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Differences in emotional processing along the fybromialgianess continuum
No full textTrabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina apresentado à Faculdade de MedicinaIntroduction: Fibromyalgia is a complex syndrome characterized by chronic widespread pain, fatigue, and cognitive and emotional dysfunction. Some authors have adopted a dimensional perspective, according to which fibromyalgia represents the extreme end of a continuum of similar symptoms (called fibromyalgianess), which are common and vary in distribution in the general population. Evidence suggests that an imbalance in emotional regulation systems — namely, hyperactivation of the threat system and hypoactivation of the tranquillization system — may contribute to the predisposition and maintenance of fibromyalgia(ness). However, it remains unclear whether emotional processing disorders are present across this continuum and how they relate to psychological and clinical variables that are often altered in this condition, such as alexithymia, interoceptive awareness, fears of compassion, and emotional disturbances. Thus, the study sought to explore these relationships.Methods: Twenty-nine women with and without a diagnosis of fibromyalgia, aged between 18 and 65 years, participated in this study. The participants performed an experimental task of timed recognition of dynamic facial emotional expressions. Clinical and psychosocial variables were assessed using self-report instruments, including measures of alexithymia, interoceptive awareness, fears of compassion, depressive symptomatology, and psychosomatic symptoms. Statistical analyses were conducted in SPSS v29, using descriptive statistics, Mann-Whitney tests, Spearman correlations, and hierarchical linear regression.Results: Significant associations were found between overall response times and response times to critical faces and the degree of fibromyalgianess. A positive association was also observed between fear of giving compassion and response times to faces of pain and sadness, and a positive association between the ability to regulate attention and response time to faces of happiness. No differences were observed in response times or task accuracy as a function of levels (low vs. high) in clinical and psychological variables. Linear regression showed that, when controlling for the effect of depressive symptoms, overall response time no longer significantly predicted the degree of fibromyalgianess.Conclusion: The data suggest that emotional processing disorders are associated with the degree of fibromyalgianess, partially supporting the FITSS model. These disorders appear to be associated with psychological variables of interest that may be targets for therapeutic intervention. The results seem to suggest that interventions that integrate emotional regulation strategies may be beneficial for the treatment of fibromyalgia.Introdução: A fibromialgia é uma síndrome complexa, caracterizada por dor crónica generalizada, fadiga e disfunções cognitivas e emocionais. Alguns autores têm adotado uma perspetiva dimensional, segundo a qual a fibromialgia representa o extremo de um continuum de sintomas semelhantes (designado por fibromyalgianess), os quais são comuns e se distribuem de forma variável na população geral. Evidências sugerem que um desequilíbrio nos sistemas de regulação emocional — nomeadamente a hiperativação do sistema de ameaça e a hipoativação do sistema de tranquilização — poderá contribuir para a predisposição e manutenção da fibromialgia(ness). Contudo, permanece impreciso se distúrbios no processamento emocional estão presentes ao longo deste continuum, e como se relacionam com variáveis psicológicas e clínicas frequentemente alteradas nesta condição, como a alexitimia, consciência interoceptiva, medos da compaixão e perturbações emocionais. Assim, o estudo procurou explorar estas relações.Métodos: Participaram neste estudo 29 mulheres com e sem o diagnóstico de fibromialgia, com idades entre os 18 e os 65 anos. As participantes realizaram uma tarefa experimental de reconhecimento temporizado de expressões emocionais faciais dinâmicas. Foram avaliadas variáveis clínicas e psicossociais através de instrumentos de autorresposta, incluindo medidas de alexitimia, consciência interoceptiva, medos da compaixão, sintomatologia depressiva e sintomas psicossomáticos. As análises estatísticas foram conduzidas no SPSS v29, recorrendo a estatística descritiva, testes de Mann-Whitney, correlações de Spearman e regressão linear hierárquica.Resultados: Foram encontradas associações significativas entre tempos de resposta globais e tempos de resposta a faces críticas e o grau de fibromyalgianess. Observou-se também uma associação positiva entre o medo de dar compaixão e os tempos de reposta a faces de dor e tristeza e uma associação positiva entre a capacidade de regular atenção e o tempo de resposta a faces de felicidade. Não foram observadas diferenças nos tempos de reposta nem na precisão da tarefa em função dos níveis (baixos vs elevados) nas variáveis clínicas e psicológicas. A regressão linear mostrou que, ao controlar o efeito da sintomatologia depressiva, o tempo de resposta global deixou de predizer significativamente o grau de fibromyalgianess.Conclusão: Os dados sugerem que distúrbios no processamento emocional estão associados com o grau de fibromyalgianess, parcialmente suportando o modelo FITSS. Estes distúrbios parecem estar associados com variáveis psicológicas de interesse que podem ser alvo de intervenção terapêutica. Os resultados parecem sugerir que intervenções que integrem estratégias de regulação emocional poderão ser benéficas para o tratamento da fibromialgia
Projeto e fabrico de dispositivos bioeletrónicos para medir a comunicação elétrica em redes neuronais.
No full textDissertação de Mestrado em Engenharia Eletrotécnica e de Computadores apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaThis dissertation aims to develop electrodes capable of measuring the communication of brain cell populations known as astrocytes.Astrocytes are cells that communicate with neurons and are also believed to control communication between neurons. Unlike neurons, astrocytes do not generate electrical impulses. Instead, astrocytes generate ultra-slow oscillations that can last several seconds or even minutes and have periods of several minutes. Measurements of astrocyte signals require instrumentation capable of measuring ultra-weak signals (milivolts (mV)) at a frequency of milihertz (mHz). Although there are many studies on neurons, there is little information on astrocyte signals. This represents a significant challenge in understanding how the brain works.The work carried out in this thesis includes the fabrication of electrodes with different areas and geometries. These electrodes were used to measure extracellular signals using methodologies previously developed by the research group hosting this thesis.To better understand the communications between astrocytes, two working hypotheses were proposed:(1) Could the electrode's geometries and area influence the shape of the bioelectronic signal collected in astrocyte populations?(2) Can the oscillations generated by astrocytes propagate through a population of cells forming an electrical wave or are they localised oscillations? To test these hypotheses, several types of electrodes with different areas and geometries were used.The results showed that the shape and area of the electrode do not influence the shape of the measured signal. However, it was not always possible to ensure that astrocyte populations formed a continuous and interconnected layer, an essential condition to allow wave propagation through cells. Thus, the results were not entirely conclusive regarding the propagation of oscillations in the astrocyte population.O objetivo desta dissertação é desenvolver elétrodos e métodos que nos permitam perceber a comunicação entre populações de células cerebrais conhecidas como astrócitos.Os astrócitos são células que interagem com os neurónios e acredita-se que desempenham um papel fundamental no controle da comunicação neuronal. Em contraste com os neurónios, que geram impulsos elétricos, os astrócitos produzem oscilações ultra-lentas, com duração de vários segundos a minutos e períodos entre sinais na escala de vários minutos. A medição dessas oscilações exige instrumentação de baixo ruído, capaz de detetar sinais ultrafracos (na faixa de milivolts (mV)) em frequências da ordem de millihertz (mHz). Embora existam inúmeros estudos sobre neurónios, há pouca informação disponível sobre os sinais dos astrócitos, tornando sua investigação um desafio relevante para a compreensão do funcionamento do cérebro.Com o objetivo de compreender melhor a comunicação entre astrócitos, foram formuladas duas hipóteses de trabalho:(i) A geometria e a área do elétrodo influenciam a forma do sinal medido?(ii) As oscilações geradas pelos astrócitos propagam-se através da população celular, formando uma onda elétrica, ou permanecem como oscilações localizadas?Para testar essas hipóteses, foram utilizados diversos tipos de elétrodos com diferentes áreas e geometrias. Os resultados mostraram que a forma e a área do elétrodo não influenciam a forma do sinal medido. No entanto, nem sempre foi possível garantir que as populações de astrócitos formavam uma camada contínua e interligada, condição essencial para permitir a propagação de ondas através das células. Assim, os resultados não foram inteiramente conclusivos quanto à propagação das oscilações na população de astrócitos.FC
