dos sinais obtidos na presença do indicador. Para avaliar as condições de hipóxia, foi medida a pressão parcial de oxigénio na câmara experimental, sendo observada uma discrepância entre a percentagem de oxigénio nas garrafas de gás e na câmara experimental. Contudo, foi possível estabelecer que as misturas de gases contendo 40% e 0% de O2 originaram condições respetivamente de hipóxia moderada e de hipóxia severa. Além da hipóxia, as preparações foram submetidas a estimulação química (KCl, 20 mM), para estudar o efeito da despolarização celular na autofluorescência e na formação de ROS. No primeiro conjunto de experiências observou-se que a hipóxia induz a formação de ROS, sendo esta mais elevada para a hipóxia severa do que para a moderada e aumentando com a despolarização das células por KCl. No entanto, em condições basais de estimulação, a autofluorescência associada ao FAD diminuiu ligeiramente para a hipoxia moderada e aumentou em condições de hipoxia severa. A aplicação de KCl (20 mM) induziu, em ambos os casos, o aumento da autofluorescência. Foi também demonstrado que, em situação de hipóxia moderada, a inibição dos recetores de NMDA pelo antagonista D-APV (50 µM), que reduz a entrada de cálcio na zona pós-sináptica, e a remoção do zinco livre pelo agente quelante TPEN (20 µM) impediram a formação de ROS. Além disso, a autofluorescência ligada ao FAD aumentou na ausência dos referidos iões. Num outro conjunto de experiências foi analisada a influência dos principais mecanismos de formação de ROS e o impacto na autofluorescência na mitocôndria. Os resultados sugerem que a inibição dos complexos MRC I e III, respetivamente por rotenona (2 µM) e mixotiazol (2 µM) fez cessar a formação de ROS. Para além disso, o bloqueio do uniportador de cálcio mitocondrial (MCU) por Ru265 (10 µM) também impediu a geração de ROS. Ainda dentro do mesmo grupo de experiências, o bloqueio do MCU e do complexo I do MRC induziu um aumento da autofluorescência ligada ao FAD. Com relação ao efeito das enzimas oxidases NADPH e xantina oxidase, constatou-se que o seu bloqueio fez com que a produção de ROS cessasse, enquanto a autofluorescência aumentou. Assim, pode ser concluído que a hipóxia induz a geração de ROS e que esse evento só ocorre quando todos os principais mecanismos nela envolvidos são ativados.Hypoxia, a reduction in cellular oxygen availability, can lead to severe consequences for brain functioning, particularly in regions with high metabolic demands such as the hippocampus. During hypoxia, excessive production of reactive oxygen species (ROS) can induce oxidative stress, contributing to cellular damage and neuronal dysfunction. ROS are highly reactive molecules that have an important role in cellular biology, being involved in cell signaling processes. However, when their levels increase beyond a certain point, their accumulation may lead to several kinds of cell damage and, thus, to neurodegenerative and other diseases. Most of the studies characterizing the formation of ROS were performed in the context of ischemia, induced by oxygen-glucose deprivation, existing relatively few works about ROS production under less severe conditions. Previous work points to the existence of hypoxia evoked neuronal ROS changes, possibly associated with calcium and free or loosely bound zinc changes. Zinc is very abundant in the mammalian brain, playing both ions an important role in signalling processes, in the central nervous system. Despite the amount of information about ROS generation during synaptic activity, some issues still need to be clarified, namely the effect of different degrees of hypoxia in ROS formation and also the role of various intra- and extramitochondrial mechanisms that are involved in ROS production. Therefore, the main aim of this work was to study ROS formation in neurons in hypoxic conditions and its dependence on the activation of mechanisms such as components of the mitochondrial respiratory chain (MRC), enzyme oxidases, glutamate receptors and the mitochondrial calcium uniporter (MCU). The experiments were performed in rat hippocampal slices (350 μm thick), at the zinc enriched mossy fiber synapses of CA3 area. The permeant indicator 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA, 10 µM) was used to study ROS changes, which were obtained as the difference between fluorescence signals recorded from H2DCFDA-containing and indicator-free slices. The later type of signals represent the component of autofluorescence that is associated with mitochondrial flavin adenine dinucleotide (FAD) activation. In order to evaluate the intensity of the evoked hypoxia, resulting from oxygenation provided by specific gas bottles, the partial oxygen pressure (pO2) was measured in the experimental chamber, near the slices. It was found that, based in previous definitions, the gas mixtures containing 40% and 0% O2, evoked moderate and severe hypoxic