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O Impacto da Infecção Bacteriana na Doença de Parkinson de Origem Intestinal: a influência da activação da imunidade inata na expressão da α-Sinucleína e na disfunção mitocondrial
No full textTese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina apresentada ao Instituto de Investigação InterdisciplinarA incidência da doença de Parkinson, uma doença neurodegenerativa progressiva que afeta milhões de pessoas, deverá aumentar nas próximas décadas devido ao número crescente de idosos na sociedade ocidental. De um ponto de vista histológico, a DP caracteriza-se pela perda de neurónios dopaminérgicos da Substantia Nigra pars compacta e pela acumulação de α-sinucleína em corpos de Lewy nos neurónios sobreviventes. Os principais sintomas motores da DP são os tremores, a rigidez e a dificuldade no equilíbrio e na coordenação. Os tratamentos disponíveis ajudam a aliviar os sintomas e a manter a qualidade de vida, mas não travam a sua progressão. Por isso, são necessárias terapias mais eficazes e/ou novos alvos terapêuticos para travar a progressão da DP. Assim, é necessária mais investigação para perceber qual a etiologia da DP esporádica. Antes de o diagnóstico clínico ser estabelecido, os doentes com DP apresentam frequentemente uma multiplicidade de sintomas prodrómicos que incluem hiposmia, perturbação do comportamento do sono com movimentos oculares rápidos, perturbações do humor e uma vasta gama de complicações gastrointestinais. Este último é o sintoma prodrómico mais comum relatado pelos doentes com DP. Entre os sintomas gastrointestinais relatados, a obstipação, a disfagia e o inchaço são frequentemente descritos. Devido ao facto de os sintomas prodrómicos ocorrerem antes diagnóstico clinico, surgiu a hipótese do " body-first " para explicar alguns casos de DP. No início dos anos 2000, Heiko Braak colocou a hipótese de que um agente patogénico oportunista poderia estar na origem da DP "body-first". Recentemente, foram observadas alterações no número de diferentes populações bacterianas no intestino, nomeadamente uma diminuição das bactérias produtoras de butirato e um aumento das bactérias pró-inflamatórias. Além disso, foi também demonstrado que os agregados de aSyn que se acumulam no trato gastrointestinal (GIT) podem propagar-se do intestino para o sistema nervoso central (SNC).No Capítulo 3, utilizámos neurónios do mesencéfalo de ratinhos, habitualmente usados em estudos celulares da DP, para compreender como uma bactéria intimamente relacionada com as mitocôndrias altera a sua dinâmica e função. Observámos que a infeção com αProteobacteria alterava a dinâmica das mitocôndrias neuronais, induzindo a fragmentação mitocondrial e a diminuição da mitofagia. Além disso, observámos que os neurónios foram capazes de ativar uma resposta imune inata e, finalmente, observamos um aumento dos agregados de aSyn nas mitocôndrias dos neurónios infectados.No capítulo 4, utilizámos um modelo de ratinho para prever como um evento disbiótico, induzido pela infeção de Listeria monocytogenes 4b no trato gastrointestinal, poderia induzir parkinsonismo em ratinhos. Demonstrámos que a infeção por Listeria leva a uma fragmentação da rede de mitocôndrias nos neurónios entéricos, induzindo uma resposta pró-inflamatória no intestino. Além disso, observámos que a permeabilidade intestinal estava aumentada e permitia que as citocinas pró-inflamatórias fossem para a periferia. Além disso, observamos que nas áreas de contacto com as bactérias, as vilosidades, houve um aumento dos níveis de oligómeros de aSyn. Além disso, os murganhos infectados apresentaram alterações no comportamento motor caraterístico da DP. No cérebro, observámos níveis aumentados de aSyn oligomérica, mitocôndrias fragmentadas e neuroinflamação evidente na SNpc.No capítulo 5, utilizámos uma abordagem diferente das experiências anteriores. Assim, utilizámos a Nocardia cyriacigeorgica, uma bactéria que já tinha sido associada à DP, causando alterações motoras e neurodegeneração dopaminérgica quando injectada na corrente sanguínea de ratinhos. Procurámos explorar uma via mais natural e, por isso, introduzimos a bactéria por gavagem. Uma vez que a Nocardia não é tão virulenta como a Listeria, procurámos imitar um evento disbiótico e pró-inflamatório que é normalmente entendido como facilitador da invasão de agentes patogénicos oportunistas no corpo dos mamíferos. Assim, utilizámos um modelo estabelecido de colite em ratinhos, usando dextran sulfato de sódio, para compreender como a perda da barreira intestinal facilita a neurodegeneração mediada por bactérias. De facto, observámos que a colite em combinação com uma infeção bacteriana exercia alguns efeitos a curto e a longo prazo, mas não reproduzia a DP. A curto prazo, foi observado um grande aumento de eventos pró-inflamatórios, as mitocôndrias dos neurónios entéricos apresentavam uma morfologia alterada concomitantemente com o aumento dos níveis de oligómeros de aSyn no intestino. No entanto, mostramos que a neuroinflamação só ocorreu em ratinhos 12 semanas após a infeção, sem aumento da aSyn ou da neurodegeneração dopaminérgica. Estes resultados permitiram-nos inferir que o processo neurodegenerativo da DP requer que os fatores desencadeantes, facilitadores e agravantes tenha de ocorrer sequencialmente.Parkinson's disease (PD), a progressive neurodegenerative disorder affecting millions of people, is expected to increase in the coming decades due to the growing number of elderly people in western societies. Histologically, PD is characterized by the loss of dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (SNpc) and the accumulation of α-synuclein (aSyn) in Lewy bodies (LBs) in surviving neurons. The cardinal motor symptoms of PD are tremor, rigidity, and difficulties with balance and coordination. Available treatments help relieve symptoms and maintain quality of life. Therefore, there is a need for more effective therapies or new therapeutic targets to halt the progression of PD. Therefore, more research is needed to find the etiology of PD. Before the clinical diagnosis is established, PD patients often experience a variety of prodromal symptoms, including hyposmia, rapid eye movement (REM) sleep behavior disorder (RBD), mood disorders, and a variety of gastrointestinal complications. The latter is the most common prodromal symptom reported by Parkinson's patients. Common gastrointestinal symptoms reported include constipation, dysphagia, bloating, and abdominal fullness. Because prodromal