Ehime University Institutional Repository

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)doctoral thesi

平井, 邦明

HIRAI, Kuniaki

（第３号様式） 
学 位 論 文 要 旨
   氏 名 平井 邦明 
   論 文 名 心臓 MRI における compressed sensing を用いた冠動脈 MRA の有用性の検討 
【背景】 
心臓 MRI 検査では cine MRI による心筋壁運動の評価、perfusion MRI による心筋虚血の評価、
遅延造影 MRI による心筋梗塞の評価、coronary MRA による冠動脈の評価を一度の検査で行う事
ができ、虚血性心疾患や心筋症の診断に有用とされている。その中で coronary MRA は放射線
被曝なく、MRI 特有の高い組織間コントラストで冠動脈の形態評価が可能であることが知られ
ている。さらに 1 回の 3D 撮像により冠動脈全領域の画像データを得ることが出来る whole hea
rt coronary MRA の進歩により、撮像自体も高速化が進んできた。 しかし、whole heart cor
onary MRA を用いても冠動脈撮像には 10-15 分程度掛かるのが現状であり、心臓 MRI の検査時
間が延長する大きな要因となっている。また冠動脈 MRA 撮像自体も検査の最後に行われること
が多いため、患者の疲れによる体動や呼吸状態の不安定化により撮像途中で検査が中断・失敗
に終わってしまうことも多々あり得る。一方、圧縮センシングを用いた超高速撮像である comp
ressed sensing (CS) を用いることで検査時間の短縮が期待される。CS coronary MRA では従
来に比して 1/4〜1/5 程度の時間 (おおよそ 3-5 分程度) で良好な冠動脈撮像が可能と考えら
れる。このことにより心臓 MRI 検査で待ち時間となってしまう遅延造影撮像前の 10 分間に冠
動脈 MRA 撮像を行うことができ、患者の負担軽減や検査時間の短縮に繋がると考えた。 
【目的】 
本研究の目的は compressed sensing coronary MRA を従来法と比較して撮像時間や画質を検討
することである。 
氏名 平井 邦明   
 
【方法】 
本研究は当院および済生会松山病院での多施設共同前向き研究として計画された。2018 年 8 月
から 2019 年 3 月までの期間に心筋障害を疑われ心臓 MRI 検査を受ける症例のうち、coronary 
MRA の追加撮像に同意を得られた症例を対象とした。不整脈や経皮的冠動脈形成術の既往があ
る症例は除外した。プロトコールは通常の心臓 MRI 検査の中で、造影剤を入れてから遅延造影
までの待ち時間の間に CS coronary MRA を撮像し、遅延造影の後に従来法の coronary MRA を
撮像した。CS coronary MRA の撮像に造影剤を入れてから 10 分以上かかった場合は検査失敗と
して撮像を中止した。CS 法と従来法で撮像された coronary MRA 画像に対して、それぞれ視覚
的に画質と artifact の評価をセグメント毎に行った。また専用のワークステーションを用い
て右冠動脈(RCA)、左前下行枝(LAD)、左回旋枝(LCX)それぞれの描出血管長、sharpness、血管
径を定量評価として計測した。統計学的有意差は P<0.05 と定義した。 
【結果】 
50 症例全てで、遅延造影までの待ち時間(10 分以内)に CS coronary MRA 撮像を完了すること
ができた。撮像時間(秒)の中央値および四分位は CS 法で 207 (163, 259)、従来法で 785 (69
8, 975)と有意に撮像時間の短縮を認めた。CS 法と従来法で画質や artifact に有意差を認めな
かった。描出血管長(mm)の中央値および四分位は RCA で CS 149 (128, 161), 従来法 146 (13
2, 163)、LAD で CS 134 (103, 155)、従来法 138 (110, 155)、LCX で CS 91 (80, 111)、従来
法 93 (82, 114)といずれも有意差を認めなかった。 描出血管長の相関は R2で RCA 0.93、LAD 
0.87、LCX 0.88 と良好な相関を示した。sharpness(1/mm)の平均値±標準偏差は RCA で CS 0.8
7 ± 0.14、従来法 0.85 ± 0.16、LAD で CS 0.90 ± 0.15、従来法 0.87 ± 0.14、LCX で CS 0.9
5 ± 0.19、従来法 0.94 ± 0.16 といずれも有意差を認めなかった。血管径(mm)の平均値±標準
偏差は RCA で CS 4.0 ± 0.6、従来法 4.1 ± 0.6、LAD で CS 3.6 ± 0.6、従来法 3.5 ± 0.6、LC
X で CS 3.2 ± 0.5、従来法 3.2 ± 0.5 といずれも有意差を認めなかった。 
【結論】 
compressed sensing coronary MRA は従来法と比較して画質を保ちながら高速撮像が可能であ
る。 
 
なお、本研究は愛媛大学医学部附属病院および済生会松山病院の倫理委員会によって承認され
ている。 
 
 
 
 
キーワード（３～５）
 
 
 
心臓MRI、冠動脈MRA、compressed sensing 
 
 
 
 


English

心臓MRIにおけるcompressed sensingを用いた冠動脈MRAの有用性の検討

Ehime University (愛媛大学)博士(工学)doctoral thesi

山中, 聡士

YAMANAKA, Satoshi

（第 6号様式）                                                                        
学位論文審査の結果の要旨 
氏  名 山中  聡士 
 
