Ehime University Institutional Repository

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)thesi

堀内, 史枝

HORIUCHI, Fumie

 
 
（第７号様式） 
 
学位論文審査結果の要旨 
 
氏     名 堀内 史枝 
審 査 委 員 
 
                             
 
                        
 
                       
 
                     
 
                   
       
論  文  名  自閉症スペクトラム障害における感情および行動上の問題：学齢・性別毎の 
定型発達児との比較 
 
審査結果の要旨（2,000 字以内） 
 
 発達障害の１つである自閉症スペクトラム（ASD）はその発達障害に併存する二次性障害を早
期に捉えて介入することが重要である。本論文は ASD 症例について自己記入式質問票 SDQ を評価、
解析し、二次障害の予防および治療について考察した研究である。 
 解析は ASD およびコントロール群を年齢および性別で分類し、情緒、行為、多動・注意、仲間
関係、社会性の 5 つの項目について比較検討を行った。その結果、情緒については ASD 群で小学
校高学年にピークとなり、行為については女性で小学校高学年顕著となった。多動・注意では中
学生で顕在化し、仲間関係は ASD 群では年齢に関わらず高値となり、社会性は男性で小学校高学
年、女性で低学年より獲得できることが分かった。以上より、SDQ を用いて年齢・性別の ASD の
問題点を評価するは二次障害の予防および治療に有用である、と結論している。 
 
本研究に関して各審査委員より、いくつかの質問が行われた。その質疑の内容について以下に簡
単に記載する。 
１． ASD 症例が増えている要因はなにか。→診断の問題や社会的背景の変化が考えられる。 
２． 治療や薬物の効果はどうか。→20％の症例が薬剤を使用しており、80％は親の希望などに
より介入している。 
３． コントロール群の男性で臨床群が多いのはなぜか。→本来 10％程度は正常でも存在して
おり、普通の結果と考えられる。 
４． ASD の病態で分かっていることはあるか。→いくつかの遺伝子異常も同定されているが、
確定したものはない。 
５． 疾患概念について。→今回 DSM-IV を使用したが、DSM-V で概念の変更が行われている。 
 
 
６． 早期介入は有効か。→行動パターンを同定して介入すれば、有効と考えられる。 
７． ASD 群とコントロール群では地域性に差はないか。→差はほとんどない。 
８． SDQ を両親ではなく本人に評価させると違った結果が出るのではないか。→現在それは検
討中である。 
９． 早期介入の適正な時期はどうか。→時期や介入内容は不明な点があるので、今後検討して
いきたい。 
１０．ASD 群における SDQ で支援不要となる理由はどうしてか。→SDQ 回答者が母親であり、 
  親から見ると正常と判断されてしまうため。 
１１．調査票一部未記入者を調査対象から除外している点について今後どう扱うか。→今回の
解析結果と齟齬がないかどうか検討したい。 
 
以上申請者は各質問に対して明確に応答し、学位授与に値する充分な見識と能力を有するこ
とが認められた。 


English

Age- and sex-related emotional and behavioral problems in children with autism spectrum disorders: Comparison with control children

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)doctoral thesi

白戸, 玲臣

SHIRATO, Akitomi

 
 
（第７号様式） 
 
学位論文審査結果の要旨 
 
氏     名 白戸 玲臣 
審 査 委 員 
 
 
 
 
 
 
       
論  文  名：AKR1C2 により導入される膀胱がん細胞のシスプラチン耐性 
 
審査結果の要旨 
【背景】 
 ヒト膀胱癌細胞株 HT1376 より作製したシスプラチン耐性株 HT1376-CisR を用いたシスプ
ラチン耐性のメカニズムが明らかにされてきた。HT1376 および HT1376-CisR に発現している
タンパクをプロテオミクス解析により網羅的に同定し比較した結果、36 種類のタンパクで発
現量に有意差があった。中でも HT1376-CisR で増加したタンパクは 21 種類あった。そのうち、
aldo-keto reductase family 1 member C2 (AKR1C2)は、HT1376 では発現が認められない一方、
HT1376-CisR にのみ強発現していたので、今回、AKR1C2 に着目した。 
 AKR スーパーファミリーは nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) 依存性の酸
化還元酵素群で、内因性および外因性の様々な物質を代謝する。多様な癌腫の抗癌剤耐性株に
おいて AKR の過発現が報告されており、抗癌剤耐性との関連が報告されている。 
 本研究においてはシスプラチン耐性メカニズムにおける AKR1C2 の機能解析を分子細胞学
的に行った。 
 
【方法】 
 ①タンパク発現の有無は、Western blotting 法により検討した。②siRNA 法を用いて、AKR 
1C2 を knock down した株(HT1376-CisR-AKR1C2(-))を作成し、シスプラチンに対する感受性
を比較した。③AKR1C2 に特異的な阻害薬である 5β-cholanic acid を HT1376-CisR に添加し、
同様にシスプラチンに対する感受性を比較した。④次に 3 つの細胞株（HT1376、HT1376-CisR、 
HT1376-CisR-AKR1C2(-)）をシスプラチン非存在下あるいは存在下に培養し、細胞内活性酸素
濃度(Reactive Oxygen Species; ROS)を測定した。さらには酸化剤であるメナジオンを添加し
 
