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The governance model the New Public Service in Local Government: the new decentralization of competences
No full textRelatório de Estágio do Mestrado em Administração Público-Privada apresentado à Faculdade de DireitoThis report was drawn up as part of the master’s degree in Public-Private Administration at the Faculty of Law of the University of Coimbra, as part of a curricular internship carried out at Mira City Council, more specifically in the Fees Department within the Administrative and Financial Division, which occurred between October 2023 and February 2024.The curricular internship was based on the need to combine and articulate the theoretical knowledge, acquired during the academic training, with the practical application, more specifically, the reality of Public Administration.As well as explaining the reality of Mira City Council, which welcomed us and the tasks we undertook, we intend to explain our perception of the impact of the decentralization of competences within this organization, especially in the provision of Public Services related to health, in terms of proximity to citizens, and to what extent the concept of the New Public Service is being applied to optimize this decentralization.Therefore, this report is divided into five main parts. The first relates to the Portuguese Public Administration, where governance models are also mentioned, more specifically, the New Public Service. The second touches on the local government in Portugal, the third addresses the decentralization process, the fourth is the characterization of the municipality of Mira and the introduction to the field of health, finally, we have the characterization of the work carried out in the internship and consequent conclusions and links to the bibliographical review.O presente relatório foi elaborado no âmbito do Mestrado de Administração Público- Privada da Faculdade de Direito da Universidade de Coimbra, inserido na realização do estágio curricular realizado na Câmara municipal de Mira, mais concretamente no Serviço de Taxas inserido na Divisão Administrativa e Financeira, compreendido entre outubro de 2023 e fevereiro de 2024.A realização do estágio curricular, partiu da necessidade de interligar e articular os conhecimentos teóricos, adquiridos ao longo da formação académica, com a prática, mais especificamente, a realidade da Administração Pública.Para além de darmos a conhecer a realidade da Câmara Municipal de Mira que nos acolheu e as tarefas que assumimos, pretendemos explanar a perceção que obtivemos sobre o impacto da descentralização de competências dentro da referida organização, em especial na prestação de serviços públicos relacionados com a área da saúde, em termos de proximidade para os cidadãos, e em que medida o conceito do Novo Serviço Público está a ser aplicado para otimizar essa descentralização.Assim, o Relatório encontra-se dividido em cinco grandes partes. A primeira é relativa à Administração Pública Portuguesa, onde também são referidos os modelos de governação, mais especificamente o Novo Serviço Público. A segunda diz respeito ao poder local em Portugal, a terceira aborda o processo de descentralização, a quarta passa pela caracterização do município de Mira e pela introdução ao domínio da saúde, por último, temos a caracterização do trabalho realizado no estágio e consequentes conclusões e interligações com a revisão bibliográfica
CORRUPTION AND ILLICIT ENRICHMENT: ANALYSING THE PARLIAMENT AND COUNCIL PROPOSAL ON THE FIGHT AGAINST CORRUPTION AND ITS IMPLICATIONS FOR THE PORTUGUESE LEGAL SYSTEM
No full textDissertação de Mestrado em Ciências Jurídico-Forenses apresentada à Faculdade de DireitoThis dissertation starts with the phenomenon of corruption in general, and then looks at the problem of criminalizing illicit enrichment. However, the centerpiece of the text is the Proposal for a Directive on the fight against corruption. The assertion of the obvious and absolute unconstitutionality of any attempt to turn the problem of criminalizing illicit enrichment into a criminal offence does not seem to be the right one. This is because, contrary to what doctrine and jurisprudence have argued, this incrimination has an autonomous and specific legal good: the transparency, integrity, and probity of political and public officials. Human perception is apprehensible because of indices or indicators. These indicators tell us that people need to feel more trust (through transparency) in those from whom they can ask and demand more because of the position they hold or what they represent. As such, there has been a push for the criminalization of a crime that is in fact lacking in the legal landscape.However, the motivation does not plug "holes". This is where the legal and institutional anti-corruption framework, which has come to seem like a static bicycle, comes into play. A patchwork quilt that recently seems to have fewer holes, but still has many loose threads, starting with the inoperativeness of the anti-corruption agencies (be it the National Anti-Corruption Mechanism, in prevention, or the Transparency Authority, in promoting transparency). In any case, this Proposal for a Directive does not only offer advantages. Its Proposal contains problems such as the reversal of the burden of proof against the accused/defendant, the attempt to link the crime of illicit enrichment to a supposed violation of the principle of the presumption of innocence and the confrontation between the institute of the loss of assets in favor of the State and illicit enrichment - where the figure of the loss of assets ends up giving rise to a presumption, while illicit enrichment forces proof of the causal link between the conduct and the illegality).In short, the criminalization of illicit enrichment benefits the normal functioning of society, in which its greatest duel is with the expression that "crime pays".A presente dissertação parte do fenómeno corruptivo em geral, para depois se debruçar sobre a problematização da criminalização do enriquecimento ilícito. Todavia, o objeto central do texto é a Proposta de Diretiva relativa ao combate contra a corrupção. A afirmação de uma óbvia e absoluta inconstitucionalidade de uma qualquer tentativa de verter em ofensa criminal, o problema da criminalização do enriquecimento ilícito, não parece a mais acertada. Isto porque, contrariamente ao que a doutrina e a jurisprudência vêm defendendo, esta incriminação tem um bem jurídico autónomo e específico: a transparência, integridade e probidade dos agentes políticos e públicos. A perceção humana é apreensível com base em índices ou indicadores. Esses indicadores dizem-nos que as pessoas necessitam de sentir mais confiança (através da transparência) daqueles a quem podem pedir e exigir mais, devido ao cargo que ocupam ou àquilo que representam. Assim sendo, tem-se pugnado pela tipificação de um crime que, de facto, faz falta ao panorama jurídico.Todavia, a motivação referida não tapa “buracos”. Aqui, entra em cena o quadro legal e institucional anticorruptivo que chegou a parecer uma bicicleta estática. Uma manta de retalhos que, nos últimos tempos, parece ter menos buracos, mas continua a ter muitas linhas soltas, a começar pela inoperatividade das agências de combate à corrupção (seja do Mecanismo Nacional Anticorrupção, na área da prevenção, seja da Entidade para a Transparência, na área da promoção da transparência). De qualquer forma, esta Proposta de Diretiva não oferece apenas vantagens. Da sua Proposta verificam-se problemas como a inversão do ónus da prova contra o acusado/arguido, a tentativa de atrelar o crime de enriquecimento ilícito a uma suposta violação do princípio da presunção de inocência e o confronto entre o instituto da perda de bens a favor do Estado e o enriquecimento ilícito – em que a figura da perda de bens acaba por dar origem a uma presunção, enquanto o enriquecimento ilícito força a prova do nexo de causalidade entre a conduta e a ilicitude).Em suma, a tipificação do enriquecimento ilícito beneficia o normal funcionamento da sociedade, em que o seu maior duelo é com a expressão de que “o crime compensa”
