Ehime University Institutional Repository

Ehime University (愛媛大学)博士(農学)thesi

Saranta, Sawettanun

1496

 
 
学位論文全文に代わる要約 
Extended Summary in Lieu of Dissertation 
 
 
氏名： 
Name 
Saranta Sawettanun  
 
学位論文題目： 
Title of Dissertation 
Effect of D-allulose on fermentation of bread dough, and physicochemical, 
and organoleptic properties of bread 
(パン生地の発酵およびパンの物理化学的性質と官能特性に及ぼす
D-アルロースの影響) 
 
学位論文要約： 
Dissertation Summary 
 
Bread has remained the staple food for human diets in many countries since then until now due to it is 
a convenient product serving with nutrients. Bread is produced from dough which is a mixture of 
wheat flour, salt, yeast, and water as the fundamental ingredients. Bread making is mainly divided the 
following four steps: bread dough formation, fermentation, baking process, and cooling process. 
Methods and ingredients have continuously developed and modified into different types of bread such 
as white bread, sourdough bread, French bread and so on. Therefore, producers have to provide the 
high quality of bread in terms of health and sensory qualities (appearance, texture and flavor). Sugar, 
such as disaccharides and monosaccharides, is frequently used as an additional ingredient in bread 
production as it makes positive impacts on the quality of bread in terms of flavor, odor, color, texture, 
and preservation. The taste of bread is greatly affected by the intensity and taste quality in sweetness 
of sugar added. Additional sugar improves the odor and color of the bread, that is depending on the 
rate Maillard and Caramelization reaction in baking process (Pico et al., 2015). Moreover, it also 
improves the bread texture. This is due to the following two factors: The first is carbon dioxide gas 
produced during yeast fermentation, and the added sugar allows the bread expansion to increase by 
the CO2, which results in softer and spongier bread (Ortolan & Steel, 2017). The other factor is the 
effect on wheat starch. Suc increases the gelatinization temperature during baking process which 
allows the bread to fully expand and improve the texture of final bread (Allan et al., 2018; Bolger et 
al., 2021). In addition, sugar is reported to improve the bread preservation that is, delaying the change 
of bread texture and preventing spoilage through reducing water activity (Pateras, I.M.C., 2007). This 
is why sugar is widely used in the production of bread. However, the effectiveness on bread quality 
parameters greatly depends on the type of sugar added. 
Rare sugar is defined as monosaccharides and their derivatives that are presented in the 
limited quantities in nature. Izumori (2006) developed the method for the mass production of rare 
sugars known as “Izumoring”. The success of rare monosaccharides in mass production is D-allulose 
(Alu), D-tagatose (Tag), D-allose (All), and so on. Among those rare sugars, the most widely studied 
rare monosaccharie is Alu. Alu is the C-3 epimer of Fru and is considered a good alternative to Suc 
due to it has low calories and it is about 70% sweetness of Suc. Due to the development of 
 
 
Izumoring, however, the large quantities production of Alu was started in late 2020s, and Alu has 
been selling in the market in many countries. Many studies have been demonstrated that Alu could 
be able to prevent many diseases, for instant, anti-obesity by inhibiting the anti-fatty acid synthesis 
and fatty acid oxidation (Nagata et al., 2015), anti-diabetes by reducing the postprandial glucose 
levels (Hossain et al., 2015) and anti-inflammation and anti-oxidation (Han et al., 2020 & Murata et 
al., 2003). Due to its low calories and disease-preventing effect, Alu has been as a substitute for 
those common sugar in many foods. Several studies have revealed that the addition of Alu to foods 
enhances food properties as well as confer disease prevention, which attract the healthy lifestyle 
consumers. Moreover, Alu was also expected to be used as a low calorie sweetener in many foods 
including bakery products. However, there is little information regarding the effect of Alu on 
fermented bakery products. Therefore, this research aims to investigate the effects of Alu addition on 
each processing process of bread including yeast fermentation and the influences of Alu on bread 
quality, by comparing with Suc. Alu used as a bread ingredient was applied to bread dough in the 
following three forms: In chapter 2, Suc as an ingredient was 100% replaced with Alu; in chapter 3, 
Suc was partially (25, 50, and 75%) replaced with Alu; and in chapter 4, Suc at the two levels of Brix 
value (°Bx) of 2 and 20 was 100% replaced with Alu-containing syrup RSS. 
 In Chapter 2, first we investigated if baker’s yeast S. cerevisiae uses the rare sugar Alu as a 
source of carbon. Alu was not utilized under the presence of other sugar; but utilizing Alu at a very 
low rate under a condition without other sugar. Thus, the yeast does not produce CO2 from Alu much. 
The hypothesized phenomenal of the mechanism of alcoholic fermentation of S. cerevisiae inhibited 
by Alu is depicted in Fig. 1. The use of 100% Alu for bread materials instead of Suc resulted in higher 
hardness and gumminess values than sugar-free and Suc-bread due to the low rate of CO2 production 
by baker’s yeast and the low expansion rate of dough, which was not related to the action of Alu on 
gluten rheology. 100% Alu-substituted bread had less hardening rate of crumb part during storage 
which associated with the low moisture loss. In addition, there was the high content of Alu remaining 
in bread after baking which is expected to promote the health benefits. However, a negative result in 
bread texture was obtained for 100% Alu-substituted bread.  
As shown in Chapter 2, replacing Suc with 100% Alu interfered the quality of the bread in 
appearance and texture as some reasons including the inhibition of yeast metabolism in bread dough. 
This is probably ascribed to that metabolic enzymes in yeast cell are inhibited by the presence of Alu. 
To test this hypothesis, it came to investigate the fermentability of bread dough and the bread quality 
under coexistence of Alu with Suc. Therefore in chapter 3, breads in which 25%, 50%, 75% and 
100% of Suc was replaced with Alu were prepared and their physical properties, volatile compounds 
and sensory properties were compared with 100% Suc-bread. Furthermore, the effects of Alu 
substitution on the hardening of the bread during storage were assessed. The replacement Suc with 
Alu up to 75% did not change physical and texture properties of the bread from those of 100% 
Suc-bread. The volatile compounds in the bread samples were classified into four chemical groups  
 