conditions, respectively. In this work, autofluorescence and ROS signals were evoked, under hypoxia, by chemical depolarization caused by extracellular KCl (20 mM). In the first set of experiments, it was observed that ROS formation was more intense for severe than for moderate hypoxia and that it rose during KCl application (30 min). In constrast, in basal stimulation conditions, FAD-linked autofluorescence slightly decreased for moderate hypoxia and increased in severe hypoxic conditions The application of 20 mM evoked, in both cases, the rise of autofluorescence. It was also found that, under moderate hypoxia, the inhibition of the NMDA receptors by D-amino-5-phosphonovaleric acid (D-APV, 50 µM), which prevents postsynaptic calcium entry, and the chelation of free or loosely bound zinc by N,N,N′,N′-Tetrakis (2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN, 20 μM), prevented the formation of ROS. Moreover, in similar conditions, the FAD-linked autofluorescence was enhanced in the absence of both ions. In another set of experiments, performed under moderate hypoxic conditions, the influence of the activation of major mechanisms of ROS formation and its impact on mitochondrial autofluorescence were analyzed. The results suggest that the inhibition of the MRC complexes I and III, by rotenone (2 µM) and myxothiazol (2 µM), respectively, abolished ROS formation. Furthermore, the blockage, by Ru265 (10 µM) of the mitochondrial calcium uniporter (MCU) also prevented the generation of ROS. Moreover, the blockage of MCU and of complex I of MRC induced a rise of the FAD-linked autofluorescence. With respect to the effect of the enzymes NADPH and xanthine oxidases, it was found that their blockage, by apocynin (300 µM) and allopurinol (100 µM), respectively, caused ROS production to cease, while the autofluorescence was enhanced. Thus, it can be concluded that moderate hypoxia induces ROS formation and that it only occurs when all the main mechanisms involved in that process are activated
O papel dos cefalópodes nos ecossitemas do Oceano Austral através de interações predador-presa
No full textDissertação de Mestrado em Biologia Marinha e Alterações Globais apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaO albatroz-errante (Diomeda exulans), a maior ave marinha que habita o Oceano Austral, nidifica em ilhas subantárticas, sendo as colónias mais importantes as dos arquipélagos da Geórgia do Sul, Crozet e Kerguelen. Na Geórgia do Sul, os albatrozes-errantes fazem parte de um programa de monitorização de longo prazo, que se concentra principalmente na sua demografia, condição e padrões na procura de presas. A sua dieta também tem sido um fator-chave na investigação e monitorização dos albatrozes-errantes. A sua dieta é composta por proporções aproximadamente iguais de peixes (40%) e cefalópodes (40%), e uma menor proporção de crustáceos (20%). Embora vários estudos tenham investigado a sua dieta, apenas alguns se focaram em como mudanças ambientais anuais extremas podem influenciar os padrões alimentares do albatroz-errante. De forma a preencher esta lacuna, a minha tese visa estudar o impacto de eventos ambientais extremos, de curto prazo, na componente de cefalópodes da dieta do albatroz-errante em Bird Island, na Geórgia do Sul.Para alcançar este objetivo, a dieta do albatroz-errante foi estudada através de regurgitados de crias desta ave, ao longo de um período de cinco anos (época de reprodução de 2012/2013 a 2016/2017). No geral, o albatroz-errante alimentou-se de uma ampla gama de espécies de cefalópodes, com um total de 42 espécies identificadas. As três espécies mais importantes foram, Moroteuthopsis longimana (84.7% frequência de ocorrência (FO); 59.58% massa (M); 20.4% número de bicos inferiores (N)), Taonius notalia (91.3% FO; 11.00% M; 24.3% N) e Histioteuthis eltaninae (66.8% FO; 1.09% M; 10.3% N). Seguindo estas espécies por nível de importância temos: Histioteuthis atlantica, Alluroteuthis antarcticus, Gonatus antarcticus, Galiteuthis glacialis e Asperoteurhis lui. Durante o período de estudo, a dieta dos albatrozes-errantes foi predominantemente composta por Moroteuthopsis longimana em termos de massa (59.58%). Estudos anteriores em Geórgia do Sul, relataram resultados semelhantes (54% - 80% contribuição em massa).Ao longo dos cinco anos, os albatrozes-errantes mostraram uma composição de espécies semelhante. Isto pode ser explicado pela sua consistência no comportamento quando vão à procura de presas durante o período de criação de crias na Geórgia do Sul. Os nossos resultados indicam que mudanças ambientais de curto prazo, caracterizadas por eventos extremos de Índice Oscilação do Sul (SOI) (ou seja, El Niño e La Niña), sugerem não existir impacto nas presas de cefalópodes dos albatrozes-errantes que se reproduzem na Geórgia do Sul. Isto pode ser atribuído à plasticidade e ampla distribuição dos cefalópodes no Oceano Austral