A lacuna legislativa sobre Apatridia: uma análise crítica do Direito Internacional e de Direitos Humanos
No full textDissertação de Mestrado em Relações Internacionais - Estudos da Paz, Segurança e Desenvolvimento apresentada à Faculdade de EconomiaEmbora afete milhões de pessoas globalmente, privando-as de identidade legal, direitos básicos e um senso de pertencimento, a apatridia é um fenómeno ainda pouco explorado no direito internacional e nos direitos humanos. Esta dissertação examina criticamente a evolução da legislação internacional sobre apatridia e as lacunas legais inerentes. Nesse sentido, este estudo questiona em que medida a evolução legislativa sobre cidadania e apatridia influenciou o reconhecimento efetivo das populações apátridas? E como os sistemas jurídicos refletem e reforçam as dinâmicas de poder? O argumento defendido é que, ao invés de integrar os apátridas na sociedade, os sistemas legais têm refletido as estruturas de poder, perpetuando a marginalização dos indivíduos apátridas. A importância da análise reside em sua abordagem inovadora, utilizando Critical Legal Studies (CLS) e o método genealógico de Michel Foucault. Esta dissertação pretende desafiar os paradigmas legais convencionais e assim revelar as dinâmicas de poder e os preconceitos dentro dos enquadramentos legais que aumentam a vulnerabilidade das populações apátridas. Ao expor as dinâmicas sociojurídicas que contribuem para a exclusão dos indivíduos apátridas, este estudo oferece uma nova perspectiva sobre as contingências históricas e as relações de poder que moldam as normas legais. Essa abordagem fornece uma compreensão aprofundada sobre as bases estruturais e ideológicas da apatridia. Ao abordar uma área muito pouco explorada no direito internacional e nos direitos humanos, esta pesquisa é crucial, pois destaca o impacto dos fatores sociopolíticos, das práticas discriminatórias e dos obstáculos administrativos que agravam a apatridia, enfatizando a necessidade de leis de nacionalidade inclusivas e equitativas. Ao integrar perspectivas interdisciplinares da sociologia, antropologia e ciência política, a dissertação proporciona uma compreensão detalhada das complexidades que envolvem a apatridia e a interação entre definições legais e realidades sociais.A abordagem metodológica inclui uma análise qualitativa de conteúdo de textos legais e literatura acadêmica, revelando padrões e tendências na evolução da legislação sobre apatridia. As descobertas indicam que, apesar dos avanços, permanecem lacunas significativas nos quadros internacionais e nacionais, necessitando de reformas legais robustas e cooperação internacional para proteger os direitos dos indivíduos apátridas. Ao desafiar paradigmas legais convencionais e destacar as dinâmicas sociojurídicas em jogo, este estudo contribui para o discurso mais amplo sobre direitos humanos e direito internacional, visando inspirar estratégias eficazes para eliminar a apatridia globalmente.Although it affects millions globally, depriving them of legal identity, basic rights, and a sense of belonging, statelessness remains a relatively unexplored phenomenon in international law and human rights. This dissertation critically examines the evolution of international legislation on statelessness and the inherent legal gaps. In this context, this analysis questions to what extent the legislative evolution on citizenship and statelessness influenced the effective recognition of stateless populations? And how do legal frameworks mirror and reinforce power dynamics? The argument is that rather than integrating the stateless into society, legal systems have reflected power structures, perpetuating the marginalisation of stateless individuals.The importance of this analysis lies in its innovative approach, utilising Critical Legal Studies (CLS) and Michel Foucault's genealogical method. This dissertation aims to challenge conventional legal paradigms and thereby reveal the power dynamics and biases within legal frameworks that increase the vulnerability of stateless populations. By exposing the socio-legal dynamics that contribute to the exclusion of stateless individuals, this study offers a new perspective on the historical contingencies and power relations that shape legal norms. This approach provides a profound understanding of the structural and ideological foundations of statelessness.Addressing a largely unexplored area in international law and human rights, this research is crucial as it highlights the impact of socio-political factors, discriminatory practices, and administrative obstacles that exacerbate statelessness, emphasising the need for inclusive and equitable nationality laws. By integrating interdisciplinary perspectives from sociology, anthropology, and political science, the dissertation provides a detailed understanding of statelessness's complexities and the interaction between legal definitions and social realities.The methodological approach includes a qualitative content analysis of legal texts and academic literature, revealing patterns and trends in the evolution of legislation on statelessness. The findings indicate that, despite advancements, significant gaps remain in both international and national frameworks, necessitating robust legal reforms and international cooperation to protect the rights of stateless individuals. By challenging conventional legal paradigms and highlighting the socio-legal dynamics at play, this study contributes to the broader discourse on human rights and international law, aiming to inspire effective strategies to eliminate statelessness globally
The Electronic Communications Sector in Portugal and Brazil According to the New Public Governance
No full textTese de Doutoramento em Direito apresentada à Faculdade de DireitoThis thesis deals with the regulation of electronic communications in Portugal and Brazil according to the new public governance. We have analysed the consolidation of the regulatory state model in both countries at the end of the 20th century (era of "managerialism"), and we have found that its format has changed throughout the 21st century. We are aware that the obstacles that led to the new public management have not disappeared and that new challenges and material conditions have been added, which require a focus on governance, not just management. We are aware that the concept of public governance has not yet acquired a clear and well-defined profile in the field of law. However, its idea permeates the whole debate on changes in administrative law and public administration, which includes the regulatory function. In the definition of public governance that we adopted, it can be seen as an organisation and administrative mode of action in favour of interaction between public actors and between them and private actors, at different levels, for a coordinated and collaborative reach of collective interests, based on subsidiarity, sustainability, proportionality, reasonableness, good administration, simplification, transparency, participation, collaboration, coordination, coherence and accountability. Taking this idea as a guide for reflection, we observe the structure and functioning of the regulation of electronic communications. We locate the actions of the Portuguese and Brazilian States amidst the subjective pluralization that contributes to the formation of regulatory decisions, whether internally or outside the national territory. This is