 
alcohols, ketones, aldehydes, and others. The amount and types of volatile compounds produced from 
100% Alu-bread differed from those sugar-free bread and 100% Suc-bread. The Alu-substitution 
breads, especially the Alu100 bread, had lower ethanol concentrations than the Suc bread. Seven 
ketone compounds were detected in all the Alu-substituted breads. 2, 2′-bifuran, 
3,5-dihydroxy-6-methyl-2-3-dihydro-4H-pyran-4-one, maltol, acetylfuran, and 2,3-pentanedione were 
presented in much higher amounts in the Alu-substituted breads than in the Suc100 bread which are 
characterized as a caramel-like aroma, roasted-like aroma, and sweet-butter scent. Furfural was a 
major aldehyde in the Alu bread. Moreover, acetic acid and propylene glycol ethyl ether were also 
found in a large amount in the Alu100 bread. The bread prepared with 100% Alu without Suc 
adversely affected the physical properties, resulting in a lower liking score. In contrast, using a 
mixture of Alu and Suc (both sugars contained at least 25% weight ratio) had comparable physical 
properties to the 100% Suc bread, leading to an acceptable level of preference. Moreover, bread using 
a mix of Alu and Suc retarded bread hardening during storage. The present results suggest that Alu 
substitution up to 75% allows the development of healthy bread with a high consumer overall 
acceptability and high storage stability. 
In chapter 4, rare sugar syrup (RSS), a commercial syrup containing Alu, was applied to the 
bread making and the quality of the final bread products were compared to that of breads added with 
high fructose corn syrup (HFCS) and Suc syrup (SS). Rare sugar syrup (RSS), has been developed 
from HFCS through alkaline isomerization, and is commercialized in some countries including Japan 
in 2011 (Takamine et al., 2015). The sugar composition of RSS is as follows: 45% Glc, 29% Fru, 13% 
rare sugars including 5% Alu, 5% Sor, 2% Tag, 1% All, and 13% oligosaccharide (Shintani et al., 
2017). Having those health and food processing advantages of rare sugars, RSS has been applied to 
beverages and bakery products like donut and cakes, which are available in the food market in Japan. 
Although RSS is employed for many bakery products, there are little scientific reports on the effects 
of RSS on the bread processing steps and the bread qualities. This chapter investigated the effects of 
RSS containing several rare monosaccharides on the baker’s yeast fermentation ability, and the 
physicochemical, texture characteristic, and consumer acceptance of bread. The addition of 2°Bx RSS 
to bread dough did not show any differences on bread physical characteristic and texture properties 
from SS- and HFCS-bread. The addition of 20°Bx RSS, in comparison with 20°Bx SS, resulted in a 
reduction in loaf height and volume, MC, and aw and increase in hardness and gumminess of bread 
crumb, which was similar result as HFCS-bread. 20°Bx RSS-bread generated lower amounts for most 
alcohols, ketones and aldehydes but higher amount for acetic acid than 20°Bx HFCS-bread but did not 
affect the aroma preference. Twenty-five Kagawa University students (62 % female and 38 % male) 
with the averages ages 22 years old were recruited as panelists. The breads were firstly evaluated the 
perception of external characteristic then after consuming the crumb parts of the three sample breads 
was investigated using the hedonic scales. The appearance, crumb color, crust color, and aroma, their 
preference score of all the bread samples were above the score of 3.0 which represents “neither like 
 