e, à ampla distribuição dos albatrozes-errantes quando se deslocam à procura de presas. Para além disso, os albatrozes-errantes são capazes de se alimentar das mesmas espécies de cefalópodes de forma consistente durante o período de criação das crias, ao longo dos cinco anos, apesar das flutuações nas condições ambientais (SOI).Wandering albatross (Diomeda exulans), the largest seabird inhabiting the Southern Ocean, breeds on the sub-Antarctic Islands, with South Georgia, Crozet, and Kerguelen archipelagos, as the most important colonies. At South Georgia, wandering albatrosses are part of a long-term monitoring program, which focus mainly on their demography, condition and foraging patterns. Simultaneously, diet have remained also a key factor in wandering albatross research and monitoring. Their diet is composed of roughly equal proportions of fish (40%) and cephalopods (40%), with a smaller proportion of crustaceans (20%). Cephalopods are highly sensitive to environmental changes, making them good indicators of how extreme short-term events, such as El Niño and La Niña, affect the marine ecosystem. Still, while numerous studies have investigated its diet, only a handful have focused on how extreme annual environmental changes might influence wandering albatross feeding patterns. Within this context, my thesis aims to study the impact of extreme short-term events on the cephalopod´s component of the wandering albatross diet at Bird Island, South Georgia.To achieve this, the wandering albatross diet was studied by the analysis of boluses from wandering albatross chicks over a five-year period (breeding season 2012/13 to 2016/17). Overall, the wandering albatross fed on a wide range of cephalopod species, with a total of 42 species identified. The three most important species were Moroteuthopsis longimana (84.7% frequency of occurrence (FO); 59.58% by mass (M); 20.4% number of lower beaks (N)), Taonius notalia (91.3% FO; 11.00% M; 24.3% N) and Histioteuthis eltaninae (66.8% FO; 1.09% M; 10.3% N). Following, per importance, by these species: Histioteuthis atlantica, Alluroteuthis antarcticus, Gonatus antarcticus, Galiteuthis glacialis, and Asperoteurhis lui. During the study period, the diet of wandering albatrosses was predominantly composed of Moroteuthopsis longimana, remaining as main prey by mass (59.58%), similar to previous studies at South Georgia (54% - 80% mass contribution).Over the five years, wandering albatross have shown similar species composition. This might be explained by their consistent in foraging behaviour during the chick rearing period at South Georgia, equally leading to this uniformity in the cephalopod species present in the wandering albatross’ diet throughout the years. Our results indicate that short-term environmental changes, characterized by extreme events SOI events (i.e. El Niño and La Niña), had no apparent impact on the cephalopod prey of wandering albatrosses breeding at South Georgia. This could be attributed to the plasticity and wide distribution of cephalopod species in the Southern Ocean and to the broad foraging range of wandering albatrosses. Hence, wandering albatrosses were capable of preying on the same cephalopod species consistently over the chick-rearing period, during the five years, despite the fluctuations in environmental (SOI) conditions
Diversidade biológica e genética de bactérias com atividade ureolítica e a sua aplicação em biocimentação
No full textDissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaAround 7-8% of the world's CO2 emissions come from the civil engineering sector, where the large-scale production of Portland cement presents an exponential pollution, economic and sustainability problem. Considering this, methods that ensure the lasting quality of the materials associated with a beneficial environmental quality must be implemented when building materials wear out to avoid replacing them. Emerges the precipitation of calcium carbonate (CaCO3) induced by microorganisms (MICP), a natural process that can be assisted by ureolytic bacteria and their innate capacity to produce effective enzymes to hasten the precipitation of CaCO3.The primary objective of this work was to study the biological and genetic diversity of ureolytic bacteria to select a strain capable of efficiently performing MICP for the development of sustainable solutions in biocementation within the construction sector. To achieve this, this project analyzed the potential of five strains with ureolytic capabilities to perform MICP via urease enzyme activity, in B4 medium. These strains were subjected to biochemical tests to optimize various parameters including temperature, pH, cell concentration, urea concentration, and calcium source. All the bacteria showed the ability for urea degradation and cell growth when cultivated in B4 medium. The best outcomes were obtained by Sporosarcina pasteurii strain LMG 