Ehime University Institutional Repository

西山, 綺竜

NISHIYAMA, Kiryu

 
 
アボカド成熟度非破壊判定手法の開発 
産業イノベーション学科（ものづくりコース） 西山 綺竜 
 
1 緒   言 
アボカドは輸入・国産問わず，成熟に伴う色変化が小
さく，成熟の判定基準とされる乾物率を非破壊的に判定
する手段が存在しない．先行研究においてアボカドの乾
物率が表面のワックスの質量と相関すること，ワックス
多少が光の表面反射と相関することが別々に報告され
ており，ワックスの増加を非破壊的に捉えることで乾物
率が基準とされるアボカドの成熟度を判定できる可能
性がある．本研究では表面反射によるアボカド成熟度の
非破壊判定法の構築を目的とした． 
2 アボカドの成熟度と光表面反射のモデル式 
先行研究においてアボカド乾物率はワックスの面積
あたり質量と概ね比例することが示されている（式(1)）． 
 
(アボカドの乾物率) ∝ (ワックスの面積あたり質量) 
(1) 
 
表面反射の強さは正反射率で定量できる．正反射率は
フレネルの式で求められる（式(2)）．𝑛は表面から波長程
度の厚みの平均的屈折率であり，アボカドではワックス
の屈折率が相当する．𝑛は主成分や厚みが変わらずに密
度のみが変わる場合には，𝑛は面積あたりの質量𝑤と式
(3)の関係性を示す．𝑤′は面積あたりの質量𝑤に係数を乗
じて無次元化している．ワックス主成分である脂肪酸分
子の屈折率𝑛は 1.3～1.5 程度であり，面積あたり質量𝑤
と正反射率は正の相関となる．式(1)～(3)より，アボカド
が成熟する際の乾物率や面積あたりのワックス質量の
増加によって正反射率の増加が見込める． 
 
$反射率% =
(𝟏 − 𝒏)𝟐
(𝟏 + 𝒏)𝟐 
(2) 
𝒏 = -(𝟏 + 𝟐𝒘′) (𝟏 − 𝟐𝒘′)⁄  
(3) 
3 実験方法 
3.1 サンプルと追熟処理 品種は国内で主要なベーコ
ンとした．2023 年 10 月 19 日に県内の農園で，8 年生の
樹より未熟な 40 果実を収穫した．サンプルの重量は 96.4
〜217.7g で，長径は 62.3〜91.2mm，短径は 50.6〜69.3mm
であった．また一連の実験の間，果実は 10℃で保管した． 
入手した果実のうち 20 果実は入手翌日から実験を開
始し，もう 20 果実はインキュベータを用いて 20℃で 20
日間追熟をさせてから実験を行った． 
3.2 乾物率の測定 サンプルの果実それぞれから約 20 
g 切り出したものを準備し，アルミホイルにのせ 20 時間
105℃の乾燥機に入れた．その後，乾燥物を元の湿潤質量
の百分率として計算し，乾物率を求めた． 
3.3 正反射率の測定と解析 今回はモデル式の計算か
ら反射率変化がおよそ 1〜3％ほどであることが予想さ
れたため，消光比が 1:100以上の偏光フィルタを使用し
た．偏光フィルタを回転させ，反射が最大の画像と最小
の画像を引き算することで正反射のみの画像を得た．正
反射率を算出するためにホワイトバランスは標準白色
板で取った．リング照明の反射領域について，光ってい
る最大領域（直径 45mm）から光っていない最大領域（直
径15mm）を引いた部分を関心領域とし，その領域のRGB
平均ピクセル強度を得た．値は 255 で規格化し，0〜1 の
間で表した．LED 光源強さやアボカドの表面吸収の影響
を鑑みて R 反射率を示す． 
4 結   果 
アボカドの乾物率の測定結果を Fig.1 に示す．未熟状
態では 20%程であったのに対し，追熟状態では 2%ほど
大きく，追熟状態の下位四分位数は未熟状態の上位四分
位数を上回った（p<0.05）．次に，正反射率を Fig. 2 に示
す．未熟状態では 15%程であったのに対し，追熟状態で
は 30%程度であり 2倍程増加した．また乾物率同様に値
の分布は異なっており，有意差も得られた（p<0.05）． 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.1 成熟度の異なるアボカドの乾物率 
 