 
nor dislike”. The preference scores of the six items, softness, elasticity, sweetness, flavor, overall 
preference of 20°Bx RSS-bread had by 0.32 - 0.72 lower scores than 20°Bx SS-bread, suggesting that 
the RSS-bread has slightly inferior impression to the SS-bread. However, the other items including 
sweetness, flavor, overall preference, and intension of consumption were not different between HFCS- 
and RSS bread. Moreover, all the bread samples showed no significant difference in intention of 
consumption. 20°Bx RSS-bread, although not preferable compared to 20°Bx SS-bread, seems to be 
similar preference to 20°Bx HFCS-bread. The content of the saccharides that are added to bread 
dough is reduced by such the bread processes as alcohol fermentation and baking. Analysis of the 
residual sugars in 2°Bx sugar-breads showed that no saccharide has been detected in RSS-bread, 
which was the same as SS- and HFCS-bread. The low amount (2°Bx) of saccharide added to bread 
dough had been mostly degraded by alcohol fermentation with yeast or the Maillard and 
caramelization reaction induced with the baking treatment due to bakery yeast. On the other hand, 
Glc, Fru, Alu, and Sor were detected in 20°Bx RSS-bread. The healthy rare sugar Alu was remained 
with relatively high rate in 20°Bx RSS-bread. Therefore, the use of RSS at the relatively high 
concentration could be beneficial for bread making. 
To be concluded, single use of Alu as a sugar ingredient has negative impact on bread texture. 
On the other hand, a mixture of Alu and Suc (both sugars contained at least 25% weight ratio) had 
comparable physical properties to the Suc bread, leading to an acceptable level of preference. It is 
recommended that adding a mixture of 75% Alu and 25% Suc to bread dough is preferable to develop 
healthy bread (low calorie and anti-obesity effect) with a high consumer overall acceptability and high 
storage stability.
（様式５）(Style5) 
 
 
 
Figure 1 Hypothesis of inhibition mechanism of alcoholic fermentation of S. cerevisiae inhibited by 
Alu 
 
 
 
 
 
（様式５）(Style5) 
 
 
References 
Allan, M.C. & Mauer, L.J. (2022). Variable effects of twenty sugars and sugar alcohols on the retrogradation of 
wheat starch gels. Foods. 11(19), 3008. https://doi.org/10.3390/foods11193008 
Bolger, A.M., Rastall, R.A., Oruna-Concha, M.J. & RodriguezGarcia, J. (2021). Effect of D-allulose, in 
comparison to sucrose and D-fructose, on the physical properties of cupcakes. LWT – Food Science and 
Technology, 150, 111989. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2021.111989 
Han, Y., Yoon, J. & Choi, M.S. (2020). Tracing the anti-inflammatory mechanism/triggers of D-Allulose: A 
profile study of microbiome composition and mRNA expression in diet-induced obese mice. Molecular 
Nutrition & Food Research, 64(5): e1900982. https://doi.org/10.1002/mnfr.201900982 
Hossain, A., Yamaguchi, F., Hirose, K., Matsunaga, T., Sui, L., Hirata, Y., Noguchi, C., Katagi, A., Kamitori, K. 
& Dong, Y. (2015). Rare sugar D-psicose prevents progression and development of diabetes in T2DM 
model Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty rats. Drug Design, Development and Therapy, 9, 525–535. 
https://doi.org/10.2147/DDDT.S71289 
Izomori, K. (2006). Izumoring: a strategy for bioproduction of all hexoses. Journal of Biotechnology, 124 (4): 
717–722. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2006.04.016 
Murata, A., Sekiya, K., Watanabe, Y., Yamaguchi, F., Hatano, N., Izumori, K. & Tokuda, M.A. (2003). Novel 
inhibitory effect of D-allose on production of reactive oxygen species from neutrophils. Journal of 
Bioscience and Bioengineering, 96, 89–91. https://doi.org/10.1016/s1389-1723(03)90104-6 
Nagata, Y., Kanasaki, A., Tamaru, S. & Tanaka, K. (2015). D-psicose, an epimer of D-fructose, favorably alters 
lipid metabolism in Sprague-Dawley rats. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63, 3168–3176. 
https://doi.org/10.1021/jf502535p  
Ortolan, F. & Steel, C. J. (2017). Protein characteristics that affect the quality of vital wheat gluten to be used in 
baking: A review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 16(3), 369–381. 
https://doi.org/10.1111/1541-4337.12259 
Pateras, I.M.C. (2007). Bread spoilage and staling. In: technology of breadmaking. Springer, Boston, MA. 
https://doi.org/10.1007/0-387-38565-7_10 
Pico, J., Bernal, J. & Gómez, M. (2015). Wheat bread aroma compounds in crumb and crust: A review. Food 
Research International, 75, 200–215. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2015.05.051 
 
(注) 要約の文量は，学位論文の文量の約１０分の１として下さい。図表や写真を含めても構いません。
(Note)  The Summary should be about 10％ of the entire dissertation and may include illustrations 


English

Effect of D-allulose on fermentation of bread dough, and physicochemical, and organoleptic properties of bread