 
審査委員 
 
 
主  査    澤崎  達也 
        
副  査    坪井  敬文       
 
副  査    高井  和幸       
 
論 文 名 
ケミカルバイオロジーに基づいたユビキチン修飾により制御されるタンパク質分解と 
シグナル伝達に関する研究 
 
審査結果の要旨 
 
タンパク質のユビキチン化は、真核生物に高度に保存された翻訳後修飾である。ユビキチン化は、
複数のユビキチン分子が基質タンパク質上で鎖状に結合することにより、ポリユビキチン鎖を形成す
ることが知られている。ポリユビキチン鎖はその結合型の違いにより、細胞内で異なった機能を有す
ることが報告されている。 
K63型や直鎖型ポリユビキチン鎖はシグナル伝達に関与する。これらのポリユビキチン鎖依存的
なシグナル伝達として、免疫・炎症応答において極めて重要な働きをするNF-κBシグナル伝達が
知られている。NF-κBシグナル伝達経路において、ユビキチン化の逆反応であるユビキチンの切
断を担うCYLDやOTULINなどの脱ユビキチン化酵素(DUB)は負の制御因子として機能している。
これまでの研究から、CYLDやOTULINは重複した機能や個別の機能を有することが報告されてい
るが、個別の役割においては完全には理解されていない。現在、DUBの役割やDUBが関与する疾
患を対象に、DUBの低分子阻害剤の開発が盛んに行われている。 
K48型ポリユビキチン鎖は、標的タンパク質の分解に関与している。タンパク質の分解システムは
様々な疾患に関与しており、これまでにタンパク質分解を対象にした様々な薬剤が開発されてきた。
過去10年の研究から、サリドマイドはCRBNに結合し、本来の基質タンパク質とは異なった、ネオ基
質タンパク質の分解を誘導することにより薬効や副作用を示すことが明らかになってきた。現在では、
サリドマイドをはじめとする、この様なタンパク質分解誘導剤は次世代の薬剤として世界中で開発さ
れている。新たなサリドマイド誘導体の開発において、基質タンパク質を知ることは重要な課題である。
また、現在ではタンパク質分解誘導剤を用いた標的タンパク質ノックダウン技術の細胞生物学への
利用が期待されている。 
申請者の学位論文の目的は、このようなポリユビキチン鎖依存的な現象に対して、低分子化合物
を基盤にして、CYLD阻害剤の開発、サリドマイド催奇性の作用機序を明らかにすること、及び薬剤
依存的な標的タンパク質の分解技術開発である。 
申請者は、CYLD阻害剤の開発を目指して、東京大学創薬機構の化合物ライブラリーから
Subquinocinを見出した。細胞内において、SubquinocinはCYLDのDUB活性を阻害し、ポリユビキチ
ン鎖を増加させることでNF-κBの活性化を促進することを見出し、ドッキングモデル解析及び
CYLD変異体を用いた生化学的解析から、SubquinocinはUSPファミリーに高度に保存されたチ
ロシン残基と相互作用していることが明らかとなった。さらに、特異性解析からSubquinocinは
USPファミリーのDUBに阻害効果を示す一方で、他のファミリーのDUBに対しては阻害効果を示
さないことが分かった。加えて、CYLDノックアウト細胞を用いた解析からTNFα(LUBAC)依存的
なNF-κBシグナル伝達経路において、USPファミリーの中でCYLDが支配的に負の制御因子とし
て機能していることが明らかとなった。 
次に申請者は、サリドマイド催奇性の作用機序を明らかにするため、コムギ無細胞系によって作製
された転写因子プロテインアレイを用いて、サリドマイド依存的なCRBNの相互作用因子としてPLZF
を見出した。複数の培養細胞において、PLZFはサリドマイド依存的にタンパク質分解を受けることが
明らかにされた。加えて、サリドマイド代謝産物である5-ヒドロキシサリドマイドもPLZFや既報の基質
SALL4の分解を誘導することが明らかにされた。ニワトリ胚において、PLZFは四肢発生の重要な役
割を担っていることが示された。さらに、サリドマイド投与に伴い催奇性を示す個体の肢芽において、
Plzfが減少していること明らかにした。これらの結果から、Plzfはサリドマイド催奇性に関与する新規な
基質タンパク質であることが明らかとなった。 
次に申請者は、標的タンパク質の機能解析のためのサリドマイド様化合物依存的な分解タグを開
発した。開発された分解タグは、サリドマイド様化合物を投与することによって、迅速且つ可逆的に目
的タンパク質の発現量を分解できること示した。加えて、生化学的及び培養細胞を用いた解析から、
一過性及び内在性の標的タンパク質に分解タグを孵化することで標的タンパク質の機能解析が行え
ることを明らかにした。 
以上のように、本学位論文研究は、ケミカルバイオロジーに基づきCYLDの阻害剤を開発し、
サリドマイド副作用における重要な因子及びそのメカニズムを明らかにし、標的タンパク質の機能
解析のための薬剤依存的分解タグを開発した。これらの研究は、今後のユビキチン修飾系を対
象にした薬剤開発における重要な成果である。従って、本論文は、博士 (工学) の学位論文とし
て十分価値があると判定した。 
 


Japanese

ケミカルバイオロジーに基づいたユビキチン修飾により制御されるタンパク質分解とシグナル伝達に関する研究

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)thesi

宮上, 紀之

MIYAUE, Noriyuki

 
（第 12号様式） 
 
 
学 位 論 文 の 要 約 
（ 研 究 成 果 の ま と め ） 
 
 
 
      氏   名 宮上 紀之 
 
 
      学位論文名 パーキンソン病患者における血清 GDF15と好気性運動負荷試験の検討 
 
 
 