 
Fig.2  成熟度の異なるアボカドの正反射率 
 
一方，正反射率はモデル式の計算で見積もられる反射
率よりも 1桁大きかったことから，拡散成分のうちで偏
光方向が入射光のそれと等しい成分強度も含まれてい
る可能性もある．ワックスの面積あたり質量はアラビア
ゴムで剥離し測定しており，実測値とワックス厚みを数
μmと仮定した場合の変化は 2倍程度と変化率は実験と
良く一致したため，式(3)の大小は成立したと考えられる．
今後は，式(2)に光の拡散成分の寄与を含めることで偏光
フィルタを通過したアボカドの反射率を説明できると
期待できる． 
1


Japanese

アボカド成熟度非破壊判定手法の開発

秋山, 英治

Akiyama, Eiji

愛媛県魚島方言における複合名詞のアクセント

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)thesi

小西, 達矢

（第７号様式） 
学位論文審査結果の要旨
  氏   名 小西  達矢 
 審 査 委 員 
  論 文 名 Bridging-BiTE により作製した二重特異性抗体パネルによる 
   dual-lymphoid activation を介した強化型抗骨髄腫治療に関する研究 
  審査結果の要旨 
【背景と目的】 
多発性骨髄腫は治癒が困難な造血器腫瘍である。その理由のひとつとして、骨髄腫細胞の多
様性による治療抵抗性が挙げられている。腫瘍抗原と T 細胞に結合できる二重特異性抗体 
(Bispecific Antibody: BsAb)が治療薬として注目されているが、多様性のある骨髄腫サブク
ローンの全てを標的とすることは困難である。そこで、ヒト IgG の Fc 部と、T 細胞の CD3 抗原
を結合する BsAb である Bridging-Bispecific T-cell Engager (B-BiTE)を使用すれば、NK 細
胞と T 細胞を同時に活性化した強い抗骨髄腫活性が得られるという仮説を検証することを目的
として研究を行った。 
【方法】 
末梢血単核球(PBMCs)は健常者と多発性骨髄腫患者から単離した。CD20+細胞と CD3+細胞の標
準細胞株として Raji と Jurkat を、陰性標準細胞株として骨髄性白血病細胞株である K562 を、
また、CD20 あるいは CD38 を導入した K562、骨髄腫細胞株 MM1S、MM1R、RPMI8226 と患者由来
骨髄腫細胞を標的細胞として用いた。B-BiTE とともにモノクローナル抗体(mAb)医薬品である 
Rituximab(Rit)、Daratumumab(Dar)、Elotuzumab(Elo)を使用した。ヒト T 細胞と NK 細胞の活
性化は、サイトカインや表面抗原を指標とし、フローサイトメトリー、51Cr 放出法を用いて評
価した。NOD/Shi-scid IL2rgamma(null)にヒト PBMCs とヒト Ig を十分量投与して、骨髄腫病
主　査 　増本　純也 
副　査 　山下　政克 
副　査 　石前　峰斉 
副　査 　松元　隆 
副　査 　白石　研
態モデルを作製し、標的作用を評価した。 
【結果】 
Rit と Dar のそれぞれの mAb/B-BiTE 複合体は、標的抗原である CD20/CD3, CD38/CD3 に特異
的に結合した。一方で B-BiTE と Dar の Fc 部との相互作用は、NK 細胞を非特異的に活性化しな
かった。また、B-BiTE 単独と Dar/B-BiTE 複合体は T 細胞と NK 細胞の非特異的な活性化を誘導
しなかった。Dar/B-BiTE は、ヒト末梢血由来の T 細胞と NK 細胞を同時に活性化した。 
Dar/B-BiTE と Elo/B-BiTE は、骨髄腫細胞株に対して、Dar、Elo それぞれの標的抗原である 
CD38 と SLAMF7 の発現量依存的に T 細胞と NK 細胞の細胞傷害活性を誘導した。Dar/B-BiTE と 
Elo/B-BiTE を連続で投与する連続治療群では、Dar 単独群あるいは Dar/B-BiTE 治療群に比較
して、強力で持続的な治療効果が認められた。 
【結論】 
本研究で、臨床的に使用可能な Dar と Elo を B-BiTE と組み合わせて連続的に使用することで、
非特異的な免疫的活性化もほとんどなく、持続する抗腫瘍効果を誘導できることが示された。 
 