中根, 達人

1499

NAKANE, Tatsuto

（第５号様式）
学位論文審査の結果の要旨
氏 名  
審 査 委 員 
論  文  名 
2 型糖尿病における CPG16-JDP2 を介したインスリン発現抑制機構 
審査結果の要旨
2 型糖尿病は生活習慣や遺伝的な要因により空腹時の血糖値が高くなる疾病であり、世界
に約 5 億 4 千万人の患者が存在する生活習慣病として知られている。2 型糖尿病において高
血糖状態が長期間持続すると、膵臓細胞の機能障害（インスリン分泌障害，インスリン発
現抑制、アポトーシス）と肝臓や筋肉などの代謝組織におけるインスリン抵抗性が引き起こ
される。これらの現象は“糖毒性”と呼ばれ、糖尿病を深刻化させる要因として重要視されて
いる。2 型糖尿病が深刻化すると糖尿病性網膜症や糖尿病性腎症などの合併症が引き起こさ
れ、quality of life (QOL)が著しく低下することが問題となっている。糖毒性状態の膵臓細胞
におけるインスリン分泌障害はインスリン遺伝子の発現抑制によって引き起こされるが、そ
の発現抑制機構については未だ不明な点が多く残されている。そこで本研究では、糖毒性状
態においてインスリン遺伝子の発現を抑制するリン酸化シグナリングを明らかにすることを
目的とした。
１．糖毒性においてインスリン発現を抑制するリン酸化シグナル因子の同定
申請者は、2 型糖尿病モデル細胞であるラット膵臓細胞由来インスリノーマ INS-1 細胞
を 11.2 mM グルコース（インスリン分泌・発現を促進）および 22.4 mM グルコース（イン
スリン分泌・発現を抑制、糖毒性）を含む培地で 7 日間し、糖毒性状態における遺伝子の発
現をマイクロアレイにより網羅的に解析した。これらの中で、1.5 倍以上発現変動していた
プロテインキナーゼおよびプロテインホスファターゼの発現量をリアルタイム PCR により
定量した。その結果、9 種類のプロテインキナーゼの発現が変動することが明らかとなった。
そこで、これらの遺伝子を INS-1 細胞に過剰発現させてインスリンプロモーター活性に対す
る影響をルシフェラーゼアッセイによって調べたところ、candidate plasticity gene 16 (CPG16)
がインスリン遺伝子の発現を抑制することが明らかとなった。さらに、CPG16 のキナーゼ
活性欠損体を用いた解析により、CPG16 によるインスリン遺伝子の発現抑制にはキナーゼ
活性が必要であることが示された。
中根　達人
主　査　　杉山　康憲
副　査　　大西　浩平
副　査　　田中　直孝
副　査　　関藤　孝之
副　査　　田淵　光昭
 
 
２．CPG16 を介したインスリン遺伝子の発現抑制機構の解明 
CPG16 の基質タンパク質はほとんど明らかではないことから、CPG16 と同じファミリー
である DCLK キナーゼの基質転写因子である jun dimerization protein 2 (JDP2)に着目した。
CPG16 は JDP2 と直接結合することがプルダウンアッセイにより示され、JDP2 の DNA 結合
領域を含む C 末端領域をリン酸化することが in vitro キナーゼアッセイにより明らかとなっ
た。続いて、JDP2 がインスリン遺伝子の発現を制御するかをルシフェラーゼアッセイおよ
び EMSA にて調べたところ、JDP2 はインスリンプロモーター上の G1 領域に結合してイン
スリンプロモーターを活性化する新規インスリン転写因子であることが示された。また、糖
毒性状態の INS-1 細胞における JDP2 のインスリンプロモーターへの結合量は低下すること
が ChIP アッセイによって示された。続いて、CPG16 と JDP2 によるインスリンプロモータ
ー活性の制御を解析したところ、CPG16 は JDP2 によるインスリンプロモーターの活性化を
キナーゼ活性依存的に抑制し、この抑制には JDP2 の T116 が重要であることが示唆された。 
 
本研究により、CPG16-JDP2 経路が 2 型糖尿病の糖毒性におけるインスリン発現抑制に寄
与することが明らかとなった。このシグナル経路はインスリン遺伝子の発現制御の分子機構
の一端を解き明かしたものであり、2 型糖尿病の理解を深めるための優れた基礎的研究成果
であると評価できる。 
 
本論文に関する公開審査会は、令和 5 年 2 月 5 日に愛媛大学農学部で開催され、論文発表
と質疑応答が行われた。引き続いて行われた学位論文審査委員会で、本論文の内容を慎重に
審議した結果、審査委員全員一致して博士（農学）の学位を授与するものと判定した。 
 


Japanese

2型糖尿病におけるCPG16-JDP2を介したインスリン発現抑制機構

Ramida, Krumsri

1504

Assessment of allelopathic potential and the growth inhibitory substances in Thai forest plants for the development of bioherbicides