symptoms occur before physical symptoms are evident, the "body first" hypothesis has emerged to explain some PD cases. In the early 2000s, Heiko Braak hypothesized that an opportunistic pathogen could be the origin of "body-first" PD. More recently, changes in the number of different bacterial populations in the gut have been observed, particularly a decrease in butyrate-producing bacteria and an increase in pro-inflammatory bacteria. In addition, aSyn aggregates that accumulate in the gastrointestinal tract (GIT) have been shown to spread from the gut to the central nervous system (CNS).In Chapter 3, we used mouse midbrain neurons, commonly used in cellular studies of Parkinson's disease, to understand how a bacterium closely related to mitochondria alters their dynamics and function. We observed that infection with α-proteobacteria altered the dynamics of neuronal mitochondria, induced mitochondrial fragmentation, and decreased mitophagy. In addition, we observed that neurons were able to activate an innate immune response, and finally, aSyn aggregates increased in the mitochondria of infected neurons.In Chapter 4, we used a mouse model to predict how a dysbiotic event induced by Listeria monocytogenes 4b infection in the gastrointestinal tract could induce parkinsonism in mice. We demonstrated that Listeria infection leads to fragmentation of the mitochondrial network in enteric neurons, thereby inducing a pro-inflammatory response in the gut. In addition, we observed that intestinal permeability was increased, allowing pro-inflammatory cytokines to reach the periphery. We also observed an increase in the levels of aSyn oligomers in the areas of contact with the bacteria, the villi. In addition, the infected mice showed changes in motor behavior that are characteristic of PD. In the brain, we observed increased levels of oligomeric aSyn, fragmented mitochondria and apparent neuroinflammation in the SNpc.Chapter 5 utilized a distinct approach from previous experiments by introducing Nocardia cyriacigeorgica, a bacterium previously linked to PD, into the bloodstream of mice. This resulted in motor deficiencies and dopaminergic neurodegeneration. In this work, we aimed to explore a more natural route by introducing the bacterium through gavage. To investigate the invasion of opportunistic pathogens into the mammalian body, we aimed to mimic a dysbiotic and pro-inflammatory event. As Nocardia is less virulent than Listeria, we chose this approach to create a suitable environment for our investigation. We used an established model of colitis in mice, induced by dextran sulfate sodium (DSS), to understand how the loss of the intestinal barrier facilitates bacteria-mediated neurodegeneration. We observed that a pro-inflammatory event, such as colitis, in combination with a bacterial infection had short- and long-term effects but did not affect the PD neurodegenerative process. In the short term, we observed a significant increase in pro-inflammatory events. Simultaneously, we observed an altered morphology of the mitochondria in enteric neurons, accompanied by an increase in the levels of aSyn oligomers in the intestine. Additionally, we noticed that pro-inflammation persisted in some cases with the combined treatment, whereas it did not with isolated treatments, indicating that the combination of both treatments impedes rapid resolution. However, our findings indicate that neuroinflammation was only present in mice 12 weeks after infection, and there was no increase in aSyn or dopaminergic neurodegeneration. These results suggest that the neurodegenerative process of PD requires triggers, facilitators, and aggravators to occur in a sequential order.FC
The Valentina case: A retrospective study to identify risk factors for child abuse and filicide
No full textDissertação de Mestrado em Psicologia Clínica Forense apresentada à Faculdade de Psicologia e de Ciências da EducaçãoFatal abuse is the most common reason for filicide. This is defined as the murder of children under the age of 18 by their own parents. The abuse is most often perpetrated by parental figures in a space - the home - that should be perceived as safe, comfortable and affectionate. The aim of this study is to identify the risk factors for parent-child violence, the precipitating factors for filicide and the protective factors. This is a retrospective case study of a nine-year-old child who was violently abused and signed by his father. The qualitative analysis of the data was carried out by consulting the judgment of the Coimbra Court of Appeal, as well as procedural documents from the criminal case. Among the risk factors analyzed, we highlight the stress to which the father and his family seem to have been subjected, not least economic difficulties, unemployment and the lockdown caused by the Covid-19 pandemic. The lack of information in the criminal file does not allow us to conclude the (in)existence of a mental disorder, an aspect referred to in the literature as an important risk factor for filicide. Hashish consumption alone does not seem to justify (fatal) abuse. This case underlines the importance of closer monitoring by the competent authorities in assessing the safety and well-being of children at risk and that effective coordination between different entities is crucial not only in responding to a real threat, but also in preventing possible situations of child abuse.O abuso fatal é a razão mais comum para o filicídio. Este é definido como o assassinato dos filhos, com menos de 18 anos de idade, cometido pelos próprios pais. O maltrato é, na maioria das vezes, perpetrado pelas figuras parentais num espaço – a própria casa – que devia ser entendido como seguro, confortável e afetuoso. O objetivo deste estudo passa pela identificação dos fatores de risco da violência pai-criança, dos fatores precipitantes do filicídio, e dos fatores de proteção. Trata-se de um estudo de caso, de carácter retrospetivo de uma criança de nove anos, violentamente maltratada e assinada pelo seu pai. A análise qualitativa dos dados foi realizada através da consulta do Acórdão do Tribunal da Relação de Coimbra, assim como de peças processuais do processo criminal. De entre os fatores de risco analisados salienta-se o stresse a que a figura parental e a sua família parecem ter estado sujeitos e a que não são estranhos as dificuldades económicas, a situação de desemprego e o confinamento provocado pela pandemia de Covid-19. A carência de informação no processo-crime não permite concluir a (in)existência de uma perturbação mental, aspeto referido na literatura como importante fator de risco do filicídio. Os consumos de haxixe parecem não justificar, por si só, o abuso (fatal). Este caso sublinha a importância de um acompanhamento mais rigoroso por parte das autoridades competentes na avaliação da segurança e do bem-estar das crianças em risco e de uma articulação eficaz entre diferentes entidades é crucial não só na resposta a uma ameaça real, mas também na prevenção de possíveis situações de maltrato infantil