公開審査会は令和６年１月２３日に開催され、申請者は、研究内容を英語で明確に発表した
後に、審査委員から本研究に関する以下の質問がなされた。 
1)Bridging の意味について：抗原と抗原あるいは細胞と細胞などについて。 
2)B-BiTE の臨床応用の可能性と課題について。 
3)mAb と B-BiTE を組み合わせる治療概念のオリジナル性について。 
4)mAb、B-BiTE と mAb/B-BiTE 複合体の生体内での安定性について。 
5)癌の進展の結果としての炎症反応と IL-6 高値との関連について。 
6)CD38 と SLAMF7 以外の多発性骨髄腫で使用可能な抗原について。 
7)免疫チェックポイント阻害抗体医薬の多発性骨髄腫への効果について。 
8)固形癌など、他の悪性腫瘍への応用の可能性について。 
9)マウス皮下腫瘍モデルで、効果が認められる腫瘍量について。 
10)実臨床で効果のあるステージ、および骨髄での効果について。 
11)効果に必要な骨髄中の CD3 陽性 T 細胞の存在量について。 
12)ELISPOT 法などでの IFN 陽性細胞の確認について。 
13)ナイーブ T 細胞とメモリーT 細胞の存在パターンが治療効果に及ぼす影響について。 
14)治療によって活性化する T 細胞の分画、メカニズム、その後の運命について。 
15)多発性骨髄腫の異なる抗体産生が治療効果へ及ぼす影響について。 
これらの質問に対して申請者は、質問の意図を十分に理解した上で、詳細かつ明解に応答した。 
本論文は、多発性骨髄腫の腫瘍抗原特異的抗体と B-BiTE 複合体を、複数組み合わせて連続治
療することにより、薬剤耐性を克服し、持続的な抗腫瘍活性が誘導できる可能性を初めて明ら
かにしたものである。また、上市されている標的抗体医薬を応用するための新規方法論を提示
したものであり、今後の臨床応用が期待される。 
審査委員は、申請者が本論文関連領域に対して学位授与に値する十分な見識と能力を有する
ことを全員一致で確認し、本論文が学位授与に値すると判定した。 
 
 


Bridging-BiTEにより作製した二重特異性抗体パネルによるdual-lymphoid activationを介した強化型抗骨髄腫治療に関する研究

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)doctoral thesi

足立, 智子

（第３号様式） 
 
学 位 論 文 要 旨 
 
 
        氏   名  足立 智子 
 
 
 
       論 文 名  口腔扁平上皮癌の予後予測因子としての Interleukin-6 の重要性 
 
 
 