especially relevant for Portugal, which is experiencing a strong "Europeanization" of Law and National Administration through EU cohesion and functional integration policy. Furthermore, we have shown that other forms of administrative-regulatory action are being added to the traditional forms of action, not in a process of overcoming, but of "layered" change, with a focus on consensuality and responsiveness. Finally, we analyse the control and accountability of ANACOM and ANATEL, particularly concerning non-contractual civil liability.A presente tese versa sobre a regulação das comunicações eletrónicas em Portugal e no Brasil à luz da nova governação pública. Analisamos a consolidação do modelo de Estado Regulador em ambos os países, no final do século XX (era do “gerencialismo”), e verificamos que sua formatação se alterou ao longo do século XXI. Percebemos que os obstáculos que levaram à nova gestão pública não desapareceram e que a eles somaram-se novos desafios e condições materiais, demandando foco em governar, não apenas em gerenciar. Percebemos que, no âmbito do Direito, o conceito de governação pública ainda não adquiriu um perfil claro e bem definido; não obstante, sua ideia permeia o debate das alterações do Direito Administrativo e da administração pública, na qual se insere a função regulatória. Na definição de governação pública que adotamos, esta pode ser perspetivada como organização e modo de ação administrativos em prol da interação entre atores públicos e entre estes e privados, em diversos níveis, para alcance coordenado e colaborativo de interesses coletivos, tendo como fundamentos a subsidiariedade, a sustentabilidade, a proporcionalidade, a razoabilidade, a boa administração, a simplificação, a transparência, a participação, a colaboração, a coordenação, a coerência e a responsabilização. Tomando esta ideia como guia de reflexão, observamos a estrutura e o funcionamento da regulação das comunicações eletrónicas. Localizamos a atuação do Estado português e do brasileiro em meio à pluralização subjetiva que concorre para a formação das decisões regulatórias, seja internamente, seja fora do território nacional, especialmente para Portugal, que experimenta forte “europeização” do Direito e da Administração nacional, pela política de coesão e de integração funcional da UE. Além disso, evidenciamos que às tradicionais formas de atuação administrativo-regulatórias estão sendo agregadas outras, não em um processo de superação, mas de mudança “em camadas”, com foco em consensualidade e responsividade. Por fim, analisamos o controlo e responsabilização da ANACOM e da ANATEL, especialmente quanto à responsabilidade civil extracontratual
Optimização de um Anticorpo Anti-Nucleolina para Aumento de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo Contra Cancro da Mama Triplo-Negativo
No full textTese de Doutoramento em Ciências Farmacêuticas apresentada à Faculdade de FarmáciaCancer remains one of the leading causes of death worldwide, with breast cancer recently surpassing lung tumors as the malignancy with highest incidence. Triple-negative breast cancer (TNBC) represents 15-20% of breast tumors, affecting mostly young, pre-menopausal women. It is a clinically aggressive subtype of breast cancer, with the highest metastatic potential, recurrence rates, and mortality within the first 6 months of diagnosis. TNBC tumors are characterized by lack of expression of progesterone (PR) and estrogen (ER) receptors, and absence of overexpression or amplification of human epidermal growth factor receptor-2 (HER2). Because these are the main therapeutic targets of breast tumors, TNBC’s standard treatment still consists of conventional chemotherapy, with consequent safety and chemoresistance concerns. TNBCs are now considered immunogenic for the demonstrated high tumor mutational burden (TMB), identification of immune gene signatures and presence of immune cell infiltrates. In this regard, novel targets and therapeutic strategies are being explored, including monoclonal antibodies, antibody-drug conjugates, vaccines, and cell therapies. Accordingly, two checkpoint inhibitor antibodies, and one antibody-drug conjugate have been approved in the TNBC setting in recent years.In the present work, the optimization and characterization of an antibody capable of nucleolin-mediated cytotoxicity against TNBC cells is described. Our group had previously developed an anti-nucleolin antibody with a nanobody-Fc (VHH-Fc) format capable of antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) against nucleolin-overexpressing cancer cells. Herein, the improvement of its ADCC potency against TNBC cells was aimed. For this optimization, it was hypothesized that increasing the antibody’s affinity to the target would translate into an enhanced ADCC effect against nucleolin-overexpressing and TNBC cell lines. In this regard, it was proposed a novel rational for affinity maturation and cell-based phage display antibody selection.First, a mutator bacteria strain not used before for the mutagenesis of antibodies (Escherichia coli JS200), was here employed in the construction of a mutated anti-nucleolin VHH library. The library was screened by cell-based phage display against nucleolin-overexpressing cells, by selecting the cells with internalized clones by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Then, a deep sequencing analysis of the pre- and post-selection libraries was performed by next generation sequencing (NGS). The screening method was validated, by demonstration that the post-selection antibody pool was approximately 50% less diverse than the initial library, i.e., enriched in clones with potentially higher affinity to nucleolin than the reference antibody. Moreover, the analysis of the mutated antibodies’ CDR 3 showed a trend in transitions towards amino acids with functional side chains, such as tyrosine, cysteine, and arginine, thus providing information potentially useful for future study of VHH structure and nucleolin-antibody interactions. Furthermore, NGS data analysis of the post-selection antibody pool was used to determine the most frequent CDR3 sequences which, combined with structure predictive 3D-modeling, lead to the selection of five antibody clones. These clones differed from each other and from the reference antibody in one single amino acid in the CDR3 region, and from the originally developed anti-nucleolin VHH-Fc additionally in the CDR1 region. Two of the selected clones exhibited a significant improvement of 4.4- and 6.1-fold (p<0.05) in binding to nucleolin-overexpressing and TNBC cells relative to the reference antibody, and an increase in affinity to the sub micromolar range (0.19 µM and 83.69 nM, respectively), validating the affinity maturation process developed. However, the results presented herein demonstrated that the correlation between binding and affinity did not translate into a uniformly enhanced ADCC effect against nucleolin-overexpressing cells across all tested antibodies. In fact, the most significant increase in binding and affinity, compared to the previously developed bispecific antibody, was observed for clone M3, while the maximal gain in ADCC activity relative to the bispecific was verified for the M2 clone in MDA-MB-435S cells (4.6-fold, p<0.05), and the reference antibody in the MDA-MB-231 line (3.66-fold, p<0.01).Altogether, the results presented in chapters 2 and 3 of this thesis demonstrate a new method of antibody affinity maturation, fast and simple to perform, which may be used in the future to optimize antibodies. Moreover, this approach culminated in the construction of antibodies capable of TNBC cell cytotoxicity by ADCC in a nucleolin-dependent mechanism, in a higher extent than the previously developed antibody, whose characterization contributed