Ehime University Institutional Repository

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)thesi

谷野, 彰子

TANINO, Akiko

（第７号様式） 
 
学位論文審査結果の要旨 
 
   氏     名 谷野 彰子 
 
 
 
 
 
   審 査 委 員 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
                                      
 
                                      
 
                                      
 
                                      
 
                                      
 
 
      論  文  名  
腎線維化抑制の新たな治療ターゲットとしてのインターロイキン(IL)-18: 
アルドステロン-食塩負荷マウスにおいて、IL-18 欠損は腎間質線維化を抑制する 
      審査結果の要旨 
【背景】 
IL-18はマクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、尿細管細胞などの細胞で産生
されるIL-1ファミリーに属するサイトカインで、腎虚血再還流障害、移植腎拒絶、自己免
疫疾患などの炎症性腎疾患の病態形成に関与している。 
アルドステロンはミネラルコルチコイド受容体（MR）に結合し、体内のナトリウムやカリ
ウムの調整において中心的な役割を果たしている。アルドステロンの過剰は腎臓の線維化
を引き起こすことが報告されている。申請者らの教室ではこの腎線維化にオステオポンチ
ン（OPN）が重要な役割を果たしていることを報告している。 
心筋においてはアルドステロンがIL-18の産生を促進し、さらにIL-18がOPNを誘導するこ
とが報告されている。本研究ではアルドステロンにより誘導される腎線維化におけるIL-1
8およびOPNの役割に関して検討をおこなった。 
【方法】 
アルドステロン-食塩負荷マウスモデルとして 8 週齢雄性の野生型マウス(WT)または IL-1
8 ノックアウトマウス(IL-18KO)の左腎摘出後、浸透圧ポンプにてアルドステロンを投与、
普通餌、1%食塩水で 4 週間飼育した。4 週間後にテイルカフ法で血圧測定を行い、血液、
尿、腎臓を採取し、組織学的変化、遺伝子発現、蛋白発現について両マウスで比較した。 
細胞レベルの実験として、ラット尿細管上皮細胞（NRK-52E cells）の培養液中にアルド
ステロンの添加あるいはアルドステロンと MR 拮抗薬であるスピロノラクトンの添加を行
った。またラット線維芽細胞（NRK-49F cells）の培養液中にリコンビナント IL-18（rI
L-18）の添加を行なった。 
【結果】 
WT アルドステロン-食塩負荷群では血圧の上昇を認めたが、IL-18KO アルドステロン-食塩
負荷群では血圧の上昇を認めなかった。WT アルドステロン-食塩負荷群で糸球体の拡大を
認め、IL-18KO アルドステロン-食塩負荷群でも同様の変化を認めた。尿細管間質病変につ
いて、WT アルドステロン-食塩負荷群においてマッソントリクロム染色で腎間質に高度の
線維化を認めたが、IL-18KO アルドステロン-食塩負荷群においては間質線維化が抑制され
ていた。免疫組織染色による検討で、WT アルドステロン-食塩負荷群では腎間質にマクロ
ファージの浸潤(F4/80)、および線維芽細胞(FSP-1)の浸潤、集積を認め、尿細管での IL−
18 の発現増加を認めたが、IL-18KO アルドステロン-食塩負荷群ではその浸潤、集積、発
現増加は抑制されていた。線維化関連因子である I 型コラーゲン、III 型コラーゲン遺伝
子の発現を腎皮質 Total RNA を用い、リアルタイム RT— PCR 法で解析した。I 型、III 型
コラーゲンともに WT アルドステロン-食塩負荷群では増加し、IL-18KO アルドステロン-食
塩負荷群ではその発現は有意に抑制された。腎臓の線維化との関連が強く報告されている
OPN についてもリアルタイム RT-PCR 法、ウェスタンブロット法および免疫組織染色で遺伝
子発現、蛋白発現を検討したところ、WT アルドステロン-食塩負荷群において遺伝子発現
増加、尿細管での蛋白発現増加を認めたが、IL-18KO アルドステロン-食塩負荷群ではその
発現増加は抑制されていた。血中、腎皮質中 IL-18 を、ELISA 法、および免疫組織染色で
蛋白発現を検討したところ、WT アルドステロン-食塩負荷群は WT と比較して腎皮質での蛋
白発現増加を認めた。血中の IL-18 蛋白発現には両群で差は認めなかった。尿細管細胞に
よる検討ではアルドステロンによって直接的に IL-18 の発現が誘導され、この作用は MR
拮抗薬であるスピロノラクトンの添加により阻害された。腎線維芽細胞に rIL-18 の添加
を行なっても I 型、III 型、IV 型コラーゲンおよび OPN は誘導されなかった。 
【結論】 
IL-18 は OPN を介してアルドステロンによる腎線維化を制御していると考えられ、IL-18
は腎線維化進展抑制治療のターゲットとなりうる可能性が示唆された。 
 