学位論文要旨 
  
【目的】 
口腔扁平上皮癌 (以下 OSCC) は日本では希少癌とされているが、患者数は年々増加していること
が報告されている。OSCC は，手術療法や放射線化学療法等の進歩にもかかわらず、標準的な治療を
行ってもしばしばコントロール不良となる症例を経験する。一方で、それらを識別する汎用性のあ
るマーカーは存在しない。そこで、新たな予後予測マーカーを探索する必要性があると考えた。以
前、我々は、予後予測因子のスクリーニングとして、OSCC 患者の術前血清を用いて検討した結果、
Interleukin-6 （以下 IL-6） と Interleukin-8 に予後との相関が認められることを報告した。IL-
6 は、T 細胞、マクロファージ、線維芽細胞、単球によって主に産生されるサイトカインであり、炎
症や免疫、造血、神経系細胞の分化など、様々な生物学的プロセスにおいて重要な役割を担ってい
る。さらに、既に抗 IL-6 受容体に対する抗体薬が臨床応用されており、IL-6 は治療標的分子とし
ての有用性も考えられる分子である。最近の研究では、IL-6 などの炎症性サイトカインが癌の悪性
形質獲得に関与することが示唆されているが、OSCC における IL-6 の全身および局所的な機能は不
明である。本研究では、OSCC 患者において、IL-6 の OSCC 患者における予後予測因子としての有
用性と、腫瘍局所および全身状態に対する影響を検討することを目的とした。 
 
【方法】 
当科で診断された OSCC 患者新鮮症例 95 症例を対象とし、血清 IL-6 高値群と低値群に分け、
カプランマイヤー法を用いて予後との相関を調べた。次に、免疫組織化学染色を行い、血清 IL-6 と
腫瘍局所における IL-6 の局在との関連を検討した。続いて、血清 IL-6 高値群と低値群から、原
発部位や病期など臨床病理学的因子が類似するようにそれぞれ 9 症例ずつ選定し、マイクロアレイ
による網羅的遺伝子発現解析を行い、両群間での比較検討を行った。抽出された遺伝子について、 
氏名 足立 智子   
 
さらに KEGG pathway 解析を用いて検討を行った。最後に、血算、生化学検査等と比較検討を行い、
局所および全身状態における関連を比較検討した。 
 
【結果】 
血清 IL-6 のカットオフ値を 8pg/mL としたところ、高値群 78 症例、低値群 17 症例であった。
予後との比較においては、全生存期間 (P<0.0001)，無病生存期間 (P=0.0283) と強い相関が認めら
れた。腫瘍局所における IL-6 の局在は、免疫組織学的染色において腫瘍細胞より間質細胞に強い
局在が認められた。そこで、局所での発現を確認するために、術中検体から癌関連線維芽細胞(以下
CAF)と正常線維芽細胞(以下 NF)を樹立した。CAF (vimentin, α-SMA 陽性細胞)、NF、OSCC 細胞株 
(SAS、HSC2、HSC3)について、IL-6 タンパクの分泌を ELISA 法により測定したところ、IL-6 タン
パク分泌量は、OSCC 細胞株と比較し優位に多く、特に CAF は NF よりも約 3 倍の分泌量が認めら
れた。また、陽性細胞率スコアと染色強度スコアを積算した immuno reactive score を用いた評価
においては、間質の IL-6 と血清 IL-6 間に強い関連が認められた。 
OSCC 組織における網羅的遺伝子発現解析においては、血清 IL-6 高値群と低値群の比較におい
て、SN 比 2 倍以上の発現亢進遺伝子が 164、発現抑制遺伝子が 349 認められた。KEGG pathway 
解析においては、高値群では代謝関連および酸化還元遺伝子群の発現亢進が、低値群においては炎
症や免疫応答に関連する遺伝子群の低下が認められた。これらの結果より、血清 IL-6 値と血算お
よび生化学検査との比較行ったところ、albumin (P=0.0004) および CRP (P=0.0001) との強い相関
が認められ、炎症因子や栄養因子を指標とした各種予後スコアとの強い相関が認められた。低栄養
や全身炎症反応は、化学療法や放射線療法における治療抵抗因子として知られており、間接的に予
後不良に関連している可能性が示唆された。 
 
【考察】 
本研究において、IL-6 は全身的には悪液質などの栄養障害を通して、局所的には抗腫瘍免疫活性
の低下を通して予後不良に関与している可能性が示唆された。これらの知見は、IL-6 が OSCC の予
後予測因子および治療標的分子としての可能性が示唆された。 
 