to a better understanding of the interplay between antibody binding, affinity and ADCC.O cancro é uma das principais causas de morte no mundo, com os tumores da mama a ultrapassarem recentemente os do pulmão em incidência. O cancro da mama triplo-negativo (TNBC) representa 15-20% dos tumores de mama, e afecta sobretudo mulheres jovens, em idade pré-menopáusica. É um subtipo agressivo, que apresenta o maior potencial metastático, taxas de recorrência, e mortalidade nos primeiros 6 meses após diagnóstico. Os tumores de TNBC são caracterizados pela falta de expressão dos receptors de progesterona (PR) e estrogénio (ER), e ausência de sobreexpressão ou amplificação do factor de crescimento epidermal humano-2 (HER-2). Estes constituem os principais alvos terapêuticos dos cancros da mama, e a sua ausência determina que o tratamento padrão do TNBC consista na administração de quimioterapia convencional, com consequentes efeitos secundários e potencial desenvolvimento de resistência aos fármacos. Os TNBCs são hoje considerados imunogénicos, pela elevada carga mutacional tumoral (TMB), identificação de assinaturas genéticas imunes, e presença de infiltrados de células do sistema imunitário. Deste modo, novos alvos e abordagens terapêuticas estão a ser explorados, incluindo anticorpos monoclonais, conjugados anticorpo-fármaco, vacinas, e terapias celulares. Inclusivamente, dois anticorpos inibidores de checkpoints imunitários, e um conjugado anticorpo-fármaco foram aprovados para tratamento de TNBC.No âmbito do presente trabalho, é descrita a optimização de um anticorpo capaz de desencadear citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), mediada por nucleolina, contra células de TNBC. Previamente, o nosso grupo desenvolveu um anticorpo anti-nucleolina, com o formato nanobody-Fc (VHH-Fc), capaz de desencadear ADCC contra células que sobreexpressam nucleolina. O objectivo deste projecto consistiu em intensificar o seu efeito de ADCC contra células de TNBC, colocando a hipótese de que aumentando a sua afinidade para o alvo, iria aumentar-se a extensão de ADCC. Para tal, foi proposta uma nova estratégia para maturação da afinidade de anticorpos e selecção contra células por sistema de expressão em fagos.Em primeiro lugar, uma estirpe de bactéria nunca usada na mutagénese de anticorpos (Escherichia coli JS200), foi aqui utilizada na construção de uma biblioteca mutada de anticorpos anti-nucleolina. Seguiu-se um screening por sistema de expressão em fagos contra células que sobreexpressam nucleolina, que permitiu a selecção de clones internalizados por separação de células activadas por fluorescência (FACS). Foi depois feita uma análise das bibliotecas pré- e pós-selecção, por sequenciação de próxima geração (NGS). O método de screening foi validado ao demonstrar que a biblioteca de anticorpos pós-selecção tinha, aproximadamente, menos 50% de diversidade do que a inicial, estando enriquecida em clones potencialmente com maior afinidade para a nucleolina do que o anticorpo de referência. Além disso, a análise dos CDR3 mutantes mostrou uma tendência em transições para aminoácidos com cadeias laterais funcionais, como tirosina, cisteína e arginina, dando informações que poderão ser úteis para estudo da estrutura de VHH e das interacções nucleolina-anticorpo.A análise dos dados de NGS da bilbioteca pós-selecção foi usada para determinar as sequências CDR3 mais frequentes, o que, combinado com modelos 3D preditivos de estrutura dos respectivos CDR3, culminanou na selecção de cinco clones de anticorpos mutados. Este clones apenas diferiam uns do outros em um aminoácido na região CDR3 e, do anti-nucleolina VHH-Fc desenvolvido originalmente na região CDR1. Dois dos clones demonstraram um aumento de ligação a células que sobreexpressam nucleolina e de TNBC de 4.4 e 6.1 vezes (p<0.05) relativamente ao de referência, e um aumento de afinidade para o nível submicromolar (0.19 µM e 83.69 nM, respectivamente), validando o processo de maturação de afinidade desenvolvido. No entanto, os resultados demonstram que a correlação entre ligação ao alvo e afinidade não se traduziu num efeito de ADCC mais potente de forma uniforme para os anticorpos testados. De facto, o maior aumento em ligação ao alvo e afinidade relativamente ao anticorpo previamente desenvolvido foi observado para o clone M3, enquanto que o ganho máximo em ADCC foi verificado para o clone M2 nas células MDA-MB-435S (4.6-fold, p<0.05), e para o anticorpo de referência naa MDA-MB-231 (3.66-fold, p<0.01). Em suma, os resultados apresentados nos capítulos 2 e 3 desta tese demonstram o desenvolvimento de um novo método de maturação da afinidade de anticorpos, rápido e simples de executar, que poderá ser utilizado para optimização de anticorpos. Para além disso, esta abordagem culminou na construção de anticorpos capazes de ADCC contra células de TNBC, dependente de nucleolina, com uma extensão superior à do anticorpo previamente desenvolvido, e cuja caracterização contribuiu para uma melhor compreensão da relação entre ligação ao alvo, afinidade e ADCC.FCTFCTFCTFCTFCTFCTOutro - CInTech - Technological Hub for Innovation, Translation and Industrialization of Complex Injectable Drugs - with the reference n.º C644865576-00000005, co-funded by Component C5 – Capitalisation and Business Innovation under the Portuguese Resilience and Recovery Plan (PRR), through the NextGenerationEU FundOutro - Fundación La Caixa BREAST-BRAIN-N-BB
Estudo do efeito dos secretomas derivados de osteossarcoma na disfunção de células endoteliais cardíacas
No full textDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaCardiac diseases and cancer are the leading causes of death worldwide and can often coexist. Moreover, cardiovascular illnesses and cancer share common risk factors, creating a pathophysiological link between them. Endothelial cells (ECs), among the most abundant cell types in the heart, can be impacted by cancer secreted factors, as those cells can sense and respond to the OS secretome. However, OS-secretome influence in the heart endothelium is poorly described. In addition, and, due to doxorubicin (DOX) systemic administration, ECs are the first cells that contact with this drug, which correlates with acute and chronic cardiotoxicity. This study aims to investigate the impact of secretome derived from OS cells, either treated or untreated with DOX. Our main goal is to uncover the potential role of cancer cell-derived factors in inducing vascular stress, which may contribute to the development of cardiovascular diseases. To achieve this, we evaluated endothelial cell viability, tight-junction protein Zonula Occludens (ZO)-1 levels and distribution, angiogenic response, autophagic activity, and mechanisms driving cellular senescence.Mouse Cardiac Endothelial Cell (MCEC) line were incubated with the secretome of basal or DOX-treated OS cells (143B cell line) in an optimized proportion of OS-secretome and culture medium, that proved to not influence MCEC morphology. MCEC angiogenesis capacity was studied considering several parameters: cell migration was studied by a Scratch assay, MCEC proliferation was assessed by a KI-67-based proliferation assay (immunofluorescence), MCEC metabolic activity (viability) measurements were performed based on the reduction of resazurin and tube-like formation was measured by a Matrigel angiogenesis assay (tubulation assay). Tight-junction protein Zonula Occludens (ZO)-1 and γ-H2Ax foci were studied through immunofluorescence. Senescence (p53 and p21) and autophagy-related (p62, LC3-I, and LC3-II) proteins were studied by Western-Blot. TEM imaging was performed to visualize any ultrastructural differences regarding secretome-treated MCECs.Our data showed that osteosarcoma (OS)-derived secretomes decreased MCEC cellular viability and caused