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)doctoral thesi

加藤, 宏章

KATO, Hiroaki

（第７号様式） 
学位論文審査結果の要旨
 氏 名 
 審 査 委 員 
 論  文  名 LIM1 は子宮内膜癌の悪性化に寄与する 
審査結果の要旨 
子宮体がんに対する新規の分子マーカーや治療標的の同定が望まれている。申請者は、TCGA 
(The Cancer Genome Atlas)に登録された子宮内膜がん組織の RNA-seq による遺伝子発現プロ
ファイルを比較することで進行期子宮体がんにおいて有意に発現上昇している転写因子 LIM h
omeobox 1 (LIM1)を候補遺伝子として同定した。子宮内膜がんにおける LIM1 の機能を子宮内
膜がん細胞株の Ishikawa 細胞と HEC50B 細胞を用いて、RT-qPCR による LIM1 発現および細胞
増殖能の比較を行い、LIM1 高発現であった HEC50B 細胞から LIM1 ノックダウン安定株（LIM-K
D 細胞）を作成し、細胞増殖能、遊走能、浸潤能を対照株と比較解析することで LIM1 発現が
腫瘍の増殖と浸潤能に関与する可能性を示した。さらに In vivo での Xenograft モデル解析で
は、LIM1-KD を移植したマウスで有意に腫瘍重量が減少した。LIM1 による遺伝子発現制御機構
を明らかにするために RNA-seq を行い、Control 細胞と比べ LIM-KD 細胞では CREB のリン酸化
に関連する一連の遺伝子の発現が低下していることが示され、LIM-KD 細胞および LIM-KD 細胞
由来腫瘍ともに CREB のリン酸化の有意な低下が確認された。これらの結果から子宮内膜がん
における転写因子 LIM1 による遺伝子発現調節が、細胞増殖等の様々な生体反応に働く CREB の
リン酸化を通じて腫瘍の悪性化に寄与している可能性を示し、LIM1 が進行期子宮体がんの治
療標的分子となりうると考えられた。 
加藤　宏章
主　査　　雑賀　隆史
副　査　　増本　純也
副　査　　廣岡　昌史
副　査　　川上　良介
副　査　　亀井　義明
公開審査会は、令和 4 年 12 月 22 日に開催され、申請者は、研究内容を英語で明確に発表した 
後に，審査員から本研究に関する以下のように 
・ 子宮内膜癌の臨床的背景と治療方針のなかで本研究の位置づけと方向性について 
・  また LIM1 を候補遺伝子とした理論的背景と得られた結果からの新しい展開の可能性 
・   正常臓器での LIM1 発現度合いと臓器特異性について 
・   LIM1 が CREB リン酸化への direct regulation の可能性の有無と今後の応用について 
・   LIM1 ノックダウン cell lines の違いとノックダウン法についての考察 
・   in vivo 標本における病理組織像の解釈について 
・   TypeⅠ腫瘍と typeⅡ腫瘍の臨床的悪性度の違いと細胞悪性度の関係について 
・   LIM1 が独立した予後因子である可能性とそれを検討する方向性について 
・   内分泌依存性腫瘍である細胞培養における女性ホルモンの影響について 
など多数の質問がなされた。 
これらの質問に対し申請者は的確に応答した。 
 
審査委員は，申請者が本論文関連領域に対して学位授与に値する十分な見識と能力を有 
することを全員一致で確認し，本論文が学位授与に値すると判定した。 
 
 