なお、本研究は、愛媛大学医学部の倫理委員会によって承認されている。 
 
 
キーワード（３～５） 
 
 
口腔扁平上皮癌 
Interleukin-6 
栄養障害 
予後予測因子 
 


口腔扁平上皮癌の予後予測因子としてのInterleukin-6の重要性

Ehime University (愛媛大学)博士(学術)thesi

Taufiq Ihsan

（第５号様式）
学位論文審査の結果の要旨
氏 名 Taufiq Ihsan 
審 査 委 員
論  文  名
A Novel and Sustainable Approach for Rural Drinking Water Disinfection: Layered Double Hydroxide Foil 
（遠隔地住民の飲料水消毒のための斬新で持続可能なアプローチ： 層状複水酸化物ホイル）
審査結果の要旨
世界では約 17 億人が糞便が混入した地表水を飲用し、水生病原菌による感染症によって、主
に乳幼児を中心に毎年数十万人が死亡している。飲み水を無処理の地表水に依存している人々が
自身の健康（命）を守るためには、煮沸法、塩素消毒法、ろ過法、太陽光消毒（SODIS）法 な
どの家庭用水消毒法（HWT 法）に頼らざるを得ない。HWT 法は大きく２つに分類される。１つ
は塩素処理やろ過のような、政府などから支給される、あるいは市販の資材を必要とする方法で
ある（非DIY法）。もう１つは、これら資材の支給を受けられず市販品を購入する資金もない人
々が依存する、煮沸や SODIS のような DIY 法である。一方で、非 DIY 法にしても DIY 法にし
ても、実施方法が不適切な場合や使用されない場合が多く、このことが先述の壊滅的な被害に繋
がっている。例えば、途上国の貧困層にとっては、２分間の煮沸処理は非現実的であり（燃料不
足）、残留塩素消毒剤による味と匂いには嫌悪感が強く、必要であるとされている６時間の日光
照射（SODIS）は困難な場合も多い。したがって、既存の HWT 法を補完する、新しい HWT 法
の開発が望ましい。本研究では、政府などからの資材供給を受けられず資金も乏しい、無処理の
地表水を使用している人々を念頭に、簡単にDIYで作成でき使用方法も単純な、新規飲料水消毒
ツールの開発を目指した。
本研究では、吸着法に着目した。種々の微生物吸着剤が知られており、その一つである層状複
水酸化物（LDH）は、水から広範囲の細菌やウイルスを吸着する能力が実証されている強力な吸
着剤（粉末結晶）である。LDH は人体に無毒であり医薬品用途にも使用されている。しかし、
LDH に限らず粉体は、処理水との分離回収が困難であるため、既存の HWT 法には採用されてい
ない。そこで本研究では、アルミホイルの表面に Mg-Al 型の LDH を直接生成させた「LDH ホイ
ル」を開発してバッチ水の簡易処理を可能とし、その大腸菌吸着能を評価することを目的とした。
アルミホイルを原料としたのは、先進国はもちろん途上国でも、アルミホイルは比較的入手が容
易であり、使い捨てにされているからである。また、LDH には Zn-Al 型や Co-Al 型などのよう
な重金属陽イオンを成分とするものもあるが、安心面を考慮してMg-Al型を用いることとした。
まず、アルミホイルを 0.2 M NaOH で処理して表面の酸化アルミニウム層を除去して金属アル
主　査　　松枝　直人
副　査　　康　  峪梅
副　査　　光延　聖
副　査　　野村　美加
副　査　　川嶋　文人
 