a significant reduction in MCEC proliferation capabilities. However, the incubation with both basal and doxorubicin (DOX)-treated secretomes was able to increase vessel-like structure formation. Furthermore, OS-derived secretomes induced marked alterations in ZO-1 protein subcellular distribution and levels, illustrated by internalized ZO-1 puncta and decreased total levels. OS secretomes also triggered cellular hypertrophy which can be correlated with other senescence-associated markers like an increase in γ- H2Ax foci and dysregulation of p53 and p21 protein levels. Additionally, OS-secretomes promoted a downregulation of p62 expression, while maintaining the ratio between LC3-II/LC3-I forms. Lastly, we also observed that OS-derived secretomes promoted alterations in ECs morphology such as organelle enlargement and had differences in their ultrastructure: mitochondria cristae and Golgi apparatus were enlarged, endoplasmic reticulum was deformed and the intercellular junctions presented some fissures.Our work elucidates on the direct interactions between osteosarcoma, its secretome and the dysfunctional behavior seen in MCECs. On top of that, our work demonstrated that OS-derived secretome might lead to senescence through a p53-independent mechanism. Moreover, our work represents a step forward towards new antitumoral therapeutic approaches that account for patients´ heart condition.As doenças cardiovasculares e o cancro são as principais causas de morte no mundo, coexistindo frequentemente. Para além disso, ambas partilham fatores de risco, podendo aferir uma ligação patofisiológica entre elas. Células endoteliais (ECs), um dos tipos de células mais abundantes no coração podem ser afetadas por fatores secretados pelo cancro uma vez que estas sentem e respondem aos estímulos provocados pelo secretoma de osteossarcoma (OS). No entanto, a influência dos fatores secretados pelo cancro no endotélio cardíaco está pouco descrita. Além do mais, e devido à administração sistémica de doxorrubicina (DOX), as ECs são a primeira linha de contacto com esta droga. Pretendemos investigar o impacto do secretoma derivado de células de OS sujeitas, ou não, a tratamento com DOX em ECs cardíacas. O objetivo principal deste trabalho é estudar o papel dos fatores secretados de OS na indução de stress vascular, podendo contribuir para o desenvolvimento de doença cardíaca. Pretendemos estudar a viabilidade celular, os níveis e a distribuição da proteína Zonula-Occludens (ZO)-1, resposta angiogénica, atividade autofágica e mecanismos que podem levar à senescência celular. Células Endoteliais Cardíacas de Murganho (MCEC, em inglês) foram incubadas com o secretoma de células de osteossarcoma tratadas ou não com doxorrubicina (linha celular 143B) numa proporção otimizada. A capacidade angiogénica das ECs foi estudada tendo em conta vários parâmetros, tais como a migração, proliferação, atividade metabólica (viabilidade) e a sua capacidade de reorganizarem em estruturas semelhantes a vasos. A proteína ZO-1, que pertence às junções oclusivas, e a contagem de γ-H2Ax (histona H2Ax fosforilada) foram estudadas por imunofluorescência. Proteínas relativas à senescência (p53 e p21) e à autofagia (p62, LC3-I e LC3-II) foram estudadas por Western-Blot. Foram também tiradas imagens de Microscopia Eletrónica de Transmissão (TEM, em inglês) para visualizar se existiriam diferenças na ultraestrutura das células MCEC tratadas com o secretoma de células de OS.Os nossos ensaios demonstraram que os secretomas derivados de osteossarcoma diminuíram a capacidade angiogénica das MCEC, demonstrado por um decréscimo significativo na viabilidade e por uma redução significativa na capacidade de proliferação das MCEC. Contudo, a incubação com ambos os secretomas (basal e tratado com DOX) foi capaz de aumentar a formação de estruturas semelhantes a vasos. O secretoma de OS também alterou o padrão de distribuição da ZO-1 nas células MCEC, ilustrado pela internalização de pontos de ZO-1 perto da região do núcleo e no citoplasma das células. Verificámos ainda que os secretomas de OS induziram um aumento significativo no tamanho das células e à senescência, indicado pelo aumento no número de pontos de histona H2Ax fosforilada (γ- H2Ax) por núcleo, mas também devido à redução significativa de p53 e ao aumento dos níveis de p21. Os secretomas também reduziram significativamente os níveis de proteína p62 assim como os de LC3-I e LC3-II (não é estatisticamente significativo) embora o rácio entre a LC3-II e a LC3-I tenha permanecido inalterado. Por último, imagens de TEM mostraram que as MCEC sujeitas ao tratamento com os secretomas derivados de OS apresentavam diferenças no que diz respeito à sua ultraestrutura: crista mitocondrial e complexo de Golgi estavam dilatados, o retículo endoplasmático apresentava-se deformado e as junções intercelulares apresentavam algumas fissuras. Este trabalho demonstrou que o osteossarcoma, o seu secretoma e o comportamento disfuncional que estes provocam nas células endoteliais cardíacas têm uma ligação direta. Demonstrámos ainda que o secretoma derivado de OS poderá levar à senescência celular através de um mecanismo independente da proteína p53. Para além disso este trabalho representa um passo em direção a novas abordagens terapêuticas que tenham em conta a condição cardíaca dos doentes.FCTFCTFCTOutro - This work was financed by the European Regional Development Fund (ERDF), through the Operational Program for Competitiveness Factors (COMPETE; under the projects POCI-01-0145-FEDER-007440, CENTRO-01-0145-FEDER-032179, CENTRO-01-0145-FEDER-032414; UIDP/04539/2020). Support to iLab – Microscopy and Bioimaging Laboratory - from PPBI-Portuguese Platform of BioImaging: POCI-01-0145-FEDER-022122 and CENTRO-04-3559-FSE-000142 was also provided
Aplicação de plasma frio atmosférico em linhas celulares de cancro da mama triplo negativo e os seus efeitos nas principais vias de sinalização celular
No full textDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaBreast cancer is the second most common type of cancer worldwide, and it is one of those with a high mortality rate. It can be molecularly classified based on the expression of various biomarkers into subtypes such as luminal A and B, HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) and triple-negative. Although triple-negative breast cancer (TNBC) accounts for the lowest percentage of breast cancer cases, it has the poorest prognosis. Current therapies for TNBC, primarily involve surgery, chemotherapy and radiotherapy with target therapies, for some cases. However, these treatments are often limited and associated with significant side effects and resistance. Recent studies have focused on exploring innovative therapeutic strategies that target the molecular characteristics of TNBC to develop more personalised treatment strategies. One emerging option is the application of cold atmospheric plasma (CAP) for tumour treatment. Plasma is the fourth state of matter and exerts its action through ultraviolet radiation production, electromagnetic fields and reactive species. Recent studies have highlighted the promising potential of CAP in biomedical fields, particularly, cancer therapy, due to its possible selectivity for tumour cells and its ability to reduce their proliferation and viability. The main objective of this dissertation was to evaluate the therapeutic effects of CAP on two breast cancer cell lines (HCC1806 and HCC1395) representative of triple-negative with distinct molecular characteristics. Various studies were conducted to assess the effects of CAP on the cancer hallmarks, mainly in the signalling pathways related to cell migration, invasion, adhesion, proliferation, autophagy, senescence and epigenetic alterations. CAP treatment affected cell migration and invasion