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Development of ligands and chemical tools for functionnal proteomics
No full textL'objectif majeur de ce travail était de développer des sondes « site-actif » dérivées d'inhibiteurs, comportant des modules chimiques fonctionnels biocompatibles de type photo-liaison, couplage par réaction bio-orthogonale, clivage chimique et module de purification par affinité pour des applications en protéomique. Les applications sont multiples et permettent entre autres de réaliser des études d'identification de complexes moléculaires actifs et de déconvolution de cibles thérapeutiques. Le travail réalisé porte sur la validation de ces modules chimiques au travers de l'étude d'une topoisomérase bactérienne de type II (l'ADN gyrase) et de son inhibiteur antibiotique naturel (la
novobiocine) avec la perspective de développer divers types de sondes site actif ciblant d'autres familles d'enzymes.
Dans un premier temps une sonde a été développée et une analyse qualitative des chimies de couplage de type cycloaddition de Huisgen et ligation de Staudinger (biocompatibilité, spécificité, efficacité) a été réalisée. Puis cette sonde équipée d'un module clivable azobenzène a ensuite permis de réaliser en condition non dénaturante la purification des complexes impliquant ·la gyrase B et la déconvolution des cibles de la novobiocine chez Escherichia coli. Enfin, le travail réalisé sur le couple gyrase/novobiocine permis d'initier le développement d'une
nouvelle étiquette de purification de complexes basée sur le domaine minimal de fixation de la novobiocine. Le développement d'une sonde ciblant les protéines histones désacétylases a également été entrepris.The major goal of this work was to develop a site specifie probe derived from inhibitors, contammg functional chemical and biocompatible modules (photo-labelling, bio orthogonalligation, chemical cleavage, affinity purification) for proteomic applications. The applications are multiple and would allow identification of protein partners in molecular complexes or target deconvolution studies. The work achieved concems the validation of these chemical modules through the study of a type II bacterial topoisomerase (DNA gyrase) and its antibiotic inhibitor (novobiocin) with the prospect at developing site specific probes targeting other enzyme families. First a probe was developed and a qualitative analysis of the bioorthogonal ligation reaction called Huisgen's cycloaddition was performed to compare to the Staudinger ligation. The biocompatibility, the specificity and the efficiency were analysed. The probe was then equipped with an azobenzene cleavable module and was used to purify (under non-denaturing conditions) multiprotein complexes containing gyrase B and achieve target deconvolution of novobiocin on Escherichia coli. Finally the work done on the gyrase B/novobiocin was used to initiate the development of a new
purification tag that can be used for complex enrichment. A probe targeting HDAC proteins has also been developed
Study of statins effects on mitochondrial function in cardiac and skeletal muscles
No full textLes statines sont des médicaments très efficaces dans le traitement de l’hypercholestérolémie. Cependant, elles entraînent des effets délétères qui se traduisent par l’apparition de douleurs musculaires. Il a été clairement établi que la mitochondrie était une cible privilégiée des statines et était la principale source des radicaux libres. Cependant, aucune étude n’a été consacrée sur l’effet de statines sur cette production de radicaux libres. La première partie de ma thèse a démontré que, in vitro, l’atorvastatine diminue la respiration mitochondriale musculaire, quel que soit le phénotype, et augmente la production de ROS. Par contre, un entraînement en endurance prévient ces effets délétères sur les muscles squelettiques. Par ailleurs, nous avons démontré que, sur des rats traités chroniquement avec l’atorvastatine, les capacités d’endurance sont diminuées. La seconde partie de ma thèse a montré que ces statines agissent selon le concept du « mitohormesis ». En effet, elles entraînent dans le muscle squelettique une augmentation importante de radicaux libres débordant le système antioxydant et entraînant une désactivation de la biogenèse mitochondriale et une altération des capacités oxydatives musculaires. Par contre, dans le cœur où les capacités antioxydantes sont importantes, elles entraînent une augmentation modérée des ROS qui permet l’activation de voies de signalisation menant à la biogenèse mitochondriale. Ces travaux ont permis de comprendre pourquoi et comment les statines agissaient différemment dans le cœur et les muscle squelettiques et d’ouvrir des pistes dans le traitement des douleurs musculaires suite à un traitement avec des statines.Statins is very effective drugs in the treatment of hypercholesterolemia. However, statins induced deleterious effects including muscular pains. It was clearly established that mitochondria were a privileged target of statins and were the principal source of free radicals. However, no study concerned the effect of statins on this ROS production. The first part of my thesis demonstrated that in vitro, atorvastatin decreased mitochondrial respiration whatever the phenotype and increased the ROS production. On the other hand, a chronically endurance training decreased these deleterious effects in skeletal muscles. Besides, we demonstrated that on treated rats chronically with atorvastatin, the endurance capacities decreased. The second part of my thesis showed that statins acted according to the concept of “mitohormesis”. Indeed, statins induced in glycolytic muscle an important increase of ROS extending beyond the antioxidant system inducing a deactivation of the mitochondrial biogenesis and a decrease of muscular oxidative capacities. On the other hand, in the cardiac muscle where the antioxidant capacities are important, statins induced a moderate increase of ROS which allowed to the activation of the mitochondrial biogenesis.
