Ehime University Institutional Repository

愛媛大学Ehime University博士(工学)doctoral thesi

野村, 勇太

NOMURA, Yuhta

English

Role of ppGpp in regulation of purine biosynthesis and translation process in plant chloroplast

津山, 忠久

TSUYAMA, Tadahisa

Japanese

ホットワイヤ法による溶接金属部の機械的性質に及ぼす微細組織の効果およびこの効果に基づく溶接法開発に関する研究

松永, 達

Matsunaga, Tatsushi

EnergyproblemsandEuropeanIntegration: CanEnergypolicygivenewmomentumtoEuropeanIntegration?

高橋, 基泰

Takahashi, Motoyasu

旧上田藩上塩尻村同族・分家誌

佐藤, 亮子

各地で広がる市活動の運営実態と今後の展開に向けた課題 : 半島担い手強化プロジェクト「手と口の距離を近づけるまちづくりとマーケットを開こう」の調査結果をふまえて

FUJIE, Keiko

Tradition and Transformation in Cape Cod Literature : Robert Finch's The Primal Place and Henry David Thoreau's Cape Cod

千代田, 憲子

沿道景観の貢献要素に関する考察-2

岡本, 威明

岡部, 麻未

田頭, 歩佳

篠原, 一作

島田, 郁子

田中, 守

主観的幸福度の調査 : 12の生活環境要因を指標として

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)thesi

有光, 英治

ARIMITSU, Eiji

 （第３号様式）     
 
 
学 位 論 文 要 旨 
 
 
 
            氏   名        有光 英治 
 
 
 
            論 文 名  リポソーム添加型無細胞蛋白質合成系による膜蛋白質受容体の 
薬理学的機能解析 
 
 
 
 
 
 
 
学位論文要旨 
【背景と目的】 
無細胞蛋白質合成法は、細胞を直接使用せず、蛋白質合成系に関わるリボソーム、酵素などを
利用して in vitro にて蛋白質を合成する方法であり、蛋白質の構造解析や医薬品やワクチン製
造に応用されている。リポソームは、リン脂質から構成される人工の微粒子であるが、澤崎らは、
この人工的な膜構造の存在下に無細胞合成系と組み合わせて、膜蛋白質を合成する方法を報告し
てきた。しかし、これにより発現された膜蛋白質の機能的な評価は不明である。そこで申請者は、
リポソームの存在下に無細胞蛋白合成系を用いてドパミン D1 受容体タンパク質の発現を行い、
放射性リガンドを用いた特異的結合能を検討した。また、一定濃度の放射性リガンドの存在下に
各種ドパミン受容体アンタゴニストおよびアゴニストを添加して得られる置換曲線からリポソー
ムに発現した受容体のドパミン受容体リガンドに対する選択性を検討した。  
本研究はリポソーム存在下で膜蛋白質受容体を発現し、その受容体の結合能を評価することを
目的とした。 
 
【材料と方法】 
１. ドパミン D1 受容体蛋白質の発現 
特異的 DNA プライマーを用いて、ヒト完全長 cDNA ライブラリ－からドパミン D1 受容体遺伝子
を単離し、無細胞系専用発現ベクタ－に組み込み、その後の翻訳反応には重層法を用いて、蛋白
質発現を行った。 
氏名   有光 英治  
２. 受容体結合実験 
発現したドパミン D1 受容体の結合能は放射性標識したドパミン D1 受容体アンタゴニスト 
([3H]SCH23390)用いて測定した。特異的結合量は、全結合量と放射性リガンドﾞの 1000 倍量の
非放射性標識 SCH23390 存在下で得られた非特異的結合量の差から求め、濃度-結合曲線に対する
解析により、受容体の結合親和性(Kd)と最大結合数(Bmax)を算出した。対照実験としてラット
脳線条体膜分画を用いた。 
３. 結合蛋白競合実験 
一定濃度の放射性リガンドの存在下に受容体アンタゴニストおよびアゴニストの濃度を変化させ
て添加したのち結合蛋白競合実験を行った。得られた置換曲線から各種リガンドに対する IC50値
と結合解離定数(Ki)を算出した。対照実験としてラット脳線条体膜分画を用い、同様に IC50値と
Ki を算出した。 
 