    学位論文の要約 
【背景および目的】 
パーキンソン病（Parkinson’s disease: PD）は、黒質のドパミン神経細胞の変性・脱落
に伴う神経変性疾患であり、ミトコンドリア機能不全は PD 発症の主要な原因の一つ
であると考えられている。GDF15（growth and differentiation factor 15）は種々のストレ
スに応じて産生されるサイトカインであり、心不全、悪性腫瘍、糖尿病患者で高値と
なる。また、ミトコンドリア病（mitochondria disease: MD）患者において著明に上昇し、
診断マーカーとして期待されている。本研究では PD 患者を対象として血中 GDF15 値
測定に加えて、MD の診断に用いられる好気性運動負荷試験を含む検討を行った。 
【方法】 
2017 年 7 月から 2019 年 4 月の間に愛媛大学医学部附属病院を受診した心臓血管疾
患、糖尿病、悪性腫瘍の既往のない PD 患者および健常対照群である患者家族を対象
とした。患者背景（年齢、性別、BMI、病歴、内服薬、運動頻度、食事）、Unified Parkinson's 
Disease Rating Scale（UPDRS）、Hoehn and Yahr scale、Mini-Mental State Examination
（MMSE）、ELISA 法による血中 GDF15 値測定、および好気性運動負荷試験に伴う血
中乳酸値測定を行った。また、MD 患者においても血中 GDF15 値測定を行った。本研
究は愛媛大学医学部の倫理委員会の承認を受けて実施された。 
【結果】 
PD 患者 36 人、健常者 30 人、MD 患者 5 人に対して血中 GDF15 値測定を行った。
年齢に関して、PD 群は平均 72.44 歳であるのに対して健常者群は平均 71.93 歳と有意
差はなく、また MD 群は平均 43.60 歳であった。平均血中 GDF15 値は、健常者群は 1,093 
pg/mL であるのに対して、PD 患者群では 1,472 pg/mL、MD 患者群では 3,363 pg/mL と
有意に高値であった。PD 患者 20 人と健常者 18 人を対象に行った好気性運動負荷試験
では群間に有意差は認めなかった。血中 GDF15 値を目的変数とした単回帰分析で、PD
群では年齢と有意な正の相関を示したが、罹病期間および UPDRS スコアによる重症
度とは相関を認めなかった。健常者群では年齢と正の相関、MMSE スコアおよび肉摂
 
取頻度と有意な負の相関を認め、さらに、年齢、MMSE スコア、肉摂取頻度を説明変
数とした重回帰分析では年齢との有意な相関を認めた。また、健常者群においてステ
ップワイズ法を用いたロジスティック回帰分析では、肉摂取頻度は MMSE スコアと有
意な正の相関を認めた。 
【考察】 
 PD 患者において黒質のミトコンドリア呼吸鎖複合体の活性低下が確認されてお
り、また骨格筋においても同様の活性低下が報告されている。好気性運動負荷試験は
骨格筋におけるミトコンドリア機能を反映することから MD 診断の非侵襲的バイオ
マーカーとして用いられている。本研究では、PD 患者において血中 GDF15 値は健常
者より高値であり、好気性運動負荷試験では群間差を認めなかった。PD 患者では骨
格筋のミトコンドリア活性低下が軽微である可能性、また血中 GDF15 は好気性運動
負荷試験より鋭敏にミトコンドリアストレスを検出するバイオマーカーとなる可能
性が考えられた、その他、本研究の健常者群において肉摂取頻度は MMSE スコアと
正の相関を認めたが、肉摂取量が多いほど認知機能が保たれるとの報告があることか
ら、肉摂取が認知機能低下の予防につながる可能性が示唆された。 
【結論】 
 血中 GDF15 値は年齢との相関を認め、また PD 患者では健常者より高値となるこ
とが示された。好気性運動負荷試験では両群に差は見られなかった。 
 
なお、この学位論文の内容は、以下の原著論文に既に公表済である。 
 
主論文：Noriyuki Miyaue, Hayato Yabe, Masahiro Nagai: Serum growth differentiation factor 
15, but not lactate, is elevated in patients with Parkinson's disease. Journal of the neurological 
science 409:116616, DOI: 10.1016/j.jns.2019.116616 


パーキンソン病患者における血清GDF15と好気性運動負荷試験の検討

Ehime University (愛媛大学)博士(農学)thesi

秋月, 一駿

AKIZUKI, Kazutoshi

（様式５）(Style5) 
学位論文全文に代わる要約 
Extended Summary in Lieu of Dissertation 
 
 
氏名： 
Name 秋月 一駿 
学位論文題目： 
Title of Dissertation 
大腸菌発現系を用いた高活性型CK1/CaMKIの調製法の開発と 
CaMKIδアイソフォームに関する生化学的研究 
 