 
て、ROS を測定した。 
 
【結果】 
 ①まず Western blotting 法により AKR1C2 は、HT1376-CisR で過剰発現する一方、HT1376
では発現していないことを確認した。②HT1376、HT1376-CisR、HT1376-CisR-AKR1C2(-)をそ
れぞれ濃度勾配をつけたシスプラチン環境で培養した結果、HT1376-CisR-AKR1C2(-)は HT137
6 同等にシスプラチン感受性を回復していた。③また、AKR1C2 に特異的な阻害薬である 5β-
cholanic acid を HT1376-CisR に添加し同様の実験を行った結果、100 μg の 5β-cholanic acid
の添加はシスプラチン感受性の回復につながることが確認された。④次に 3 つの細胞株におけ
る ROS を測定すると、HT1376 に比較して HT1376-CisR では ROS は抑制されていた。HT1376
-CisR-AKR1C2(-)における ROS は HT1376-CisR より高濃度で、HT1376 よりは低濃度であった。
また、それぞれの細胞株を 10-4 M のシスプラチン存在下で培養すると、HT1376、HT1376-Ci
sR-AKR1C2(-)では ROS は増加するのに対し、HT1376-CisR ではその変化が認められなかった。
酸化剤であるメナジオンを用いても同様の結果であった。 
 
【結語】 
 シスプラチン耐性を示す HT1376-CisR において過剰発現していた AKR1C2 を knock down、
もしくは阻害することでシスプラチン感受性が回復した。また、AKR1C2 過剰発現により細胞
内 ROS は低濃度に抑制されていた。さらにシスプラチンや酸化剤を用いた酸化刺激試験にお
いて本来増加することが予想される ROS は HT1376-CisR では増加しないのに対し、HT1376-C
isR-AKR1C2(-)では増加が認められた。我々の作成したシスプラチン耐性膀胱がん細胞株はシ
スプラチンの酸化作用がもたらす ROS 環境から回避させる手段として AKR1C2 を過剰発現さ
せ、その抗酸化作用によりシスプラチン耐性を獲得したと考えられた。 
 
 
本論文の公開審査会は平成２６年２月４日に開催された。申請者は研究内容を明確に発表
し、以下の内容を含む多くの質疑に対し的確に応答した。 
１) AKR1C2 の発現メカニズムについて、２）Keap1/Nrf2 と AKR1C2 がどのように関わって
いるのか、３）AKR1C2 の正常組織における局在、４）細胞死のメカニズムおよび ROS がど
の程度関わるのか、５）AKR1C2 の発現量が膀胱腫瘍の悪性度、ステージに関連するか、６）
臨床応用するためにはどのようにすればよいのかなど。 
 
本研究は膀胱がんのシスプラチン耐性のメカニズムを明らかにし、シスプラチン感受性の有
無を予測できる可能性を示した優れた基礎研究であるが、臨床応用にはさらなる発展が期待さ
れた。審査会は全員一致して本論文が学位論文に値すると判定した。 
 


Cisplatin resistance by induction of aldo?keto reductase family 1 member C2 in human bladder cancer cells

太田, 雅明

OHTA, Masaaki

 
 