 
ミニウムを露出させた。すぐさま NaOH で pH を 9.8 に調整した海水に常温で 24 時間浸漬した。
海水を用いた理由は、その Mg 濃度が約 0.05 M と高いこと、および安価なことである。pH 9.8
のアルカリ性下における、露出した金属アルミニウムと海水中の Mg との反応による Mg-Al 型
LDH のその場生成が、XRD 法によって確認された。処理後のアルミホイルは褐色を呈し、表面
に水酸化マグネシウムの粉末が付着していた。この粉末は容易に除去でき、LDH 層はホイル表
面に強固に接着していた。粉末除去後のホイルを LDH ホイルとし、大腸菌（DH5α）の吸着試験
に供した。DH5αの生菌濃度が約 1000 CFU/mL である試験水 100 mL に 20 cm2 の LDH ホイルを
１枚添加して 25℃で往復振とうしたところ、DH5α の生菌濃度は、10 分後に 134 CFU/mL、24
時間後に 1 CFU/mL 未満まで低下した。LDH ホイルを添加しない場合は、DH5α の生菌濃度は
24 時間まで変化しなかった。以上の結果は、アルミホイル、NaOH、海水を用いて、常温浸漬の
みで簡単に LDH ホイルを作成できることを示している。また、その使用方法もバッチ水に添加
するだけであり、消毒効果も高い。 
しかし、この方法には課題が残された。すなわち、NaOH は一般の人が取り扱うと危険であり、
内陸部では海水の入手は困難である。また、NaOH で表面の酸化アルミニウム層を溶解し、その
後アルカリ性海水に浸漬する２段階の手順は、面倒と感じる人々も多いと予想される。 
  そこで次に、酸化アルミニウム層の溶解と Mg-Al 型 LDH の生成を同時に行うために、アル
カリ性の Mg 水溶液に浸漬して１段階で LDH ホイルを作成することを試みた。アルカリ性試薬
として Na2CO3 などのより安全な試薬を、また、Mg 源として MgCl2 などの内陸部や農村部でも
入手可能な試薬（肥料）を用い、両試薬を組み合わせた 12 種類の混合溶液にアルミホイルを常
温で浸漬した。XRD 解析の結果、この１段階の処理でも表面に LDH がその場生成することが示
された。これら 12 種類の LDH ホイルの DH5αに対する吸着能力を評価したところ、ほとんどの
LDH ホイル（20 cm2 １枚）は、DH5αの生菌濃度が約 1000 CFU/mL の水 100 mL とともに振と
うした場合、3～24 時間以内に 99%以上の DH5αを吸着除去することが示された。最も高い効率
を示す LDH ホイルは、ホイル 1 cm2 あたり約 1.3 × 106 CFU の最大吸着容量を示した。さら
に、LDH ホイルは作成に用いたアルカリ性溶液に浸漬することで再生され、複数回の再利用が
可能であった。これは、吸着した DH5αが高 pH によって死滅したためである。 
本研究は、入手可能で安価な資材（アルミホイル、アルカリ性試薬、Mg 試薬）を用いて１段
階の DIY 法で簡単に作成でき、十分な殺菌能を有し、また、再生再利用が可能な LDH ホイルの
開発に成功した。本来は粉末である LDH をアルミホイルの表面に固着させること（粉末を有形
化させること）によって、農村家庭の水瓶水の直接消毒を可能とし、消毒後の運搬などに伴う再
汚染の可能性も低減している。LDH ホイル法は、煮沸法と SODIS 法に次ぐ、第３の DIY 法とし
ての可能性を秘めている。 
 
本論文に関する公開審査会は、令和６年２月３日に愛媛大学農学部で開催され、論文発表と質
疑応答が行われた。引き続いて行われた学位論文審査委員会で、本論文の内容を慎重に審議した
結果、審査委員全員一致して博士（学術）の学位を授与するものと判定した。 


English

A Novel and Sustainable Approach for Rural Drinking Water Disinfection: Layered Double Hydroxide Foil

相模, 健人

SAGAMI, Takehito

WOWWアプローチを行った学生の授業態度の評価理由，次回目標の分析

渡邉, 洋心

WATANABE, Hiromune

吉田, 明恵

YOSHIDA, Akie

アントレプレナーシップ教育プログラムの開発と実践: 愛媛県における若年層創業意識啓発事業を事例に

幸泉, 満夫

KOIZUMI, Mitsuo

縁帯文成立期土器群の細別に向けた新たな考察:  西部瀬戸内に潜在する新型式、辻堂式の提唱とその学術的意義

和田, 寿博

WADA, Toshihiro

The recurrent program 2021 for personnel of tourism service

Ehime University (愛媛大学)博士(農学)thesi

Okon Odiong Unung

 
 