本論文の公開審査は、平成 28 年 12 月 20 日に開催された。谷野 彰子 氏による研究発表の
後、主査、副査により、IL-18KO アルドステロン-食塩負荷群では血圧上昇が認められない原
因、及びその影響、レニン・アンジオテンシ・アルドステロン系の変化、組織学的検討方を
含めた詳細な実験条件、臨床応用を含めた研究の将来展望などについて多くの質問がなされ
た 
 
申請者は、これらに対し、いずれにも的確に回答した。従って、審査委員会は全員一致し 
て、本研究が学位授与に値するものと判定した。 
 
 


English

Interleukin-18 deficiency protects against renal interstitial fibrosis in

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)doctoral thesi

岩﨑, 智之

IWASAKI, Tomoyuki

（第７号様式） 
 
学位論文審査結果の要旨 
 
氏     名 岩崎 智之 
審 査 委 員 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
      論文名： ブラウ症候群/若年発症サルコイドーシスの発症機構の解明と 
 創薬に有用な無細胞 Nod2-ノドソームの再構成 
 
      審査結果の要旨: 
 
［背景・目的］ 
若年発症サルコイドーシス(Early-onset sarcoidosis; EOS)は、関節炎・ぶどう膜炎・皮膚炎を 3
主徴とする慢性肉芽腫性炎症疾患である。1985 年、EOS と酷似する臨床像を呈する常染色体優
性遺伝形式の家族例がアメリカのブラウにより報告され、この疾患はブラウ症候群(Blau syndro
me; BS)と命名された。その後 2001 年、BS に特異的な変異を生じる原因遺伝子として Nod2 が
同定された。2005 年には、EOS においても NOD2 の変異がその責任遺伝子であることが証明さ
れている。 
Nod2 は RICK/RIPK2/RIP2 と呼ばれるアダプター分子と結合して、Nod2-ノドソームを構成し、
細胞壁ペプチドグリカンの構成要素である Muramyl dipeptide (MDP)を認識することにより、NF
-κB を活性化する。BS/EOS における変異型 Nod2 は NF-κB の恒常的機能亢進型であることが、
内外の多くの研究で明らかにされている。 
しかしながら、BS/EOS に特異的な治療薬はなく、恒常的 Nod2 の活性化が肉芽腫を形成する
メカニズムは未だに不明である。 
そこで我々は、BS/EOS に特異的な治療薬の開発と分子プローブを探索する目的で、コムギ胚
芽無細胞蛋白質合成技術により、野生型の Nod2 と BS/EOS 疾患に特異的な変異をもつ Nod2 お
よび RICK を合成し、試験管内に無細胞 Nod2-ノドソームを再構成した。 
［方法］ 
Nod2、RICKをコードする完全長cDNAをコムギ胚芽無細胞蛋白質合成用発現ベクターであるp
EUベクターにサブクローニングし、ビオチン化Nod2 (Nod2-Btn)およびその変異体、FLAG標識R
ICK(FLAG-RICK)とその欠失体を重層法により合成した。合成の確認はイムノブロット法で行な
った。Nod2とRICKの特異的結合を確認するため、Nod2-Btnをストレプトアビジンアガロースビ
ーズでプルダウンし、抗FLAGモノクローナル抗体によるイムノブロット法により検出した。 
次に、Nod2とRICK間の相互作用に関わる最小領域とされているカスパーゼリクルートメント
ドメイン(CARD)の Nod2-CARD1+CARD2(CARDs)、RICK-CARD、またBS/EOSの変異型Nod2で
あるNod2(R334W)とNod2(N670K)をコムギ胚芽無細胞蛋白質合成し、それぞれの蛋白質間の近接
作用をAmplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (ALPHA)によって検出した。 
 