O papel dos recetores A1, A2B e A3 de adenosina na migração tangencial de neurónios derivados da Eminência Gangliónica Média
No full textDissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaBrain development comprises a tightly regulated sequence of events to achieve a functional-structural organization. Neuronal migration is crucial for cytoarchitecture formation, determining the final position of each neuron. Adenosine A2AR regulates the migration of cortical interneurons and principal neurons, with its antagonism delaying tangential migration and causing cortical projection neurons to accumulate in the lower intermediate zone. While the intake of caffeine, a well-established antagonist of adenosine P1 receptors, mimicked the delay in interneuron tangential migration observed with the antagonism of A2A, it accelerated radial migration. This suggests that the regulation of neuronal migration by adenosine may be more intricate and should involve other P1 receptors. Additionally, caffeine selectively affected radial migration in one hemisphere, indicating lateralization in brain development mechanisms. Hence, this study aimed to explore the roles of A1R, A2BR, and A3R in the migration of medial ganglionic eminence (MGE)-derived interneurons, considering potential hemisphere-specific effects. First it was identified the expression of A1R, A2BR and A3R in mice embryonic forebrain at mid-late embryogenesis (E14.5-E16.5). While no hemispheric differences were observed for A1R and A3R, A2BR density was higher in the left hemisphere at E14.5 but not at E16.5. At E16.5, A1R showed two subpopulations: one with increased density in the left hemisphere and another in the right, suggesting individual variability in lateralization.Regional distribution analysis in the subpallium at E14.5 revealed that A1R immunoreactivity peaked near the end of the MGE’s proliferative region before decreasing in the migratory region, similarly in both hemispheres. Regarding A2BR, in the left hemisphere, its immunoreactivity increased through the proliferative region and then kept stable through the migratory region, while in the right hemisphere, its immunoreactivity increased all the way from the proliferative region and through the migratory region, peaking at the furthest distance from the proliferative region. A3R remained stable across both regions in the right hemisphere but slightly increased in the left hemisphere.Regarding the subcellular distribution of each receptor in MGE-derived interneurons, it was observed a higher overall A1R immunoreactivity in the left hemisphere, while A2BR and A3R levels were similar between hemispheres. A1R was more expressed in the leading process, particularly in left hemisphere-derived cells, while A3R was higher in the cell body of these cells in comparison with the right hemisphere. A2BR showed a tendency for higher immunoreactivity in the cell bodies of left hemisphere-derived cells vs. right hemisphere-derived cells.Using a 3D MGE-explant model, if A1, A2B and/or A3 receptors are involved in the migration of MGE-derived interneurons. The pharmacological manipulation of A1R did not modify migration in either hemisphere. A2BR blockade inhibited migration selectively in left hemisphere-derived interneurons, indicating a tonic action promoting migration in selectively in that hemisphere. Preliminary data suggested also for a tonic facilitatory effect of A3R, but now in the right hemisphere-derived interneurons.In conclusion, the results obtained show that A1, A2B and A3 receptors are expressed in mice brain at mid-late embryogenesis, in particular in the telencephalon and in MGE-derived interneurons, and that A2B and A3R seem to be involved in the promotion of interneurons migration selectively in the left and right hemispheres, respectively. Although a higher sample and more studies are needed, these data already show that the control of tangential migration of cortical interneurons by adenosinergic signalling, previously shown to be controlled by A2AR, may entail the concerted action of A2BR and A3R, which may be most likely different in each hemisphere, supporting the existence of a lateralization in the mechanisms governing brain development.O desenvolvimento cerebral compreende uma sequência de eventos rigorosamente regulada para alcançar uma organização estrutural e funcional. A migração neuronal é crucial para a formação da citoarquitetura, determinando a posição final de cada neurônio. O recetor de adenosina A2AR regula a migração de interneurónios corticais e neurônios principais, sendo que sua inibição atrasa a migração tangencial e causa o acúmulo de neurônios corticais projetivos na zona intermediária inferior. Enquanto a ingestão de cafeína, um antagonista bem estabelecido dos recetores P1 de adenosina, mimetizou o atraso na migração tangencial dos interneurónios observado com a inibição do A2A, ela acelerou a migração radial. Isso sugere que a regulação da migração neuronal pela adenosina pode ser mais complexa e envolver outros recetores P1. Além disso, a cafeína afetou seletivamente a migração radial em um dos hemisférios, indicando uma lateralização nos mecanismos do desenvolvimento cerebral. Assim, este estudo teve como objetivo explorar os papéis dos recetores A1R, A2BR e A3R na migração de interneurónios derivados da eminência ganglionar medial (MGE), considerando possíveis efeitos específicos para cada hemisfério.Primeiramente, foi identificada a expressão de A1R, A2BR e A3R no prosencéfalo embrionário de murganhos durante o período temporal que engloba a migração neuronal (E14.5-E16.5). Embora não tenham sido observadas diferenças entre hemisférios para os recetores A1 e A3, a densidade de A2BR foi maior no hemisfério esquerdo em E14.5, mas não em E16.5. Em E16.5, o A1R apresentou duas subpopulações: uma com maior densidade no hemisfério esquerdo e outra no direito, sugerindo variabilidade individual na lateralização.A análise da distribuição regional no subpálio em E14.5 revelou que a imunorreatividade do A1R atingiu o pico próximo ao final da região proliferativa da MGE diminuindo depois em direção da região migratória, de maneira semelhante em ambos os hemisférios. Quanto ao A2BR, no hemisfério esquerdo, a sua imunorreatividade aumentou ao longo da região proliferativa e permaneceu estável na região migratória, enquanto no hemisfério direito, a sua imunorreatividade aumentou continuamente desde a região proliferativa até a região migratória, atingindo o pico no ponto analisado mais distante da região proliferativa. Quanto ao A3R, manteve-se estável nas duas regiões do hemisfério direito, mas apresentou um leve aumento no hemisfério esquerdo.Em relação à distribuição subcelular de cada recetor nos interneurónios derivados da MGE, observou-se uma maior imunorreatividade geral para o A1R no hemisfério esquerdo, enquanto os níveis de A2BR e A3R foram semelhantes entre os hemisférios. O A1R foi mais expresso no “leading process”, particularmente nas células derivadas do hemisfério esquerdo, enquanto o A3R foi mais abundante no corpo celular dessas células em comparação com o hemisfério direito. O A2BR mostrou uma tendência para maior imunorreatividade nos corpos celulares das células derivadas do hemisfério esquerdo em relação às do hemisfério direito.Utilizando um modelo 3D de explantes da MGE, investigou-se se os recetores A1, A2B e/ou A3 estavam envolvidos na migração dos interneurónios derivados da MGE. A manipulação farmacológica do A1R não modificou a migração em nenhum dos hemisférios. O bloqueio do A2BR inibiu seletivamente a migração dos interneurónios derivados do hemisfério esquerdo, indicando uma ação tónica que promove a migração exclusivamente nesse hemisfério. Dados preliminares também sugeriram um efeito tónico facilitatório do A3R, mas nos interneurónios derivados do hemisfério direito.Em conclusão, os resultados obtidos mostram que os recetores A1, A2B e A3 são expressos no cérebro de murganhos durante o período da embriogénese que engloba a migração neuronal, particularmente no telencéfalo e nos interneurónios derivados da MGE, e que os recetores A2B e A3R parecem estar envolvidos na promoção da migração dos interneurónios seletivamente nos hemisférios esquerdo e direito, respetivamente. Embora seja necessário aumentar a amostra e fazer mais estudos, estes dados já demonstram que o controle da migração tangencial dos interneurónios corticais pela sinalização adenosinérgica, previamente atribuído ao A2AR, pode envolver a ação coordenada dos recetores A2BR e A3R, de maneira diferenciada em cada hemisfério, apoiando a existência de lateralização nos mecanismos que regulam o desenvolvimento cerebral.FCTFCTFC