学位論文要約： 
Dissertation Summary 
 
 
序論 
生命現象の主役である多くのタンパク質・酵素は，リン酸化修飾を受けることでそれらの活性や局在，
寿命（安定性）などが調節されており，リン酸化状態のタンパク質の機能解析が生命現象の理解には必要
不可欠である．よって，試験管内でタンパク質をリン酸化できる活性型のプロテインキナーゼの調製は，
そのキナーゼ自体をはじめ，基質タンパク質のリン酸化の意義を解析するうえで肝要であるが，プロテイ
ンキナーゼの中には活性型酵素の調製法が確立されていないものも多い．例えば，多機能性キナーゼ（様々
なタンパク質をリン酸化するキナーゼ）であるカゼインキナーゼ 1 (CK1) や Ca2+/カルモジュリン (CaM) 
依存性プロテインキナーゼ (CaMK) は，大腸菌発現系を用いた高活性型酵素の取得がそれらキナーゼの性
質上困難であった．一方でこれら多機能性キナーゼは，その基質特異性の広さから幅広いリン酸化タンパ
ク質の調製に利用できる汎用性の高い“リン酸化試薬”としての利用も期待できる(1)．そこで第 1 章では，
概日リズムやアポトーシス等に重要なカゼインキナーゼ1 (CK1) について，第2章ではCa2+/カルモジュリ
ン依存性プロテインキナーゼ Iδ (CaMKIδ) について，大腸菌発現系を用いた高活性型酵素の調製法の開発
を試みた． 
  CaMKIδ は，以前の当研究室における研究で，ゼブラフィッシュの胚発生に重要なキナーゼとして単
離・同定された Ser/Thr キナーゼである(2, 3)．CaMKI の完全な活性化には，Ca2+/CaM の結合とCaMK キ
ナーゼ (CaMKK) による活性化ループ内のThrのリン酸化が必須であると考えられているが(4–6)，第2章
の研究から，CaM 結合領域を欠いたC 末欠損変異体CaMKIδ(1–299)は，Ca2+/CaM のみならずCaMKK に
よるリン酸化を受けなくてもほぼ完全な活性を示すことが判明した．このことは，CaMKIδ には CaMKK
に依存しない新規活性化メカニズムが存在することを示唆しており，第3章では，さらに詳細な酵素学的
解析を行うことでCaMKIδの未知の活性化メカニズムの解明に取り組んだ． 
  当研究室では以前，ゼブラフィッシュCaMKIδ (zCaMKIδ) には zCaMKIδ-S, L, LL（SとLは同じ遺伝
子に，LLは別の遺伝子にコードされる）の3つのアイソフォームをクローニングし，それぞれの比較解析
を行ってきた(2, 3)．一方，哺乳動物のマウスでは，CaMKIδ遺伝子 (Camk1d) は1種類しか存在しないも
（様式５）(Style5) 
のの，この 1 遺伝子からmCaMKIδ-a, b, c, d の 4 種類のスプライシングアイソフォームが作られることを 
in silicoの解析から見出した．このうちmCaMKIδ-c (別名: mCKLiKβ) に関しては培養細胞における解析例
があるものの(7)，in vitroにおける酵素学的な解析はこれまで行われておらず，またmCaMKIδ-b, dに至っ
てはタンパク質レベルでの解析例は皆無である．そこで第 4 章では，mCaMKIδ に存在する各アイソフォ
ームについて試験管内での実験や培養細胞系を用いた詳細な比較解析を行い，さらに本章で明らかにされ
た各アイソフォームの性質からそれらの存在意義について考察した． 
 