capacity significantly reducing it in both cell lines. Additionally, it influenced cell adhesion properties, particularly through the expression of the E-cadherin protein, however having induced opposite effects in the two cell lines. CAP exposure led to increased E-cadherin expression in the HCC1395 cell line, whereas it resulted in a decrease in E-cadherin expression in the HCC1806 cell line. CAP also demonstrated an ability to alter epigenetic reprogrammming and affect genome stability by promoting DNA methylation in LINE-1 sequences. The treatment also downregulated proliferative and survival signalling pathways, specifically by reducing PI3K and AKT protein expression, leading to decreased cell proliferation and survival. Furthermore, CAP exposure affected Beclin-1 expression, suggesting a possible modulation of the autophagic process and induced controlled senescence in both cell lines. This work highlights the promising potential of CAP as a treatment for breast cancer, particularly for TNBC. It also elucidates possible mechanisms of action of CAP on signalling pathways studied. The results open the door to future studies exploring the potential of CAP in cancer treatment, to advance toward clinical applications.O cancro da mama é o segundo tipo de cancro mais comum a nível mundial, sendo um dos que apresenta uma elevada taxa de mortalidade. Pode ser classificado molecularmente tendo por base a expressão de vários biomarcadores em subtipos como luminal A e B, HER 2 ( do inglês human epidermal growth factor receptor 2) positivo e triplo negativo. Embora o cancro da mama triplo negativo represente a menor percentagem dos casos de cancro da mama é o que apresenta o pior prognóstico. As terapias atuais envolvem principalmente a cirurgia, quimioterapia e radioterapia com terapias direcionadas disponíveis para alguns casos. No entanto, estes tratamentos são frequentemente limitados, estão associados à presença de efeitos secundários e resistência. Estudos recentes têm sido direcionados para a exploração de estratégias terapêuticas inovadoras que visam as características moleculares do cancro da mama triplo negativo, com o objetivo de desenvolver estratégias de tratamentos mais personalizados. Uma opção emergente é a aplicação de plasma frio atmosférico (PFA) no tratamento de tumores. O plasma é o quarto estado da matéria e exerce a sua função através da produção de radiação ultravioleta, campos eletromagnéticos e pela produção de espécies reativas. Estudos recentes destacaram o potencial promissor do PFA em áreas biomédicas, especialmente na terapia do cancro, devido à sua possível seletividade para as células tumorais e à sua capacidade de reduzir a proliferação e viabilidade. O principal objetivo desta dissertação foi avaliar os efeitos terapêuticos do PFA em duas linhas celulares de cancro da mama (HCC1806 e HCC1395), representativas do cancro da mama triplo negativo com características moleculares distintas. Foram realizados vários estudos in vitro para esclarecer os efeitos do PFA nos hallmarks do cancro, nomeadamente nas vias de sinalização relacionadas com a migração, invasão, adesão, proliferação, autofagia, senescência e alterações epigenéticas. O tratamento com PFA mostrou afetar a capacidade de migração e invasão das células promovendo a sua diminuição em ambas as linhas celulares. Adicionalmente, o PFA influenciou as propriedades de adesão celular, particularmente, através da expressão da proteína E-caderina, induzindo, contudo, efeitos opostos nas duas linhas celulares. Enquanto na linha celular HCC1395 a exposição ao PFA provocou um aumento na expressão da E-caderina, na linha HCC1806 houve uma redução na sua expressão. O PFA também demonstrou capacidade de alterar a reprogramação epigenética bem como a estabilidade do genoma, promovendo a metilação do DNA em sequências LINE-1. O tratamento também provocou uma redução nas vias de sinalização proliferativas e de sobrevivência, especificamente ao reduzir a expressão das proteínas PI3K e AKT, o que levou à diminuição da proliferação e sobrevivência celular. Além disso, a exposição ao PFA afetou a expressão da Beclina-1, sugerindo uma possível modulação do processo autofágico e induziu senescência de forma controlada. Este trabalho destaca o potencial promissor do PFA como tratamento para o cancro da mama, em particular para o cancro da mama triplo negativo. Para além disso, elucida possíveis mecanismos de ação do PFA nas vias de sinalização estudadas. Os resultados abrem portas para futuros estudos que explorem o potencial do PFA no tratamento do cancro, com vista a uma aplicação clínica.FCTFCTFCTFC
Effects of Cold Atmospheric Plasma in Breast Cancer Stem Cells
No full textDissertação de Mestrado em Engenharia Biomédica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaBreast cancer is the type of cancer with the second highest incidence rate and the fourth highest mortality rate, across all ages and both sexes, worldwide. Cancer stem cells (CSCs) are a minority population of tumor cells responsible for the initial formation of the tumor, resistance drugs used in clinical practice, and recurrences. Current treatments, including surgery, radiotherapy, chemotherapy, endocrine therapy, and anti-HER2 therapies, present undesirable side effects. Cancer treatment remains a challenge. Thus, the investigation of new therapeutic approaches is crucial. In this context, cold atmospheric plasma (CAP), known as the fourth state of matter, has been investigated over the last few years, showing promising results in treating various types of cancer.The research work that led to this dissertation aimed primarily to evaluate the effect of CAP in breast CSCs in two representative cell lines of two different cancer subtypes, the hormone-dependent (MCF7) and the triple-negative (HCC1806). The effects of CAP on CSCs were evaluated by assessing the expression of VEGFR and vimentin, using fluorescence microscopy studies, evaluating cellular invasion and differentiation, viability and types of cell death, the PI3K/AKT expression, and markers associated stemness, namely CD24 and CD44, studies.The expression of VEGFR in MCF7 CSCs increased after 240 seconds of CAP exposure, while vimentin expression increased after 120 seconds of CAP exposure in HCC1806 CSCs. The treatment induced an increase in the invasion capacity of MCF7 CSCs, whereas in HCC1806 CSCs, it led to a trend toward decreased invasion capacity. Additionally, it resulted in reduced differentiation capacity and decreased viability in MCF7 CSCs. Apoptosis and late apoptosis/necrosis were the most prevalent types of cell death observed. PI3K expression tended to increase with longer CAP exposure. AKT expression also tended to increase in MCF7 CSCs, while the opposite was observed in HCC1806 CSCs. Both cell line CSCs expressed the markers CD24 e CD44.Thus, this work reinforces the therapeutic potential of CAP in breast CSCs, encouraging further studies to enable a more compatible approach with clinical practice.O cancro da mama é o tipo de cancro com a segunda maior taxa de incidência e a quarta maior taxa de mortalidade, em todas as idades e ambos os sexos, a nível mundial. As células estaminais do cancro (CSCs) são uma população minoritária de células tumorais responsáveis pela formação inicial do tumor, resistência aos fármacos utilizados na prática clínica e, também, pelas recidivas. Os tratamentos atuais, que incluem cirurgia, radioterapia, quimioterapia, terapia endócrina e terapias anti-HER2, apresentam efeitos secundários indesejáveis. O tratamento do cancro continua a ser um desafio. Deste modo, é fundamental a investigação de novas abordagens terapêuticas. É neste sentido que, durante os últimos anos, o plasma frio atmosférico (PFA), conhecido como o quarto estado da matéria, tem vindo a ser