These works allowed understanding why and how statins acted differently in cardiac and skeletal muscles and opening perspectives in the treatment of the muscular pains following a treatment with statins
Transcriptional control of expression of the Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP) gene
No full textThymic stromallymphopoietin (TSLP), le régulateur principal de l'inflammation allergique, est fortement exprimé dans la dermatite atopique de l'homme (AD) des lésions cutanées, et plusieurs éléments de preuve ont démontré que l'expression TSLP est à la fois nécessaire et suffisante pour induire une inflammation atopique chez la souris. Des études antérieures de notre laboratoire ont suggéré que les récepteurs nucléaires (NR) RXRa, RXR~, VDR et RAR peuvent être différemment régulant l'expression de TSLP dans l'épiderme de la souris, en fonction de la relance. Mon travail de thèse démontre expérimentalement que, dans des conditions physiologiques, promoteur TSLP reste réprimées par les hétérodimères NR sans ligand, VDR/RXRa et/ou
RARy/(RARa)/RXR~. Cette répression peut être soulagée par la libération d'hétérodimères NR sans ligand ainsi
que par l'activation par des ligands agonistes de VDR et/ou RARy. En outre, j'ai caractérisé les éléments de
liaison pour NFKB, AP 1, ST AT, et des facteurs de transcription Smad, qui peut fonctionner indépendamment de
la présence de ces complexes répresseurs NR. Que les glucocorticoïdes (GC) sont des outils importants pour le traitement AD, j'ai aussi cherché à savoir si elles agissent en réprimant l'expression TSLP. Dans le processus d'analyse GC-médiation répression de la transcription de TSLP, j'ai découvert un mécanisme de GC-transrépression directe induite, qui est médiée par la liaison directe de G1ucocorticoid Receptor (GR) à un "simple" cis évolutive conservée effet négatif élément de réponse (IR nGRE). Conserves IR nGREs sont présents dans plus de 1000 souris les gènes humains orthologues, qui peut être réprimée par GC in vivo.Thymic stromal lymphopoietin (TSLP), the master regulator of allergic inflammation, is highly expressed in human atopic dermatitis (AD) skin lesions, and several lines of evidence have demonstrated that TSLP expression is both necessary and sufficient to induce atopic inflammation in mouse. Previous studies from our laboratory have suggested that Nuclear Receptors (NRs) RXRα, RXRβ, VDR and RAR may be differentially regulating the expression of TSLP in mouse epidermis, depending on the stimulus. My thesis work
experimentally demonstrates that, under physiological conditions, TSLP promoter remains repressed by the
unliganded NR heterodimers, VDR/RXRα and/or RARy/(RARα)/RXRβ. This repression can be relieved by
release of unliganded NR heterodimers as well as by activation with agonistic ligands of VDR and/or RARy.
Further, I have characterized binding elements for NFKB, AP1, STAT, and Smad transcription factors, which can
function independent of the presence of the above NR repressor complexes. As G1ucocorticoids (GCs) are important tools for AD treatment, I have also investigated whether they act by repressmg TSLP expression. In the process of analyzing GC-mediated transcriptional repression of TSLP, I have discovered a mechanism of GC-induced direct transrepression, which is mediated through the direct binding of Glucocortlcold Receptor (GR) to a "simple" evolutionary-conserved cis-acting negative response element (IR nGRE). Conserved IR nGREs are present in > 1 000 mouse/human orthologues genes, which can be repressed by
GCs in vivo
Preliminary design for port project in ecological system
No full textLes travaux de cette thèse s’intéressent au rééquilibrage des relations Homme Nature pendant l’action de conception, donc à l’intégration dans le processus de conception de la notion de bouleversement des écosystèmes par l’action de transformer et de produire. Cette recherche pose donc la question des modifications méthodologiques et organisationnelles qu’il faut engager pour réorienter le paradigme de conception. La recherche de solutions au déséquilibre croissant des relations Hommes - Nature - Ressources ne peut résider dans une approche partielle ou une résolution technique des problèmes posés par l'utilisation des ressources renouvelables (Millet, 2003). La prise en compte de l’environnement dans les actions humaines est « complexe et nécessite l’adoption de deux niveaux d’attaques : le niveau de la réflexion globale et générale d’une part, le niveau de l’action locale et spécialisée d’autre part » (Camous, in Millet, 2003).
