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MACHINE LEARNING ALGORITHM FOR GPCR-A17 LIGAND ACTION PREDICTION: A Novel Approach to Drug Discovery
No full textDissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaG-protein-coupled receptors (GPCRs) are integral membrane proteins that play a crucial role in physiological processes and act as sensors for signaling molecules, such as hormones and neurotransmitters, thereby regulating G proteins. Recent breakthroughs in GPCRs structural studies have provided valuable insights into the intricate molecular mechanisms underlying GPCRs ligand recognition, activation, allosteric modulation, and structural basis of GPCRs dimerization. Signaling pathways mediated by GPCRs are implicated in numerous human diseases, and approximately 35 percent of existing pharmaceuticals target these receptors, underscoring their significance in drug development and therapeutic interventions. It is important to continue to unveil our understanding of the intricate structure and functionality of diverse medically relevant GPCRs. To address this challenge, a comprehensive understanding of the structural features governing GPCRs activation is imperative. Therefore, in this project, we highlight the necessity of quantitatively describing the important characteristics of GPCRs’ ligands and establishing their correlation with GPCR activation. The integration of Machine Learning (ML) techniques in predicting ligand action has revolutionized the field by providing convenient access to a vast repository of annotated ligand-protein interactions. In this project, a Random Forest classifier was employed to predict three classes of ligand action in GPCRs: Antagonist (class 0), Agonist (class 1), and Binding Agent (class 2). The performance of the model was evaluated across the validation, test, and final test datasets with varying numbers of estimators (25, 100, and 200). The classifier demonstrated robust overall accuracy, peaking at 91% with 200 estimators on the validation set, and maintaining 94% accuracy on the test set. Despite the high accuracy, challenges in recall were observed for Classes 1 and 2, indicating potential misclassifications. Feature importance analysis identified key features such as "Ki," "PEOE_VSA1," and "MPC5" as significant contributors to the model's decision-making process. These results underscore the model's efficacy and the need for further refinement to enhance the recall for certain classes, potentially through additional feature engineering or model tuning.Recetores acoplados à proteína G (GPCRs) são proteínas transmembranares que desempenham um papel crucial em processos fisiológicos, atuando como sensores de moléculas sinalizadoras como as hormonas e os neurotransmissores, regulando assim as proteínas G. Os recentes avanços nos estudos estruturais dos GPCRs forneceram informações valiosas sobre os mecanismos moleculares intrincados subjacentes ao reconhecimento do ligando, à ativação, à modulação alostérica e à base estrutural da dimerização dos GPCRs. As vias de sinalização mediadas pelos GPCRs estão implicadas em numerosas doenças humanas e cerca de 35% dos fármacos existentes têm como alvo estes receptores, o que sublinha a sua importância no desenvolvimento de medicamentos e nas intervenções terapêuticas. É importante continuar a desvendar conhecimentos sem paralelo sobre a estrutura intrincada e a funcionalidade de diversos GPCRs relevantes do ponto de vista médico. Assim, neste projeto, destacamos a necessidade de descrever quantitativamente as características estruturais importantes dos GPCRs e respetivos ligandos e estabelecer a sua correlação com a ação do ligando. A integração de técnicas de Machine Learning (ML) na previsão da estrutura de proteínas revolucionou a área, fornecendo acesso conveniente a um vasto repositório de conformações anotadas. Neste projeto, foi utilizado um classificador Random Forest para prever três classes de atividade GPCR: Antagonista (classe 0), Agonista (classe 1) e Agente de Ligação (classe 2). O desempenho do modelo foi avaliado em conjuntos de dados de validação, teste e teste final com vários números de estimadores (25, 100 e 200). O classificador demonstrou uma precisão global robusta, atingindo um pico de 91% com 200 estimadores no conjunto de validação e mantendo uma precisão de 94% no conjunto de teste. Apesar da elevada exatidão, foram observados desafios na recuperação para as classes 1 e 2, indicando potenciais erros de classificação. A análise da importância das características identificou características-chave como “Ki”, “PEOE_VSA1” e “MPC5” como contribuintes significativos para o processo de tomada de decisão do modelo. Estes resultados sublinham a eficácia do modelo e a necessidade de um maior refinamento para melhorar a recuperação de determinadas classes, potencialmente através da engenharia de características adicionais ou da afinação do modelo.FC
Sonda neural regulável em termos de rigidez para uma maior biocompatibilidade
No full textDissertação de Mestrado em Engenharia Biomédica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaNeural probes play a crucial role in neuroscience research and clinical applications,as they are able to modulate and monitor neural cells electrical behavior. In recentyears the number of human trials with neural probes has increased, motivated by theirability to develop new treatments for neurological disorders.However, traditional neural probes often face challenges due to their mechanicalmismatch with brain tissue, hindering their long-term performance. Development ofsoft neural probes can address this problem, through the use of materials that possessa young´s modulus closer to the one of the brain tissue, which can potentially minimizetissue damage and inflammation, and improve long-term recording stability. On theother hand, soft probes cannot be inserted into the brain tissue, without the use ofassistive tools.This dissertation presents an improved approach to soft neural probes by incorporating a tunable stiffness hydrogel. The hydrogel’s initial rigidity allows an unassistedinsertion, while its subsequent adaptation to a soft state (kPa range) upon contactwith cerebrospinal fluid (CSF) enhances mechanical compatibility with the brain tissue.This approach also holds promise for mitigating the initial immunological response byleveraging the hydrogel’s drug carrier properties.This probe demonstrated a remarkably low Young’s Modulus of 74.5 kPa in its softstate, demonstrating improvement over the state of the art, and a 488-fold decrease inbending stiffness when transitioning from rigid to soft state. Additionally, an initialintegration of soft and stretchable electronics, based on liquid metal and PEDOT:PSSelectrodes, enables a fully soft neural probe without any rigid elements.Finally to validate the probe’s efficacy, successful penetration tests were conductedin both gel and ex-vivo brain tissue. These tests demonstrated the probe’s ability to penetrate the cerebral cortex and undergo a complete soft transition through CSFabsorption, suggesting its potential viability for in vivo applications.As sondas neurais desempenham um papel crucial na investigação em neurociências e nas