第1章 
大腸菌発現系を用いた高活性型カゼインキナーゼ1の簡便な調製法の開発 (8) 
カゼインキナーゼ 1 (CK1) は，真核生物において高度に保存された Ser/Thr キナーゼであり，概日リ
ズムやアポトーシスなど，様々な細胞プロセスに関与する重要なキナーゼである(9–11)．従って，高活性型
CK1 を調製し，その酵素学的諸性質を in vitro において詳細に解析することは，CK1 の機能を理解する上
で重要な意味を持つ．しかし，大腸菌発現系で取得したリコンビナントCK1は，大腸菌内での自己リン酸
化を介して不活性化してしまうため，リン酸化型／不活性型CK1 しか取得できないという問題があった．
本章ではこれを解決するため，λ プロテインホスファターゼ (λPPase) を恒常的に発現する大腸菌株 
BL21(DE3)pλPP株を開発し，これを用いたタンパク質発現システムを確立した．本発現系を用いることで，
リコンビナント CK1 の各アイソフォーム (α, δ, ε) を非リン酸化型酵素として簡便に調製することができ
た．また，BL21(DE3)pλPP株を用いて調製したCK1s (α, δ, ε) は，既存のBL21(DE3)から取得した酵素と比
べて著しく高いキナーゼ活性を示すことが明らかになった．最後に，リコンビンナント CK1 を λPPase を
用いて in vitro で脱リン酸化するというやや煩雑なステップが必要な従来の活性型CK1 の調製法と比較し
たところ，BL21(DE3)pλPP から簡単に調製した CK1 の方が高いキナーゼ活性を示すことが判明した．以
上から，BL21(DE3)pλPP株を用いた簡便な手法は，高活性型CK1の調製に有用であることが示された．本
発現系は CK1 に限らず，大腸菌内でのリン酸化が原因で調製の難しい他のキナーゼへの応用も期待でき
る． 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
図1．BL21(DE3)pλPP株を用いた高活性型CK1の調製法 
（様式５）(Style5) 
第 2 章 
タンパク質の“リン酸化試薬”として有用な “High-performance CaMKIδ” の開発 (12) 
本章では，ゼブラフィッシュCa2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ Iδ (zCaMKIδ) の自己阻
害ドメインを欠損させた恒常的活性断片 zCaMKIδ(1–299)を作製し，その発現精製と特徴付けを行った．本
酵素は大腸菌粗抽出液の可溶性画分を用いた簡便なワンステップの精製により，高い収量（大腸菌 1 L 培
養あたり220 mg）での精製が可能であった．また，対応するCaMKIαの断片であるCaMKIα(1–294)とは異
なり，zCaMKIδ(1–299)は活性化処理をせずとも，CaMKKで活性化した zCaMKIδ(WT)に匹敵する高いキナ
ーゼ活性を示すことが明らかになった．さらに，zCaMKIδ(1–299)は zCaMKIδ(WT)と同様の幅広い基質特
異性を示し，これはプロテインキナーゼAの触媒サブユニット (PKAc) のそれと相補的であった．加えて
zCaMKIδ(1–299)のキナーゼ活性は，PKAcやCX-30K-CaMKII (13)（CaMKIIにXenopus CaMKIのN末領域
を融合させたもの）と比較しても高いことが明らかになった．さらに本キナーゼ活性は，熱による不活性
化処理や凍結融解の繰り返しに対して非常に安定であることも示された．以上から，本章で作製した
zCaMKIδ(1–299)は取り扱いが容易で高性能な“リン酸化試薬”として，様々なタンパク質のリン酸化／脱
リン酸化実験への利用が期待される． 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
第 3 章 
C 末欠損型CaMKIδ で見出された 
CaMKK 非依存的な自己リン酸化を介した自己活性化メカニズム (14) 
Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ Iアイソフォーム (CaMKIα, β, γ, δ) は，真核生物にお
ける Ca2+シグナリングで重要な役割を果たすキナーゼであり，CaMKK によってアクチベーションループ
のThr残基がリン酸化されることで活性化する(4–6)．しかし我々は，ラットCaMKIα (rCaMKIα) とは異な
り，大腸菌から調製したゼブラフィッシュ及びマウス CaMKIδ の C 末欠損変異体 [zCaMKIδ(1–299)と
mCaMKIδ(1–297)] はCaMKK非存在下でもほぼ完全な活性を示すことを見出した（第2章）(12)．CaMKIδ
のCaMKK非依存的な活性化メカニズムを明らかにするため，本研究ではリコンビナント zCaMKIδ(1–299)
と rCaMKIα(1–294)を用いて，in vitroにおける比較解析を行った．不活性型 zCaMKIδ(1–299)とλPPase共発
表1．CaMKId(1–299)とCX-30-CaMKII及びPKAcとの比較
精製の	
簡便さ 
大腸菌1 liter
あたりの取得量
比活性	
(基質: MBP) 温度 
CaMKIδ
(1-299) ◎	 220 mg 
3.59
(nmol/min/mg) ◎	
CX-30K
-CaMKII △	 21 mg 
CaMKIδ(1-299)の
1/10以下 ×	
PKAc ◎ 10 mg（文献値） 
0.784
(nmol/min/mg) 
30°C: ◎	
40°C: ×	
（様式５）(Style5) 
現系を用いた実験から，zCaMKIδ(1–299)のみが大腸菌の培養過程で高度に自己リン酸化／活性化すること
が判明した．また質量分析と部位特異的変異体を用いた解析から，キナーゼを活性化させる主要な自己リ
ン酸化サイトはSer296であることが明らかになった．さらに，全長の zCaMKIδ におけるSer296のリン酸化
ミミック変異体は，CaMKKで完全に活性化したCaMKIよりもさらに高いキナーゼ活性を示すことが判明
した．これらの結果は，CaMKIδ が Ser296のリン酸化によって CaMKK 非依存的様式で活性化するという
初めての証拠を提供し，これはCaMKIδアイソフォームの生理的な役割を理解するうえで重要な手がかり
になる可能性がある． 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
第 4 章 
マウスCaMKIδ に存在する各種スプライシングアイソフォームの比較解析 
Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ Iδ (CaMKIδ) は，Ca2+シグナリングで機能するSer/Thr
キナーゼであり，Ca2+/CaMの結合とCaMKKによるリン酸化を受けて活性化する(4–6)．本章では，マウス
Camk1d遺伝子に由来する4つのスプライシングアイソフォーム (mCaMKIδ-a, b, c, d) をin silicoで見出し，
これらについて酵素学的な比較解析を行った．まず，マウス各臓器を用いて RT-PCR を行ったところ，
mCaMKIδ-a, c, b, d はそれぞれ異なる発現パターンを示すことが判明した（mCaMKIδ-d は肝臓にて顕著な
発現を示した）．次に，大腸菌を用いてリコンビナントmCaMKIδ-a, b c, dを取得し，in vitroにおけるキナ
ーゼ活性を評価した．その結果，どのアイソフォームもCaMKKによってリン酸化されるものの，mCaMKIδ-
a, cのみが基質 (MBP: ミエリン塩基性タンパク質) に対するリン酸化活性や自己リン酸化活性を示すこと
が明らかになった．加えて，Neuro 2a細胞から調製したmCaMKIδ-a, cはCREB（cAMP応答配列結合タン
Autophosphorylation
at Ser296
C P
Weakly active Phosphorylated/
Highly active
N-lobe
Weakly active Weakly active
No autophosphorylation
A-loopCaMKIa
(1–294)
CaMKId
(1–299)
N-lobe
C-lobe C-lobe
N-lobe N-lobe
C-lobe C-lobe
Ser296
C
C C
A-loop
A-loop A-loop
図2．CaMKIδ(1–299)の活性化モデル（模式図） 
（様式５）(Style5) 
パク質）に対してCa2+/CaM依存的なリン酸化活性を持つことが示された．また興味深いことに，in vitroで
はmCaMKIδ-a, cは両酵素ともに自己リン酸化活性を示したが，293T細胞内においては，mCaMKIδ-cでの
み顕著な自己リン酸化活性が認められた．また点変異体を用いた解析から，mCaMKIδ-cの自己リン酸化部
位は mCaMKIδ-b, c のみが有する C 末端側の Ser349 (isoform c) であることが明らかになった．さらに興味
深いことに，この自己リン酸化サイトはPKAcによってより効率的にリン酸化されることが in vitroおよび
培養細胞系における実験から示された．以上から，mCaMKIδ に存在する各種スプライシングアイソフォ
ームは，組織局在や，キナーゼ活性，自己リン酸化活性やPKAc によるリン酸化の有無といった様々な相
違点が認められ，生体内ではこれらの差異に基づく異なった役割を担うことが示唆された． 
 