Ces travaux s’inscrivent dans la problématique de la préservation de l’environnement et de son aménagement par une société. Il s’agit plus précisément de s’intéresser à la conception de projet d’aménagement sur un milieu écologiquement rare et menacé, ce que nous nommons sous le concept de milieux écologiquement sensibles. Il s’agit d’abord de comprendre, pourquoi, malgré le paradigme du développement durable, ces milieux sont toujours menacés et en quoi leur transformation éventuelle peut apporter un gain écologique pour la société. Plus particulièrement, nous nous intéressons à l’influence qu’exerce cette prise de conscience environnementale sur le processus de conception de l’aménagement tant du point de vue du concepteur que du point de vue de la société qui en bénéficie. Comment cette évolution conditionne l’élaboration du projet, à quels critères ce projet doit répondre pour être accepté au regard du dogme du développement durable et quelles contradictions doit-il résoudre pour arriver à sa réalisation ?
Le cas particulier traité par le travail de thèse est l’extension des plateformes portuaires sur le Rhin français.
Le travail de thèse présenté repose sur une démarche de conception de projet :
- Préliminaire : en aménagement du territoire, la phase de conception préliminaire n’est pas identifiée, c’est une phase de conception intuitive entre un commanditaire et des acteurs « techniques », alors qu’en conception de produit, c’est la phase au sein de laquelle émergent différentes stratégies et se dessinent les choix. Il s’agit de favoriser au sein du processus de conception l’émergence d’une étape formalisée dont l’objectif serait de se positionner sur les besoins du territoire et des logiques décisionnelles multi échelles qui interfèrent sur le territoire.
- D’éco-conception : au sens où l’environnement est perçu comme une valeur de développement et où la démarche se focalise sur le service que doit fournir l’objet à l’utilisateur, celui-ci jugeant de la performance du projet par rapport aux besoins d’une société dont l’objectif serait désormais de préserver l’environnement.
L’objectif de la recherche est de construire un outil de conception préliminaire pour l’aménagement d’infrastructures correspondant à un besoin de la société selon un objectif de développement durable. La démarche est systémique, s’inspire des démarches multicritères, multi-agent et d’accompagnement à la décision. Elle est cependant hybride, dans la mesure où elle associe trois briques conceptuelles visant à intégrer le système territorial au système de projet, puis à générer ses propres mécanismes de résolution de problème et enfin d’accompagner les acteurs du système de projet vers une prise de décision. La thèse est structurée en quatre chapitres dont le fil directeur est le système de projet d’aménagement [...].Industrialized societies need to change some practices in order to make an answers to environmental changes. Also, the research aims to develop an appropriate answers to the challenges. The thesis focuses on necessary évolution of practices in landscape planning, and more specially for French Rhine port projects. Territory impacting by the project has the particularity to be both strategic for the economic’s development, and both strategic for the survival of local ecosystems. That’s why is interessed on actors capacities to re-engineer the system of project, be able to open the decision-making system. The hypothèses is that introduce gouvernance practices for environmental project, its a good way to be innovative in the search for solutions. The particulary of research is the approach : the planning project design is considering like a project system. Indeed, project system consists of relations and interrelations between actors. Each agent tries to realese his own benefit :
- region's economic development is a goal to the local stakeholders project system ;
- protect ecosystems is a goal to environment defenders.
In fact, landscape planning is subject to conflicts between stakeholders, result comes from a compromise process. In mind, civil society, through the Community institutions, states, local communities, associations, projects into the defense of its environmental conditions and impact multiple scales. In form, the preservation of the environment resulted in the emergence of new legislative elements essential for the implementation of infrastructure projects. The thesis is built in response to a question from the manager of fluvialnetworks in France (VNF). VNF’s based on the paradox how to both develop alternative transport to the road, and both protect ecosystem river. The terrain of the study is that of port extensions on the Rhine in its French part, especially on alluvial ecosystems presented as the last in Europe. The Rhine is considering as an anthropo-ecological system, he is composed of subsystems, each one communicating and exchanging information only in terms of project.