（第 12 号様式） 
学 位 論 文 の 要 約 
（ 研 究 成 果 の ま と め ） 
 
            氏   名 太田 雅明 
            学位論文名 HDR 症候群患者で同定されたドミナントネガティブ作用を持つ新たな
変異 GATA3 遺伝子 
 
    学位論文の要約 
           
【諸言】 
HDR 症候群は、副甲状腺機能低下症（hypoparathyroidism）、感音性難聴（sensorineural 
deafness）、腎形成不全（renal dysplasia）を三主徴とする常染色体優性遺伝形式をとる稀な疾
患であり、染色体 10p15 に位置する GATA3 遺伝子のハプロ不全が病因であると考えられている。 
GATA3 遺伝子は、GATA ファミリーに属する転写因子をコードし、2 つの transactivating 
domain と 2 つの zinc finger domain(ZnF1, ZnF2)を有している。野性型 GATA3 の機能解析か
ら、ZnF2 は DNA に結合し、ZnF1 は DNA 結合を安定化にすることに重要であることが明らか
にされた。また、ZnF1 は FOG などの他の補因子との相互作用にも関与する。 
GATA3 は、胎生期の中枢神経・腎臓・副甲状腺・内耳・T 細胞などの血球系で発現し、胎児の
発生・発育に重要な役割を担っており、GATA3 遺伝子のノックアウトマウスは、胎生期に致死
的な経過を辿る事が知られている。 
我々は HDR 症候群の新生児症例から新たな GATA3 変異を見いだし、変異蛋白の機能を明ら
かにすることを目的として研究を行った。 
【方法】 
1. GATA3 遺伝子変異の同定 
患者両親の同意を得て患児の末梢血より単核球を分離し、DNA を抽出した。GATA3 の coding
領域を PCR で増幅し、直接シークエンス法により GATA3 遺伝子変異の検索を行った。 
2. Western blot 解析 
N 末に Flag tag 配列を付加した野生型 GATA3 および患者にみられた変異型 GATA3 の cDNA 全
塩基配列を発現ベクターpcDNA3.1に挿入し、HEK293細胞に遺伝子導入、24時間後に cell lysate
を回収した。GATA3 蛋白の発現を anti-Flag 抗体を用いて確認した。 
3. Luciferase assay 
GATA3 によって制御される NKG2A 遺伝子のプロモーターを用いてルシフェラーゼアッセイを
行い、野生型および変異型 GATA3 の転写活性化能を比較検討した。NKG2A (GenBank Accession 
No.NM_007328)の 1st ATG 配列より 2.5kb 上流までの領域を PCR で増幅し、pGL3-basic ベク
ターに挿入したものを NKG2A プロモーターベクターとして用いた。これを前述の野生型および
変異型 GATA3 発現ベクターとともに HEK293 細胞に遺伝子導入し、24 時間後に cell lysate を
回収し、解析に用いた。 
 
 
 
4. Gel Shift assay 
GATA consensus sequence を含む oligo プローブを用い、野生型および変異型 GATA3 の DNA
結合能をゲルシフトアッセイにより比較検討した。 
【結果】 
① 患児末梢血 DNA を用いた解析により、GATA3 エクソン 5 にヘテロ接合性の c.1516G＞C 
(p.Cys321Ser) 変異を見いだした。この点変異により ZnF2 に位置し種間で高度に保存され
ているシステインの置換が生じた。この変異は新規変異であり、コントロール 100 検体の解
析から多型は否定された。 
② HEK293 細胞に変異型 GATA3 を強制発現させウエスタンブロット解析を行ったところ、変
異 GATA3 蛋白は安定して発現していた。 
③ GATA3によって制御されているNKG2A遺伝子のプロモーターを用いたルシフェラーゼアッ
セイでは、Cys321Ser 蛋白は転写活性を有さず、さらに野生型 GATA3 の転写活性を容量依
存性に抑制した（dominant negative 効果。） 
④ ゲルシフトアッセイでは変異 GATA3 蛋白は DNA 結合能を喪失していた。 
【考察】 
 GATA3 Cys321Ser は DNA 結合能を失っており、その dominant negative 効果には野生型
GATA3 との DNA 結合の競合以外のメカニズムが考えられる(蛋白結合の阻害など)。HDR 症候
群は、GATA3 のハプロ不全により生じると考えられているが、この症例においては、GATA3 の
変異は単なる機能喪失ではなく、野生型 GATA3 に対する抑制効果を示しており、GATA3 の機能
喪失型の変異を有する症例とは症状、経過が異なる可能性がある。 
 
【結語】 
GATA3 のハプロ不全以外に、変異 GATA3 の野生型 GATA3 に対するドミナントネガティブ作用
も、HDR 症候群の病因として重要な役割を果たしていると考えられた。 
 
主論文： Masaaki Ohta,Minenori Eguchi-Ishimae,Mayumi Ohshima,Hidehiko Iwabuki,Koji Tak
emoto,Kikuko Murao,Toshiyuki Chisaka,Eiichi Yamamoto,Takashi Higaki,Keiichi Isoyama,Ma
riko Eguchi,Eiichi Ishii：Novel dominant-negative mutant of GATA3 in HDR syndrome. 
Journal of Molecular Medicine (89,1,43-50) 


novel dominant-negative mutant of GATA3 in HDR syndrome

マーガレット, スパフォド

高橋, 基泰

Takahashi, Motoyasu

Japanese

翻訳 コントラスティング・コミュニティーズ（その4）

Ehime University (愛媛大学)博士(工学)thesi

木村, 正義

KIMURA, Masayoshi

道路照明における鉛直面照度の重要性と照明光のベクトル的取り扱いの必要性

冨田, 雄一

TOMIDA, Yuichi

高速道路盛土の液状化対策の実現に向けた不飽和化工法の研究

兼平, 裕子

英領およびEU 域内オフショアを利用した国際的租税回避問題

松野尾, 裕

御殿場農民福音学校と食肉加工品製造の実践

山口, 正隆

野中, 浩一

畑田, 佳男

内湾・内海における気圧・風速・波高の長期変動および気候変動指標との相互関係の考察

東, 正史

渡辺, 政広

友近, 榮治

佐々木, 悠平

都市下水道管渠網の空気圧縮を伴う雨水流出シミュレーションモデル

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