Avaliação de Ciclo de Vida de uma Tecnologia Piloto de Remoção e Lavagem de Amoníaco para Recuperação de Azoto de Águas Residuais Urbanas
No full textDissertação de Mestrado em Engenharia do Ambiente apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaNew nutrient recovery (NR) technologies are being developed to recover nutrients from wastewater treatment plants (WWTP) and produce fertilizers for agriculture, displacing conventional fertilizers. Previous life cycle assessment (LCA) studies showed that NR systems present environmental hotspots related to energy consumption and chemical inputs. This dissertation presents an LCA to assess the environmental impacts of an ammonia Stripping-scrubbing (SS) pilot technology for nitrogen recovery (as ammonium sulfate) integrated into two WWTPs: one located in Leuven, one in Antwerp, in Belgium. The LCA compares the SS technology with conventional WWTPs (without nitrogen recovery) and conventional ammonium sulfate (AS) fertilizer supply (Reference Scenario, RS). This dissertation was conducted in the context of the European Union’s Horizon 2020 WalNUT project which includes the development of the SS process at a pilot plant scale operated by Aquafin Inc., in Flanders. The Leuven reference scenario (RS_L) comprises primary treatment, secondary treatment, and sludge treatment, and a “SHARON” unit (Single reactor system for High Ammonium Removal Over Nitrite) for sidestream nitrogen removal; in the stripping-scrubbing scenario (SS_L), the SS unit replaces sidestream nitrogen removal (conventional WWTP). The Antwerp reference scenario (RS_A) is similar to the RS_L, but it does not have a SHARON, and in SS_A it was added the SS technology to the plant. The SS system is multifunctional: it treats wastewater and produces fertilizer; thus, RS_L and RS_A system are expanded to consider the production of AS. The functional units (FU) chosen were the production of 1 kg of nitrogen (as AS), and the corresponding amount of urban wastewater (168 m3 for Leuven, 310 m3 for Antwerp) and external sludge (915 kg for Leuven, 126 kg for Antwerp). The life cycle impact assessment was performed using the Environmental Footprint method (EF 3.1). The integrated WWTP and ammonia SS technology outperformed both reference System in Leuven (RS_L) and in Antwerp (RS_A) in Climate Change, Acidification, and Terrestrial Eutrophication. The best performance was obtained for climate change, in Leuven (SS_L with 2.3 times lower impacts than RS_L), since in SS_L there is no emission of nitrous oxide (N2O) through the SHARON unit. The main environmental hotspots of both SS_L and SS_A are the use of sulfuric acid, polyelectrolyte and electricity consumption. Recommendations are made to assess the impacts associated with energy-saving and the implementation of the SS technology in WWTPs with higher nitrogen concentrations.Novas tecnologias de recuperação de nutrientes (NR) estão a ser de desenvolvidas com o objetivo de recuperar nutrientes das estações de tratamento de águas residuais (WWTP) e produzir fertilizantes para uso na agricultura, substituindo os fertilizantes convencionais. Estudos anteriores de avaliação do ciclo de vida (LCA) mostraram que os sistemas de NR apresentam pontos críticos relacionados com o consumo de energia e de produtos químicos. Esta dissertação apresenta uma LCA para avaliar os impactos ambientais da tecnologia stripping-scrubbing (SS, Remoção e Lavagem) de amoníaco para recuperação de azoto (na forma de sulfato de amónio - AS) integrada em duas WWTPs: uma localizada em Lovaina e outra em Antuérpia, na Bélgica. A LCA compara a tecnologia SS com WWTP convencional (sem recuperação de azoto) e a produção de fertilizante de sulfato de amónio convencional (cenário de referência, RS). Esta dissertação foi realizada no âmbito do projeto WalNUT do Horizonte 2020 da União Europeia, que inclui o desenvolvimento do processo SS à escala de uma instalação piloto operada pela Aquafin Inc., na região da Flandres. O cenário de referência de Lovaina (RS_L) inclui o tratamento primário, o tratamento secundário e o tratamento das lamas e uma unidade SHARON (Single reator system for High Ammonium Removal Over Nitrite) para a remoção do azoto; no SS_L, a unidade de SS substitui a tecnologia de remoção do azoto (WWTP convencional). O cenário de referência de Antuérpia (RS_A) é semelhante ao RS_L, mas não possui unidade SHARON; no SS_A, foi acrescentada a tecnologia SS à estação. O sistema SS é multifuncional: trata as águas residuais e produz fertilizantes, pelo que tanto o sistema RS_L como o RS_A foram expandidos para comtemplar a produção de sulfato de amónio. As unidades funcionais (FU) escolhidas foram a produção de 1 kg de azoto (como AS), e a quantidade correspondente de águas residuais urbanas (168 m3 em Lovaina, 310 m3 em Antuérpia) e de lamas externas (915 kg em Lovaina, 126 kg em Antuérpia). A avaliação do impacto do ciclo de vida foi efetuada utilizando o método Environmental Footprint (EF 3.1). A integração da WWTP e tecnologia SS superou ambos os cenários RS_L e RS_A nas categorias da acidificação, alterações climáticas e eutrofização terrestre. O melhor desempenho foi obtido na categoria das alterações climáticas, em Lovaina (SS_L com impacto 2.3 vezes menor que RS_L), uma vez que no SS_L não há emissão de óxido nitroso (N2O) através do SHARON. Os principais pontos críticos de ambos os cenários SS_L e SS_A prendem-se com a utilização de ácido sulfúrico, de polieletrólito e o consumo de eletricidade. São apresentadas recomendações para avaliar os impactos associados aos cenários de poupança de energia e de implementação da tecnologia SS em WWTPs com concentrações de azoto superiores/mais elevadas.H202
Regulação do Tráfego Membranar em organóides altamente invasivos de Cancro da Mama Triplo Negativo
No full textDissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaTriple-Negative Breast Cancer (TNBC) accounts for more than 35% of all breast cancer-related deaths. Considered the most aggressive breast cancer subtype, TNBC is commonly associated with an unfavourable outcome due to the combination of its high metastatic propensity, chemo-refractory behaviour, and the lack of effective targeted interventions. Thus, it is pressing to develop low-resistance effective therapeutic strategies by targeting the still poorly understood molecular mechanisms underlying TNBC invasion. Accordingly, recent advances revealed that depletion of FER kinase impairs TNBC cells invasion abilities by regulating a well-known membrane trafficking mechanism, the endosomal sorting/recycling (ESR) pathway. Specifically, FER-dependent ESR governs cell invasion by controlling the spatial distribution and turnover of adhesion and signaling complexes at the plasma membrane, subsequently propelling cell migration and invasion. However, the ESR machinery supporting TNBC aggressiveness in 3D environments remains largely unidentified. Hence, to address this knowledge gap, our study aimed to dissect the ESR molecular pathway through the identification of differentially regulated ESR regulators that propel invasion and, furthermore, establish a proof-of-concept that one of the identified ESR regulators drives invasion in TNBC cells. To test our hypothesis, we combined in a multi-omics approach preliminary single-cell transcriptomics data together with (phospho)proteomics data from TNBC Patient-Derived Xenograft Organoids (PDXOs). By employing this strategy, we demonstrated that invading PDXO cells not only prioritize fast endosomal recycling but also upregulate the expression of ESR machinery associated with invasive behaviour. Importantly, we observed a significant enrichment of phospho-events associated with organelle biogenesis in invasive PDXOs, revealing that invasive TNBC cells are preferentially regulated at the post-translational level via phosphorylation. To further validate the requirement of a specific ESR phosphoproteomic profile