Originality of the research is twice :
it considers the project as a system capable of évolution,
it explores the relationship between ideals and objectives prebuilt solutions
That’s why it proposes to focus the preliminary design stage, as a resource, consisting of Tools, to resolve conflicts between stakeholders and conflicting objectives. Specifically, the thesis was the proposal of a preliminary design process enriched the system development project, which determines the process of adding an additional stage project
Magnetism and structure of Ca3Co206 and Ca3Co409 thin films prepared by pulsed laser deposition
No full textCette thèse porte sur l'étude des propriétés structurales et magnétiques des couches minces de cobaltite de types Ca3C0206 et Ca3C0409 déposées par ablation laser pulsée sur des substrats d'AI20 3(OOl). Ce travail a d'abord consisté en l'élaboration de couches minces polycristallines de Ca3C0206 et épitaxiées de Ca3C0409. En ce qui concerne la cobaltite Ca3C0206, on a pu déterminer la valeur du gap optique et qui est en accord avec les valeurs obtenues par des études théoriques. Le résultat le plus original est qu'on a démontré que les propriétés magnétiques sont très sensibles à la taille des échantillons. On note que les plateaux d'aimantation observés à 2 K dans les couches minces de Ca3C0206 disparaissent pour les couches fines ayant une épaisseur inférieure à 60 nm. Cette disparition des plateaux d'aimantation est accompagnée de l'apparition d'une transition magnétique additionnelle vers 45 K. Nos résultats sont incompatibles avec l'effet tunnel quantique de l'aimantation comme mécanisme à l'origine des plateaux d'aimantation, et soutiennent les prédictions des modèles Monte-Carlo. Quant aux couches minces de Ca3C0409, on a déterminé la nature et l'origine des défauts structuraux qui sont souvent observés par microscopie électronique en transmission. Ces défauts correspondent à la formation de phase parasite de CaC020 4. La formation de cette phase parasite est due à la haute température de dépôt (750°C), à la grande pression appliquée par le substrat d'AI20 3(OOl) (5.5 GPa) à travers les contraintes et à une possible non stoechiométrie locale de la cible. Ces défauts structuraux influencent les propriétés magnétiques, en réduisant le champ coercitif et l'aimantation rémanente par rapport à ceux du Ca3C0409 massif.This thesis focuses on the study of structural and magne tic properties of Ca3C0206 and Ca3C0409 thin films deposited by pulsed laser deposition on Alz03(001) substrates. This work initially involved the elaboration of polycrystalline Ca3C0206 and epitaxial Ca3C0409 thin films. Regarding the Ca3C0206 cobaltite, we were able to determine the value of the optical band gap, which is in agreement with the values obtained by theoretical studies. More interestingly, we have
demonstrated that the magnetic properties are very sensitive to sample size. The magnetization plateaus observed at 2 K in Ca3C0206 thin films disappear for thin films with a thickness below 60 nm. This disappearance of the magnetization steps is accompanied by the appearance of an additional magnetic transition around 45 K. Our results are inconsistent with the quantum tunneling of magnetization as a mechanism for the origin of magnetization plateaus, and support more the predictions of Monte Carlo based models. For the Ca3C0409 films, we have determined the nature and the origin of structural defects that are often observed by transmission electron microscopy. These defects are constituted of the CaC020 4 parasitic phase. The formation of this spurious phase is due to the high deposition temperature (750 oC), the high pressure applied by the AI20 3(OOl) substrate (5.5 GPa) and the possibility of a local non-stoichiometry of the target. These structural defects affect the magne tic properties, by reducing the coercivity and remanent magnetization with respect to those of the Ca3C0409 bulk samples
Epigenetic alterations and role of the transcription factor UHRF1 in host cells infected with Toxoplasma gondii.