総括 
本研究によって大腸菌を用いた高活性型酵素の調製法が確立された CK1/CaMKI については，今後そ
れらのキナーゼ活性をはじめとする各種パラメータの詳細な解析や，未知の基質探索といった様々な機能
解析が容易となり，これらキナーゼの生理機能の解明がこれまで以上に加速されると思われる．また，こ
れら高活性型CK1/CaMKIδと既存の“リン酸化試薬”であるPKAcを組み合わせることでより幅広いリン
酸化タンパク質が簡便に調製でき，これにより様々なリン酸化タンパク質の機能解析や，リン酸化の逆反
応を司る各種ホスファターゼの同定およびそのキネティクスのための良好な基質調製が可能になると考え
られる． 
また，第 2・3 章で示唆された CaMKIδ の Ser296 のリン酸化を介した新規活性化メカニズムや，各種
mCaMKIδ アイソフォームで見出されたそれぞれに特徴的な性質は，これまであまり明らかにされていな
かった CaMKI アイソフォーム間における CaMKIδ 特異的な機能を理解する上で重要な知見になると考え
られる．将来的には，CaMKIδの関与が示唆されるアルツハイマー病や，乳がん，免疫疾患などにおいて，
本研究により見出されたCaMKIδの基本性質が創薬の開発過程や分子病理の理解における価値のある情報
源となると期待している． 
 
引用文献 
(1) MacKintosh, C., Moorhead, G. (1999) Assay and purification of protein (serine/threonine) phosphatases, in: 
Hardie, D. G. (Ed.), Protein Phosphorylation: A Practical Approach, second ed., 153–181 
(2) Senga, Y., Nagamine, T., Kameshita, I., and Sueyoshi, N. (2012) Knockdown of two splice variants of 
Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Iδ causes developmental abnormalities in zebrafish, Danio rerio. Arch. 
Biochem. Biophys. 517, 71–82 
(3) Senga, Y., Yoshioka, K., Kameshita, I., and Sueyoshi, N. (2013) Expression and gene knockdown of zebrafish 
Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Iδ-LL. Arch. Biochem. Biophys. 540, 41–52 
(4) Soderling, T. R. (1999) The Ca2+–calmodulin-dependent protein kinase cascade. Trends Biochem. Sci. 24, 232–
（様式５）(Style5) 
236 
(5) Hook, S. S., and Means, A. R. (2001) Ca2+/CaM-dependent kinases: From activation to function. Annu. Rev. 
Pharmacol. Toxicol. 41, 471–505 
(6) Wayman, G. A., Lee, Y. S., Tokumitsu, H., Silva, A., and Soderling, T. R. (2008) Calmodulin-kinases: Modulators 
of neuronal development and plasticity. Neuron 59, 914–931 
(7) Yamada, T., Suzuki, M., Satoh, H., Kihara-Negishi, F., Nakano, H., and Oikawa, T. (2004) Effects of PU.1-induced 
mouse calcium-calmodulin-dependent kinase I-like kinase (CKLiK) on apoptosis of murine erythroleukemia cells. 
Exp. Cell Res. 294, 39–50 
(8) Akizuki, K., Toyama, T., Yamashita, M., Sugiyama, Y., Ishida, A., Kameshita, I., and Sueyoshi, N. (2018) Facile 
preparation of highly active casein kinase 1 using Escherichia coli constitutively expressing lambda phosphatase. 
Anal. Biochem. 549, 99–106 
(9) Knippschild, U., Gocht, A., Wolff, S., Huber, N., Löhler, J., and Stöter, M. (2005) The casein kinase 1 family: 
participation in multiple cellular processes in eukaryotes. Cell. Signal. 17, 675–689 
(10) Gross, S. D., and Anderson, R. A. (1998) Casein kinase I: spatial organization and positioning of a multifunctional 
protein kinase family. Cell. Signal. 10, 699–711 
(11) Schittek, B., and Sinnberg, T. (2014) Biological functions of casein kinase 1 isoforms and putative roles in 
tumorigenesis. Mol. Cancer 13, 231 
(12) Senga, Y., Akizuki, K., Katayama, S., Shigeri, Y., Kameshita, I., Ishida, A., and Sueyoshi, N. (2016) High-
performance CaMKI: A highly active and stable form of CaMKIδ produced by high-level soluble expression in 
Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 475, 277–282 
(13) Shoju, H., Sueyoshi, N., Ishida, A., and Kameshita, I. (2005) High-level expression and preparation of autonomous 
Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II in Escherichia coli. J. Biochem. 138, 605–611 
(14) Akizuki, K., Kinumi, T., Ono, A., Senga, Y., Osawa, J., Shigeri, Y., Ishida, A., Kameshita, I., and Sueyoshi, N. 
(2019) Autoactivation of C-terminally truncated Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (CaMK) Iδ via CaMK 
kinase-independent autophosphorylation. Arch. Biochem. Biophys. 668, 29–38 
 
 
 


大腸菌発現系を用いた高活性型CK1/CaMKIの調製法の開発とCaMKIδアイソフォームに関する生化学的研究

池田, 祐一

IKEDA, Yuichi

（第７号様式） 
 
学位論文審査結果の要旨 
 
   氏     名 池田 祐一 
 
 
 
 
 