to drive invasion in TNBC cells, among the 95 ESR phospho-residues uniquely found in invasive PDXOs, SEC16A emerged as a potential driver of TNBC invasion. Through functional validation experiments, we demonstrated that SEC16A knockdown impaired TNBC cells invasive capacity, disrupting tumour spheroid morphology and indicating a shift in cells from an invasive phenotype to a non-invasive one. Additionally, SEC16A depletion disrupted cell-cycle progression, as evidenced by a reduction in the percentage of S-phase cells, further highlighting its role as a promising novel TNBC therapeutic target due to its dual role as a key mediator of TNBC invasiveness and proliferation.O Cancro da Mama Triplo Negativo (TNBC) é responsável por mais de 35% de todas as mortes relacionadas com cancro da mama. Considerado o subtipo mais agressivo de cancro da mama, o TNBC está associado a um desfecho desfavorável devido à combinação da sua elevada propensão metastática, do seu comportamento quimio-refratário e da falta de intervenções específicas eficazes. Deste modo, é urgente desenvolver estratégias terapêuticas eficientes de baixa resistência, visando os mecanismos moleculares ainda pouco compreendidos subjacentes à invasão de TNBC.Avanços recentes revelaram que a depleção da quinase FER prejudica a capacidade de invasão das células TNBC através da regulação de um conhecido mecanismo de tráfego membranar, a via de triagem/reciclagem endossómica (ESR). Especificamente, a ESR dependente de FER regula a invasão celular através do controlo da distribuição espacial e renovação de complexos de adesão e sinalização na membrana plasmática, impulsionando, subsequentemente, a migração e invasão celular. No entanto, a maquinaria ESR que suporta a agressividade de TNBC em ambientes 3D permanece maioritariamente não identificada. Assim sendo, para colmatar esta lacuna de conhecimento, este estudo teve como objetivo dissecar a via molecular ESR através da identificação de reguladores ESR diferencialmente regulados que impulsionam a invasão e, além disso, estabelecer uma prova de conceito de que um destes reguladores ESR identificados impulsiona a invasão em células TNBC. Assim, para testar a nossa hipótese, combinámos uma abordagem multi-ómica através da análise transcriptómica de dados preliminares de sequenciação de RNA de célula única, juntamente com uma análise (fosfo)proteómica em organóides de xeno-enxertos derivados de pacientes (PDXOs) de TNBC. Empregando esta metodologia, demonstrámos que as células PDXO invasoras não só dão prioridade à reciclagem endossómica rápida, como também aumentam a expressão da maquinaria ESR associada ao comportamento invasivo. É importante ressalvar que observámos um enriquecimento significativo de fosfo-eventos associados à biogénese de organelos em PDXOs invasivos, revelando que as células TNBC invasivas são preferencialmente reguladas a nível pós-traducional através da fosforilação. Para validar ainda mais a exigência de um perfil fosfoproteómico ESR específico para desencadear a invasão em células TNBC, entre os 95 reguladores ESR fosforilados identificados, exclusivamente invasivos, o SEC16A surgiu como um elemento crucial da invasão de TNBC. Através de experiências de validação funcional, demonstrámos que a depleção de SEC16A diminuiu a capacidade invasiva das células TNBC em cerca de 40% e perturbou a morfologia dos esferóides tumorais, passando as células de fenótipos invasivos para não invasivos. Além disso, a depleção de SEC16A interrompeu a progressão do ciclo celular, reduzindo a percentagem de células em fase S, destacando assim o seu papel como um novo e promissor alvo terapêutico em TNBC devido ao seu duplo papel como mediador fulcral da invasão e proliferação em TNBC
Estudo da Salicornia ramosissima como Substituto do Sal no Pão
No full textTese de Doutoramento em Ciências Farmacêuticas apresentada à Faculdade de FarmáciaÀ medida que os recursos de água doce se esgotam e a salinização dos solos e os eventos ambientais extremos ameaçam dramaticamente a segurança alimentar, urge repensar a forma como usamos os recursos do planeta. Maximizar o uso sustentável dos nutrientes e fitoquímicos fornecidos pelos recursos vegetais menos convencionais é crucial para um sistema alimentar mais diversificado e sustentável e uma melhor saúde global. As halófitas — espécies vegetais que prosperam em ambientes salinos — exibem características ímpares que têm sido subaproveitadas. Estas plantas estão equipadas com um poderoso sistema antioxidante que inclui moléculas altamente benéficas à saúde humana, como os ácidos fenólicos e flavonoides, ácido ascórbico, tocoferóis e carotenoides. Ademais, são interessantes fontes de fibra e outros nutrientes, como proteínas e lípidos de boa qualidade. As espécies do tipo acumulador exibem ainda a capacidade de reter quantidades consideráveis de minerais essenciais, incluindo K, Ca e Mg, o que as torna promissoras como ingredientes funcionais, particularmente como substitutos do sal (NaCl). O sal é amplamente usado na indústria alimentar devido ao seu baixo custo e múltiplas propriedades tecnológicas. Contudo, uma ingestão excessiva de Na está associada a um risco acrescido de diversas doenças, nomeadamente as cardiovasculares, mas também outras como o cancro gástrico. A ingestão média diária de Na no mundo e em Portugal excede consideravelmente o limite máximo de 2 g recomendado pela OMS. Apesar da tendência decrescente dos níveis de ingestão de Na reportada para alguns países, atribuível às políticas de redução de sal que têm sido implementadas, há ainda um longo caminho a ser trilhado. Dito isto, a redução do sal nos alimentos processados é considerada a estratégia mais custo-efetiva, pelo que o sector alimentar tem sido impulsionado a explorar novos métodos de redução, sendo os substitutos do sal que proporcionam uma “rotulagem limpa” particularmente desejados. O pão tem sido um alvo prioritário devido ao seu impacto significativo na ingestão total de sal. Contudo, devido ao papel vital que o sal desempenha em aspetos como o sabor, textura, e prazo de validade do produto final, a indústria tem enfrentado um desafio significativo. A redução gradual, o uso de outros sais metálicos como substitutos do sal, e a incorporação de intensificadores de sabor são abordagens possíveis, mas que apresentam limitações. Em Portugal, o uso de halófitas como alternativa ao sal tem sido incentivado pelo governo, mas a oferta de produtos é ainda limitada. Daqui a presente investigação, que visa avaliar a viabilidade do uso de uma halófita nativa portuguesa — Salicornia ramosissima — como substituto do sal no pão. Para este efeito, efetuou-se o estudo da composição nutricional, perfil fenólico e potenciais contaminantes de exemplares da referida espécie, com foco naqueles provenientes do estuário do Mondego. A S. ramossisima revelou ser uma boa fonte de minerais, fibra e compostos fenólicos, contudo, quando proveniente de um ambiente não controlado o risco de contaminação por micotoxinas e eventualmente metais pesados pode representar uma ameaça à saúde pública. Posto isto, foram desenvolvidas três formulas de pão: i) pão referência; ii) pão com substituição parcial do sal por Salicornia; e iii) pão com substituição total do sal pela Salicornia. A S. ramosissima usada foi produzida em hidroponia para garantir uma qualidade controlada. A composição centesimal dos pães foi determinada pelos métodos da AOAC, o perfil mineral por ICP-MS, e a análise sensorial com recurso a um painel 73 consumidores. A textura do pão com redução parcial do sal foi melhor avaliada do que a do pão referência, enquanto a apreciação de sabor e da cor da crosta foi superior para o pão referência comparativamente ao pão “sem sal”. A avaliação global foi melhor para o pão com redução parcial de sal em comparação com o pão “sem sal”, e também para o pão referência em comparação com o pão “sem sal”, mas não se observaram diferenças significativas na apreciação global do pão referência e pão com redução parcial do sal. Embora os consumidores tenham notado uma menor salinidade nos pães com teor reduzido de sal e “sem sal”, a intenção de compra foi maior para o pão com redução parcial do sal em comparação com quer o pão referência, quer o “sem sal”. Em suma, a substituição parcial do sal por S. ramosissima mostrou-se apropriada. A substituição total poderá ser atrativa no âmbito de uma estratégia de redução progressiva e/ou para grupos de consumidores específicos. A Salicornia representa, assim, uma alternativa promissora ao sal que traz inovação ao sector alimentar ao mesmo tempo que proporciona importantes benefícios aos consumidores.As freshwater resources are depleted, soil salinization and extreme environmental events dramatically threaten