aplicações clínicas, uma vez que são capazes de modular e monitorizar ocomportamento elétrico das células neurais. Nos últimos anos, o número de ensaiosem seres humanos com sondas neurais aumentou, motivado pela sua capacidade dedesenvolver novos tratamentos para doenças neurológicas.No entanto, as sondas neurais tradicionais enfrentam frequentemente desafiosdevido à sua incompatibilidade mecânica com o tecido cerebral, o que prejudica oseu desempenho a longo prazo. O desenvolvimento de sondas neurais maleáveis poderesolver este problema, através da utilização de materiais que possuem um módulo deelasticidade mais próximo do do tecido cerebral, o que pode potencialmente minimizaros danos nos tecidos e a inflamação, e melhorar a estabilidade de monitorização a longoprazo. Por outro lado, as sondas maleáveis não podem ser inseridas no tecido cerebralsem a utilização de ferramentas de assistência.Esta dissertação apresenta uma abordagem melhorada para sondas neurais macias,incorporando um hidrogel de rigidez ajustável. A rigidez inicial do hidrogel permiteuma inserção sem assistência, enquanto a sua adaptação subsequente a um estado macio(intervalo de kPa) após contacto com o líquido cefalorraquidiano (LCR) aumenta acompatibilidade mecânica com o tecido cerebral. Esta abordagem também é promissorapara atenuar a resposta imunológica inicial, se tirar partido das propriedades detransporte de fármacos do hidrogel.Esta sonda demonstrou um módulo de Young notavelmente baixo de 74,5 kPano seu estado maleável, demonstrando uma melhoria em relação ao estado da arte,e uma diminuição de 488 vezes na rigidez referente à flexão, quando transicionar doestado rígido para o estado maleável. Além disso, uma integração inicial de eletrônica maleável e extensível, baseada em metal líquido e eléctrodos PEDOT:PSS, permiteuma sonda neural totalmente maleável sem quaisquer elementos rígidos. 78Finalmente, para validar a eficácia da sonda, foram efectuados testes de inserçãobem sucedidos em tecido cerebral em gel e ex vivo. Estes testes demonstraram acapacidade da sonda de ser inserida no córtex cerebral e transicionar para um estadomaleável através da absorção do LCR, sugerindo a sua potencial viabilidade paraaplicações in vivo.Outro - This dissertation was partially supported by the European Research Council (ERC) consolidator grant Liquid3D, under grant agreement number, Grant agreement ID: 101045072. Research infrastructure, and equipment was provided by the Soft and Printed Microelectronics Laboratory, at Electrical Engineering Department of the University of Coimbra, and the Institute for Systems and Robotics
The Reconfiguration of the Crimes of Sexual Coercion and Rape according to the Istanbul Convention
No full textDissertação de Mestrado em Direito apresentada à Faculdade de DireitoThe present dissertation explores the crimes of sexual coercion and rape according to the Istanbul Convention, focusing on the incrimination models of coercion, dissent and consent, highlighting their implications for the criminal protection of sexual freedom. Therefore, our analysis will focus on the task of uncovering the incrimination model adopted in the Portuguese, German and Spanish legal systems. Basically, we will try to find out the main differences between the models and evaluate the one that, in our opinion, best suits the Portuguese legal reality. Through a critical and comparative analysis, the study also examines how different legal systems define and address sexual violence, considering the historical and cultural evolution of criminal norms. The work addresses the main legislative reforms that shaped the definition and punishment of crimes of sexual coercion and rape over time. The analysis covers the transition from a traditional focus, centered on the protection of sexual morality, to a current paradigm that prioritizes people's sexual freedom and self-determination. In the context of sexual violence and sexual crimes, one of the objectives of this work is, moreover, to try to assess whether Portugal has complied with the obligations arising from the Istanbul Convention. The emphasis on the importance of consent in the definition of crimes of sexual coercion and rape is one of the central aspects of the Convention, which clarifies that consent must be given voluntarily, as the result of the person’s free will, assessed in the context of the surrounding circumstances. In this sense, it aims to better protect victims, including those who may be unable to resist due to factors such as fear or other states of vulnerability.A presente dissertação explora os crimes de coação sexual e de violação à luz da Convenção de Istambul, focando-se nos modelos de incriminação do constrangimento, do dissentimento e do consentimento, destacando as suas implicações na tutela penal da liberdade sexual. Deste modo, a nossa análise incidirá na tarefa de descortinar qual o modelo de incriminação adotado no ordenamento jurídico português, alemão e espanhol. No fundo, vamos procurar saber as principais diferenças entre os modelos e avaliar aquele que, na nossa opinião, melhor se adequa à realidade jurídica portuguesa. Através de uma análise crítica e comparativa, o estudo também examina como os diferentes sistemas legais definem e abordam a violência sexual, considerando a evolução histórica e cultural das normas penais. O trabalho aborda as principais reformas legislativas que moldaram a definição e a punição dos crimes de coação sexual e de violação ao longo do tempo. A análise abrange a transição de um enfoque tradicional, centrado na proteção da moralidade sexual, para um paradigma atual que prioriza a liberdade e a autodeterminação sexual das pessoas. No âmbito da violência sexual e dos crimes sexuais, um dos objetivos deste trabalho é, outrossim, tentar aquilatar se Portugal cumpriu as obrigações decorrentes da Convenção de Istambul. A ênfase na importância do consentimento na definição dos crimes de coação sexual e de violação é um dos aspetos centrais da Convenção, que elucida que o consentimento deve ser dado voluntariamente, por vontade livre da pessoa, avaliado no contexto das circunstâncias envolventes. Neste sentido, visa proteger melhor as vítimas, incluindo aquelas que podem ser incapazes de resistir devido a fatores como medo ou outros estados de vulnerabilidade
Frequency of pelvic features associated with childbirth in a sample from the Identified Skeletal Collection of the MUHNAC (Lisbon): A population-based approach