   審 査 委 員 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
      論  文  名 脳梗塞患者におけるシロスタゾールの血小板反応性と臨床転帰 
および CYP 遺伝子多型との関連 
      審査結果の要旨（2,000 字以内） 
【研究の背景】抗血小板薬は動脈血栓症の再発予防に有用であるが、一部患者
においては、抗血小板薬を服用していても高い血小板反応性を示す薬剤抵抗性
患者が存在し、抗血小板薬の効果が発揮されないことが知られている。抗血小
板薬であるシロスタゾールには臨床的な有用性が報告されているが、シロスタ
ゾール服用者での血小板反応性についてはこれまで評価されてこなかった。今
回申請者らは、シロスタゾールの薬効を測定できる新たな検査法を確立し、脳
梗塞患者におけるシロスタゾールの抗血小板反応と脳梗塞再発との関連につい
て検討し、さらにシロスタゾールの代謝に関与する遺伝子多型の血小板反応性
や再発リスクに与える影響について検討を行った。 
【対象と方法】非心原性脳梗塞患者でシロスタゾールを 4 週間以上投薬された
142 人を対象とし、血小板反応性の測定と 2 年間の血栓症発症の有無について
経過観察を行った。血小板反応性は、シロスタゾールの薬理作用である cAMP
の増加によって生じる血小板蛋白である、vasodilator-stimulated phosphopr
otein（VASP）のリン酸化を認識する抗体を用いたフローサイトメトリー法で
リン酸化 VASP の量を測定し、全蛋白量に対するリン酸化率（VASP phosphoryl
ation index: VPI）を算出することで定量化し評価した。代謝関連遺伝子は CY
P3A5 および CYP2C19 の遺伝子多型について、末梢血から DNA を分離し、塩基配
列解析により検討した。 
【結果】142 人のうち、130 人において 2 年間の経過観察を行うことができ、
6 人で脳梗塞、2 人で心筋梗塞の発症を認めた。脳梗塞全患者 142 人の VPI を
検討したところ、健常者ではほぼ一定した低値を示したが（11.8±1.8）、脳
梗塞既往者では値の幅が大きく、全体的に高めの値を示した（30.5±14.0）。
再発群は非再発群と比較して VPI が有意に低値であり、VPI 法はシロスタゾー
ル服用患者の血栓症再発を予測する方法として適切であると考えられた。再
発群と非再発群を区別するカットオフ値を設定し、その値よりも低い群を高
血小板反応性群と定義すると、この群では血栓症の再発率が明らかに高いこと
が見出された。また、2 つの代謝関連遺伝子多型と VPI の関連性については有
意な相関は認められなかったが、CYP3A5 *1/*3 かつ CYP2C19 EM の患者は CYP3
A5 *3/*3 かつ CYP2C19 PM の患者と比べて VPI が有意に低いことが見出された。
一方で、いずれの遺伝子多型においても、血栓症の再発との関連は認められな
かった。 
【結語】こうしたことから、シロスタゾール服用者において VPI 法を用いた検
討により、シロスタゾールに対して低い血小板への反応を示す患者群の存在が
明らかとなり、そのような患者群では血栓症再発のリスクが高まることが示さ
れたことから、本検査法は臨床的に有用な手段となることが期待された。 
 
 本論文に対する公開審査会は、令和元年 12 月 17 日に開催された。申請者
は学位論文の内容について、英語で明確に説明した。審査委員からは本研究に
関連する以下の質問がなされた。1)代謝関連遺伝子のシロスタゾールとクロピ
ドグレルとの作用に違いがある理由、2) アッセイ法の測定にかかる時間、 
3) 臨床応用について、4)VPI の高値と低値の患者群の特徴、5)多変量の独立
変数を選んだ理由、6)多変量解析に LDL-C などの連続変数を用いた検討を行
ったかどうか、7)採血後から安定してリン酸化 VASP を測定できる検体保存時
間、8)シロスタゾールの認知機能抑制効果の可能性、9)抗血小板薬 2 剤併用
療法患者の扱い、10)アスピリン併用患者を含めているが、アスピリンの影響
について、11)シロスタゾールで誘導される頻脈との関連性、12)VASP の生体
や細胞における役割、13)VPI を変動させる因子、14)出血との関連、15)アッ
セイキットで用いた PGE1 の濃度について、16)シロスタゾールを増量して至
適 VPI 値にする治療の可能性、17)臨床的に VPI を測定する時期、18)P2Y12 の
活性化に影響する糖尿病や肥満について。など質問項目は多岐に渡った。 
 
これら多くの試問に対して申請者は、質問者の意図を十分に理解した上で、
予備実験ならびに先行研究や文献的考察を交えながら、明瞭かつ的確に回答
した。審査委員は，申請者が本論文関連領域に対して学位授与に値する十分
な見識と能力を有することを全員一致で確認し，本論文が学位授与に値する
と判定した。 
 


脳梗塞患者におけるシロスタゾールの血小板反応性と臨床転帰およびCYP遺伝子多型との関連

吉川, 武樹

YOSHIKAWA, Takeki

RFIDを用いた手術器械管理システムの記録情報を使用した手術器械耐用年数の予測

HERBUELA, VON RALPH DANE MARQUEZ

（第６号様式）                                                                        
学位論文審査の結果の要旨 
氏  名 Herbuela Von Ralph Dane Marquez 
 
審査委員 
 
 
 
 
主  査   渡辺 幸三       
副  査   森脇 亮        
副  査   三宅 洋        
 
論 文 名 
DEVELOPMENT OF AN INTEGRATED MHEALTH APP IN IMPROVING KNOWLEDGE, ATTITUDE AND PRACTICES 
TO REDUCE RISK FOR DENGUE FEVER AND ITS PSYCHOLOGICAL SYMPTOMS 
 