LIM1は子宮内膜癌の悪性化に寄与する

中尾, 恭久

NAKAO, Yasuhisa

（第７号様式） 
学位論文審査結果の要旨
 氏 名 
 審 査 委 員 
 論  文  名 O リングを用いた横行大動脈縮窄（OTAC）圧負荷心肥大・心不全マウス
モデルの開発
審査結果の要旨 
【研究内容のまとめ】左室肥大は、慢性的な全身性高血圧に対応して起こり、高血圧の独立し
た危険因子である。慢性的な左室後負荷の上昇は、心不全の主要な原因の一つであり、高い罹
患率と死亡率に関連している。したがって、心肥大に関する研究は、有害な心血管イベントを
予防するために不可欠である。マウスの横行大動脈縮窄（TAC）は、心臓圧負荷モデルとして
広く用いられ、過去 20 年間心不全と心肥大のメカニズムを理解するための優れた実験法とし
て用いられてきた。しかし、従来の縫合糸を用いた TAC は、手技の難しさから術者に大きく依
存し、その手技の習得に膨大な時間を必要とし、しかも大動脈縮窄の程度が不安定であった。
そのため、マウスを用いた心肥大を生じさせる簡便なモデルが求められていた。そこで本研究
では、マウスの左室肥大と心不全を引き起こす心臓の圧負荷を生じるリングによる横行大動脈
縮窄（OTAC）法の開発を目的とした。 
雄の 9～10 週齢（26.0±0.5g）C7BL/6J マウスを、偽手術（Sham）群、内径 0.50mm O リング
（OTAC0.50）または内径 0.45mm O リング（OTAC0.45）による２つの OTAC 手術群にランダムに
割り付け、OTAC 手術を行った。処置後、4 週間および 8 週間までマウスの観察を行った。 OTA
C 処置を受けたマウスは、処置後早期（48 時間後）に 6 群（Sham、OTAC0.50、OTAC0.45 を 4
週間または 8 週間追跡）各 14 匹（合計ｎ=84）とした。マウスは、メデトミジン、ミダソラム、
ブトルファノールの混合物を腹腔内投与して麻酔した。従来の TAC モデルと異なり、気管内挿
管を施行せず手技を行った。胸骨近位部に 2～3mm の縦切開による胸骨切開を行い、大胸筋を
中尾　恭久
主　査　　泉谷　裕則
副　査　　茂木　正樹
副　査　　髙田　秀実
副　査　　越智　博文
副　査　　松原　裕子
鈍的に剥離した。胸腺を左右に分けた避けた後、胸腺の後方に位置する横行大動脈を確認した。
手技の再現性の向上のために、大動脈の直径を変える脂肪組織はできるだけ丁寧に剥離した。
O リングを横行大動脈（腕頭動脈と左総頚動脈の間）に装着し、糸で固定した。切開部は 6-0
絹糸を用いて層を縫合した。Sham マウスは、O リングを挿入せずに同様の操作を行った。そし
て、心機能や心筋性状を心再コー図検査、組織重量の計測、組織学的解析、定量的リアルタイ
ム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）により遺伝子発現を検出し評価を行った。この動
物実験は、愛媛大学医学部の動物実験の倫理委員会によって承認されている。 
Sham、OTAC0.50、OTAC0.45 の平均手術時間（開胸から閉胸まで）はそれぞれ 8.2±0.3 分、1
7.3±0.5 分、17.9±0.6 分だった。また、麻酔から胸部閉鎖までの処置中の Sham、OTAC0.50、O
TAC0.45 マウスの死亡率はそれぞれ 0％（0/28）、9.7％（3/31）、12.5％（4/32）であった。
周術期死亡を除いた Sham 群および OTAC 手術群の Kaplan-Meier 生存曲線を解析では、OTAC0.4
5 群の死亡率は Sham 群および OTAC0.50 群と比較し有意に高かった。この遠隔期での推定死因
は、左室収縮機能の低下とそれに伴う心不全と考えられた。 OTAC による圧負荷は、全心臓の
重量増加および左室重量/脛骨長の増加で表される左室肥大を促進することが示された。術後
4 週目の左室重量/脛骨長比は、Sham マウスと比較し OTAC0.50 では平均 1.4 倍、OTAC0.45 で
は 1.5 倍に有意に増加した。さらに、術後 8 週日には、OTAC 手術群の左室重量/脛骨長比は、
Sham マウスと比較し、OTAC0.50 では平均 1.8 倍、OTAC0.45 では平均 2.1 倍と有意な増加を示
した。さらに、OTAC による圧負荷は、肺重量の増加、すなわち心不全による肺うっ血を誘導
した。心臓超音波法による心機能の生理学的評価では、術後 1～8 週で Sham 群と比較し、OTAC
両群で左室内径短縮率が低下していた。組織学的解析による評価では、心筋細胞の短軸長及び
心筋細胞横断面積が、OTAC 両群で Sham 群よりも有意に増大していた。ピクロシリウスレッド
染色で評価した左室の線維化は、Sham 群と比較して OTAC 両群で有意に増加していた。 OTAC
群の左室における心不全、心肥大、および線維化のマーカーの遺伝子発現レベルを qRT-PCR 検
査で測定した。 Nppa、Nppb、Actal、Collal、Col3al の mRNA 発現量は両 OTAC 群で Sham 群と
比較し有意に高かった。これらの結果は、組織学的所見との一貫性を示した。 
本研究により、簡便で効率的かつ再現性の高い新規心肥大・心不全マウスモデルが開発され
た。このモデルは、心不全や心肥大マウスモデル作成のための手技習得時間の節約、手技簡略
化に加え心肥大・心不全発症に関しての高い再現性を兼ね備えた病態モデルであり、今後の心
肥大・心不全研究に多大な貢献をもたらすことが期待される。 
【審査会のまとめ】 
 公開審査会は、令和 5 年 1 月 27 日に開催された。申請者は、研究発表を英語で明確に行い、
本研究の背景や意義、limitation や今後の展望などについて述べた。発表後に審査委員らか
ら以下の質疑があった。１）従来法から本法への開発に至った経緯、2）Sham 群のコントロー
ルとしての意義、3）術後急性期に死亡したマウスの死因等の解析結果、4）O リング除去の試
みやその結果、5）血管壁や組織の変化、6）心不全の有無による検討、7）心不全を発症する
以前の急性期の遺伝子発現の検討、7）今後の研究の課題や具体的な研究計画などについての
質問がなされ、申請者はこれらに対して的確に応答した。 
審査委員は、申請者が本論文関連領域に対して学位授与に値する十分な見識と能力を有する
ことを全員一致で確認し、本論文が学位授与に値すると判定した。 
 


Oリングを用いた横行大動脈縮窄(OTAC)圧負荷心肥大・心不全マウスモデルの開発

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)thesi

牧田, 愛祐

MAKITA, Ayu

 
（第 12号様式） 
 
 
学 位 論 文 の 要 約 
（ 研 究 成 果 の ま と め ） 
 
 
 