07130, proving its effective ureolytic activity and unique ability to produce CaCO3 crystals, under the tested conditions. These results affirm its potential applicability in biocementation by filling cracks and fissures in building structures.This study was an important step in selecting promising ureolytic bacteria and optimizing their conditions for possible applications in biocementation.A produção em grande escala de cimento Portland exibe, no setor da indústria civil, um problema exponencial a nível económico, sustentável, e de poluição, responsável por 7-8 % das emissões de CO2 a nível global. Tendo isto em consideração, quando existe desgaste dos materiais de construção, para evitar a sua substituição, é necessário a implementação de métodos que consigam providenciar uma qualidade duradoura dos materiais, associados a uma qualidade ambiental benéfica. Deste modo, surge a precipitação de carbonato de cálcio induzida por microrganismos (MICP), um processo natural que utiliza bactérias ureolíticas e a sua capacidade inerente de produzir enzimas eficientes para acelerar a precipitação de carbonato de cálcio (CaCO3). O objetivo fundamental deste trabalho foi estudar a diversidade a nível biológico e genético de bactérias ureolíticas para selecionar uma estirpe capaz de realizar, de forma eficiente, a técnica de MICP para o desenvolvimento de soluções sustentáveis para aplicação na biocimentação. Neste projeto foi analisado o potencial de 5 estirpes, com capacidades ureolíticas, de realizarem MICP através da atividade da enzima urease. Estas estirpes foram sujeitas a testes bioquímicos para otimização de vários parâmetros, como temperatura, pH, concentração celular, concentração de ureia e a fonte de cálcio.Todas as bactérias demonstraram aptidão para degradação de ureia e crescimento celular quando cultivadas em meio B4.Os melhores resultados foram obtidos pela estirpe Sporosarcina pasteurii LMG 07130, o que comprova a sua eficaz atividade ureolítica e a sua capacidade de produzir cristais de CaCO3, nas condições testadas. Estes resultados afirmam a potencial aplicabilidade na biocimentação, através do preenchimento de fissuras e fendas na estrutura de edifícios.O presente trabalho foi uma etapa importante na seleção de bactérias ureolíticas promissoras e na otimização das condições das mesmas para possíveis aplicações em biocimentação.FC
Controlo Lento, Segurança e Monitorização de Processos para Sistemas de Automação e Controlo Industrial de Grande Escala
No full textTese de Doutoramento em Engenharia Informática apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaSlow control systems (SCS) are essential in Large-Scale Industrial Automated Control Systems (IACS) to regulate and monitor the processes, equipment performance, or systems that operate at a slower rate. It is crucial in applications requiring precision control and stability, such as scientific research, industrial processes, and other complex control systems. SCS employ algorithms, sensors, and feedback mechanisms to ensure that the system operates within specified parameters and offers near real-time monitoring and analysis of the system.Big scientific experiments have unique requirements even when compared to other large-scale IACS. These requirements include supporting custom instrumentation, adaptability to changing conditions during the experiment, and support for hundreds of users, including scientists, experts, and shifters. Furthermore, they must support custom instrumentation to facilitate data collection and control for various instruments and equipment.The paradigm of using industrial control standards while designing large scientific setups is often a demanding task. Nevertheless, this approach grants reliability, instrumental support, and development cycle requirements that would not be possible without the use of off-the-shelf modules and software. However, the option for such an approach comes with a cost both in flexibility and interface heterogeneity. The present work researches and discusses the process of designing an industrial automation and control system for a specific experiment setup in fundamental physics for the detection of dark matter (the XENON experiments). The design and implementation of SCS systems in large scientific experiments require careful consideration of these unique requirements. These systems must support custom instrumentation to collect, store, and analyze data. Additionally, the interfaces used should be user-friendly to facilitate the interaction between the user and the SCS.The development of the SCS architecture for scientific experiments is crucial to maintain stable and consistent operating conditions and increasing the safety of large-scale scientific experiments. The SCS architecture proposed in this thesis monitors and controls various aspects of the experiment, including temperature, pressure, and liquid levels, to ensure the