investigado apresentando resultados muito promissores no tratamento de vários tipos de cancro. O trabalho de investigação que deu origem a esta dissertação teve como principal objetivo avaliar o efeito do PFA em CSCs da mama, em duas linhas celulares representativas de dois subtipos moleculares diferentes, o cancro da mama hormonodependente (MCF7) e o cancro da mama triplo negativo (HCC1806). Os efeitos do PFA nas CSCs foram avaliados através da expressão de VEGFR e vimentina, recorrendo a estudos de microscopia de fluorescência, da avaliação da invasão e diferenciação celulares, da viabilidade e tipos de morte, da via de proliferação PI3K/AKT e de marcadores associados à estaminalidade, CD24 e CD44.A expressão de VEGFR nas CSCs da linha celular MCF7 aumentou após 240 segundos de exposição ao PFA e a expressão de vimentina aumentou após 120 segundos de exposição ao PFA nas CSCs da linha celular HCC1806. A terapêutica induziu um aumento da capacidade de invasão nas CSCs da linha celular MCF7 enquanto nas CSCs da linha celular HCC1806 induziu uma tendência para uma diminuição. Além disso, induziu uma diminuição da capacidade de diferenciação e uma diminuição da viabilidade nas CSCs da linha celular MCF7. A apoptose e a apoptose tardia/necrose foram os tipos de morte mais prevalente. A expressão da PI3K apresentou uma tendência para aumentar com o aumento do tempo de exposição ao PFA. Já a expressão da AKT apresentou uma tendência para aumentar nas CSCs da linha celular MCF7 enquanto nas CSCs da linha celular HCC1806 se verificou o contrário. As CSCs de ambas as linhas celulares expressaram os marcadores CD24 e CD44.Assim, este trabalho reforça o potencial terapêutico do PFA em CSCs da mama impulsionando a novos estudos de modo a permitir uma abordagem mais compatível com a prática clínica.FC
A influência dos genes do ciclo circadiano na regulação da reparação da lesão no DNA em leucemia mieloide
No full textDissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaThe circadian rhythm is a biological system governed by the mammalian hypothalamus. It regulates various physiological processes, including the sleep-wake cycle, hormone secretion, metabolism, cell division, and DNA repair. Identified circadian clock genes such as CLOCK, BMAL1, BMAL2, PER1, PER2, PER3, CRY1, CRY2, RORα, and NR1D1 are essential for maintaining the body's daily rhythms and coordinating cellular activities. Disruption of these processes can significantly impact disease development, particularly cancer. Disturbances in the circadian clock have been found to promote tumor growth and progression by influencing crucial biological processes of cancer cells.Acute myeloid leukemia (AML) and chronic myeloid leukemia (CML) are hematologic malignancies characterized by clonal expansion of hematological cells, leading to the accumulation of altered blood cells in the bone marrow and peripheral blood. Recent research has highlighted the association between changes in circadian clock genes and the development and progression of AML and CML and their connection to DNA damage response pathways. Leukemia cells often exhibit altered expression patterns of circadian clock genes. Understanding the influence of circadian rhythms on leukemia is of great importance. This knowledge could be leveraged for chronotherapy by, for example, manipulating circadian rhythms through medication, potentially enhancing the efficacy of traditional anticancer treatments. Therefore, it is crucial to evaluate the impact of circadian clock genes on regulating DNA damage repair in AML and CML to optimize treatment timing or target specific clock genes to improve outcomes for leukemia patients. The main objectives of this study were to assess how circadian rhythm affects DNA damage repair capacity and how chronotherapy impacts the response to therapy in leukemia cell lines. To this end, two leukemia cell lines (HL-60 and K562 cells) and a normal lymphocyte cell line (IMC cells) were used to characterize the baseline expression levels of core circadian genes, such as CLOCK, BMAL1, BMAL2, PER1, PER2, PER3, CRY1, CRY2, and RORα, using qPCR; Identify the variation cycle in gene expression throughout the day; Determine the time points associated with the most and least effective DNA repair by evaluating the levels of chromosome damage using the cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay, and the levels of double-strand breaks (DSBs) by flow cytometry-based quantification of γH2AX; and, Assessment drugs' responsiveness to cancer cells at time points corresponding to the most and least effective DNA repair.Our study revealed that the HL-60 and K562 cell lines exhibited an abnormal circadian rhythm compared to normal cells. Additionally, forskolin-induced oscillations in clock gene expression were observed, particularly in CLOCK, BMAL1, PER3, and RORα, with the most significant variation occurring during the day. We also observed that the DNA damage repair capacity fluctuates throughout the day in leukemia cell lines, with different acrophase and nadir time points for clock genes. Interestingly, the administration of conventional drugs in synchronized leukemia cells at the lowest repair capacity showed promising results by reducing cell viability in these cells in comparison to unsynchronized cells.So, our research has revealed differing variations in clock genes throughout the day in AML and CML cell lines, leading to varying DNA damage repair capacities. Notably, the impact of chronotherapy on treatment response has shown promising results in both cell lines. This underscores the potential of leveraging knowledge about the circadian cycle in cells and patients to enhance treatment response and mitigate treatment-related side effects.O ritmo circadiano é um sistema biológico coordenado pelo hipotálamo nos mamíferos. Este regula vários processos fisiológicos, incluindo o ciclo de sono-vigília, a secreção hormonal, o metabolismo, a divisão celular e a reparação do DNA. Os genes do ciclo circadiano como CLOCK, BMAL1, BMAL2, PER1, PER2, PER3, CRY1, CRY2, RORα e NR1D1, são essenciais para manter os ritmos diários do organismo e coordenar diversas atividades celulares. A disrupção destes processos pode ter um impacto significativo no desenvolvimento de doenças, especialmente o cancro. As alterações do ciclo circadiano promovem o crescimento e a progressão do cancro, influenciando processos biológicos cruciais nas células cancerígenas. A leucemia mieloide aguda (LMA) e a leucemia mieloide crónica (LMC) são doenças hematológicas caracterizadas pela expansão clonal de células hematológicas, levando à acumulação de células sanguíneas imaturas na medula óssea e na corrente sanguínea. Estudos recentes destacaram a associação entre as alterações nos genes do ciclo circadiano e o desenvolvimento e progressão da LMA e da LMC e sua ligação com as vias da resposta à lesão no DNA. As células leucémicas frequentemente exibem padrões de expressão alterados dos genes do ciclo circadiano, o que torna fundamental a melhor compreensão da influência dos ritmos circadianos nestas patologias. Este conhecimento poderia ser aplicado na cronoterapia, como por exemplo na manipulação dos ritmos circadianos das células através de fármacos, aumentando potencialmente a eficácia dos tratamentos anticancerígenos tradicionais. Portanto, é crucial avaliar o impacto dos genes do ciclo circadiano na regulação da reparação da lesão do DNA na LMA e na LMC para otimizar o momento do tratamento ou modular genes do ritmo circadiano de forma a melhorar a resposta ao tratamento nestes doentes.Com este estudo pretendeu-se avaliar como o ritmo circadiano afeta a capacidade de reparação da lesão ao DNA e o impacto da cronoterapia em modelos celulares de leucemia in vitro. Para alcançar estes objetivos, utilizaram-se