No full textDissertação de Mestrado em Antropologia Forense apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaThe identification of human remains is the primary goal of forensic anthropology. This process involves constructing a biological profile, which includes sex, age at death, stature, population affinities, and the comparison of discrete traits (e.g., pathologies, traumas). The ability to determine whether a woman has experienced an obstetric event has significant implications for both forensic anthropology, aiding in the identification of human remains, and bioarcheology, allowing the reconstruction of past narratives related to obstetric events across different cultures and time periods. Currently referred to as pelvic features, these are found in the bones of the pelvic girdle. Despite decades of study, their etiology remains uncertain, however, they have been associated with childbirth. These features are not exclusively linked to obstetric events but may be accentuated by them and can be related to various factors such as age, weight, activity, bone density, stature, biomechanical stresses, and hormonal and genetic influences. This study focuses on analyzing the frequency of seven pelvic features (Pubic Tubercle Extension (ExTu), Dorsal Groove (DP), Paraglenoid Groove (PG), Pre-Auricular Groove (PS), Sacral Pre-Auricular Extension (SPE), Sacral Pre-Auricular Notch (SPN), and Auricular Margin Groove (MAG)) and their possible association with childbirth. The sample includes a total of 163 individuals from the Collection of Identified Skeletons at MUHNAC (Lisbon). This sample consists of 80 females and 83 males, with ages at death ranging from 15 to 50 years, covering the reproductive period of women. An analysis was conducted not only on the frequency of the pelvic features found in the sample but also on the grades at which they were assessed, complemented by a comparative analysis with the study by Pany-Kucera and co-authors (2022), particularly focusing on the pelvic patterns identified. Morphological methods from various authors were used, statistical analysis of the results was conducted, and diagrams with photographs of each pelvic feature were created. The results reveal that the most frequent pelvic features are the Preauricular Sulcus (PS) in females (across all age groups), and the Paraglenoid Sulcus (PG) and Pubic Tubercle Extension (ExTu) in males. They also show that younger individuals exhibit a lower frequency of pelvic features and less variation between degrees, whereas older individuals exhibit the opposite, with females showing more pronounced features. These results corroborate previous statements in the literature. Pelvic features are not exclusive to females, and the pelvic patterns found indicate that males generally have patterns with three or fewer pelvic features, while females may present patterns with three or fewer or four or more features. The absence of data on the parity of the sample individuals prevents the analysis of the relationship between the pelvic patterns found in women and their nulliparity or multiparity.A identificação de remanescentes humanos é o grande objetivo da antropologia forense. Este processo é feito a partir da construção de um perfil biológico, que inclui a estimativa do sexo, idade à morte, estatura, afinidades populacionais, e a comparação de dados ante- e post mortem (ex.: patologias). A possibilidade de identificar se uma mulher passou por algum evento obstétrico, tem grandes implicações para a investigação tanto na antropologia forense, para auxiliar a identificação de remanescentes humanos, como na bioarqueologia permitindo a reconstrução de narrativas do passado, relativamente a eventos obstétricos em diferentes culturas e épocas. As características pélvicas, como são designadas na atualidade, encontram-se nos ossos que constituem a cintura pélvica. Ao longo de décadas de estudo ainda não há certezas quanto à sua etiologia. Estas características não estão exclusivamente ligadas a eventos obstétricos, podendo apenas ser acentuadas por estes, e estar relacionadas a vários fatores como idade, peso, atividade física, densidade óssea, estatura, stresses biomecânicos, e influências hormonais e genéticas. Este estudo foca-se na análise da frequência de sete características pélvicas (Extensão do Tubérculo Púbico (ExTu), Sulco Dorsal (DP), Sulco Paraglenóide (PG), Sulco Pré-auricular (PS), Extensão Pré-auricular Sacral (SPE), Incisura Pré-auricular Sacral (SPN) e Sulco Auricular Margo (MAG)) e a sua possível associação ao parto. A amostra incluí um total de 163 indivíduos, provenientes da Coleção de Esqueletos Identificados do MUHNAC (Lisboa). Esta amostra é composta por 80 indivíduos do sexo feminino e 83 do sexo masculino, com idades à morte compreendidas entre os 15 e os 50 anos, o período reprodutivo da mulher. Foi realizada uma análise não só à frequência das características pélvicas encontradas na amostra, mas também os graus em que foram avaliadas, complementada com uma análise comparativa do artigo de Pany-Kucera e coautores (2022) focada nos padrões pélvicos encontrados. Foram utilizados métodos morfológicos de vários autores, realizou-se a análise estatística dos resultados e criaram-se esquemas com fotografias de cada uma das características. Os resultados revelam que as características pélvicas mais frequentes são o Sulco Pré-Auricular (PS) no sexo feminino (em todas as faixas etárias), e o Sulco Paraglenóide (PG) e Extensão do Tubérculo Púbico (ExTu) no sexo masculino. Mostram ainda que os indivíduos mais novos apresentam uma menor frequência de características pélvicas e menor variação entre graus, enquanto os indivíduos mais velhos apresentam o contrário e dentro destes o sexo feminino apresenta características com uma maior expressividade. Estes resultados corroboram afirmações feitas anteriormente na literatura. As características pélvicas não são exclusivas do sexo feminino, e os padrões pélvicos encontrados indicam que os homens geralmente têm padrões com três ou menos características pélvicas e mulheres podem apresentar padrões com três ou menos ou quatro ou mais características. A ausência de dados sobre paridade dos indivíduos da amostra impede a análise da relação entre os padrões pélvicos encontrados nas mulheres e a nuliparidade ou multiparidade
Infrared spectroscopy applied to the analysis of human bones with taphonomic and pathological alterations
No full textDissertação de Mestrado em Antropologia Forense apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaIn Forensic Anthropology, morphological and metric methods are used to identify individuals who may be partially or completely skeletonized, or even represented by bone fragments. The understanding of the individualizing factors, such as pathological conditions, makes it easier to achieve identification. Studies indicate alterations in the chemical and structural composition of these affected regions. Thus, it is crucial to understand whether these changes can be caused by other factors, namely taphonomic changes, or if they are exclusive to pathological conditions. This work aimed at analysing and compare the changes in the structure and chemical composition of bone tissue in samples from the 21st Century Identified Skeleton Collection (CEI/XXI) with osteolytic lesions and in samples from two medieval/modern archaeological collections, São Miguel’s Church (SM) and Castelo de Abrantes (CAST.AB), with postmortem alterations. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) was used to: assess the influence of taphonomic changes on bone tissue; to study and compare spectroscopic index (IC, BPI, C/P, Am/P e Amida I/Amida II) in samples of different types of bone (thigh bone, rib, vertebra, femur, ulna, radius, tibia, skull and mandible); to assess changes in the organic and mineral fractions of bone tissue with osteolytic lesions; and to compare samples from three different chronologies. In 60 samples, 22 from CAST.AB and 38 from the SM, it was found that there were no significant differences in both spectra and spectroscopic index between the samples with and without taphonomic alterations. However, in the modern samples from the 21st century with osteolytic lesions, there was greater intensity in the spectral bands of Amide I, Amide II and lipids compared to the samples without lesions, and a significant increase in the Am/P index (p=0,03) in the samples with osteolytic lesions (1,02 ± 0,35; n=5).The spectroscopic indices under study, IC, BPI, C/P, Am/P and Amide I/Amide II, did not vary according to the types of bone analyzed. On the other hand, these indices showed discrepant values between the 21st century samples and the archaeological samples from the 15th-16th (SM) and 17th-18th centuries (CAST.AB) (p=<0,001), which means that it is possible to use spectroscopic indices to differentiate between recent and older samples.Em antropologia forense são usados vários métodos morfológicos e métricos que visam ajudar na identificação de indivíduos que possam estar parcial ou totalmente esqueletizados ou, até mesmo, de fragmentos ósseos. O conhecimento de fatores individualizantes, como condições patológicas, permite mais facilmente alcançar a identificação. Estudos apontam para a alteração da composição química e estrutural nas regiões ósseas com lesão. Assim é crucial compreender se estas alterações podem ou não ser mimetizadas por outros fatores, nomeadamente alterações tafonómicas, ou se são exclusivas de condições patológicas. Este trabalho teve como principal objetivo analisar e comparar as modificações na estrutura e na composição química do tecido ósseo em amostras da Coleção de Esqueletos Identificados Século XXI com alterações patológicas e em amostras de duas coleções arqueológicas medievais/modernas Igreja de São Miguel (SM), Castelo Branco, e Castelo de Abrantes (CAST.AB), com alterações postmortem resultantes da quebra óssea. Recorreu-se à espetroscopia de infravermelho com transformadas de Fourier (FTIR) para: estudar e comparar índices espetroscópicos (IC, BPI, C/P, Am/P e Amida I/Amida II) em diferentes ossos (osso coxal, costela, vértebra, fémur, ulna, rádio, tíbia, crânio e mandíbula); caracterizar as alterações tafonómicas no tecido ósseo; avaliar as mudanças nas frações orgânica e mineral do tecido ósseo com lesões osteolíticas; e comparar amostras de três cronologias distintas. Nas 60 amostras analisadas, 22 de CAST.AB e 38 de SM, verificou-se que não há diferenças significativas entre os espetros e os valores dos índices espetroscópicos das amostras com e sem alterações tafonómicas. Já nas amostras mais recentes do século XXI com lesões osteolíticas, observou-se maior intensidade nas bandas espetrais da Amida I, Amida II e dos lípidos face às amostras sem lesões, e um aumento significativo no índice Am/P (p=0,03) nas amostras com lesões osteolíticas (1,02 ± 0,35; n=5).Os índices espetroscópicos em estudo, IC, BPI, C/P, Am/P e Amida I/Amida II, não variaram consoante os tipos de osso analisados. Por outro lado, estes índices apresentaram valores discrepantes entre as amostras do século XXI e as amostras arqueológicas dos séculos XV-XVI (SM) e XVII-XVIII (CAST.AB) (p=<0,001), indicando que é possível recorrer aos índices espetroscópicos para diferenciar amostras recentes de mais antigas
Exploring the impact of early-life stress on the medial orbital cortex: from neurons to microglia and back
No full textDissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA exposição ao stress durante as fases iniciais da vida (ELS), que pode assumir múltiplas formas, como abuso, negligência ou exposição a eventos traumáticos, tem-se tornado uma preocupação mundial devido aos seus impactos significativos na saúde mental e física dos indivíduos, constituindo um fator de risco importante para distúrbios neuropsiquiátricos tanto durante a infância como na idade adulta. A investigação nesta área tem demonstrado que o stress precoce pode perturbar vários sistemas fundamentais, incluindo domínios comportamentais, neuronais e até imunológicos. Este trabalho teve como objetivo investigar as consequências deste tipo de stress no neurodesenvolvimento, focando-se particularmente no circuito inibitório do córtex orbital medial (MO), uma sub-região do córtex pré-frontal medial (mPFC) envolvida na tomada de decisões, processamento de recompensas e comportamentos impulsivos.Através de uma série de testes comportamentais e análises moleculares desenvolvidas em murganhos adolescentes expostos ao protocolo de separação maternal e stress imprevisível (MSUS), demonstrámos que ELS induz respostas específicas dependentes do sexo em múltiplos domínios, muitas vezes mais acentuadas em machos, que exibem maior hiperatividade, reatividade e impulsividade. Além disso, observámos mudanças regionais específicas na população de neurónios inibitórios parvalbumina-positivos (PV+), incluindo alterações na sua atividade após uma tarefa de escolha baseada em recompensa, um aumento da sua densidade e alterações na deposição de redes perineuronais (PNN) no MO em machos expostos ao protocolo de stress. Propomos que estas alterações, que podem ser relacionadas com a perturbação dos mecanismos de eliminação neuronal mediados pela microglia durante uma janela crítica do neurodesenvolvimento que se sobrepõe ao período de exposição ao protocolo de stress, podem ser a causa da modificação observada no tónus inibitório, o que tem consequências diretas não só para o circuito local do mPFC, mas também para outras redes e sistemas conectados. Adicionalmente, o nosso estudo revelou alterações significativas nos níveis das hormonas sexuais e na expressão génica de componentes envolvidos nas suas vias de sinalização no período pós-natal, sugerindo que o stress em fases precoces interfere com a regulação hormonal fisiológica e também com a diferenciação sexual do cérebro.Os nossos resultados sublinham a complexa interação entre ELS e o neurodesenvolvimento, destacando a necessidade de compreender as diferenças sexuais em respostas a este tipo de stress. Embora seja necessário aprofundar este estudo, ao explorar os mecanismos subjacentes aos fenótipos comportamentais induzidos pelo stress, este trabalho contribui para elucidar e ajudar a esclarecer a base neurobiológica dos distúrbios psiquiátricos relacionados com o stress, abrindo caminho para intervenções e estratégias terapêuticas direcionadas.Early-life stress (ELS), encompassing experiences such as abuse, neglect, or exposure to traumatic events, has emerged as a widespread public health concern, with significant impacts on mental and physical health and constituting a major risk factor for the development of neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders, both during childhood and adult life. Studies have reported that ELS can disrupt different fundamental domains, including behavioral, neuronal, and even immunological systems. This study aimed to investigate the neurodevelopmental consequences of ELS, particularly focusing on the intrinsic inhibitory circuit of the medial orbital cortex (MO), a subregion of the medial prefrontal cortex (mPFC) implicated in decision-making and reward-processing.Through a series of