No full textLa toxoplasmose, pathologie due à un parasite, Toxoplasma gondii, est l’une des infections les plus fréquentes en France:environ 50 % de la population adulte est infectée et on estime que 200 000 à 300 000 nouvelles infections surviennent chaque année dont 15 à 20 % sont symptomatiques. La gravité de l’infection est liée au risque de transmission fœtale du parasite en cas de contamination en cours de grossesse et au risque différé de réactivation sous l’effet d’une immunodépression. Il n’existe aucun traitement efficace visant les formes intracellulaires du parasite et aucun vaccin. T.gondii est un parasite intracellulaire obligatoire qui interfère avec les voies de signalisation moléculaires des cellules-hôtes et altère de nombreux phénomènes physiologiques comme la différenciation, l’apoptose et la prolifération. Le facteur de transcription UHRF1 (Ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1) est un des principaux régulateurs du cycle cellulaire. Il présente des propriétés de « methyl-CpG-binding protein » qui lui confère un rôle crucial dans la réplication du code épigénétique lors de la prolifération cellulaire. Les mécanismes moléculaires par lesquels le parasite agit sur la cellule-hôte restent peu connus. Nous avons observé que l’infection par T.gondii conduit à une inhibition de la prolifération des cellules-hôtes due à un arrêt du cycle cellulaire en phase G2. Ceci s’accompagne d’une diminution d’expression de la cycline B et d’une forte augmentation d’UHRF1 dans les cellules-hôtes. L’inhibition d’UHRF1 par des SiRNA induit une baisse significative de la croissance parasitaire. Nous avons observé une augmentation de liaison d’UHRF1 au promoteur de la cycline B au cours de l’infection par T. gondii. UHRF1 pourrait donc être responsable de la répression du gène de la cycline B conduisant à l’arrêt du cycle cellulaire. T.gondii est un parasite unique, capable de moduler l’expression des gènes en interférant avec deux modifications épigénétiques importantes que sont la méthylation et la modification des histones. Or UHRF1 est un facteur de transcription qui relie ces deux modifications épigénétiques. Ceci ferait d’UHRF1 un outil puissant qui permettrait au parasite d’exploiter le génome de la cellule-hôte. L’activation d’UHRF1 ferait intervenir le facteur de transcription NF-kB et un facteur parasitaire issu des rhoptries.Toxoplasmosis, caused by a parasite, Toxoplasma gondii, is one of the most common infections in France:about 50% of the adult population is infected and it is estimated that 200,000-300,000 new infections occur each year, 15-20% which are symptomatic. The severity of infection is due to the risk of fetal transmission of the parasite in cases of infection during pregnancy and the risk of reactivation in the case of immunosuppression. There is no efficient treatment for the intracellular forms of the parasite and no vaccine. T.gondii is an obligate intracellular parasite that interferes with the molecular signaling pathways of host cells and alters several physiological processes such as differentiation, apoptosis and proliferation. The transcription factor UHRF1 (ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1) is a key cell cycle regulator. It’s also a "methyl-CpG-binding protein” that gives it a crucial role in the replication of the epigenetic code. The molecular mechanisms by which the parasite affects the host cell remain poorly understood. We observed that infection with T. gondii leads to an inhibition of proliferation of host cells due to cell cycle arrest in G2 phase. This results in a decrease of expression of cyclin B and a sharp increase in UHRF1 in host cells. Inhibition of UHRF1 by SiRNA in host cells induces a significant decrease in parasite growth. We observed an increase in binding of UHRF1 to cyclin B promoter during infection with T.gondii. UHRF1 could be responsible for the repression of cyclin B gene, leading to cell cycle arrest. T. gondii is able to modulate gene expression by interfering with two important epigenetic modifications, methylation and histone modifications. UHRF1 is a transcription factor that connects these two epigenetic modifications. This would make UHRF1 a powerful tool that would allow the parasite to exploit the genome of the host cell. Activating UHRF1 involved the transcription factor NF-kB and a factor based on the parasite rhoptries
Mass spectrometry development for the study of non-covalent architectures in chemistry and biology
No full textCompte tenu de l’omniprésence des interactions non-covalentes en chimie et en biologie, leur étude est devenue incontournable. Les techniques analytiques les plus fréquemment utilisées comme la RMN et la cristallographie RX sont difficiles voire impossibles à mettre en œuvre pour l’analyse de certains édifices non-covalents. De nouveaux outils analytiques sont par conséquent nécessaires pour résoudre ces problématiques. Lors de ce travail de thèse, nous avons donc évalué le potentiel de la spectrométrie de masse et notamment de deux techniques d’ionisation douce : l’ionisation électrospray (ESI-MS) et l’Ionisation/Désorption Laser Assistée par Matrice (MALDI-MS). Ce travail s’est articulé selon trois axes : i) l’analyse d’édifices neutres, insolubles ou solubles dans des solvants très volatils comme le dichlorométhane ou le