（第５号様式）  
                        学位論文審査の結果の要旨 
 
    氏    名 Okon Odiong Unung 
審 査 委 員 
主  査   小林 括平  
      副  査    曵地 康史 
      副  査    秋光 和也 
      副  査    八丈野 孝 
      副  査    賀屋 秀隆 
         論  文  名 
Roles of salicylic acid pathway in plant virus resistance and pathogenesis in tobacco models 
（タバコモデル植物でのウイルス抵抗性と病態形成におけるサリチル酸経路の役割） 
 
         審査結果の要旨 
 
 葉の退緑・黄化は，多様な植物病害において観察される典型的な感受性病徴であり，葉緑体機能の低
下に直結しているため，その抑制は減収抑制の一方途となりうる．植物病原である糸状菌や細菌には，
生きた植物細胞から栄養を収奪する活物寄生性のものに加え，植物組織を積極的に加害して腐生的に栄
養を収奪するもの，およびその両方のライフスタイルをとりうるヘミバイオトロフも存在するが，偏性
細胞寄生性のウイルスにおいては積極的に植物細胞や組織を加害するとは考えにくく，病徴発現の多く
は植物体の応答として理解される．植物ウイルス病における退緑・黄化の分子機構として，これまでに
ウイルスに対する RNA サイレンシングが葉緑体タンパク質の mRNA をも分解に導くというメカニズム
が明らかにされている．それら標的タンパク質に対する RNA サイレンシングを薬剤誘導的に引き起こ
す遺伝子組換えモデル植物においても退緑・黄化が誘導されることが示されている．さらに，それら退
緑・黄化モデル植物において，退緑・黄化の過程で植物免疫に関わる遺伝子が活性化されていることが
報告された．このことから，植物ウイルス病における退緑・黄化の発症には，植物免疫が関与している
ことが示唆された．本研究では，植物免疫において中心的な役割を果たす経路の一つであるサリチル酸
経路（SA 経路）について，退緑・黄化の発症と関与を検討するとともに，SA 経路において重要な役割
を果たすことが示唆されている CBP60 ファミリー転写因子がタバコのウイルス抵抗性において果たす役
割について検討した． 
 
１．タバコ N’トバモウイルス抵抗性遺伝子の感受性アレルからの CRISPR/Cas9 を用いた機能性抵抗性
遺伝子の再生 
 退緑・黄化の発症における植物免疫の役割を明らかにしようとする際，退緑・黄化モデル植物に導入
される遺伝子改変等や薬剤処理の植物免疫に対する効果について，準同質遺伝子系統において確認する
ことは重要である．上述の退緑・黄化モデル植物と同じタバコ（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1，
以下，SR1）は，少なくとも既知のウイルス抵抗性遺伝子を持たない．一方，SR1 は Nicotiana sylvestris
 
 
由来の N’トバモウイルス抵抗性遺伝子の感受性アレルと推定される Nt-n’ を持つことが明らかにされて
いた．Nt-n’ は，N’ コード領域の一部が完全な N’ コード領域の上流に重複することによって破壊され
ていたことから，CRISPR/Cas9 を用いてこの重複配列を除去することによって，機能性 N’ 抵抗性遺伝
子を再生することが可能であると考えられた．そこでまず，SR1 と N’ 抵抗性遺伝子を持つタバコ品種
（N. tabacum cv. Blight Yellow，以下，BY）を交配して得た F2 集団について遺伝解析を行い，Nt-n’ が
N’ のアレルであること，SR1 において Nt-n’ が転写されていることを確認した．薬剤誘導性に Cas9 を
発現する遺伝子組換えタバコ系統を作出し，さらに Nt-n’ の重複配列に対する単鎖ガイド RNA
（sgRNA）発現系を導入した．得られた再生シュートに Cas9 誘導薬剤処理を行ってさらに育成し，重
複配列の除去された新規アレルを持つ系統を得た．その自殖後代から新規アレルをホモに持つ個体を選
抜し，N’ と同一の塩基配列を持つ新規アレル，N'-R を同定した．N'-R をホモに持つ個体，およびそれ
らの自殖後代個体群はトマトモザイクウイルス（ToMV）に対する抵抗性を示した．野生型と交配して
得られた雑種第二代から Cas9 および sgRNA の導入遺伝子を持たず，かつ N'-R をホモに持つ個体を選抜
し，null-segregants を得た．得られた null-segregants がすべて ToMV に対する抵抗性を示したことから，
Nt-n’ から再生されたアレル，N'-R が安定して次世代に引き継がれることが示され，それら系統を SK3
と名付けた． 
 