behavioral and molecular analyses performed in adolescent mice exposed to the maternal separation and unpredictable stress (MSUS) protocol, we demonstrated that ELS induces sex-specific responses in multiple domains, with male mice exhibiting heightened hyperactivity, reactivity, and impulsivity. Furthermore, we observed region-specific changes in the parvalbumin-positive (PV+) inhibitory neuronal population, including altered activity following a reward-driven decision-making task, increased density of PV+ neurons in the MO of MSUS-exposed males, as well as changes in perineuronal network (PNN) deposition. We hypothesize that these changes, which can be correlated with disrupted microglial pruning mechanisms during a critical developmental window that overlaps with the MSUS period, can be the root cause of the previously observed shift in local inhibitory tonus, having the potential to impact not only the PFC circuit but also connected networks and systems. In addition, our study also revealed significant alterations in sexual hormone levels and expression of hormone metabolism-related genes during early-life, suggesting that ELS interferes with normal hormonal regulation and brain sexual differentiation.Our results underscore the complex interplay between ELS and neurodevelopment, highlighting the necessity of understanding sex differences in response to early stressors. Although further research is required, by elucidating the underlying mechanisms of ELS-induced behavioral phenotypes, this work contributes to the broader discourse on the neurobiological basis of stress-related psychiatric disorders, paving the way for targeted interventions and therapeutic strategies.FCTFCTFCTFCTFC
Cellular and molecular pathogenic mechanisms triggered by anti-CASPR1 autoantibodies
No full textDissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaThe significant increase in autoimmune diseases had prompted intensive research into their pathogenic mechanisms. In the last decade, Contactin-associated protein 1 (CASPR1) has been identified as a self-antigen in debilitating cases of chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP) and Guillain-Barré syndrome (GBS), and very recently autoantibodies against CASPR1 (CASPR1-Abs) were found in a CIDP patient with central nervous system (CNS) symptoms such as memory loss. Since then, CASPR1-Abs have been predominantly characterized in the peripheral nervous system (PNS) of patients presenting with nerve diseases. In this study, CNS implications of CASPR1-Abs antibodies were explored, addressing a critical gap in understanding the full spectrum of their effects. Based on previous evidence of CASPR1-mediated regulation of excitatory synapses in the brain, especially in the hippocampus, it was hypothesized that CASPR1-Abs invade the brain to disrupt these functions, generating possible CNS symptoms which are currently unknown.Herein, it was found that CASPR1-Abs bind to and are internalized by rat hippocampal neurons. Further, these antibodies induced pre-synaptic deficits in excitatory synapses, particularly reducing vesicular glutamate transporter 1 (VGluT1) expression. Additionally, CASPR1-Abs triggered alterations in neuronal excitability, neuronal firing profile, and network connectivity.This study underscores the necessity of considering CNS involvement in CASPR1-associated neuropathies and highlights the implications of these antibodies beyond the dysfunction of myelinated fibers in the PNS. Further functional investigations are required to elucidate the complete impact of CASPR1-Abs on neuronal excitability and network activity. These insights offer the first comprehensive analysis of the molecular mechanisms underlying CASPR1-Abs effects in the brain, calling the attention of clinicians to screen for CNS involvement in CASPR1-associated neuropathy.O aumento significativo das doenças autoimunes levou a uma pesquisa intensiva sobre seus mecanismos patogênicos. Na última década, a proteína associada à contactina 1 (CASPR1) foi identificada como um autoantígeno em casos debilitantes de polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP) e síndrome de Guillain-Barré (GBS). Recentemente, autoantianticorpos contra a CASPR1 (CASPR1-Abs) foram encontrados em um paciente com CIDP que apresentava sintomas no sistema nervoso central (SNC), como perda de memória. Até então, CASPR1-Abs foram predominantemente caracterizados no sistema nervoso periférico (SNP) de pacientes com doenças nervosas. Neste estudo, foram exploradas as implicações dos CASPR1-Abs no SNC, abordando uma lacuna crítica na compreensão do espectro completo de seus efeitos. Com base em evidências anteriores da regulação mediada pela CASPR1 de sinapses excitatórias no cérebro, especialmente no hipocampo, foi hipotetizado que os CASPR1-Abs invadem o cérebro para perturbar essas funções, gerando possíveis sintomas no SNC atualmente desconhecidos.Neste estudo, foi descoberto que os CASPR1-Abs se ligam e são internalizados por neurônios do hipocampo de ratos. Além disso, esses anticorpos induziram déficits pré-sinápticos em sinapses excitatórias, particularmente reduzindo a expressão do transportador vesicular de glutamato 1 (VGluT1). Adicionalmente, os CASPR1-Abs desencadearam alterações na excitabilidade neuronal, no perfil de disparo neuronal e na conectividade da rede.Este estudo destaca a necessidade de considerar o envolvimento do SNC nas neuropatias associadas à CASPR1 e ressalta as implicações desses anticorpos para além da disfunção das fibras mielinizadas no SNP. Investigações funcionais adicionais são necessárias para elucidar o impacto completo dos CASPR1-Abs na excitabilidade neuronal e na atividade da rede. Esses insights oferecem a primeira análise abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos dos CASPR1-Abs no cérebro, chamando a atenção dos clínicos para a considerarem o envolvimento do SNC nas neuropatias associadas à CASPR1.FCTFCTFC
Desenvolvimento de uma Vacina Terapêutica para a Hepatite B: design de um protótipo particulado multicomponente para imunomodulação
No full textTese de Doutoramento em Ciências Farmacêuticas apresentada à Faculdade de FarmáciaTo achieve the ambitious goal of eradicating HBV as a public health threat by 2030, novel strategies encompassing therapeutic measures are imperative. Unlike prophylactic HBsAg vaccines, an effective therapeutic vaccine for CHB necessitates the induction of a robust Th1-biased immune response. In this context, concerted efforts are necessary to develop adjuvants capable of augmenting the immunogenicity of therapeutic HBV vaccines. Particularly for HBV, the choice of adjuvant is critical, as it dictates the induction of a robust and enduring immune response essential for sustained control of the infection. Our primary objective is to establish innovative strategies integrating diverse antigens, adjuvants, vaccination schedules, and administration routes. This approach aims to significantly enhance the immune response against HBV, representing a notable advancement in vaccine research for chronic viral infections. Our research provided valuable insights into the intricate interplay between hepatic immune checkpoint regulation and the progression of