Software de monitorização da saúde de aplicações para uma solução de edifícios inteligentes
No full textDissertação de Mestrado em Engenharia Informática apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaDue to an ever increasing need by companies to predict and manage their software's health, the desire for software telemetry collection and visualization systems is on the rise. From being able to see the status of specific code modules, to tracking and analysing user behaviour within an application, the ability to view a system's metrics and logs is key to improving the quality and robustness of a software. Sauter AG, a Swiss-based corporate group, is the owner of Sauter’s Vision Center Building and Energy Management System, a smart building software that collects data from devices in physical installations and displays their status and values through a portal. Due to the intricacies of its functionalities, diligent monitoring is essential to ensure that the system is behaving properly in the numerous installations worldwide. In this thesis, a telemetry analytics system for the Sauter Vision Center is proposed in order to address the client's need to visualize their application data. The document specifies the software requirements and a practical cloud and on-premise architecture. During development, a prototype of a system capable of capturing data from software installations all over the globe to a central data storage was implemented. This was achieve through the use of well known observability tools, such as Grafana and Elastic Stack. Despite encountering several challenges and obstacles during the internship, almost all the specified requirements were fully completed in time, making the end prototype a close representation of how the software will behave in production.Devido à crescente necessidade de empresas conseguirem prever e gerenciar a saúde do seu software, a demanda por sistemas de colheita e visualização de telemetria está em ascensão. Desde ser capaz de visualizar o estado de módulos de código específicos a rastrear e analisar o comportamento do usuário dentro da aplicação, a capacidade de visualizar as métricas e logs de um sistema é fundamental para melhorar a qualidade e robustez do software.A Sauter AG, um grupo corporativo com sede na Suíça, é a proprietária do Sauter's Vision Center Building and Energy Management System, um software para edifícios inteligentes que coleta dados de dispositivos em instalações físicas e exibe o seu status por via de um portal. Devido à complexidade das suas funcionalidades, é essencial realizar uma monitorização diligente para garantir que o sistema se comporte adequadamente nas inúmeras instalações em todo o mundo. Nesta tese, um sistema de análise de telemetria para o Sauter Vision Center é proposto para atender à necessidade do cliente de visualizar dados de aplicação. O documento especifica os requisitos de software e uma arquitetura prática de cloud e on-premise.Durante o desenvolvimento, foi implementado um protótipo de um sistema capaz de capturar dados de instalações de software em todo o mundo e centralizá-los em um armazenamento de dados central. Isto foi alcançado através do uso de ferramentas de observabilidade bem conhecidas, como o Grafana e o Elastic Stack.Apesar de terem sido encontrados vários desafios e obstáculos durante o estágio, quase todos os requisitos especificados foram totalmente concluídos a tempo, ficando o protótipo uma representação aproximada de como o software se comportará em produção
A arena da comparação social: O papel da vergonha e do auto-criticismo na ligação entre a comparação social do treinador e os sintomas psicopatológicos.
No full textDissertação de Mestrado em Intervenções Cognitivo-Comportamentais em Psicologia Clínica e da Saúde apresentada à Faculdade de Psicologia e de Ciências da EducaçãoCoaches play a crucial role in enhancing athletic performance and well-being, but they also face personal stressors, which can affect their mental health. Recent studies showed that coaches commonly experience symptoms of depression and anxiety. The sports context also induces individuals to engage in social comparison due to the competitive nature of sports. However, research on coach social comparison has been limited. Hence, this study aimed to explore differences on compassionate coach, external and internal shame, self-criticism and psychopathological symptoms considering three groups based on coach social comparison levels: unfavorable, neutral and favorable. Additionally, the mediating role of external and internal shame and self-criticism in the link between coach social comparison and psychopathology symptoms was also tested. This cross-sectional study included 200 coaches of aesthetic sports, aged between 18-72 years, who completed a set of self-report measures through an online survey. Results showed significant differences in age, compassionate coach, the two shame dimensions, self-criticism and psychopathological symptoms for the three coach social comparison levels. The mediating role of external and internal shame and self-criticism in the link between coach social comparison and psychopathological symptoms was confirmed. The tested model explained 29% of the variance of psychopathological symptoms. These findings seem to suggest that unfavorable social comparisons are associated with increased feelings of shame that, in turn, lead to higher levels of self-criticism, as well as higher levels of psychopathological symptoms. These findings support the importance of including strategies to develop self-compassionate skills in intervention programs designed specifically to aesthetic sports coaches.Os treinadores desempenham um papel crucial no desempenho desportivo e no bem-estar, mas também enfrentam fatores de stress que podem afetar a sua saúde mental. Estudos recentes mostram que os treinadores frequentemente apresentam sintomas de depressão e ansiedade. O contexto desportivo também induz os indivíduos a envolverem-se em comparações