２．退緑・黄化モデル植物における退緑・黄化劇症化への SA 経路の関与 
 退緑・黄化モデルである i-hpHSP90C は，薬剤誘導性に葉緑体局在型 HSP90（HSP90C）の特異配列に
対するヘアピン RNA（hpRNA）を発現し，HSP90C の発現を抑制する．これに誘導薬剤を処理し，経時
的に SA を計測したところ，処理 8 時間後に高レベルの SA を蓄積することが明らかとなった．遺伝子
発現解析の結果，CBP60 ファミリー転写因子である SARD1A および SARD1B を介して SA 合成系に関
与する HSR201 や HSR203J の発現が活性化され，それらによって SA 合成が誘導されることが示唆され
た．i-hpHSP90C における重篤な退緑・黄化の発症における SA 経路の関与を解析する目的で，SA 分解
酵素をコードする nahG 遺伝子を発現するタバコを作出し，それらを上述の SK3 および i-hpHSP90C と
交配し，nahG 遺伝子および hpRNA 発現系または N'-R をホモに持つ系統を作出した（以下，それぞれ
n/H および n/S）．n/S において ToMV 抵抗性が減弱してることが観察されたが，SA の減少が認められ
なかったため，塩基配列を確認したところ 1 アミノ酸変異が検出された．このことから n/S における抵
抗性の減弱は，レセプターと SA を競合することによると推察された．n/H では，一部の個体において
退緑・黄化の軽減，および散発的な細胞死の減少が認められた．i-hpHSP90C における退緑・黄化は，
SA シグナル伝達阻害剤のテノキシカムによっても軽減された．以上のことから，SA 合成の活性化を含
む，最終的に散発的な細胞死を誘導する免疫応答の活性化が，i-hpHSP90C における退緑・黄化の重症化
に寄与することが示唆された． 
 
３．CBP60 ファミリー転写因子の発現抑制植物の作出とウイルス抵抗性の評価 
 i-hpHSP90C における退緑・黄化発症の過程で，CBP60 ファミリー転写因子である SARD1A および
SARD1B の発現誘導が認められたことから，これらが退緑・黄化の重症化に関与することが示唆された．
そこで，これらの発現を抑制した SK3 由来遺伝子組換え植物を作出し，それらの ToMV 抵抗性を評価
した．その結果，抵抗性病斑およびウイルス感染の拡大，さらには全身感染が認められ，これら転写因
子がタバコにおいても植物免疫の活性化制御に関与することが示唆された． 
 
 本研究によって得られた以上の知見は，感受性病徴である退緑・黄化の発症・重症化に植物免疫が寄
与することを示したものと評価され，今後の植物病害発症機構に関する研究のみならず，病徴軽減によ
る減収抑制技術の開発にも貢献すると期待される． 
 
 本論文に関する公開審査会は，令和 6 年 8 月 3 日に高知大学農林海洋科学部で開催され，論文発表と
 
 
質疑応答が行われた．引き続いて行われた学位論文審査委員会で，本論文の内容を慎重に審議した結果，
審査委員全員一致して博士（農学）の学位を授与するものと判定した． 


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