food security, an urgent need arises to rethink the way we use the planet's resources. Maximizing the sustainable use of nutrients and phytochemicals provided by less conventional plant resources is crucial for a more diverse and sustainable food system and better global health. Halophytes — vegetable species that thrive in saline environments — exhibit unique characteristics that have been underutilized. These plants are equipped with a powerful antioxidant system that includes molecules highly beneficial to human health, such as phenolic acids and flavonoids, ascorbic acid, tocopherols, and carotenoids. Furthermore, they are interesting sources of fiber and other nutrients such as proteins and lipids of high quality. Accumulator-type species also exhibit the ability to retain considerable amounts of essential minerals, including K, Ca, and Mg, which makes them promising as functional ingredients, particularly as salt (NaCl) substitutes.Salt is widely used in the food industry owing to its low cost and multiple technological properties. Yet, an excessive intake of Na is associated with an accrued risk of a series of diseases, including cardiovascular ones, but also others such as gastric cancer. The average daily intake of Na in the world and in Portugal considerably exceeds the maximum limit of 2 g recommended by the WHO. Despite the downward trend in Na intake levels reported for some countries, attributable to the salt reduction policies that have been implemented, there is still a long way to go. That said, reducing salt in processed foods is considered the most cost-effective strategy, wherefore the food sector has been driven to explore new reduction methods, with salt substitutes that provide “clean labeling” particularly in demand. Bread has been a priority target due to its significant impact on total salt intake, but owing to the vital role of this ingredient in aspects such as flavor, texture, and shelf life of the final product, its reduction poses a significant challenge to the industry. Gradual reduction, the use of other metallic salts as salt substitutes, and the incorporation of flavor enhancers are possible approaches, but these methods have limitations. In Portugal, the use of halophytes as an alternative to salt has been encouraged by the government, but the availability of products is still limited.Hence the present research, which aims to evaluate the feasibility of using an indigenous Portuguese halophyte — Salicornia ramosissima — as a substitute for salt in bread. To this end, a study was carried out on the nutritional composition, phenolic profile and potential contaminants of specimens of the aforementioned species, focusing on those from the Mondego estuary. S. ramossisima proved to be a good source of minerals, fiber and phenolic compounds, however, when coming from an uncontrolled environment, the risk of contamination by mycotoxins and eventually heavy metals can represent a threat to public health. That being said, three bread formulas were developed: i) reference bread; ii) bread with partial replacement of salt with Salicornia; and iii) bread with total salt replacement with Salicornia. The S. ramosissima used was produced in hydroponics to ensure controlled quality. The proximate composition of the bread rolls was determined using AOAC methods, the mineral profile by ICP-MS, and sensory analysis using a panel of 73 consumers. The texture of the bread with partial salt reduction was better evaluated than that of the reference bread, whilst the appreciation of the flavor and crust color was higher for the reference bread compared to the “salt-free” bread. The overall evaluation was better for the bread with partial salt reduction compared to the “salt-free” bread, and also for the reference bread compared to the “salt-free” bread, but no significant differences were observed in the overall evaluation of the reference bread and bread with partial salt reduction. Even if consumers noted lower saltiness in reduced-salt and “salt-free” bread rolls, purchase intention was higher for the partially salt-reduced bread compared to the reference bread and the “salt-free” bread. In all, the partial replacement of salt by S. ramosissima proved to be appropriate. Full replacement could be attractive within a progressive reduction strategy and/or for specific consumer groups. Salicornia, thus, represents a promising alternative to salt that brings innovation to the food sector while providing important benefits to consumers.FC
Investigação do impacto da O-GlcNAcilação na degradação proteassómica de Ascl1: o papel da E3 ubiquitina-ligase Huwe1
No full textDissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaProneural transcription factors (TFs) of the bHLH family, such as Ascl1, function as master regulators of neurogenesis in vertebrates, being both necessary and sufficient for the activation of neuronal differentiation. Given its function, the transcriptional activity of Ascl1 requires continuous regulation during neurogenesis, with post-translational modifications (PTMs) playing an essential part in this process. Protein O-GlcNAcylation is a nutrient-sensitive PTM that relies on two enzymes – OGT and OGA – to add and remove O-GlcNAc groups from threonine or serine residues of proteins, respectively. It targets multiple cytoplasmic and nuclear proteins, including TFs.Recent unpublished work from our group revealed that pharmacological inhibition of OGT with OSMI-1 resulted in decreased Ascl1 protein levels in neural stem (NS) cells. This occurs in a proteasomal-dependent manner, suggesting that O-GlcNAcylation may regulate Ascl1 protein levels by impacting its degradation. Huwe1 is an E3 ubiquitin ligase known to control the proteasomal degradation of Ascl1 in NS cells. Interestingly, Huwe1 was found to be O-GlcNAcylated in whole protein extracts of mouse adult hippocampus, where one of the adult neurogenic niches is located. Based on these observations, we aimed to investigate if O-GlcNAcylation, mediated by OGT, impacts the ubiquitin-ligase activity of Huwe1, reducing the conjugation of ubiquitin to Ascl1, and protecting it from proteasomal degradation.To test our hypothesis, we investigated the impact of inhibiting O-GlcNAcylation on Huwe1 protein levels in NS cells via immunoblotting. Our results suggest that this PTM does not affect Huwe1 protein levels. Nevertheless, we observed a consistent change in the migration pattern of Huwe1 induced by the inhibitor, consistent with Huwe1 being a target of OGT in NS cells. By performing an in silico search with a deep-learning tool, we identified Huwe1 sites that are potential targets of OGT, including residues within the linker region of the HECT domain and a site upstream of a conserved phenylalanine situated four residues from the C-terminus. These elements are essential for the flexibility of the HECT domain, which the enzyme requires to execute its catalytic activity. Then, to determine if O-GlcNAcylation affects the proteasomal degradation of Ascl1 mediated by Huwe1, we developed tools to co-express Ascl1 and ubiquitin in P19 cells, subsequently detecting ubiquitinated forms of Ascl1 through co-immunoprecipitation and western blotting. Initial evidence suggests that the mere introduction of Ub into the system is sufficient to enhance the conjugation of Ub chains to Ascl1, an important observation to be pursued in future experiments. Moreover, preliminary results suggest a slight increase in ubiquitinated Ascl1 forms following OSMI-1 treatment, which is in line with the reduction of O-GlcNAcylation promoting the activity of Huwe1. Finally, we successfully optimised a Co-IP protocol for testing the interaction of Ascl1 and Huwe1 in transfected P19 cells. This establishes the base for future experiments aiming at testing the impact of OGT inhibition in this interaction.Fatores de transcrição (FTs) proneurais da família bHLH, como Ascl1, são reguladores da neurogénese em vertebrados, sendo simultaneamente necessários e suficientes para ativar a diferenciação neuronal. Dada a sua função, a atividade transcricional de Ascl1 deve ser controlada durante este processo, sendo que as modificações pós-traducionais (MPTs) desempenham um papel essencial nesta regulação. A O-GlcNAcilação proteica é uma MPT sensível à disponibilidade de nutrientes que depende apenas de duas enzimas - OGT e OGA - para adicionar e remover grupos de O-GlcNAc a treoninas ou serinas, respetivamente. Além disso, tem como alvo múltiplas proteínas citoplasmáticas e nucleares, incluindo FTs. Trabalho recente e não publicado do nosso grupo revelou que a inibição de OGT, através do tratamento com OSMI-1, resulta numa diminuição dos níveis proteicos de Ascl1 em células estaminais neurais (EN). Isto