chloroforme : ces analytes offrent l’opportunité de tester une approche par MALDI-MS comme alternative à l’ESI-MS, ii) l’étude in vivo et in vitro d’une petite molécule à visée thérapeutique, le myo-Inositol trispyrophosphate (ITPP), dans le sang : cette étude doit permettre de mieux comprendre le mécanisme de régulation de l’ITPP, iii) l’étude du complexe Adx/AdR, impliqué dans la biosynthèse des stéroïdes chez les vertébrés : la mesure des constantes de stabilité des complexes formés à partir de variants d’Adx doit permettre de mieux comprendre le mécanisme d’interaction entre ces deux partenaires redox lors du transfert d’électron.Studying the non-covalent interactions in chemistry and biology cannot be ignored, considering their omnipresence. The most frequently used analytical techniques, such as RMN or X-ray crystallography, are difficult or even impossible to implement to the analysis of some non-covalent architectures. New analytical resources are thus required to solve these issues. During this thesis, mass spectrometry potential has been evaluated, especially through two soft ionization techniques: the Electrospray Ionization (ESI-MS) and the Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI-MS). This work has been based on three axes: i) the analysis of neutral architectures, indissoluble architectures or architectures soluble in high volatile solvents as dichloromethane or chloroform: these analyses give the opportunity to test out a MALDI-MS approach as an alternative to ESI-MS, ii) in vivo and in vitro study of a small therapeutic molecule, named myo-Inositol trispyrophosphate (ITPP), in blood : the goal of this study is to better understand the ITPP regulation mechanism, iii) the study of Adx/AdR complex, involved in vertebrates steroids biosynthesis : the measurement of stability constants of complexes formed from different Adx variants give the opportunity to better understand the interaction mechanism between these two redox partners during the electron transfer
Functional studies of PPR proteins in Arabidopsis organelles
No full textDans les organites de plantes, les étapes post- transcriptionnelles sont régulées par des protéines codées par le noyau et adressées aux organites. Chez les plantes, les protéines de la vaste famille PPR (PentatricoPeptide Repeat), sont des acteurs majeurs de cette régulation. Nous avons utilisé une stratégie de génétique inverse afin d'identifier les rôles de protéines PPR chez Arabidopsis thaliana. Dans les organites de plantes supérieures, l'édition de l'ARN convertit spécifiquement certains résidus cytidine en uridine dans les transcrits. La spécificité de reconnaissance de ces sites est assurée par des trans-facteurs protéiques qui lient l'ARN en amont du site d'édition. Nous avons identifié six nouveaux facteurs d'édition PPR dans les chloroplastes d'Arabidopsis thaliana (OTP80, OTP81, OTP82, OTP84, OTP85 et OTP86). Ces facteurs sont impliqués dans l'édition de 9 cytidines distinctes et certains reconnaissent plusieurs sites. Une analyse bio-informatique conduite sur les séquences cibles des trans-facteurs PPR reconnaissant plusieurs sites d'édition, suggère que leur spécificité de reconnaissance peut être expliquée si le facteur d'édition reconnait certains nucléotides conservés et distingue les résidus pyrimidines et purines. Lors d'une seconde étude, nous avons identifié un gène essentiel pour le développement de l'embryon chez Arabidopsis. Ce gène code pour une nouvelle protéine PPR, PPR9. Des expériences de fusion à la GFP, d'immunodétection et d'immunohistochimie ont montré que PPR9 est à la fois localisée dans les mitochondries et le noyau des cellules. Des expériences de complémentation génétique prouvent que seule la localisation mitochondriale est essentielle au développement de l'embryon. PPR9 lie l'ARN in vitro et est associée avec les polysomes des mitochondries de plantes. La protéine interagit avec la protéine NAP1 (Nucleosome Assembly Protein1) et le facteur de transcription TCP8. L'ensemble des données suggère que PPR9 régule l'expression des gènes mitochondriaux et nucléaires.In plant organelles, nuclear encoded proteins targeted to the organelles control post-transcriptional mechanisms. The PentatricoPeptide Repeat proteins (PPR) whose family has greatly expanded in land plants, are good candidates to play such regulatory roles. We used a reverse genetic screen in Arabidopsis thaliana to assign new functions to PPR genes. RNA editing in higher plant organelles results in the conversion of specific cytidine residues to uridine residues in RNA. The recognition of a specific target C site by the editing machinery involves trans-acting factors that bind to the RNA upstream of the C to be edited. We identified six new PPR chloroplast editing factors in Arabidopsis thaliana (OTP80, OTP81, OTP82, OTP84, OTP85, and OTP86). These six factors account for nine editing sites not previously assigned to an editing factor and, together with the nine PPR editing proteins previously described, explain more than half of the 34 editing events in Arabidopsis chloroplasts. An analysis of the target sites requiring the editing factors involved in editing of multiple sites suggests that editing factors can generally distinguish pyrimidines from purines and, at some positions, must be able to recognize specific bases.