sociais devido à natureza competitiva do desporto. Contudo, a investigação sobre a comparação social entre treinadores tem sido limitada. Assim, este estudo visou explorar as diferenças na compaixão, vergonha externa e interna, auto-criticismo e sintomas psicopatológicos, considerando três grupos com base nos níveis de comparação social dos treinadores: desfavorável, neutro e favorável. Adicionalmente, foi testado o papel mediador das dimensões da vergonha e do auto-criticismo na relação entre a comparação social dos treinadores e os sintomas psicopatológicos. O estudo incluiu 200 treinadores de desportos estéticos, com idades entre os 18 e 72 anos, que completaram um conjunto de medidas de autorrelato através de um questionário online. Os resultados mostraram diferenças significativas na idade, na compaixão, nas dimensões da vergonha, auto-criticismo e sintomas psicopatológicos para os três níveis de comparação social. O papel mediador da vergonha externa e interna e do auto-criticismo na relação entre a comparação social dos treinadores e os sintomas psicopatológicos foi confirmado. O modelo testado explicou 29% da variância dos sintomas psicopatológicos. Estes resultados parecem sugerir que comparações sociais desfavoráveis estão associadas a um aumento de vergonha, levando ao uso do auto-criticismo e a níveis elevados de sintomas psicopatológicos. Estes resultados apoiam a importância de incluir estratégias para desenvolver competências de auto-compaixão em programas de intervenção destinados a treinadores de desportos estéticos
POTENCIAL TERAPÊUTICO DO PARTENOLIDE EM NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS DAS CÉLULAS B
No full textDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaLymphoid neoplasms comprehend a highly heterogeneous group of diseases, including acute lymphoblastic leukaemia (ALL), chronic lymphocytic leukaemia (CLL) and multiple myeloma (MM), among others. These malignancies exhibit dysregulated NF-kB pathway, crucial for cell survival and proliferation. The inhibition of NF-kB pathway in lymphoid malignancies has emerged as a promising therapeutic option for these diseases. Parthenolide (PRT) is a naturally occurring sesquiterpene lactone that is derived from feverfew plant. Its potential as an anticancer agent has been extensively researched, and it has shown promising results in not only haematological neoplasms, but also in a variety of solid cancers, such as breast, lung, colorectal, prostate and ovarian cancers. PRT has a series of direct targets (e.g. p65, IkB kinase, IGF-1, BRAF) that have already been reported to affect several signalling pathways related to tumorigenesis and progression, mainly inhibiting growth, and inducing apoptosis. In this context, the aim of this study was to assess the therapeutic efficacy of PRT in in vitro models of B-cell neoplasms.To this end, three cell lines were used: 697 (B-ALL), HG-3 (CLL) and U266 (MM). Cells were incubated with PRT in different concentrations, ranging between 0.1-25 µM. Metabolic activity was evaluated after 24, 48 and 72 hours of incubation, using resazurin assay. Subsequent studies were performed using two concentrations, one common to all three cell lines and corresponding to 1 µM and a concentration closer to the IC50 (half maximal inhibition concentration). After a 72-hour incubation, cell death was evaluated by flow cytometry (FCM) using Annexin V/7AAD double staining and by optical microscopy using May Grünwald-Giemsa. Intracellular peroxides, superoxide anion levels, reduced glutathione (GSH) and mitochondrial membrane potential (∆Ψm) were measured by FCM using DCFH2-DA, DHE, MO and JC-1 fluorescent probes, respectively. Cell cycle distribution was also evaluated by FCM using PI/RNase kit. Finally, gene expression analysis was conducted by qPCR to assess expression levels of MYC, BAX, BCL-2, CASP9 and TXNRD1.The results demonstrate that PRT induced a decrease in metabolic activity in a dose-, time- and cell-line-dependent manner. 697 cell line is the most sensitive to PRT with an IC50 of 4.8 µM, at 72h, followed by HG3 cell line with an IC50 of 6.0 µM and U266, the least sensitive, with an IC50 of 22.4 µM. PRT induced cell death, mainly by apoptosis, and these results were confirmed by optical microscopy where cells displayed distinctive morphological features of apoptosis, namely blebbing, which leads to the formation of apoptotic bodies. Furthermore, PRT also induced a decrease in a dose-dependent manner of ∆Ψm in all cell lines, further confirming mitochondrial dysfunctions, which in turn are also highly associated with the intrinsic pathway of apoptosis. To better clarify the mechanisms of PRT in these neoplasms, oxidative stress was assessed in all cell lines. GSH levels and ROS (superoxide anion and/or peroxides) decreased in U266 cell line and increased in the HG3 cell line. In 697, peroxides dropped significantly, superoxide anion marginally increased, and GSH levels were similar to the control. To further assess if PRT possesses an antiproliferative effect, cell cycle was evaluated, and results show that PRT’s IC50 in U266 cell line induced cell cycle arrest in G2/M phase but didn’t seem to affect 697 and HG3. These findings suggest a potential cytotoxic and cytostatic effect of PRT in lymphoid malignancies in vitro.In conclusion, PRT exhibits anticancer activity in our models, paving the way for more studies to be conducted and as such, potentially increasing the treatment landscape for B-cell haematological malignancies.As neoplasias linfoides compreendem um grupo bastante heterogéneo de doenças, que inclui a leucemia linfoblástica aguda (LLA), a leucemia linfocítica crónica (LLC) e o mieloma múltiplo (MM), entre outras. Estas neoplasias são caraterizadas por exibirem disfunção da via do NF-kB. O NF-kB é um fator de transcrição crucial para a sobrevivência e proliferação celular. A inibição desta via em tumores linfoides surgiu como uma opção terapêutica promissora para estas doenças. O partenolide (PRT) é um inibidor da via do NF-kB de ocorrência natural derivada da planta matricária. O seu potencial como agente anticancerígeno tem sido amplamente estudado, e mostrou resultados promissores não só em neoplasias hematológicas, mas também numa variedade de tumores sólidos, como o cancro da mama, pulmão, colorretal, próstata e ovário. O PRT tem uma série de alvos diretos (por exemplo p65, cinase IkB, IGF-1, BRAF) que afetam várias vias de sinalização relacionadas com o cancro e com a sua progressão, dado ao facto de inibir o crescimento celular e induzir apoptose. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia terapêutica do PRT em modelos in vitro de neoplasias linfoides.Neste estudo foram utilizadas três linhas celulares: 697 (LLA-B), HG3 (LLC) e U266 (MM). As células foram incubadas com PRT em diferentes concentrações, variando entre 0,1-25 µM. A atividade metabólica foi avaliada após 24, 48 e 72 horas de incubação, pelo ensaio da resazurina. Estudos subsequentes foram realizados utilizando duas doses, uma dose comum às três linhas celulares, correspondendo a 1 µM, e uma concentração próxima do IC50 (metade da concentração inibitória máxima). Após 72 horas de incubação, a morte celular foi avaliada por citometria de fluxo (FCM) utilizando dupla marcação com Annexina V/7AAD e por microscopia ótica utilizando a coloração de May-Grümwald Giemsa. Em seguida, foram avaliados, por FCM, os níveis intracelulares de peróxidos, anião superóxido, glutationa reduzida (GSH) e potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm) utilizando as sondas fluorescentes DCFH2-DA, DHE, MO e JC-1, respetivamente. A distribuição do ciclo celular também foi avaliada por FCM utilizando o kit PI/RNase. Por fim, a análise da expressão génica foi realizada por qPCR de modo a avaliar os níveis de expressão de MYC, BAX, BCL-2, CASP9 e TXNRDI. Os resultados demonstram que o PRT induziu uma diminuição da atividade metabólica de forma dependente da dose, do tempo e da linha celular. A linha celular 697 é a mais sensível à PRT, com um IC50 de 4,8 µM, às 72h, seguida da linha HG3 com um IC50 de 6,0 µM, e da U266, a menos sensível, com um IC50 de 22,4 µM. O PRT induziu morte celular, principalmente por apoptose, e resultados confirmados por microscopia ótica, onde verificamos que as células exibiram características morfológicas típicas da apoptose, nomeadamente a formação de prolongamentos da membrana citoplasmática, blebs, que são responsáveis pela formação de corpos apoptóticos. De facto, também verificamos que o PRT induziu uma diminuição, dependente da concentração, do ∆Ψm em todas as linhas celulares, sugerindo que este induz disfunções mitocondriais, que por sua vez estão altamente associadas à via intrínseca da apoptose. Para melhor clarificar os mecanismos do PRT nestas neoplasias, avaliou-se o stresse oxidativo nas linhas celulares. Os níveis de GSH e ROS (anião superóxido e/ou peróxidos) diminuíram na linha celular U266 e aumentaram na linha HG3. Nas 697, os peróxidos diminuíram significativamente, o anião superóxido aumentou ligeiramente, e os níveis de GSH foram semelhantes aos do controlo. Adicionalmente, de modo a perceber se o PRT apresentava um efeito antiproliferativo, foi avaliado o ciclo celular, e os resultados mostraram que o IC50 do PRT na linha celular U266 induziu bloqueio do ciclo celular na fase G2/M, porém não teve o mesmo efeito nas linhas 697 e HG3. Estes achados sugerem um potencial efeito citotóxico e citostático do PRT nos nossos modelos in vitro. Concluindo, o PRT possui atividade anticancerígena nos modelos estudados, abrindo caminho para mais estudos com este fármaco e, assim, potencialmente aumentar o panorama do tratamento para as neoplasias hematológicas da linhagem B.Outro - This research was funded by ACIMAGO. The Centre for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB) and the Institute for Clinical and Biomedical Research (ICBR) are supported by the Foundation for Science and Technology (FCT), Portugal, through the Strategic Projects UIDB/04539/2020 (10.54499/UIDB/04539/2020) and UIDB/04539/2020 (10.54499/UIDB/04539/2020) and Associated Laboratory funding LA/P/0058/2020 (10.54499/LA/P/0058/2020)
Engenharia da superfície de pequenas vesículas extracelulares usando escovas poliméricas para aplicações biomédicas
No full textDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaAs pequenas vesículas extracelulares [(sEVs); também designadas por exossomas] têm sido recentemente exploradas como potenciais transportadores terapêuticos seguros para o tratamento de várias doenças, tais como cancros, perturbações neurológicas, cicatrização de feridas, etc. A curta semi-vida sistémica dos sEVs e a sua fraca acumulação em alguns órgãos (por exemplo, coração e cérebro) limitam a sua aplicação in vivo. De forma a ultrapassar estas limitações, utilizou se a engenharia da superfície dos sEVs para melhorar a semivida em circulação e a sua biodistribuição, promovendo eficazmente um avanço para a clínica, nomeadamente, em terapias baseadas em sEV. A biodistribuição dos sEVs é intrinsecamente modulada por vários fatores, tais como, a origem celular dos sEVs, a composição da membrana, o estado fisiopatológico do hospedeiro, etc. A biodistribuição in vivo dos sEVs após administração intravenosa pode ser controlada através da modificação da sua superfície. Os polímeros do tipo escova, são particularmente adequados para conferir um comportamento furtivo, melhorar o carregamento de fármacos, ácidos nucleicos e proteínas, facilitando o seu direcionamento ativo. Estas escovas de polímero podem ser geradas utilizando técnicas de polimerização viva, como a polimerização radical por transferência de átomos (ATRP). Relativamente às técnicas de polimerização viva, estas têm a vantagem de oferecer um excelente controlo sobre o comprimento e a densidade da cadeia polimérica, que, por sua vez, podem ser utilizadas para obter as propriedades físico-químicas ideais para melhorar a farmacocinética e a biodistribuição das nanopartículas. As escovas de polímero podem ser incorporadas numa variedade de núcleos de nanopartículas sólidas, com uma arquitetura e uma química de núcleo-casca bem definidas, utilizando abordagens como o “enxerto de” (crescimento de escovas de polímero a partir da superfície da nanopartícula), o “enxerto para” (pré-sintetização de um polímero e fusão com a membrana da nanopartícula) ou o “enxerto através de” (interligação de nanopartículas através de polímeros numa matriz como um hidrogel 3D). Importa ainda referir que a modificação de sEVs com escovas de polímero para controlar as suas propriedades de superfície até atualidade não foi relatada. No presente trabalho, investigámos sistematicamente o enxerto de escovas poliméricas na superfície dos sEVs e o impacto da modificação destas escovas poliméricas na modulação das propriedades físico-químicas dos sEVs, assim como, na sua interação com as células, in vitro.Small extracellular vesicles (sEVs; also called exosomes) have been recently explored as potential and safe therapeutic carriers to treat various