ocorre de uma forma dependente do proteassoma, sugerindo que a O-GlcNAcilação regula os níveis proteicos de Ascl1 através do controlo da sua degradação. Huwe1 é a uma E3 ubiquitina ligase conhecida por controlar a degradação proteassómica de Ascl1 em células EN. Curiosamente, verificou-se que Huwe1 é O-GlcNAcilada em extratos proteicos do hipocampo de ratos adultos, onde se localiza um dos nichos neurogénicos. Com base nestas observações, pretendeu-se investigar se a O-GlcNAcilação, mediada por OGT, tem impacto na atividade da ubiquitina-ligase Huwe1, reduzindo a conjugação de ubiquitina a Ascl1 e a sua degradação proteassómica.Para testar esta hipótese, investigou-se o impacto da inibição da O-GlcNAcilação nos níveis proteicos de Huwe1 em células EN, por immunoblotting. Os nossos resultados demonstram que esta MPT não afeta os níveis proteicos de Huwe1, contudo parece induzir uma alteração no padrão de migração de Huwe1, consistente com o facto de Huwe1 ser um alvo de OGT em células EN. Uma pesquisa in silico com uma ‘deep learning-based tool', permitiu identificar potenciais locais de O-GlcNAcilação em Huwe1, incluindo resíduos na região de ligação ao domínio HECT e um local a montante de uma fenilalanina situada a quatro resíduos do términus de Huwe1. Estes elementos são cruciais para a flexibilidade do domínio HECT, impreterível para a enzima executar a sua atividade catalítica. Entretanto, para se determinar se a O-GlcNAcilação afeta a atividade de Huwe1, desenvolveram-se ferramentas para co-expressar Ascl1 e ubiquitina em células P19, de forma a se detetar formas ubiquitinadas de Ascl1 por co-imunoprecipitação e western blotting. Primeiras evidências sugerem que a mera adição de Ub no sistema é suficiente para aumentar a conjugação de cadeias de Ub a Ascl1, uma observação importante que deve ser tida em consideração para experiências futuras. Além disso, os resultados preliminares sugerem um ligeiro aumento das formas ubiquitinadas de Ascl1 após o tratamento com OSMI-1, sugerindo que a redução de O-GlcNAcilação promove a atividade de Huwe1. Por fim, otimizámos com sucesso um protocolo de Co-IP em células P19 para investigar o efeito da O-GlcNAcilação na interação entre Ascl1 e Huwe1, estabelecendo a base para futuras experiências destinadas a testar o impacto da inibição de OGT nesta interação
O Papel do metabolismo do triptofano no complexo da esclerose tuberosa: Um possível mecanismo comum subjacente à epilepsia e ao transtorno do espectro do autismo
No full textTese de Doutoramento em Engenharia Biomédica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaTuberous sclerosis complex (TSC) is a neurological disorder characterized by brain neural abnormalities, namely cortical tubers, which are linked to the manifestations of epilepsy and autism spectrum disorder (ASD). The high prevalence and co-occurrence of epilepsy and ASD in TSC suggest a common underlying mechanism driving both disorders. Despite this, specific cortical alterations contributing to the symptomatology of TSC have not yet been identified. Based on current evidence, we hypothesize that cortical alterations involving the serotonergic system and tryptophan (Tryp) metabolism are linked to excitatory/inhibitory (E/I) imbalance, leading to these clinical manifestations. Further, we propose that Tryp supplementation could offer a promising therapeutic strategy for addressing epilepsy and ASD symptoms in TSC, an issue that remains largely unexplored. We used a genetic animal model of TSC, the Tsc2+/- mouse, to investigate our hypothesis. Several converging features and mechanisms have been identified in Tsc2+/- mice that align with the clinical manifestations of TSC. We demonstrated that this animal model exhibits cortical E/I imbalance shift toward heightened excitability, abnormal cortical serotonin (5-HT) receptor function and altered neuron morphology and structural connectivity. Moreover, Tsc2+/- mice present increased seizure susceptibility and ASD-like behaviors, including social deficits. We also prove that serotonergic signaling correlates with E/I balance and that Tryp metabolism affects autistic-like behavior in transgenic animals. These findings suggest a potential connection between these biochemical changes and the manifestation of both epilepsy and ASD in TSC. Interestingly, our results also showed that a Tryp-enriched diet significantly increased cortical Tryp concentrations without affecting the E/I profile. Importantly, this supplementation improved social deficits, reduced anxiety, and normalized digging behavior in Tsc2+/- mice mainly through the enhancement of cortical Tryp levels. Sexual dimorphisms in Tryp metabolism have been associated with distinct predisposition between women and men for some neuropsychiatric disorders. The understanding of Tryp-related molecular processes behind these sex differences could help develop more targeted therapies with higher success rates. The distinct manifestations between males and females in ASD and epilepsy also underscore the need to investigate sex-specific mechanisms underlying these conditions, still poorly understood. Here, we observed cortical-based and sex-dependent alterations in molecular and functional traits, which can lead to sexual dimorphic manifestations. At the molecular level, Tsc2+/- males had shorter and less complex cortical basal dendrites, while apical dendrites of transgenic females exhibited the opposite morphology, highlighting inherent sexual dimorphisms in neuronal organization. We also observed female-specific cortical 5-HT1A receptor density reduction and increased excitability. Furthermore, the TSC2 mouse model presented sex-dependent changes in the structural connectivity of the cortex-amygdala-hippocampus circuit: females showed a reduced number of axonal fiber pathways, while males exhibited a loss of tissue density. Finally, the Tsc2+/- mouse model displayed sex-dependent seizure susceptibility and social impairments: females showed reduced sociability, whereas males exhibited constant increased susceptibility for induced seizures and aggravated deficits in social novelty. Tryp supplementation effectively mitigated the distinct social impairments in both sexes. Further, we demonstrated a positive effect of Tryp supplementation on anxiety in transgenic animals, especially in females.This thesis advances our understanding of the neuronal underpinnings of epilepsy and ASD symptoms in TSC, highlighting the important role of Tryp and the serotonergic system in these clinical manifestations. Additionally, our findings support Tryp supplementation as a promising therapeutic strategy for ASD-related symptoms in TSC and emphasize the importance of studying sexual dimorphisms in this research area.O Complexo da Esclerose Tuberosa (CET) é uma doença neurológica caracterizada por malformações cerebrais, nomeadamente túberes corticais, que estão envolvidas em manifestações de epilepsia e perturbação do espectro do autismo (PEA). A alta prevalência e co-ocorrência de sintomas de epilepsia e da PEA no CET sugerem um mecanismo comum que origina ambas as manifestações. Apesar disso, ainda não foram identificadas alterações corticais específicas que possam estar na origem da sintomatologia do CET. Com base em evidências atuais, propomos que alterações corticais envolvendo o sistema serotoninérgico e o metabolismo do triptofano (Trip) possam contribuir para o desequilíbrio excitatório/inibitório (E/I) e originar ambas as manifestações clínicas. Além disso, sugerimos que suplementação de Trip através da dieta possa ser uma estratégia terapêutica promissora para tratar os sintomas de epilepsia e da PEA no CET, uma área amplamente inexplorada. Para testar essas hipóteses, utilizamos um modelo genético do CET, o murganho Tsc2+/-.Diversas características e mecanismos comuns foram identificadas no murganho Tsc2+/- que convergem com as manifestações clínicas do CET. Demonstrámos que este modelo apresenta um desequilíbrio cortical E/I com tendência para excitabilidade aumentada, disfunção dos recetores corticais de serotonina (5-HT) e alterações na morfologia neuronal e na conectividade estrutural. Em paralelo, animais com mutação apresentam uma maior suscetibilidade a crises convulsivas e comportamentos semelhantes aos da PEA, nomeadamente défices sociais. Observamos também que o sistema serotoninérgico está correlacionado com o equilíbrio E/I e que o metabolismo do Trip afeta o comportamento semelhante à PEA em animais transgénicos. Estes resultados sugerem uma possível ligação entre essas alterações bioquímicas e as manifestações tanto de epilepsia como da PEA no CET. Adicionalmente, descobrimos que uma dieta enriquecida com Trip aumenta significativamente as concentrações de Trip no córtex