experiment runs stable and safely, using multiple sensors and actuators to monitor, adjust, and control the parameters in real-time. Simultaneously, the SCS serves as a crucial tool for diagnosing the operational aspects of the experiment and plays a vital role in overseeing the experiment's long-term stability, ensuring the continuity and reliability of the scientific data. This control system is, therefore, essential for the security and safety of large-scale IACS, and its significance cannot be overstated.The XENON experiments represent a significant endeavor in our quest to decipher the mysteries of our universe, primarily focusing on investigating dark matter and other rare events. These scientific experiments strive to illuminate our understanding of dark matter's nature, uncovering the evidence of Weakly Interacting Massive Particles (WIMPs). Ultimately, the SCS architecture emerges as an integral component for safeguarding the security and safety of large-scale scientific experiments, particularly those as complex and critical as dark matter research.Os sistemas de controlo lento são essenciais em Sistemas de Automação e Controlo Industrial (SACI) de Larga Escala para regular e monitorizar o desempenho de equipamentos, processos ou sistemas que operam em um ritmo mais lento. Esse tipo de controlo lento é crucial em aplicações que exigem controlo de precisão e estabilidade, como pesquisa científica, processos industriais e outros sistemas de controle complexos. Os sistemas de controlo lento empregam algoritmos, sensores e mecanismos de feedback para garantir que o sistema opere dentro dos parâmetros especificados e ofereçam monitorização e análise em quase tempo real.As grandes experiências científicas apresentam requisitos específicos em comparação com outros SACI de grande escala. Esses requisitos incluem suporte a instrumentação personalizada, adaptabilidade a condições variáveis e suporte para centenas de utilizadores, incluindo cientistas, especialistas e shifters. As experiências científicas são tipicamente dinâmicas, exigindo que mudanças sejam suportadas durante a experiência. Além disso, eles devem suportar instrumentação personalizada para facilitar a recolha e análise de dados para vários instrumentos.O paradigma de usar padrões de controle industrial ao projetar grandes experiências científicas costuma ser uma tarefa exigente. No entanto, essa abordagem garante requisitos de confiabilidade, suporte instrumental e ciclo de desenvolvimento que não seriam possíveis sem o uso de módulos e softwares disponíveis no mercado. A opção por tal abordagem tem um custo tanto em flexibilidade quanto em variabilidade de interface. O presente trabalho descreve e discute o processo de utilização de uma instalação industrial para um experiência específico em física fundamental para a deteção de matéria escura (as experiência da colaboração XENON).O projeto e a implementação de sistemas de controlo lento em grandes experiências científicas requerem consideração cuidadosa desses requisitos específicos. Além disso, as interfaces utilizadas nesses sistemas devem ser amigáveis e capazes de atender às diversas necessidades dos utilizadores, como cientistas, especialistas e shifter.O desenvolvimento da arquitetura de controlo lento para experiências científicas é crucial para manter condições operacionais estáveis e consistentes e contribui para aumentar a segurança de experiências científicas em larga escala. Essa arquitetura de controlo lento monitora e controla vários aspetos da experiência, incluindo temperatura, pressão e níveis de líquido, para garantir que a experiência seja executada de forma estável e segura, usando vários sensores e atuadores para monitorar, ajustar e controlar os parâmetros em tempo real. Ao mesmo tempo, os dados recolhidos pelo sistema de controlo lento são utilizados para diagnosticar e monitorar a estabilidade de longo prazo da experiência. O sistema de controlo lento é essencial para proteger o SACI em larga escala.O objetivo da experiência XENON é investigar a natureza da matéria escura e outros eventos raros no universo, descobrindo a evidência de Partículas Massivas de Interação Fraca, que se acredita constituir uma porção significativa do universo. Em última análise, a arquitetura de controlo lento é fundamental para garantir o sucesso e a segurança de experiências científicas de grande escala, como a investigação da matéria escura.FCTFC
Nanoformulações de Edição genética para Aplicações no Cérebro