CHB. When expressed, PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, Gal-9, CD272, TIGIT, and 2B4 predominantly localized in portal tracts and sinusoids. Furthermore, we identified a correlation between the expression levels of PD-1, TIM-3, and Gal-9 and ALT levels in CHB patients. Overall, our findings underscored the significance of the Tim-3:Gal-9 pathway in the immunopathogenesis of CHB.Through our investigation, we have shed light on the advantageous properties of biopolymer-based adjuvant systems, specifically glucan particles (GPs) and glucan nanoparticles (Glu 130 and Glu 355 NPs). Notably, GPs and Glu 355 NPs exhibited significant interaction with the Dectin-1 receptor. Furthermore, the stimulation of dendritic cells by Glu 355 NPs resulted in phenotypic and functional maturation. Using autologous mixed lymphocyte reaction, we unveiled substantial rates of lymphocyte proliferation. These findings hold promise for the development of novel natural polymeric vaccination strategies, contributing to advancements in vaccine research.Despite the potential of GPs, rigorous risk assessment is imperative. This thesis undertook a full characterization of GPs, focusing on their physicochemical attributes, biocompatibility, and immunomodulatory potential. Notably, GPs exhibited biocompatibility by eliciting no cytotoxicity or hemolysis. GPs induced cytokine secretion, indicative of their adjuvant potential, and were internalized by monocytes. GPs encapsulating HBsAg, HBcAg, and the TLR7 agonist CL097 elicited distinct cellular immune responses in mice. By assessing their immunotoxicological profile, this thesis underscores the importance of conducting thorough biocompatibility assessments of particles intended for the medical field.In our pursuit of developing enhanced therapeutic vaccines against CHB, this thesis designed and evaluated a dual antigen vaccine administered via subcutaneous and oral routes, encapsulated within GPs containing CL097. Biodistribution studies confirmed the liver accumulation of GPs post oral administration. GP-hepatocyte interactions unveiled that GPs induced heightened production of reactive oxygen species in HepG2. Vaccination studies employing GPs encapsulating HBsAg, HBcAg, and CL097 evoked a robust cellular immune response characterized by augmented cytotoxic T cell functions, cytokine production, antigen-specific antibody titers, spleen cell proliferation and hepatic IFN-γ levels. Overall, this innovative strategy boosted the immune response against HBV, marking a significant leap forward in vaccine research for CHB.Lastly, we delved into the design and evaluation of a subcutaneously administered therapeutic vaccine targeting HBcAg, encapsulated within GPs, alongside novel adjuvants. This approach integrated CL097 and extracellular vesicles (EVs) derived from Giardia lamblia, introduced here as novel adjuvant. The incorporation of CL097 or Giardia EVs augmented and modulated the immunostimulatory properties of GPs-based vaccines. This led to the promotion of dendritic cell maturation and polarization of macrophages towards an M1 phenotype. These formulations induced robust Th1 immune responses, characterized by heightened production of antigen-specific antibodies and pro-inflammatory cytokines, alongside increased hepatic IFN-γ levels. The development of novel therapeutic strategies focusing on revitalizing the immune system is paramount. Advancements in adjuvant development are essential for modulating the immunostimulatory effects of therapeutic vaccines and achieving a "functional" cure for HBV.Overall, the work presented in this thesis represents a significant contribution to the understanding of innovative strategies combining different adjuvants and immunostimulatory molecules. The investigations conducted herein have successfully addressed primary objectives and provided novel insights into the fields of vaccinology and adjuvant research.Para alcançar o objetivo de erradicar o Vírus da Hepatite B (VHB) como uma ameaça à saúde pública até 2030, estratégias inovadoras que abranjam medidas terapêuticas são essenciais. Ao contrário das vacinas profiláticas de HBsAg, uma vacina terapêutica eficaz para a Hepatite B Crónica (HBC) exige a indução de uma resposta imune robusta, com viés Th1. Nesse contexto, são necessários esforços para desenvolver adjuvantes capazes de aumentar a imunogenicidade das vacinas terapêuticas contra o VHB. Escolher o adjuvante adequado é fundamental, pois ele dita a indução de uma resposta imune robusta e duradoura, essencial para o controlo da infeção. O nosso objetivo principal é estabelecer estratégias inovadoras que integrem diversos antigénios, adjuvantes, esquemas de vacinação e vias de administração. Essa abordagem visa aumentar a resposta imune contra o VHB, representando um avanço na procura de vacinas para infeções virais crónicas. Os nossos resultados forneceram novos dados sobre a interação entre a regulação dos checkpoints imunológicos e a progressão da HBC. Quando expressos, PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, Gal-9, CD272, TIGIT e 2B4 localizavam-se predominantemente em zonas portais e sinusoides. Além disso, identificámos uma correlação entre os níveis de expressão de PD-1, TIM-3 e Gal-9 e os níveis de ALT em pacientes com HBC. Os nosso resultados destacaram a importância da via Tim-3:Gal-9 na HBC.Através dos nossos resultados, confirmámos as propriedades vantajosas de sistemas adjuvantes à base de biopolímeros, especificamente partículas de glucano (GPs) e nanopartículas de glucano (Glu 130 e Glu 355 NPs). GPs e Glu 355 NPs exibiram interação significativa com o recetor da Dectina-1. Além disso, a estimulação de células dendríticas pelas Glu 355 NPs resultou numa maturação fenotípica e funcional. Usando a reação mista de linfócitos autóloga, revelámos taxas substanciais de proliferação de linfócitos. Estes resultados são promissores para o desenvolvimento de estratégias de vacinação inovadoras, contribuindo para os avanços na investigação de vacinas. Apesar do potencial das GPs, uma avaliação de riscos rigorosa é necessária. Esta tese realizou uma caracterização das GPs, focando-se nos seus atributos físico-químicos, biocompatibilidade e potencial imunomodulatório. As GPs exibiram biocompatibilidade ao não provocar citotoxicidade ou hemólise. As GPs induziram a secreção de citocinas, mostrando o seu potencial adjuvante, e foram internalizadas por monócitos. HBsAg, HBcAg e o agonista TLR7, CL097, encapsulados dentro de GPs levaram a respostas imunes celulares distintas em murganhos. Ao avaliar o seu perfil imunotoxicológico, esta tese destaca a importância de conduzir avaliações de biocompatibilidade de partículas destinadas ao uso médico. Ao desenvolver vacinas terapêuticas contra a HBC, esta tese projetou e avaliou uma vacina dupla administrada por vias subcutânea e oral, encapsulada em GPs contendo CL097. Os estudos de biodistribuição confirmaram a acumulação hepática de GPs após administração oral. Interações GP-hepatócito revelaram que as GPs induzirem uma produção aumentada de espécies reativas de oxigênio em HepG2. Estudos de vacinação com GPs encapsulando HBsAg, HBcAg e CL097 provocaram uma resposta imune celular robusta