sem alteração do perfil E/I. Por outro lado, a suplementação com Trip melhora défices sociais, reduz ansiedade e normaliza o comportamento de escavação em animais Tsc2+/-, essencialmente através do aumento das concentrações de Trip cortical. Dimorfismos sexuais inerentes ao metabolismo do Trip relacionam-se com predisposições distintas entre mulheres e homens em diversas doenças neuropsiquiátricas. Assim, uma melhor compreensão dos processos moleculares envolvidos nessas diferenças pode ajudar a desenvolver terapias mais direcionadas e com maiores taxas de sucesso. Em paralelo, manifestações distintas entre homens e mulheres na PEA e na epilepsia salientam a necessidade de investigar a base molecular e mecanismos específicos de cada sexo envolventes nestas condições, que ainda são pouco compreendidos. Nesse seguimento, observámos alterações moleculares e funcionais ao nível do córtex dependentes do sexo e que podem levar a manifestações distintas entre machos e fêmeas. A nível molecular, os machos Tsc2+/- apresentaram dendrites corticais basais mais curtas e menos complexas, enquanto as dendrites apicais das fêmeas transgénicas exibem a morfologia oposta, realçando dimorfismos sexuais inerentes à organização neuronal. Também notamos uma redução específica nas fêmeas relativa à densidade dos recetores corticais 5-HT1A e um aumento na excitabilidade. Além disso, o modelo TSC2 apresentou alterações distintas na conectividade estrutural do circuito córtex-amígdala-hipocampo dependentes do sexo: as fêmeas apresentaram redução no número de fibras axonais, enquanto que os machos exibiram uma perda de densidade tecidual. Por fim, o modelo Tsc2+/-, dependendo do sexo, exibiu suscetibilidade a crises convulsivas e défices sociais distintos: as fêmeas apresentam menor sociabilidade, enquanto os machos exibiram uma constante aumenta vulnerabilidade a crises convulsivas e défices agravados em novidade social. A suplementação com Trip melhorou eficazmente as alterações sociais em ambos os sexos. Além disso, demostramos um efeito positivo da suplementação de Trip na ansiedade de animais transgénicos, especificamente em fêmeas.No seu conjunto, esta tese avança a compreensão das bases neuronais envolventes nos sintomas de epilepsia e de PEA no CET, destacando o papel importante do Trip e do sistema serotoninérgico nas suas principais manifestações clínicas. Além disso, os nossos resultados sugerem a suplementação com Trip como uma estratégia terapêutica promissora para os sintomas relacionados à PEA no CET e realçam a importância do estudo dos dimorfismos sexuais nesta área de investigação.FC
Hypermethylation in Myelodysplastic Syndromes: Prognostic Value of Methylenetetrahydrofolate reductase Gene Polymorphisms and Tumor Suppressor Gene Methylation
No full textTrabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina apresentado à Faculdade de MedicinaIntrodução: As síndromes mielodisplásicas (SMD) são neoplasias hematológicas clonais com hematopoiese ineficaz e risco de transformação em leucemia mieloblástica aguda (LMA). Alterações epigenéticas e no metabolismo do folato têm sido implicadas na sua patogénese e prognóstico. Este estudo teve como objetivo avaliar o valor prognóstico dos polimorfismos da MTHFR, dos níveis séricos de vitaminas B9 e B12, e do estado de metilação de genes supressores tumorais e genes da família TRAIL, numa coorte retrospetiva de doentes com SMD. Métodos: Realizou-se um estudo observacional retrospetivo com 88 doentes com SMD, seguidos ao longo de 15 anos. Analisaram-se os polimorfismos MTHFR C677T e A1298C, os níveis séricos de vitaminas B9 e B12 e o estado de metilação dos genes p15, p16, TP53, DAPK, MGMT e TRAILR1-4, através de técnicas de Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Chemoluminescent Microparticle ImmunoAssay (CMIA) e Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction (MS-PCR), respetivamente. A classificação da doença foi atualizada segundo a OMS 2022 e a ICC 2022, e o prognóstico determinado com base no IPSS-R. Foram avaliadas associações com variáveis clínicas e laboratoriais, e desfechos clínicos. Resultados: A hipermetilação do gene p15 foi a mais prevalente (57,7%) e associou-se a percentagens mais baixas de blastos, subtipos morfológicos menos agressivos e categorias de menor risco no IPSS-R. A metilação do gene TRAILR2 mostrou associação significativa com grupos de risco intermédio. Níveis elevados de vitamina B12 associaram-se a menor progressão para LMA. Embora não se tenha verificado associação significativa entre os genótipos MTHFR (A1298C e C677T) ou o número total de mutações e a progressão para LMA, o polimorfismo C677T demonstrou associação com a sobrevivência global: os doentes com o genótipo homozigoto mutado (T/T) apresentaram uma mediana de sobrevivência marcadamente inferior. Observou-se ainda uma correlação inversa entre o número de mutações nos loci 677 e 1298 e a sobrevivência, sugerindo um possível efeito cumulativo. Conclusão: A integração de marcadores epigenéticos e genéticos, como a metilação dos genes p15 e TRAILR2 e os polimorfismos da MTHFR, os últimos especialmente no contexto da sobrevivência global, demonstra potencial na estratificação prognóstica dos doentes com SMD. Estes resultados sustentam a importância de uma abordagem multidimensional, combinando dados moleculares, epigenéticos e clínicos, para orientar decisões terapêuticas mais personalizadas e potencialmente mais eficazes.Introduction: Myelodysplastic syndromes (MDS) are clonal hematological neoplasms characterized by ineffective hematopoiesis and a risk of progression to acute myeloid leukemia (AML). Epigenetic alterations and disruptions in folate metabolism have been implicated in their pathogenesis and prognosis. This study aimed to evaluate the prognostic value of MTHFR polymorphisms, serum levels of vitamins B9 and B12, and methylation of tumor suppressor genes and TRAIL family genes, in a retrospective cohort of MDS patients. Methods: A retrospective observational study was conducted enrolling 88 MDS patients followed over 15 years. MTHFR C677T and A1298C polymorphisms, serum levels of vitamins B9 and B12, and methylation status of the genes p15, p16, TP53, DAPK, MGMT, and TRAILR1-4 were analyzed using Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Chemiluminescent Microparticle ImmunoAssay (CMIA), and Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction (MS-PCR) techniques, respectively. Disease classification was updated according to WHO 2022 and ICC 2022 criteria, and prognosis was assessed using the IPSS-R. Associations with clinical, laboratory, and outcome variables were evaluated. Results: Hypermethylation of the p15 gene was the most prevalent (57.7%) and was associated with lower blast percentages, less aggressive morphological subtypes, and lower-risk categories according to the IPSS-R. Methylation of the TRAILR2 gene showed a significant association with intermediate-risk groups. Elevated serum vitamin B12 levels were associated with reduced progression to AML. Although no significant association was observed between the MTHFR genotypes (A1298C and C677T) or the total number of mutations and AML progression, the C677T polymorphism was significantly associated with overall survival: the patients with the homozygous mutant genotype (T/T) were linked to a markedly shorter median survival. An inverse correlation was also observed between the total number of mutations at loci 677 and 1298 and overall survival, suggesting a potential cumulative effect of these genetic variants on folate metabolism and genomic stability. Conclusion: The integration of epigenetic and genetic markers—such as methylation of the p15 and TRAILR2 genes and the MTHFR polymorphisms, this one especially in the context of overall survival—shows potential for prognostic stratification in patients with MDS. These findings support the importance of a multidimensional approach that combines molecular, epigenetic, and clinical data to guide more personalized and potentially more effective therapeutic decisions
Stress Perinatal: Impacto na remodelação mediada pela microglia dos circuitos neuronais e da mielinizaçao do cortex pré-frontal