Secondly, we report that loss-of-function mutations of PPR9 are lethal for the embryo in Arabidopsis thaliana. PPR9 encodes a novel PPR protein dual localized to mitochondria and nuclei as observed by GFP fusions, immunoblots using anti-PPR9 antibodies on sub-cellular fractions and immunohistochemistry experiments. Genetic complementation showed that loss of PPR9 function in mitochondria is lethal for the embryo but not in nuclei. PPR9 is able to bind RNA. In mitochondria, it is associated with polysomes and may play a role in translation, whereas, in the nucleus, PPR9 interacts with the nucleosome assembly protein NAP1 and the transcription factor TCP8. Altogether, our findings suggest that PPR9 might be involved in gene expression regulation between mitochondria and the nucleus
The inhibition of histone deacetylases regulates cocaine self-administration in rats
No full textLa consommation de substances illicites, telles que la cocaïne, constitue un problème important de santé publique. Les puissants effets renforçants de la cocaïne conduisent certains individus à une consommation abusive voire à une dépendance. Au sein du circuit de récompense, la cocaïne bloque la recapture présynaptique des monoamines, ce qui est à l’origine d’une plasticité neuronale impliquant la transcription de nombreux gènes. Des études récentes ont montré que la transcription de ces gènes était sous le contrôle de mécanismes épigénétiques, concernant essentiellement la méthylation de l’ADN et les modifications
post traductionnelles des histones dont l’acétylation. Au cours de cette étude, nous avons montré d’abord que l’inhibition des histones désacétylases par divers composés pharmacologiques dont la trichostatine A (TsA) diminuait
les propriétés renforçantes de la cocaïne et la motivation des rats à en consommer, sans affecter les effets récompensants du saccharose. La TsA bloque aussi la sensibilisation comportementale induite par la cocaïne et diminue le comportement de recherche de cocaïne
après une période de sevrage. Les effets de la TsA sur l’auto-administration de cocaïne sont accompagnés par la modification de l’expression du facteur de liaison à l’ADN méthylé Mecp2, de l’histone désacétylase HDAC11 et du facteur de transcription MEF2C. Nous avons procédé à l’analyse du transcriptome chez des rats, au niveau du cortex cingulaire antérieur et du noyau accumbens, afin de caractériser un ensemble de gènes sous-jacents aux
modifications comportementales. Parmi ceux-ci figurent les gènes Lissencephaly gene-1 et Reeline, deux gènes qui, lorsqu’ils sont mutés chez l’homme, sont à l’origine d’une
lissencéphalie caractérisée par la désorganisation des couches corticales résultant d’un défaut de migration neuronale. L’auto-administration de cocaïne induit l’expression des deux gènes. La TsA potentialise l’induction dans le cortex, mais la bloque dans le noyau accumbens. Il apparaît que l’administration répétée de cocaïne réenclenche des mécanismes déjà utilisés lors
du développement du cortex cérébral, afin de mettre en place une plasticité synaptique. Cette plasticité est susceptible de participer au développement de la dépendance aux drogues. Notons que l’ensemble de ces mécanismes est sous le contrôle étroit de facteurs épigénétiques, notamment des histones désacétylases.Cocaine is an addictive stimulant drug abused by humans and self-administered by rats. Drug addiction is a chronic brain disease characterized primarily by a compulsive drug-seeking and drug-taking behavior. A unique characteristic of drug addiction, from a clinical point of view, is the persistence of relapse risk long after a person has stopped taking drugs, which constitutes a major obstacle to successful treatment. Cocaine blocks the monoamine transporters, resulting in increased synaptic levels of the amines. The dopaminergic system in
particular is thought to represent a key pathway by which psychostimulants produce reinforcement. On the other hand, cocaine administration has been shown to elicit induction in
neurons of several immediate early genes that encode transcription factors. Recent data have shown that gene transcription is controlled by epigenetic mechanisms that include DNA methylation and modifications of histones such as acetylation. We show here that injection of several histone deacetylase inhibitors, like trichostatin A (TsA), to rats was sufficient to reduce the reinforcing properties of cocaine and decrease the motivation of the animals to
self-administer cocaine but not sucrose. The data also report the blockade of behavioral sensitization by TsA, as well as the reduction of cocaine-seeking behavior induced after a withdrawal period. The effect of TsA on cocaine self-administration was associated with an alteration of the expression of Mecp2 (methyl CpG binding protein 2), of the histone deacetylase HDAC11 and of the transcription factor MEF2C. Modification of the selfadministration
behavior in response to TsA was accompanied by extensive changes in gene expression in the cingulate cortex and in the nucleus accumbens, as assessed by cDNA microarray technology. Among the genes induced by cocaine self-administration, we found Lissencephaly gene-1 and Reelin, gene that belong to the same transduction pathway.