            氏   名  牧田 愛祐 
 
 
            学位論文名  Real-time tissue elastography で評価した腎の弾性と腎
線維化の関連 
 
 
    学位論文の要約 
 
【背景】 
慢性腎臓病（CKD）は進行すると透析療法や腎移植が必要な末期腎不全に至る。また、
CKD は心血管疾患のリスク因子でもある。CKD に共通した病理学的変化である腎臓
の線維化は CKD の進行を予測する重要な因子であるが、その評価には腎生検が必要で
ある。しかしながら、腎生検は出血や疼痛、動静脈瘻などの合併症のリスクを伴う侵
襲的な検査であり、また、萎縮腎や片腎など、腎生検の施行が困難な症例も存在する。
そのため、非侵襲的な腎線維化の評価方法の開発が課題となっている。 
エラストグラフィは超音波を用いて生体組織の弾性を計測する方法で、非侵襲的な線
維化評価法として肝臓領域では確立されている。一方で、腎線維化の評価における有
用性については、文献上、その結果が一致していない。  
エラストグラフィのうち Real-time tissue elastography（RTE）法は心拍変動による組織
の歪みを測定する方法であるが、本法では腎臓線維化を評価した報告はない。このた
め、今回、RTE で評価した腎弾性と腎線維化との相関について検証した。また、我々
はこれまでに、腎エコーで評価した腎末梢血管抵抗値（RI）は、腎不全の進行の予測
因子として有用であることを見出している。そこで、本研究では“Renal elasticity and RI 
conventional index”を定義し、腎線維化との関連について合わせて検討を行った。 
 
【方法】 
2018 年 2 月から 2019 年 3 月までに、愛媛大学医学部附属病院で腎生検と RTE、RI
の測定を施行し、腎生検組織での観察糸球体数≧5 個であった 29 例を対象とした。RTE
は腎生検の前日に、ARIETTA 850（Hitachi Medical Systems）を用いて、腎皮質の腎弾
性を測定した。 
腎生検組織を用いて、病理医が腎線維化を 3 段階（軽度：＜25％、中等度：25～50
％、高度：＞50％）のグレードに分類した。RTE で評価した腎の弾性ならびに RI と、
 
腎線維化グレードの相関について解析した。 
 
【結果】 
対象患者の年齢は 58.8±14.4 歳、eGFR は 55.2±20.5 mL/min/1.73m2 であった。CKD
の原疾患としては、IgA 腎症が 31.0%、糖尿病性腎症が 17.2%、腎硬化症が 20.7%であ
った。RTE で測定した平均腎弾性値は軽度 3.40±0.59、中等度 3.98±0.70、高度 4.77
±1.18 であった。 
腎弾性は腎線維化グレードと有意な相関があった（ρ=0.529, P=0.003）。軽度の線維
化と中等度以上の線維化を鑑別する腎弾性値のカットオフ値を 3.81 とした場合の感度
は 68.4％、特異度は 81.8％で AUC 0.778 であった。 
また、前述した我々の研究結果も踏まえると、RI と RTE は腎不全や腎線維化に大き
く関係すると考え、腎線維化グレードを従属変数、RI と RTE を独立変数として線形回
帰分析を行い、“Renal elasticity and RI conventional index” =4.08×RI+0 .293×RTE−2.019 を
定義した。“Renal elasticity and RI conventional index”は腎線維化グレードと有意な相関
があった（ρ=0.712, P<0.001）。軽度の線維化と中等度以上の線維化を鑑別する腎弾性
値のカットオフ値を 1.75 とした場合の感度は 88.9％、特異度は 100％で AUC 0.967 で
あった。 
 
【結論】 
RTE で評価した腎弾性は、腎生検組織の線維化グレードと相関していた。RTE は、
CKD の腎線維化を評価する有用なモダリティとなりうると考えられた。 
 
本研究は愛媛大学医学部附属病院の倫理委員会（承認番号: 1603002）によって承認さ
れている。 
なお、この学位論文の内容は、以下の原著論文に既に公表済である。 
 
Ayu Makita, Tomoaki Nagao, Ken-ichi Miyoshi, Yohei Koizumi, Mie Kurata, Fumikazu 
Kondo, Satoru Shichijo, Masashi Hirooka, Osamu Yamaguchi 
The association between renal elasticity evaluated by Real-time tissue elastography 
and renal fibrosis 
Clinical and Experimental Nephrology 2021;25(9):981-987.  
DOI:10.1007/s10157-021-02063-2. 
 
 
 
 
 
 
 