diseases such as cancers, neurological disorders, wound healing etc. Although, the short systemic half-life of sEV and their poor accumulation in some organs (e.g. heart and brain) limits their in vivo application. Surface engineering of the sEV to improve their circulation half-life and bio distribution can be an effective strategy to advance the clinical translation of sEV-based therapies. Biodistribution of sEVs is intrinsically modulated by several factors such as the cellular origin of sEVs, membrane composition, pathophysiological condition of the host etc. [1] The in vivo biodistribution of sEVs after intravenous administration can be controlled by modifying their surface. Brush type polymers are particularly suitable to confer stealth behaviour, improve loading of drugs, nucleic acids, proteins and facilitate their active targeting [2,3]. Polymer brushes can be generated using living polymerization techniques like atom transfer radical polymerization (ATRP). Living polymerization techniques have the advantage of offering excellent control over the polymer chain length and density, which in turn can be utilized to achieve optimal physicochemical properties necessary for improved pharmacokinetics and bio distribution of nanoparticles. Also, can be incorporated on various solid nanoparticle cores with a well-defined core−shell architecture and chemistry, using approaches such as ‘grafting from’ (growing polymer brushes from the surface of nanoparticle), ‘grafting to’ (pre-synthesizing a polymer and fusing it with the nanoparticle membrane) or ‘grafting through’ (interconnecting nanoparticles through polymers within a matrix such as a 3D hydrogel) [2,3]. In fact, the modification of sEVs with polymer brushes to control their surface properties has not been reported. In the present work, we have systematically investigated the grafting of polymer brushes to sEV surface and the impact of these polymer brush modification in modulating the physicochemical properties of sEVs and their interaction with cells, in vitro.FC
Interacção Salmonella-célula hospedeira: caracterização de factores do hospedeiro relevantes para a infecção de células epiteliais
No full textTese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina apresentada ao Instituto de Investigação InterdisciplinarHost–bacterial pathogen interactions represent a fundamental aspect of infectious disease biology, encompassing the complex and dynamic interplay between a host and an invading bacterial pathogen. These interactions are pivotal in determining the outcome of infections, influencing whether a pathogen will be successfully cleared or establish an infection, and ultimately causing disease.Salmonella Typhimurium (hereafter Salmonella), a facultative intracellular bacterium and one of the most well-studied and noteworthy serovars of the Salmonella genus, is a significant cause of foodborne disease worldwide, leading to conditions ranging from mild gastroenteritis to severe systemic infections in humans. Salmonella interaction with host cells is a complex and multifaceted process that involves a series of well-coordinated steps, enabling the invasion, survival, and replication within host cells, while evading host defences. Understanding this interaction is crucial for understanding Salmonella pathogenesis and developing effective strategies to prevent and treat infections. In this thesis, the interaction of Salmonella with epithelial cells was investigated in two projects that characterized key host determinants/factors important for infection.In the first project, we highlight the host cell cycle as a critical aspect of host-Salmonella interaction. Previous studies revealed that Salmonella manipulates the host cell cycle using various molecular strategies, specifically favouring the transition between the G1 and S phases and promoting the arrest in the G2 phase. In this work, we focused on understanding why Salmonella replication is inhibited in cells arrested in the G1 phase. Mechanistically, we demonstrate that cells arrested in the G1 phase present a unique cellular environment with dysregulated endolysosomal trafficking, negatively affecting the interaction of Salmonella with the endolysosomal system and ultimately compromising Salmonella replication inside the vacuole. Overall, this study further demonstrates that Salmonella manipulates the host cell cycle to create a favourable environment for replication. In the second project, we study the role of the microRNA miR-744-5p in Salmonella infection. Previous studies showed that miR-744-5p expression is downregulated during infection, and that miR-744-5p overexpression inhibits infection. We demonstrate that miR-744-5p inhibits Salmonella infection, both at early and late stages of infection, specifically bacterial intracellular replication. Upon identification of miR-744-5p putative targets relevant in the context of Salmonella infection, we focused on connexin 43 (Cx43). We demonstrate that Cx43 expression is increased during Salmonella infection, likely contributing to the maintenance of Golgi network integrity. This is particularly relevant given that previous reports have demonstrated that Golgi integrity is crucial for Salmonella vacuolar replication. Our work indicates that microRNA regulation is an additional strategy exploited by Salmonella to promote Golgi stability, further emphasising the important role of microRNAs during Salmonella infection.Overall, this thesis reveals two sophisticated strategies explored by Salmonella to manipulate the intracellular environment of epithelial cells to favour infection, further unravelling the complex interactions that Salmonella establishes with its host cells.As interações hospedeiro-patógeno bacteriano representam um aspeto fundamental da biologia das doenças infeciosas, abrangendo a complexa e dinâmica relação entre hospedeiro e bactéria patogénica invasora. Estas interações são essenciais para determinar o resultado de infeções, influenciando se um patógeno será eficazmente eliminado ou estabelecerá uma infeção e, em última análise, causará doença.A Salmonella Typhimurium (seguidamente designada apenas Salmonella), uma bactéria intracelular facultativa e um dos serovares mais bem estudados e relevantes do género Salmonella, é uma causa significativa de doenças transmitidas por alimentos em todo o mundo, levando a manifestações que variam desde gastroenterites leves até infeções sistémicas graves em humanos. A interação da Salmonella com as células hospedeiras é um processo