No full textTese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina apresentada ao Instituto de Investigação InterdisciplinarIn response to the increasing global aging population and the associated surge in age-related brain diseases, this work explores innovative approaches to overcome the blood-brain barrier (BBB) and address the neuronal loss in age-related pathologies, such as neurodegenerative disorders and stroke. The first part of this PhD thesis focused on the challenge of drug delivery to the brain. Recognizing the restrictive permeability of the BBB and its dynamic nature during aging, we investigated the use of plasma-derived small extracellular vesicles (sEVs) enriched with microRNAs (miRNAs) that are overexpressed during aging or age-related diseases. Intriguingly, our results demonstrated that miR-383-3p-enriched sEVs could transiently and reversibly increase the human BBB model paracellular permeability by downregulating claudin 5, a critical tight junction protein expressed in brain endothelial cells. This effect is mediated in part by the knockdown of activating transcription factor 4 (ATF4), a known target gene of miR-383-3p. We also developed a BBB model based on microfluidics in order to test the nanoformulation in a more physiological-like setting, obtaining results similar to the ones observed in the static model. This engineered sEVs-involving strategy holds promise for facilitating temporary BBB opening, enhancing the accessibility of therapeutic agents to the brain.The second part of this PhD thesis focused on the delivery of the CRISPR gene editing tool into brain cells, particularly astrocytes, for their direct reprogramming into neurons to address the neuronal loss in age-related pathologies. We initially developed an innovative polymeric drug delivery system to induce the gene knockout both in HeLa cells and in murine astrocytes with the Cas9-based system. Then, by using the developed nanoparticles (NPs) loaded with CRISPR/dCas9 ribonucleoprotein (RNP) and targeting the neurogenin 2 (Ngn2) gene, we induced the transdifferentiation of astrocytes into neurons, with multiple administrations. The synthesis of branched polymers enhanced the loading capacity of the NPs, showing the potential of non-viral delivery systems for dCas9-VPR delivery, crucial for the safe and effective modulation of brain cells.Through these dual endeavors, our goal was to contribute to the fields of neuroregeneration and drug delivery to the brain, with broader implications for addressing the healthcare challenges associated with an aging population.Em resposta ao crescente envelhecimento da população global e ao aumento associado de doenças cerebrais, este trabalho explora estratégias inovadoras para cruzar a barreira hematoencefálica (BBB) e combater a perda neuronal em patologias relacionadas com a idade, como distúrbios neurodegenerativos e acidente vascular cerebral.A primeira parte desta tese de doutoramento centrou-se no desafio da entrega de medicamentos no cérebro. Reconhecendo a permeabilidade restritiva da BBB e sua natureza dinâmica durante o envelhecimento, investigamos o uso de pequenas vesículas extracelulares (sEVs) do plasma enriquecidas com microRNAs (miRNAs) que são mais expressos durante o envelhecimento ou as doenças relacionadas à idade. Curiosamente, nossos resultados demonstraram que as sEVs enriquecidas com miR-383-3p aumentam transitoriamente e reversivelmente a permeabilidade paracelular do modelo de BBB humana, regulando negativamente a claudina 5, uma proteína crítica das junções entre as células endoteliais cerebrais. Este efeito é mediado em parte pelo knockdown do activating transcription factor 4 (ATF4), um conhecido gene alvo de miR-383-3p. Também desenvolvemos um modelo dinâmico da BBB baseado em microfluídica para testar a nanoformulação num ambiente mais biomimetico fisiologicamente, obtendo resultados semelhantes aos observados no modelo estático. Esta estratégia desenvolvida envolvendo sEVs é promissora para facilitar a abertura temporária da BBB, melhorando a acessibilidade de agentes terapêuticos ao cérebro.A segunda parte desta tese de doutoramento centrou-se na entrega do sistema de edição genética CRISPR em células cerebrais, particularmente em astrócitos, para a reprogramação direta destas células em neurónios para travar a perda neuronal em patologias relacionadas com a idade. Inicialmente, desenvolvemos um inovador sistema polimérico para a entrega do sistema da edição genética para induzir o knockout de genes tanto em células HeLa como em astrócitos de murganho com o sistema baseado na proteína Cas9. Depois, utilizando as nanopartículas (NPs) desenvolvidas carregadas com a ribonucleoproteína (RNP) CRISPR/dCas9 e fazendo a ativação do gene neurogenin 2 (Ngn2), induzimos a transdiferenciação de astrócitos em neurónios, com múltiplas administrações. A síntese de polímeros ramificados melhorou a capacidade de carga das NPs, mostrando o potencial dos sistemas de entrega não virais carregados com dCas9-VPR, crucial para uma modulação segura e eficaz das células cerebrais.Através destes dois estudos, o nosso objetivo foi contribuir para os campos da neuro-regeneração e da administração de medicamentos ao cérebro, com implicações mais amplas para enfrentar os desafios de saúde associados ao envelhecimento da população.FCTH202