Real-time tissue elastographyで評価した腎の弾性と腎線維化の関連

Ehime University (愛媛大学)博士（理学）doctoral thesi

東垣, 大祐

TOUGAKI, Daisuke

魚類群集形成における外部および内部要因：下流域における水域ネットワークと上流域における種間相互作用

Ehime University (愛媛大学)博士（理学）thesi

家田, 曜世

IEDA, Teruyo

（ 第 ３ 号 様 式 ） (Fo rm No.  3 )  
学 位 論 文 要 約
Dissertation Abstract
氏  名  (Name)  家 田  曜 世
論 文 名： 環境保存試料中有機ハロゲン化合物の網羅的スクリーニングと 
レトロスペクティブ解析
(Dissertat ion Tit le)  Comprehens ive screening and ret rospect ive  analys is  of  organic  ha logen 
compounds in archived env i ronmenta l  samples  
研究背景と目的  
近年、化学物質の数は指数関数的に増加しており、日々の人間活動を通して多様な化
学物質が環境中に排出されていると推測される。国際条約等で規制されている有機ハロゲ
ン化合物 (OHCs)については監視体制が構築されているものの、対象化合物は全体のごく
一部に過ぎない。また、個々の物質の定量値を得ることを目的とした一般的なターゲット分
析法では、測定の妨害になり得る成分を選択的に除去することで高感度・高精度な定量を
可能にする一方、対象外の物質を探索（スクリーニング）する目的には適していない。その
ため、多様な化学 物質を包括的にスクリーニングすることが可能なノンターゲット分析手法
の開発が求められている。
本研究では、環境試料中のOHCsを網羅的にスクリーニングできる手法開発を主な目的
とし、その検証と応用として環境保存試料中OHCsのレトロスペクティブ解析を試みた。分析
手法には、二次元ガスクロマトグラフと高分解能飛行時間型質量分析計を組み合わせたG
C×GC-HRToFMSを採用し、先ずデータ解析ワークフローの構築と評価を行った。次に、物
質同定の手がかりとなる分子イオンの検出を目的として、ソフトイオン化法の最適化と効果
を検証した。そして、構築した分析手法を用いて貴重な環境保存試 料である日本海深海
堆積物コア試料の粗抽出液を測定し、OHCsの網羅的スクリーニングとレトロスペクティブ解
析を実施した。 
環境試料網羅的スクリーニングのためのデータ処理手法の構築と有効性評価  
GC×GC-HRToFMSを用いた環境試料網羅的スクリーニングにおけるデータ解析手法の
問題を解決するため、互いに相補的な２つのデータ解析ワークフローを構築し、その評価を
行った。主要な有機ハロゲン化合物の混合標準溶液を用いてGC×GC-HRToFMS分離条
件の最適化を行い、河口域底質試料の粗抽 出液を測定した。得られたデータを構築した
解析ワークフローに従い処理し、多種類の化合物における同定を試みた結果、ターゲットス
クリーニングでは粗抽出液中に存在する微量のOHCs検出が可能であったが、異性体の同
定精度については改善すべき課題が残った。一方、ノンターゲットスクリーニングでは、マス
スペクトルのデコンボリューション処理を行うことで、マススペクトルライブラリー検索のヒット率
が向上することを確認した。GCの保持指標（RI）や分子イオンの質量誤差など5種のクライ
テリアを設定した結果、全てのクライテリアをパスした成分は、全ピーク数の0.03%となった。
登録物質数が最も多いマススペクトルライブラリーでさえ環境分析には不十分であることや、
一般的に使用されている電子イオン化（ EI）法では、分子イオンが検出され難いことなどが
要因と考えられた。 
 
不活性ガスを用いたイオン化法による有機ハロゲン化合物の網羅的スクリーニング 
有機ハロゲン化合物の分子イオン検出を目的とし、不活性ガスを緩衝ガスとして利用し
た電子捕獲型負イオン化に基づくソフトイオン化法をGC×GC-HRToFMSを用いた環境分
析用に最適化した。緩衝ガスには3種類のガスを検討し、高塩素化芳香族化合物のM−を
選択的かつ高感度に検出する条件を検討した結果、低いイオン源温度と低流量（0.1 mL
/min）のArガスの使用が最も良好であった。Arイオン化法と従来のEI法を用いてハウスダス
ト粗抽出液のGC×GC-HRToFMS測定を行った結果、Arイオン化の方が芳香族塩素系化
合物の分子イオンM−の高感度かつ選択的な検出に適していることが判明した。これにより、
分子イオンM−の精密質量から化合物の化学式推定も可能となり、環境試料中に存在する
未知の有機塩素化合物の同定にも有効であることが示された。また、電子捕獲型負イオン
化では、フラグメントイオンが生じにくいことで、干渉するマススペクトルが大幅に減少し、検
出能力が向上した。さらに、Cl−やBr−などのハロゲンアニオンを利用したマスクロマトグラムに
よる探索は、環境試料中 OHCsの網羅的スクリーニングに有用であることが示され、複雑な
マトリクスで構成される環境試料中に存在するOHCsを選択的に検出する手法としても有効
であると考えられた。 
 
海底堆積物コア試料中有機ハロゲン化合物のレトロスペクティブ解析  
本研究で開発したArイオン化法とEI法を併用した環境 試料の網 羅的スクリーニング手
法の有効性を検証すると共に、貴重な日本海深海堆積物コア試料に本分析技術を適用
することで、OHCsの過去からの汚染（分布と消長）を復元するためのレトロスペクティブ解析
を試みた。２つのイオン化法（ EI法とArイオン化法）を用いて日本 海深海堆積 物コア試料
の粗抽出液をGC×GC-HRToFMS測定し広範 囲の精密質量スペクトルを包括的に解析し
た結果、ポリ塩素化ビフェニル（PCBs）など既知の人為起源有機ハロゲン化合物だけでな
く、天然起源の有機ハロゲン化合物（HNPs）を検出することに成功した。HNPsの鉛直プロ
ファイルはPCBsと異なり、表層に近くなるにつれて濃度が高くなる傾向が認められた。このH
NPsによる濃度変化は、近年における海洋環境の変化を表している可能性があり、科学的
にも特筆すべき結果である。現在、開発した手法により検出された数 千の化合物のうち鉛
直プロファイルを解析している物質は限定されるが、継続的に解析を進め多数の化合物で
同定が可能となれば、調査海域における古環境の復元と新たな学説の発見につながること
も期待される。  


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