complexo e multifacetado que envolve uma série de etapas bem coordenadas, que permitem a invasão, a sobrevivência e a replicação no interior das células hospedeiras, em paralelo com a evasão às defesas do hospedeiro. Compreender esta interação é crucial para entender a patogénese da Salmonella e desenvolver estratégias eficazes para prevenir e tratar infeções.Nesta tese, a interação da Salmonella com células epiteliais foi investigada em dois projetos que caracterizaram determinantes/fatores do hospedeiro cruciais para a infeção.No primeiro projeto, destacamos o ciclo celular do hospedeiro como um aspeto crucial da interação entre o hospedeiro e a Salmonella. Estudos anteriores revelaram que a infeção por Salmonella controla o ciclo celular do hospedeiro usando várias estratégias moleculares, especificamente favorecendo a transição entre as fases G1 e S e promovendo o bloqueio na fase G2. Neste trabalho, concentrámo-nos em compreender o motivo pelo qual a replicação da Salmonella é inibida em células bloqueadas na fase G1. Em termos mecanísticos, demonstramos que as células bloqueadas na fase G1 apresentam um ambiente celular único com um fluxo endolisossomal desregulado, afetando negativamente a interação da Salmonella com o sistema endolisossomal e, em última análise, comprometendo a replicação da Salmonella no interior do vacúolo. Globalmente, este estudo demonstra que a Salmonella controla o ciclo celular do hospedeiro para criar um ambiente favorável à replicação.No segundo projeto, estudamos o papel do microRNA miR-744-5p na infeção por Salmonella. Estudos anteriores mostraram que a expressão do miR-744-5p está diminuída durante a infeção, e que a sobre-expressão do miR-744-5p inibe a infeção. Neste estudo, demonstramos que o miR-744-5p inibe a infeção por Salmonella nas fases iniciais, assim como nas fases avançadas da infeção, especialmente a replicação bacteriana intracelular. Após a identificação de potenciais alvos do miR-744-5p relevantes no contexto da infeção por Salmonella, focámo-nos na conexina-43 (Cx43). Demonstramos que a expressão da Cx43 está aumentada durante a infeção por Salmonella, provavelmente contribuindo para a manutenção da integridade do complexo de Golgi. Isto é particularmente relevante dado que estudos anteriores demonstraram que a integridade do complexo de Golgi é crucial para a replicação vacuolar da Salmonella. O nosso trabalho indica que a regulação de microRNAs constitui uma estratégia adicional explorada pela Salmonella para promover a estabilidade do Golgi, reforçando o papel importante dos microRNAs durante a infeção por Salmonella.Em suma, esta tese revela duas estratégias sofisticadas exploradas pela Salmonella para controlar o ambiente intracelular das células epiteliais para favorecer a infeção, contribuindo para elucidar as interações complexas que a Salmonella estabelece com as suas células hospedeiras.FC
Digital Marketing: Impact of digital marketing on the growth of small and medium business
No full textRelatório de Estágio do Mestrado em Gestão apresentado à Faculdade de EconomiaThe changes that classic marketing strategies have undergone due to the progress of digital platforms and the impact that their use can have as a communication channel for brands are notorious. Using social networks to communicate new products and services, creating a website to sell products online and investing in ads on social networks and search engines are just some of the examples of how brands' positioning and distribution channels have changed over the last decade. This internship report aims to present the concept of digital marketing and contextualize it within a classic marketing strategy, including paid media work, which is the main object of study in this report. After this explanation, a practical case is analyzed, which consists of verifying the extent to which investment in paid media has a positive impact, not only on brand awareness, but also on sales volume.The practical case presented corresponds to the intern's experience throughout the internship period, actively participating in the paid media investment strategy and in the tasks inherent to this investment, namely implementing Meta Ads and Google Ads campaigns, reviewing graphic content published on social media, etc. The campaigns implemented aimed to increase brand awareness and define its positioning, but also to obtain conversions, in this case, restaurant reservations from these ads.By linking the literature review phase, where various authors are cited who help to contextualize the subject of digital marketing and paid media, with the description of the internship and analysis of the case study, the aim is to get an overview of the impact of digital marketing on brand performance.São notórias as alterações que as clássicas estratégias de marketing sofreram devido ao progresso das plataformas digitais e o impacto que a sua utilização pode ter como canal de comunicação para as marcas. A utilização de redes sociais para comunicar novos produtos e serviços, a criação de um website para vender produtos online e o investimento em anúncios nas redes sociais e em motores de pesquisa são apenas alguns dos exemplos de como o posicionamento e os canais de distribuição das marcas se alteraram na última década. Este relatório de estágio pretende apresentar o conceito de marketing digital e tem por objetivo contextualizá-lo numa estratégia clássica de marketing, incluindo o trabalho em paid media, que é o principal objeto de estudo deste relatório. Após esta explicação, é analisado um caso prático que consiste em verificar em que medida o investimento em paid media exerce um impacto positivo, não só na notoriedade da marca, mas também no seu volume de vendas.O caso prático apresentado corresponde à experiência que o estagiário teve ao longo de todo o período de estágio, participando ativamente na estratégia de investimento em paid media e nas tarefas inerentes a esse investimento, nomeadamente na implementação de campanhas em Meta Ads e Google Ads, revisão de conteúdos gráficos publicados nas redes sociais, etc. As campanhas implementadas tiveram como objetivo aumentar a notoriedade da marca e definir o seu posicionamento, mas também obter conversões, neste caso, obter reservas em restaurantes a partir destes anúncios.Relacionando a fase da revisão da literatura, onde são citados diversos autores que ajudam a contextualizar a temática do marketing digital e do paid media, com a descrição do estágio e análise do caso prático, pretende-se ter uma visão geral do impacto do marketing digital na performance das marcas