caracterizada por funções aumentadas de células T citotóxicas, produção de citocinas, títulos de anticorpos específicos do antígeno elevados, proliferação de células do baço e níveis hepáticos de IFN-γ aumentados. Esta estratégia inovadora impulsionou a resposta imune contra o VHB, marcando um avanço significativo na investigação de vacinas para a HBC. Por fim, focámo-nos no desenho e avaliação de uma vacina terapêutica administrada por via subcutânea com o HBcAg encapsulado em GPs, juntamente com adjuvantes inovadores. Esta abordagem integrava CL097 e vesículas extracelulares (EVs) derivadas de Giardia lamblia. A incorporação de CL097 ou EVs de Giardia aumentaram as propriedades imunomoduladoras das vacinas utilizadas. Estas vacinas levaram à maturação de células dendríticas e à polarização de macrófagos para um fenótipo M1. Essas formulações induziram respostas imunes Th1 robustas, caracterizadas pela produção aumentada de anticorpos específicos do antigénio e citocinas pró-inflamatórias, juntamente com o aumento dos níveis hepáticos de IFN-γ. O desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras focadas em revitalizar o sistema imunológico é primordial. Avanços no desenvolvimento de adjuvantes são essenciais para controlar os efeitos imunomoduladores de vacinas terapêuticas e alcançar uma "cura funcional" para o VHB. Concluindo, o trabalho apresentado nesta tese representa uma contribuição significativa para a compreensão de estratégias inovadoras que combinam diferentes adjuvantes e moléculas imunomoduladoras. Os resultados obtidos confirmam que os objetivos foram alcançados e forneceram uma nova visão sobre a investigação em vacinas e adjuvantes para a VHB.FC
Quando a Química e a Antropologia se Encontram: Tafonomia e Lesões Traumáticas em Ossos Queimados
No full textTese de Doutoramento em Antropologia apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaThe analysis of human skeletal remains provides very important biocultural information since the skeleton is the result of biological and socio-cultural dimensions and must therefore be understood as such. Often, human skeletonized remains have been subjected to high temperatures, originating from a variety of different circumstances both intentional and accidental (e.g., forest fires, traffic accidents, terrorist attacks, armed conflicts, funeral practices, homicide, or body disposal). High temperatures can promote very intense alterations in bones, both in micro- and macroscopical aspects, such as in bones’ dimensions, mass, colouration, chemical composition and molecular structure. Burned bones can also present warping and heat-induced fractures. All these changes make the anthropological analysis of these remains extremely challenging, and interpretations can be less reliable. These can have a great impact both in forensic and archaeological scenarios, affecting procedures such as the biological profile estimation, the estimation of the postmortem interval, or the analysis of anatomical variations, pathologies, and traumatic lesions. With that in mind, this PhD project was developed to explore how different circumstances and variables can affect burned bones. This project encompasses three different experiments, focusing on macroscopical and chemical changes in bones exposed to high temperatures in a variety of circumstances. The first experiment aimed to determine potential causes of unusual colouration changes usually observed in burned bone that can result from contact with a variety of exogenous chemicals and materials during heat-exposure. To accomplish this, fresh human clavicles provided by INMLCF (Portuguese National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences), dry human clavicles from the Unidentified Skeletal Collection of Capuchos Cemetery (CC_NI), and pig ribs were experimentally burned at 500 °C, 700 °C, 900 °C, and 1100 °C in contact with iron, zinc, manganese, chalk, polyester cloth and copper wire and later analysed using spectrophotometry, Fourier-transform Infrared Spectroscopy in attenuated total reflectance mode (FTIR-ATR) and X-ray Fluorescence (XRF). The second experiment aimed to determine if sharp instruments leave detectable chemical traces in unburned and burned bone. The samples used to accomplish this aim had the same origin as for the previous experiment. Sharp force traumas were experimentally inflicted to these bone samples with five different types of sharp instruments (a stainless-steel kitchen knife, a ceramic kitchen knife, an artisanal kitchen knife, a small axe and a big axe). Bone samples were then analysed using XRF and FTIR-ATR, both before and after burning (at 500 °C, 700 °C, 900 °C, and 1100 °C). The third presently reported experiment aimed to investigate possible diachronic post-depositional variation, in both burned and unburned bones and teeth, regarding mass, metric and chemical alterations. This was achieved by regularly exhuming and recording the changes of burned (500 °C, 900 °C, and 1050 °C) and unburned bones (CC_NI) and teeth from the Identified Dental Collection from the Laboratory of Forensic Anthropology (CDI), which were experimentally inhumed in 2015 in the scope of an MSc Dissertation. The results obtained in these experiments showed that: 1) Fe, Mn, Cu and Zn affect burned bone colouration and, although CaO and a polyester cloth did not affect the colouration manifested by burned bone, they did affect the corresponding FTIR-ATR or XRF spectra; 2) XRF can potentially be very useful in the identification of sharp instruments traces, aiding in the distinction between sharp force trauma and heat-induced fractures; and 3) teeth, trabecular and cortical bone tissue are affected differentially by heat and inhumation, cortical bone tissue apparently being the most useful for the analysis of skeletal remains that have been both buried and exposed to high temperatures, although all provide complementary information. By applying three pilot studies in a still very underexplored area, this project allowed to delve deeper into some of the plethora of variables that can affect burned bones and shed light on the potential of FTIR-ATR and XRF when applied to burned skeletal remains.A análise de restos humanos queimados permite obter informação biocultural muito importante já que o esqueleto resulta tanto de dimensões biológicas como socioculturais e deve, portanto, ser entendido de uma forma holística. É comum que os restos esqueléticos humanos sob análise tenham sido expostos a temperaturas elevadas, que resultaram de uma variedade de circunstâncias, tanto intencionais, como acidentais (e.g., incêndios florestais, acidentes de viação, ataques terroristas, conflitos armados, práticas funerárias, homicídios ou ocultação de cadáveres). A exposição a temperaturas elevadas pode promover alterações muito intensas nos ossos, tanto em aspetos microscópicos como macroscópicos, nomeadamente nas dimensões, massa, coloração, composição química e estrutura molecular. Os ossos queimados podem ainda apresentar deformações e fraturas térmico-induzidas. Estas alterações tornam a análise antropológica extremamente desafiante, criando problemas de interpretação. Estes podem ter grande impacto tanto em cenários forenses