Mutations within both genes are causing lissencephaly. TsA caused their expression to increase in the cortex and to decrease in the nucleus accumbens. Our results suggest that
mechanisms important for the formation of cortical layers during development are used again during adulthood to establish brain plasticity in response to cocaine. The mechanisms, which are under the control of epigenetic factors, especially histone deacetylases, may participate in
the development of drug dependence
Non-polar semifluorinated amphiphiles : synthesis-nanostructuration in 2D and 3D
No full textCe travail de thèse s'inscrit dans le domaine des molécules amphiphiles semi-fluorées et s'étend de la synthèse de nouvelles architectures à l'investigation de leurs propriétés d'auto-assemblage à 2D et à 3D. Il s'articule
principalement autour de l'élaboration et de l'étude de films fins obtenus par auto-assemblage d'amphiphiles semi-fluorés, avec pour objectif de créer des surfaces décorées par des nanodomaines de tailles et formes contrôlées. La première partie de ce travail analyse la compression de nano-objets auto-assemblés constitués de diblocs FnHm(F(CF2)n(CH2)mH), conduisant à la formation de films composites à plusieurs niveaux de structuration à l'échelle nanométrique (développement d'une bicouche (F8H20) ou d'inflorescences (Fl0H16) au dessus du tapis de micelles). La deuxième partie est consacrée à la synthèse et à l'étude du comportement d'une nouvelle famille de tétrablocs semi-fluorés (CnF2n+1CH2)(Cm-2H2m3)CH-CH(CnF2n+1CH2)(Cm-2H2m-3), « di(FnHm) ». Ils présentent une transition réversible du 1er ordre avant la fusion entre une phase modulée ruban et une phase lamellaire de type hexatique B. L'imagerie de la surface (à l'échelle du nanomètre par AFM), sur films transférés (ou obtenus par spin-coating) révèle qu'ils s'auto-assemblent en micelles de surface dont la compression engendre la formation d'une seconde couche superposée, elle-même composée de micelles de surface. Dans une dernière partie, une nouvelle famille d'amphiphiles triaffines FnHmEOx (Fn = CnF2n+1;Hm = CmH2m+1;EOx = CH3(OC2H4)xO) récemment synthétisée au sein de l'équipe, a fait l'objet d'une étude de leur aptitude à la nanostructuration à l'interface eau/air (2D) et dans l'eau (3D).This work deals with semifluorinated amphiphiles, from the synthesis of new architectures to the investigation of their self-assembly in 2D and 3D. It is principally based on the elaboration and study of thin films obtained by self-assembly of semifluorinated alkanes in order to create surfaces decorated with nanodomains weIl defined in size and shape. The first part of this work analyses the compression of self assembled nanometric objects constituted by FnHm diblocks (F(CF2)n(CH2)mH), leading to hitherto unknown organized nanometric composite
arrangements (bilayer (FBH20) or crystalline like-inflorescences (Fl0H16) in coexistence with the initial monolayer of micelles). The second part is dedicated to the synthesis and the study of the behavior of a new familly of semifluorinated tetrablocks, « di(FnHm)» (CnF2n+1CH2)(Cm-2H2m-3)CH-CH(CnF2n+1CH2)(Cm-2H2m-3).They present a reversible first order transition before melting, between a modulated smectic phase and a lamellar hexatic B
arrangement. As assessed by AFM, transferred or spin-coated films consist of two sublayers of dis crete surface
micelles. In the last part, the nanostructuration at the air /water interface and in water of a new triaffine architecture FnHmEOx (Fn = CnF2n+1;Hm = CmH2m+1;EOx= CH3(OC2H4)xO) was investigated