審査結果の要旨 
デング熱はネッタイシマカ等の蚊が媒介するウイルス感染症で，熱帯・亜熱帯地域に広く分布
する熱性・発疹性疾患である。フィリピンではデング熱患者が急増しており，その対策が急務と
されている。本博士論文では、人々のデング熱に関する症状や予防策に関する「知識（knowledge）」、
デング熱に対する恐怖や感情などに関する「態度（attitude）」およびデング熱に対する予防措
置や予防的行動などの「実践（practices）」の３つの要素(知識・態度・実践（KAP）)に着目し
て，デング熱感染リスクの抑制に資する知見を収集し，それらの知見を活用した対応技術の開発
に繋げた。また，デング熱患者が病気や蚊への恐怖や不安か発症する神経学的合併症（うつ病と
不安神経症）にも対象疾患を拡大して，デング熱が抱えるリスクを包括的に議論した。最終的に
は，デング熱やデング熱に伴う神経学的合併症のリスクを制御するためのスマートフォンベース
のモバイルヘルスアプリを開発して，フィリピンなどで深刻な社会問題となりつつあるデング熱
に対応するための技術提案も行っている。 
本研究の目的は以下の３つである。 
１）デング熱患者のデング熱に対する知識・態度・実践の特性を明らかにする。 
２）デング熱患者のうつ病や不安神経症の有病率とこれら合併症を誘発する外的因子を推定する。 
３）デング熱患者発生モニタリングとデング熱リスク低下を目的としたモバイルヘルスアプリを
開発する。 
 本学位論文は以下のように構成されている。第１章では，デング熱が全世界やフィリピンにお
ける流行状況の概要について述べられ，また論文の全体の構成と目的が記述されている。第２章
では，デング熱患者の知識、態度と実践、抑うつおよび不安症状、そしてモバイルヘルス（mHealth）
アプリケーション開発に関する既存研究がレビューされている。第３章では，フィリピン・マニ
ラ首都圏におけるデング熱入院小児および成人患者のデング熱に関する知識・態度・実践の特性
を明らかにしている。第４章では，デング熱入院小児患者のうつ病と不安神経症の症例対照研究
をインタビュー調査に基づいて行い，うつ病と不安神経症の有病率を推定して比較すると共に，
これらの神経学的合併症を引き起こす外的要因を推定している。第５章では，デング熱患者デー
タの集約，患者位置情報のマッピング，医療コミュニケーション，デング熱抑制に向けた行動変
容を促すための統合的モバイルヘルスアプリ Mozzify （モズィファイ）を開発すると共に，ア
ンケート調査からユーザーの満足度などを評価している。第６章では，前章で開発した Mozzify 
（モズィファイ）を，デング熱流行地のフィリピン・メトロマニラでの 979 人に配布する実証実
験を行い，その有用性を検証すると共に，改善が必要な点についても抽出している。最後に，第
７章では本論文で得られた知見がまとめられている。 
 
 得られた主な知見は以下の通りである。 
 デング熱入院患者のインタビュー調査に基づいて，知識・態度・実践の特性を明らかにした。
デング熱（臨床的または血清学的に確認されたデング熱診断）患者およびコミュニティベー
スのコントロールを持つ 233 人の小児患者と 17 人の成人患者の知識・態度・実践を比較し
た。その結果，小児および成人患者は、小児および成人のコントロールと比較して、実践に
関する評価値の平均スコアが有意に低かった（p <0.001）。デング熱患者のデング熱の知識と
デング熱に対する態度は、デング熱に対する実践と有意な相関は示さなかった。以上のこと
から，知識と態度を高めることに注力している現在のフィリピンのデング熱制御プログラム
の方針を，人々の行動の変容を促して実践を高めることにウェイトを置いた方針に転換して
いく重要性が示された。 
 225 人の小児入院デング熱患者と健康な生徒コントロール 260 人のインタビュー調査に基づ
いて，うつ病と不安神経症の神経学的合併症の有病率を推定して比較すると共に，これらの
神経学的合併症を引き起こす外的要因を推定した。調査の結果，デング熱小児患者のうつ病
（13.3％）および不安神経症（34.2％）の有病率は、コントロール（それぞれ 3.5％，16.2％）
よりも有意に高いことが明らかにされた（p <0.001）。また，重回帰分析の結果、年齢、家族
のデング熱有病歴、入院期間の短さ、筋肉痛および関節痛の発症が、デング熱患者のうつ病
および不安神経症の増加因子であることも明らかになった。さらに、デング熱患者の 26.7％
が、いらいら、興奮、幻覚などの深刻な症状を発症していることも分かった。 
 都市内のデング熱患者や蚊吸血イベントの位置情報の収集とマッピング，医療相談コミュニ
ケーション，デング熱を抑制する行動を促す情報発信などを実現する統合的モバイルヘルス
アプリ Mozzify を iOS 携帯電話プラットフォーム用に開発した。スマートフォンなどが提供
するモバイルヘルスアプリは多方面で注目されているが，本研究によりデング熱抑制に資す
る新たなアプリが提案された。日本の 50 名の被験者およびデング熱流行地のマニラ首都圏
の 979 名の被験者を対象にモバイルアプリ評価スケール（MARS）を使用したアンケート調
査を実施して，アプリの動作性，情報共有能力、機能性、デザイン，ユーザー間の一体感な
どの観点からユーザー満足度を評価した。その結果，高い満足度を得られていることが示さ
れた。さらに，多言語機能の追加、デング熱以外の他疾患もカバーする，iOS だけではなく
Android バージョンの開発，データ信頼性の検証，などアプリに必要な改善点も提案された。 
 
 学位論文の公聴会は令和２年２月１３日に開催され，続いて開催された学位論文審査会におい
て慎重に審議を行った。審査の結果，本論文は環境や人間の行動に注目した独創的アプローチに
より現地の健康課題の解決に資する有用な知見や技術を提案していること，論文の内容の一部が
３つの査読付きジャーナル論文が既に出版されていることなどから，社会的および学術的に重要
な貢献をしていると判断でき，博士（工学）を授与するに値すると全員一致して判定した。 


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