duas linhas celulares de leucemia mieloide (HL-60 e K562) e uma linha celular de linfócitos normais (IMC) para: Caracterizar os níveis basais de expressão de genes circadianos, como CLOCK, BMAL1, BMAL2, PER1, PER2, PER3, CRY1, CRY2 e RORα, usando qPCR; Identificar o ciclo de variação na expressão génica ao longo do dia; Determinar a altura do dia associada à menor e maior reparação da lesão no DNA, avaliando os níveis de lesão cromossómica usando o ensaio de micronúcleo pelo bloqueio de citocinese e os níveis de quebras de cadeia dupla por quantificação baseada em citometria de fluxo de γH2AX; e Avaliar a capacidade de resposta dos fármacos às células cancerígenas em momentos correspondentes à reparação do DNA mais e menos eficazes.Este estudo revelou que as linhas celulares HL-60 e K562 mostraram um ritmo circadiano desregulado em comparação com as células normais. Além disso, foram observadas oscilações induzidas pela forskolina na expressão dos genes circadianos, mostrando uma variação mais significativa nos genes CLOCK, BMAL1, PER3 e RORα. A capacidade de reparação da lesão do DNA apresentou oscilações ao longo do dia nas linhas celulares de leucemia, com diferentes momentos de aumento de expressão e diminuição de expressão dos genes circadianos. Resultados promissores mostraram que a administração dos tratamentos convencionais na altura da menor capacidade de reparação em células leucémicas sincronizadas diminuiu a viabilidade celular destas células comparativamente a células não sincronizadas.Desta forma, os resultados revelaram diferentes variações na expressão génica ao longo do dia nas linhas celulares de LMA e LMC, mostrando diferentes capacidades de reparação da lesão no DNA. O impacto da cronoterapia na resposta ao tratamento mostrou resultados promissores em ambas as linhas celulares. Isto sublinha a relevância do conhecimento do ciclo circadiano em células e doentes de forma a melhorar a resposta e mitigar os efeitos secundários relacionados com o tratamento
Reprogramação de astrócitos em neurónios para tratar a Ataxia Espinocerebelar Tipo 3 Estudos de prova de conceito
No full textDissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaMachado-Joseph disease, or spinocerebellar ataxia type 3, is a neurodegenerative disease caused by the toxic properties of the expanded ataxin-3 proteins, provoked by an abnormal expansion of the CAG trinucleotide within the ATXN3 gene. Patients experience a severe clinical condition, unfortunately with no currently available treatment. A novel therapeutic approach involving the direct reprogramming of glial cells into neurons through overexpression of transcription factors (TFs) has been explored in the context of Alzheimer’s, Parkinson’s, and Huntington’s disease. This strategy aims to replenish the degenerated neuronal population and restore functionality. Nevertheless, this technology faces several challenges such as identifying optimal TF combinations, refining reprogramming protocols, and ensuring the long-term integration and functionality of induced neurons. This project aimed at investigating the potential for direct reprogramming of astrocytes into neurons. For that, adeno-associated virus of serotype 5 (AAV5), which preferentially infects astrocytes, simultaneously overexpressed Cre and the TF under a system that allows tracking the astrocyte induced neurons by triggering the expression of mCherry (a red fluorescent probe) upon transcription. The project was focused on designing the AAV5 vectors, validating their plasmid construction, producing the AAVs and validating them, and a proof of concept for reprogramming a glial lineage. The AAV plasmids showed to work properly and overexpressed Cre and transgenes, although the rate of expression was low. After producing the viral vectors, the AAV5 samples were found to be of low quality. Besides displaying considered levels of aggregation, signs of impurity were detected. These results were found to profoundly influence the subsequent expression experiments, to the extent that the GFP and mCherry reporters could not be detected in infection assays on glioma cells. For this reason, subsequent reprogramming of the glial lineage was performed using lentiviral vectors (expressing the same TFs and Cre-FLEx system). The first proof-of-concept study revealed two of the TFs used as the most promising, promoting high levels of expression of βIII-tubulin, which suggests possible reprogramming events. However, further studies are needed to ensure the reproducibility of the results presented here.A doença de Machado-Joseph, ou ataxia espinocerebelar tipo 3, é uma doença neurodegenerativa causada pelas propriedades tóxicas da proteína ataxina-3 expandida, provocadas pela expansão anormal do trinucleótido CAG no gene ATXN3. Os doentes apresentam um quadro clínico grave, infelizmente sem tratamento atualmente disponível.Uma nova abordagem terapêutica envolvendo a reprogramação direta de células gliais em neurónios através da sobre-expressão de fatores de transcrição (TFs) tem sido explorada no contexto das doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington. Esta estratégia visa repor a população neuronal degenerada e restaurar a funcionalidade. No entanto, esta tecnologia enfrenta vários desafios como a identificação de combinações ideais de TFs, o aperfeiçoamento dos protocolos de reprogramação e a garantia da integração e funcionalidade a longo prazo dos neurónios induzidos.Este projeto teve como objetivo investigar o potencial de reprogramação direta de astrócitos em neurónios. Para tal, o vírus adeno-associado do serotipo 5 (AAV5), que infecta preferencialmente astrócitos, sobre-expressou simultaneamente Cre e o TF, num sistema que permite rastrear os neurónios induzidos por astrócitos através da expressão de mCherry (sonda fluorescente vermelha) após a transcrição. O projeto centrou-se no design dos vetores AAV5, na validação das suas construções plasmídicas, na produção e validação dos AAVs e numa prova de conceito para a reprogramação de uma linhagem glial.Os plasmídeos AAV mostraram funcionar corretamente e foi observada a sobre-expressão da Cre e dos transgenes, embora não de forma eficiente. Após a produção dos vetores virais, verificou-se que as amostras de AAV5 eram de baixa qualidade. Para além de apresentarem níveis consideráveis de agregação, foram detetados sinais de impureza. Estas limitações influenciaram profundamente as experiências de expressão subsequentes, na medida em que os repórteres GFP e mCherry não puderam ser detetados em ensaios de infeção em células de glioma. Assim, a reprogramação subsequente da linhagem glial foi realizada utilizando vetores lentivirais (que expressam os mesmos TFs e o sistema Cre-FLEx). O primeiro estudo de prova de conceito revelou que dois dos TFs usados como sendo os mais promissores, promovendo a expressão de níveis elevados de βIII-tubulina, o que sugere possíveis eventos de reprogramação. No entanto, mais estudos são necessários para garantir a reprodutibilidade dos resultados aqui apresentados.Outro - This laboratory is funded by the European Regional Development Fund (ERDF), through the Centro 2020 Regional Operational Program; through the COMPETE 2020 - Operational Programme for Competitiveness and Internationalisation, and Portuguese national funds via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, under the projects: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, 2022.06127.PTDC, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095) and Neurodiet (JPND/0001/2022), Cintech, ref.C64486557600000005, Portuguese Resilience and Recovery Plan, NextGenerationEU Fund; ARDAT under the IMI2 JU Grant agreement No 945473 supported by EU and EFPIA; GeneT- Teaming Project 101059981 supported by the European Union's Horizon Europe program