No full textTese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina apresentada ao Instituto de Investigação InterdisciplinarEarly life stress (ELS), arising from adverse experiences such as abuse, neglect, or trauma, is a significant global issue with profound public health implications and has been strongly linked to various neurodevelopmental and psychiatric disorders. Previous research, in both humans and animal models, has shown that ELS can disrupt typical neurodevelopmental pathways, leading to lasting changes in neuronal and behavioral functions. Importantly, while these effects are increasingly recognized to be sex-dependent, but most studies have predominantly focused on male subjects, leaving a gap in understanding the sex-specific impact of ELS.The medial prefrontal cortex (mPFC), crucial for emotional regulation and executive functioning, is particularly vulnerable to ELS, due to its extended development period, which last into adolescence and early adulthood. Structural changes in the PFC, as well as altered connectivity with other brain regions, are often observed in individuals with a history of ELS, leading to impaired cognitive and emotional functions. Despite this, the mechanisms by which ELS affects the mPFC remain unclear. Microglial cells, the brain's resident immune cells, are well-positioned to play a significant role both in the establishment and dysfunction of mPFC neuronal circuits. Involved in essential neurodevelopmental processes crucial for neuronal wiring, regulation and survival, microglia are highly sensitive to environmental stressors, making them key candidates in mediating ELS's effects.In this study, we employed the maternal separation and unpredictable stress (MSUS) model to investigate the impact of ELS on several behavioral domains and on the establishment and maturation of intrinsic circuits in the mPFC, with a focus on the regional inhibitory system. We specifically examined sex differences in the effects of ELS, centering on adolescence, a critical period for both behavioral consolidation and mPFC development. Given microglia’s pivotal role in shaping neuronal circuits during early development, we also aimed to understand how ELS disrupts microglial function during critical developmental windows in the mPFC, and how such disruptions might contribute to the long-term effects of ELS on neuronal circuits.Through a series of behavioral, functional, and molecular analyses during adolescence, we demonstrated that MSUS induces a sex-specific behavioral phenotype in male mice, characterized by hyperactivity, impulsivity, and risk-taking behaviors—traits commonly associated with attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) in humans. These behavioral changes were accompanied by an increased density and excitability of parvalbumin (PV+) inhibitory neurons and heightened inhibitory synaptic transmission in the internal layers of the medial orbital (MO) subregion of the mPFC, suggesting an increased inhibitory tone that may underlie the observed behavioral outcomes.Additionally, our study revealed significant ELS-induced and sex-specific changes in microglial function during development. MSUS-exposed male mice exhibited microglial morphological alterations and decreased phagocytic activity in the internal layers of the MO during the critical period for PV+ neuronal programmed cell death in the cortex. At this period and in this region, we observed microglia engulfing inhibitory neuronal material in animals not exposed to ELS, suggesting that the MSUS-induced reduction in microglial phagocytic activity may contribute to the increased density of PV+ neurons in the internal layers of the MO observed in MSUS-exposed males, setting the tone for the electrophysiological changes and behavioral phenotype observed later on, during adolescence.Overall, our study highlights the sex-specific impact of ELS on behavior and neurodevelopment, while uncovering a potential role for microglia in mediating these processes. Although further research is necessary to elucidate the underlying mechanisms promoting microglia dysfunction, as well as the resilience observed in females, this work enhances our understanding of the neurobiological substrates of stress-related disorders and opens new avenues for exploring therapeutic strategies to prevent or reverse ELS-induced dysfunction.A exposição ao stress durante as fases iniciais da vida (ELS), na forma de abuso, negligência ou trauma, é um problema global com profundas implicações para a saúde pública, constituindo um importante fator de risco para o desenvolvimento de várias doenças neuropsiquiátricas e do neurodesenvolvimento. Estudos retrospetivos em humanos, bem como estudos utilizando modelos animais, têm vindo a demonstrar que a exposição precoce ao stress pode perturbar os processos de neurodesenvolvimento e levar a alterações duradouras nas funções neuronais e comportamentais. Apesar de estes efeitos serem cada vez mais reconhecidos como dependentes do sexo, a maioria dos estudos publicados concentra-se em indivíduos do sexo masculino, impedindo assim a compreensão do impacto específico do ELS em cada sexo.O córtex pré-frontal medial (mPFC) é uma região do córtex frontal que desempenha um papel crucial em processos de regulação emocional e função executiva, sendo particularmente vulnerável aos efeitos do stress precoce devido à sua longa janela de maturação, que se estende até ao início da idade adulta. Indivíduos com um historial de ELS apresentam alterações estruturais nesta região, bem como uma conectividade alterada entre esta e outras regiões do cérebro, levando a disfunções cognitivas e emocionais. Os mecanismos que estão na base desta correlação ainda não são conhecidos, mas cada vez mais tem sido sugerido que a microglia, as células imunitárias residentes no cérebro, possam desempenhar um papel importante neste processo. Estas células participam em vários processos do neurodesenvolvimento essenciais para a correta formação dos circuitos neuronais e são altamente sensíveis a fatores ambientais, colocando-as numa posição privilegiada para mediar os efeitos neuronais do stress na infância.Assim, o presente estudo pretendeu utilizar o modelo de separação maternal e stress imprevisível (MSUS) para investigar o impacto do stress na infância em vários domínios do comportamento e na formação e maturação dos circuitos do mPFC, com foco no sistema inibitório desta região e em potenciais diferenças entre sexos. Estes efeitos foram analisados durante a adolescência, um período crítico para a consolidação comportamental e para a maturação do mPFC. Dado o papel da microglia no estabelecimento dos circuitos neuronais, o presente estudo também visou clarificar o impacto do stress na infância na função destas células durante janelas temporais críticas para o desenvolvimento do mPFC e perceber como elas podem contribuir para os efeitos duradouros do stress precoce nos circuitos neuronais.Neste trabalho, partindo de uma série de testes comportamentais e análises funcionais e moleculares, demonstrámos que o protocolo MSUS induz um fenótipo comportamental dependente do sexo em machos, caracterizado por hiperatividade, impulsividade e comportamentos de risco – características comportamentais tipicamente associadas ao défice de atenção e hiperatividade em humanos. Estas alterações comportamentais foram acompanhadas por um aumento na densidade e excitabilidade dos neurónios inibitórios positivos para parvalbumina (PV+) no córtex orbitofrontal medial (MO), e por uma alteração da atividade sináptica inibitória nas camadas internas do MO. Estes resultados sugerem um aumento do tónus inibitório nesta sub-região do mPFC, que poderá estar relacionado com o fenótipo comportamental observado.Adicionalmente, o nosso estudo revelou que o stress durante a infância leva a alterações significativas e dependentes do sexo na morfologia e atividade da microglia durante o desenvolvimento. Em machos expostos ao protocolo MSUS, observámos uma diminuição na atividade fagocítica destas células nas camadas internas do MO durante o período crítico para a morte celular programada dos neurónios PV+ no córtex. É importante realçar que, durante este mesmo período temporal, observámos células da microglia a participar na eliminação de material neuronal inibitório nesta sub-região em animais não expostos ao protocolo MSUS, o que sugere que a redução na atividade fagocítica da microglia observada durante o desenvolvimento nos machos MSUS poderá contribuir para o aumento da densidade de neurónios PV+, e estar na base das alterações eletrofisiológicas e comportamentais observadas mais tarde, durante a adolescência.Em conclusão, estes resultados destacam o impacto do stress precoce no neurodesenvolvimento e evidenciam como o sexo modula estes efeitos, ao mesmo tempo que revelam um potencial papel para a microglia na mediação desses processos. Embora seja necessária mais investigação para elucidar os mecanismos subjacentes aos défices funcionais observados e à resiliência observada nas fêmeas, este trabalho amplia a nossa compreensão dos substratos neurobiológicos dos distúrbios neuropsiquiátricos relacionados com o stress e abre novas vias para a exploração de estratégias terapêuticas para prevenir ou reverter as disfunções induzidas pelo stress precoce.FC