【結果と考察】 
１．ヒト完全長 cDNA ライブラリ－から単離したドパミン D1 受容体をコードする遺伝子を無細胞
系専用発現ベクタ－に導入した。小麦胚芽由来の抽出液を用いた無細胞蛋白質合成を用い、構築
した発現プラスミドによる蛋白質発現を確認した。 
２．放射性リガンド([3H]SCH23390),非放射性リガンド(SCH23390)を用いた受容体結合実験を行
い、濃度-結合曲線を作成した。得られた曲線に対する Scatchard plot 解析より、Kd と Bmax が
算出され、それぞれリポソーム蛋白質では 6.61±0.63 nM、1.85±0.05 pmol/mg protein であった。
対照実験のラット線条体膜分画では 2.67±0.52 nM、0.70±0.10 pmol/mg protein であり、両群では
比較的近似した値が得られた。 
３．発現したリポソーム蛋白質と放射性リガンドとの特異的結合を経時的に評価した。その結果、
特異的結合は時間依存的に増加し、約 90 分後にはプラト－に達することがわかった。 
４．リポソーム蛋白質に一定濃度の放射性リガンド(8nM)の存在条件下で各濃度のアンタゴニス
ト、アゴニストを添加させ、置換曲線を作成した。その結果、ドパミン D１受容体のアンタゴニ
スト、アゴニストの濃度を増加させると特異的結合が減少することがわかった。また、ドパミン
D２受容体のアンタゴニスト存在下では、特異的結合に変化がないことを確認した。 
５．得られた置換曲線から放射性リガンドの結合を 50％減少させる IC50を算出した。さらに 
Cheng-Prusoff 式からリガンド固有の Ki を算出した。リポソーム蛋白質における Ki は SCH23390、
LE300、SKF83566 ではそれぞれ 3.62nM、22.64nM、90.49nM であった。一方、ラット線条体膜
分画における Ki は SCH23390、LE300、SKF83566 ではそれぞれ 2.53nM、20.20nM、101.01nM で
あり、両群では近似した値が得られた。 
 
【結論】 
無細胞蛋白質合成系を利用しリポソーム存在下で発現した膜蛋白質受容体が機能的な結合能を有
していることが示唆された。本手法は新たな医薬品開発のスクリーニングや膜受容体の構造を認
識する機能性抗体製剤の作製に結びつく可能性が示された。    
キーワード（３～５） GPCR, 無細胞蛋白質合成法, binding assay 
 


The ligand binding ability of dopamine D1 receptors synthesized using a wheat germ cell-free protein synthesis system with liposomes

石丸, 雅巳

ISHIMARU, Masami

（第 12 号様式）
学 位 論 文 の 要 約 
（ 研 究 成 果 の ま と め ）
  氏 名    石丸 雅巳 
  学位論文名 画像相関を利用したイメージマッチング法による人工膝関節
全置換術後膝蓋骨の三次元動態解析
   学位論文の要約 
近年、人口の高齢化とともに変形性膝関節症罹患者数も増加傾向にある。その発生頻度や QOL 
(Quality of Life) に与える影響から、治療には全人工膝関節置換術 (Total Knee Arthroplasty, TKA) 
が発展し、それに応ずるように TKA 後動態解析も進んできた。生体および TKA 術後の膝関節の
動態解析では大腿脛骨関節での報告が大部分で、膝蓋骨に関する報告は少ない。しかし日常の膝
関節の運動において、膝蓋骨もその動態と機能は膝関節の可動域や運動および安定性に重要な役
割を担っているのは言うまでもない。また、臨床においても生体膝、TKA 術後膝に関わらず、病
態の把握に困難な膝蓋大腿関節の疾患にも遭遇することがあり、生体内での膝蓋骨および膝蓋骨
コンポーネントの動態解析は必要である。しかし、膝蓋骨は体積が小さいうえに大腿骨とも重な
りが生じるため、十分な精度を得ることが困難である。さらに TKA 術後の膝蓋骨ともなれば、
コンポーネントは超高分子量ポリエチレン製での X 線透過性のため、動作時の生体内での膝蓋骨
コンポーネントの動態を高精度に解析する手法は確立していない。
我々は、独自に開発したウィンドウ解析技術と一方向 X 線連続撮影像を用いた画像相関を利用
したイメージマッチング法により、TKA 膝および生体膝の動態解析を行ってきた。本研究では、
これまでのイメージマッチング法をさらに応用し、いまだ確立した手法のない生体内での TKA
術後のコンポーネント置換後膝蓋骨の 3 次元的動態解析を行い、その可視化と膝蓋大腿関節の各
コンポーネントの最近接点を可視化することを目的とした。
方法：本手法での画像撮影には、CT (computed tomography) と FPD (Flat Panel Detector) を使用し
た。TKA 術前の CT データからグレースケール 3 次元モデルを構築し、それを FPD 撮影条件と同
様の条件にした仮想投影シミュレーション像を作成した。その仮想投影シミュレーション像と、
解析対象となる FPD で撮影された X 線連続撮影画像の画素値の画像相関を利用したイメージマ
ッチングを行うことで生体関節の動態解析を行った。TKA 術後の大腿骨および脛骨コンポーネン
トの 3 次元描出には X 線画像と仮想投影シミュレーション像とを比較し、排他的論理和によりそ
の空間位置と姿勢を推定した。動態解析の精度は、二乗平均平方根偏差 (Root mean square error, 
 