Relatórios de Estágio e Monografia intitulada "Aplicações da Tecnologia CRISPR na Gestão da Infeção por HIV - Prevenção, Diagnóstico, Monitorização e Tratamento"
No full textRelatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de FarmáciaApesar dos esforços globais para controlar a epidemia de HIV, uma pessoa morre a cada minuto com SIDA. A tecnologia CRISPR/Cas surge, entre várias estratégias emergentes, como uma ferramenta promissora para revolucionar a gestão da infeção por HIV nas áreas de prevenção, diagnóstico, monitorização e tratamento, com potencial para atingir curas esterilizante e funcional. Esta revisão visa explorar os mais recentes avanços nestas tecnologias, enfatizando o seu potencial na deteção e tratamento, e abordando também as suas implicações sociais, éticas e económicas, bem como considerações regulamentares. Na prevenção da infeção por HIV, os resultados iniciais são encorajadores, demonstrando especificidade e reduzidos limites de deteção; no entanto, desafios como a necessidade de equipamento especializado e de conhecimentos técnicos permanecem. No tratamento, dois ensaios clínicos em curso destacam o potencial das estratégias CRISPR/Cas, embora persistam obstáculos importantes, incluindo baixa eficiência de edição. A evolução destas tecnologias promete melhorar significativamente a gestão da infeção e impulsionar a inovação neste campo. Contudo, garantir a acessibilidade global será crucial para aproveitar todo o seu potencial. .Despite global efforts to control the HIV epidemic, one person still perishes every minute due to AIDS. Emerging CRISPR/Cas-based strategies offer a promising tool to revolutionise HIV management across prevention, diagnosis, monitoring, and treatment, with the potential for both sterilising and functional cures. This review explores the latest advancements in CRISPR/Cas-based technologies, emphasising their potential in HIV detection and treatment while also addressing the associated social, ethical, and economic implications, and regulatory considerations. In HIV prevention, early results of these technologies are encouraging, demonstrating optimal specificity and low limits of detection; however, challenges such as the need for specialised equipment and expertise remain. In treatment, two ongoing clinical trials highlight the potential of CRISPR/Cas-based strategies, although major hurdles, including low editing efficiency, persist. As these technologies continue to evolve, they hold great promise for enhancing HIV management and driving innovation in the field. Nonetheless, ensuring global accessibility will be crucial to fully profit from their potential.
Relatórios de Estágio e Monografia intitulada "Anti-LAG-3: A change in the paradigm of advanced melanoma treatment"
No full textRelatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de FarmáciaMelanoma is the deadliest skin cancer globally. It arises from the malignant transformation of melanocytes through multiple complex pathways. While cutaneous melanoma, originating from the epidermis, is the most common form, other rarer subtypes also exist. The complex physiopathology of melanoma, characterized by a high mutational load and metastatic potential, when correlated with the hallmarks of cancer, clearly demonstrates its predisposition to immunotherapy.Immunotherapy has significantly improved clinical outcomes, with the median survival of patients with advanced melanoma increasing from 6 months to 6 years following treatment with immune checkpoint inhibitors. However, the high risk of toxicity, particularly with the current standard combination therapies, and problems related to relapse or resistance to treatment, remain a major concern, with some mechanisms yet to be fully elucidated. Therefore, the discovery of new molecules targeting alternative immune checkpoints (ICs) has become one of the leading approaches.This review, focusing on lymphocyte-activation gene 3 (LAG-3), characterizes this novel IC at the structural and molecular level, as well as describing its enigmatic mechanism of action. Moreover, it highlights key clinical trials involving anti-LAG-3 molecules, including the landmark RELATIVITY-047 study, which led to the approval of relatlimab, the first anti-LAG-3 monoclonal antibody, in combination with nivolumab, as a first-line treatment for advanced melanoma. By reporting these promising clinical results, which demonstrate that this novel combination therapy is safer and as effective as other first-line therapies, this review points to a paradigm shift in the treatment of advanced melanoma.O melanoma é o cancro de pele mais mortal do mundo. Este resulta da transformação maligna dos melanócitos através de múltiplas vias de sinalização complexas. Embora o melanoma cutâneo, com origem na epiderme, seja a forma mais comum, existem outros subtipos mais raros. A complexa fisiopatologia do melanoma, caracterizada por uma elevada carga mutacional e potencial metastático, quando correlacionada com os hallmarks do cancro, transparece de forma evidente a sua predisposição para o tratamento com imunoterapia.A imunoterapia melhorou significativamente o prognóstico clínico, com a sobrevivência média dos doentes com melanoma avançado a aumentar de 6 meses para 6 anos, após o tratamento com inibidores dos checkpoints imunológicos. No entanto, o elevado risco de toxicidade, em particular com as atuais terapias combinadas padrão, e os problemas relacionados com recaídas ou com a resistência ao tratamento, continuam a ser um grande desafio, havendo alguns mecanismos ainda por elucidar. Por conseguinte, a descoberta de novas moléculas que visam checkpoints imunológicos alternativos tornou-se uma das principais abordagens. Esta monografia, centrada no gene de ativação de linfócitos 3 (LAG-3), caracteriza este inovador checkpoint imunológico a nível estrutural e molecular, descrevendo também o seu enigmático mecanismo de ação. Além disso, destaca os principais ensaios clínicos que envolvem moléculas anti-LAG-3, incluindo o estudo de referência RELATIVITY-047, que levou à aprovação do relatlimab, o primeiro anticorpo monoclonal anti-LAG-3, em combinação com o nivolumab, como tratamento de primeira linha para o melanoma avançado. Ao destacar estes resultados clínicos promissores, que demonstram que esta nova terapêutica combinada é mais segura e tão eficaz como outras terapêuticas de primeira linha, esta revisão aponta para uma mudança de paradigma no tratamento do melanoma avançado