como arqueológicos, afetando procedimentos tais como a estimativa do perfil biológico, a análise de variações anatómicas e de patologias, a estimativa do intervalo pós-morte ou a análise de lesões traumáticas. Assim, este projeto de doutoramento foi desenvolvido com vista a explorar diferentes circunstâncias e variáveis que podem ser afetadas pelo facto de os ossos estarem queimados. Foram realizadas três experiências distintas, que se focam em alterações macroscópicas e químicas, em ossos expostos a temperaturas elevadas em diferentes circunstâncias. A primeira experiência teve como objetivo determinar potenciais causas de alterações cromáticas invulgares observadas em ossos queimados em contacto com substâncias químicas e materiais exógenos. Para cumprir com este objetivo, clavículas humanas frescas providenciadas pelo INMLCF (Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses), clavículas humanas secas da Colecção de Esqueletos Não Identificados do Cemitério dos Capuchos (CC_NI) e costelas de porco formam sujeitas a queimas experimentais a 500 °C, 700 °C, 900 °C, e 1100 °C em contacto com ferro, zinco, manganês, cal, tecido de poliéster e fio de cobre. Posteriormente, estas amostras foram analisadas utilizando espetrofotometria, espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier em modo de Refletância Total Atenuada (FTIR-ATR) e fluorescência de raios-X (XRF). A segunda experiência teve com objetivo determinar se instrumentos metálicos cortantes deixam vestígios químicos detetáveis em ossos queimados e não queimados. As amostras utilizadas para esta experiência tiveram a mesma origem que as usadas na experiência anterior. Utilizando cinco instrumentos cortantes diferentes (uma faca de aço inoxidável, uma faca de cerâmica, uma faca artesanal, um machado pequeno e um machado grande), foram causados traumas cortantes nestas amostras, que foram posteriormente analisadas utilizando FTIR-ATR e XRF, antes e depois da exposição ao calor (a 500 °C, 700 °C, 900 °C e 1100 °C). A terceira experiência teve como objetivo investigar possíveis variações diacrónicas pós-deposicionais, tanto em ossos queimados (500 °C, 900 °C e 1050 °C) como não queimados, no que toca à massa, e a alterações métricas e/ou químicas. Com este fim foram feitas exumações regulares a ossos da CC_NI e a dentes da Coleção Dentária Identificada do Laboratório de Antropologia Forense (CDI), que foram experimentalmente inumados em 2015 no âmbito de uma dissertação de mestrado. Durante estas exumações, as alterações observadas foram documentadas. Os resultados obtidos nestas experiências mostraram que: 1) o Fe, o Mn, o Cu e o Zn afetam as colorações térmico-induzidas, e apesar da presença de CaO e/ou de tecido de poliéster não afetarem a coloração manifestada pelos ossos queimados, ambos foram detetados por FTIR-ATR e XRF; 2) o XRF tem grande potencial para a identificação de vestígios de instrumentos cortantes, auxiliando na distinção entre traumatismos cortantes e fraturas térmico-induzidas; e 3) os dentes, o tecido ósseo trabecular e o tecido ósseo cortical são afetados de forma diferente pela exposição ao calor e pela inumação, sendo que a melhor abordagem analítica utilizando FTIR-ATR e XRF consiste em, sempre que possível, priorizar o tecido ósseo cortical, embora os três providenciem informação complementar. Através da realização destes três estudos piloto, numa área ainda pouco explorada, este projeto pretende aprofundar o conhecimento relativamente a algumas das muitas variáveis que podem afetar os ossos queimados e lançar alguma luz sobre o potencial analítico das técnicas de FTIR-ATR e de XRF.FC
FORENSICS EXPERTIES APPLIED TO THE HUMAN RIGHTS
No full textRelatório de Estágio do Mestrado em Medicina Legal e Ciências Forenses apresentado à Faculdade de MedicinaForensic experiments applied to human rights were at the heart of this internship report, addressed through various scientific activities covering the biological and forensic analysis of bones, including the identification of people through information such as age, gender, age progression and forensic facial reconstruction at the Institute of Forensic Medicine in Parma, Italy.A study was also carried out on femicide, the aim of which was to identify and analyze the circumstances of women's deaths throughout the country (Italy), through an analysis of data from 1080 cases and based on two scientific articles. As a result, various characterizing elements were obtained, such as age, relationship with the aggressor(s), cause of death, motive for death, location, number of injuries and region of injuries, and whether the aggressor was under the influence of alcohol or drugs and determining whether each of these cases from the parameters mentioned above was a femicide or not.The statistical and clinical pattern of cases suggests that femicide is not an isolated event, but the result of a set of factors such as gender inequality and the cycle of violence. In view of the above, we are faced with a high number of cases of violent deaths of women, influenced by a number of factors, including the age of the victim, her relationship with the aggressor, substance use and the location of the incident.The research aimed not only to map the extent of this phenomenon, but also to understand the dynamics that characterize gender violence and provide a universally accepted definition of the term, thus contributing to the development of effective strategies to prevent and combat femicide in Italy.As experiências forenses aplicadas aos direitos humanos foram o cerne do presente relatório de estágio, abordadas através de várias atividades científicas que abrangem a análise biológica e forense de ossos, incluindo a identificação de pessoas através de informações como a idade, género, progressão de idade e reconstrução facial forense no Instituto de Medicina Legal de Parma, em Itália.Foi, ainda, desenvolvido um estudo sobre o feminicídio, cujo objetivo assentou em identificar e analisar as circunstâncias da morte de mulheres em todo o país (Itália), através de uma análise de dados de 1080 casos e com base em dois artigos científicos. Como resultado, obtiveram-se vários elementos caracterizadores, tais como idade, relação com o agressor(es), causa de morte, motivo da morte, localização, número de lesões e região das lesões, e se o agressor estava sob o efeito de álcool ou drogas e determinando se cada um destes casos a partir dos parâmetros mencionados anteriormente se tratava de feminicídio ou não.O padrão estatístico e clínico dos casos sugere que o feminicídio não é um evento isolado, mas o resultado de um conjunto de fatores como a desigualdade de género e o ciclo de violência. Em face ao exposto, estamos perante um elevado número de casos de mortes violentas de mulheres, influenciados por uma série de fatores, incluindo a idade da vítima, a sua relação com o agressor, o consumo de substâncias e o local do incidente.A pesquisa visou não só mapear a extensão deste fenómeno, mas também entender as dinâmicas que caracterizam a violência de género e fornecer uma definição universalmente aceite do termo, contribuindo assim para o desenvolvimento de estratégias eficazes de prevenção e combate ao feminicídio na Itália