RMSE) を使用して算出し、新鮮冷凍ブタの膝蓋骨で平均誤差 0.2 mm、0.2 deg 以内の精度が得ら
れた。 
臨床例では Quest Knee System を使用した 4 症例(平均年齢 68 歳) を対象に、しゃがみ込み動作
の解析を行い、膝蓋骨コンポーネントの 6 自由度運動における変位量、変位角度を評価するとと
もに膝蓋骨コンポーネントを可視化した。また、TKA 術後の膝蓋骨および大腿骨コンポーネント
の最近接点を評価した。膝蓋骨コンポーネント設置位置は、我々独自に考案した手法で、術後残
存した膝蓋骨と膝蓋骨コンポーネント設置のために作成したドリルホールから算出した。 
結果：本手法により、TKA 術後の大腿骨および脛骨コンポーネントと、コンポーネント置換後膝
蓋骨の相対位置関係を 3 次元で描出することができた。膝蓋骨 6 自由度運動評価では、しゃがみ
込み動作での後傾運動(flexion)、X 軸変位、Y 軸変位、Z 軸変位は全症例で同様の傾向を認めた。
回転運動(rotation)と回旋運動(tilt)は、明らかな傾向は見られなかった。 
膝蓋骨コンポーネントの大腿骨コンポーネントとの最近接点では、屈曲が進むにつれて内外側
の接触点間隔が広くなりながら近位に移動していた。大腿骨コンポーネントの最近接点は遠位に
移動しながら顆間部に移動する傾向を示していた。 
考察：人工膝関節のコンポーネント形状は、大腿骨、膝蓋骨ともに生体の解剖学的形状とは異な
っている。膝蓋骨コンポーネント形状は大腿骨コンポーネント顆間部の形状に合わせたドーム形
状で作られているものが多い。本研究結果では、しゃがみ込み動作での TKA 術後膝蓋骨コンポ
ーネントは rotation と tilt 以外の変位ではほとんど同様の運動が見られ、屈曲初期での TKA コン
ポーネントの形状に沿った運動を示していたものと考えられた。またしゃがみ込み動作での外側
移動は、使用機種のデザインコンセプトを反映した結果を示していたのではないかと考えられ
た。 
これまでにも膝関節を対象とした様々な動態解析手法が報告されてきたが、膝蓋骨においては
実際の生体の運動を反映していない in vitro での解析が多く、また、解析精度の低いもの、外科的
侵襲の加わるものも多い。 
骨の一部分を用いて解析を行う本手法は、膝関節のみならず、診断に難渋する種々の関節疾患
の病態把握や術後評価などにも有用性があるとともに、さらなる ADL (activity of daily living) の
向上を目指した次世代型人工関節への改良や開発など、様々な分野において有益なツールとして
期待のできる手法であると考えられた。 


Three-Dimensional Motion Analysis of the Patellar Component in Total Knee Arthroplasty by the Image Matching Method Using Image Correlations

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