［結果と考察］ 
コムギ胚芽無細胞蛋白質合成法による Nod2-ノドソームの構成蛋白質の合成を確認した。 
次に、Nod2-Btn と FLAG-RICK の反応生成物をストレプトアビジンアガロースビーズでプル
ダウンし、イムノブロット法で抗 FLAG モノクローナル抗体により検出した。その結果、MDP
存在下で FLAG-RICK が検出され、細胞を用いた先行研究で報告されている Nod2-RICK 間の相
互作用に MDP が関与していることが無細胞合成系で確認できた。 
次に、Nod2 と RICK の近接を検証するため ALPHA をおこなった。野生型の Nod2-Btn、FL
AG-RICK に加え、Nod2-CARDs-Btn、FLAG-RICK-CARD を無細胞合成し、それぞれの組み合
わせで ALPHA をおこなった。その結果、Nod2-CARDs-Btn と FLAG-RICK-CARD でのシグナ
ルが最も高い数値を示し、CARD 領域による結合が示唆された。また MDP と MDP 構成成分
や類似化合物の添加による比較では、MDP 添加においてのみ顕著なシグナル上昇が確認され
た。さらに BS/EOS における変異型 Nod2 と野生型 Nod2 で比較すると、野生型に比べ、疾患
変異型 Nod2 は MDP 濃度依存的に、より高いシグナルが確認され、ALPHA による無細胞 Nod
2-ノドソームの再構成が確認できた。 
 
［結語］ 
 無細胞 Nod2-ノドソームにおいて、MDP による相互作用の亢進、BS/EOS に関与する変異型
Nod2 での MDP 反応性の上昇が確認できた。これらから、新規治療薬の開発や特異的な分子プ
ローブの探索に有用と考えられる無細胞試験管内 Nod2-ノドソームの構築に成功したと考える。 
 
 
 公開審査会は平成 28 年 12 月 19 日に開催され、申請者は研究内容を明快に発表し、以下の
内容を含む多くの質問に対し的確に応答した。主な質疑の内容として、1)クローン病を含めた
他の Nod2 の変異に関して、2) ALPHA の解析方法に関して、3) EOS/Blau 症候群の臨床症状
に関して、4) MDP による Nod2 と RICK の結合に関して、5) 試験管内と細胞質内での Nod2, 
RICK の反応性の相違に関して、などであった。 
 審査委員は，申請者が本論文関連領域に対して学位授与に値する十分な見識と能力を有する
ことを全員一致で確認し，本論文が学位授与に値すると判定した。 


Nod2-Nodosome in a Cell-Free System: Implications in Pathogenesis and Drug Discovery for Blau Syndrome and Early-Onset Sarcoidosis

上田, 哲平

KAMINOTA, Teppei

（第７号様式） 
 
学位論文審査結果の要旨 
 
   氏     名      上 田 哲 平 
 
 
 
 
 
   審 査 委 員 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
                                      
 
                                      
 
                                      
 
                                      
 
                                      
 
 
      論  文  名 集団的細胞運動への関与による頭頸部扁平上皮がんのリンパ節転
移における NHE1 の寄与 
 
頭頸部扁平上皮がんの進行は、肺などへの遠隔転移に先立ってリンパ節転移を経ること
が多い。このことはリンパ節転移さえなければ遠隔転移の起こる可能性が低いことを示し
ており、したがってリンパ節転移を阻止できれば、このがんの進行を食い止める効果的な
治療となると期待されて久しい。 
上皮がん細胞の転移に至る腫瘍細胞の運動は、運動性を獲得した単一の細胞が原発巣を
離脱して血管やリンパ管に侵入することがその初期過程であると認識されてきたが、近年
これに加えて、がん細胞が集団で移動して転移に至る例 - collective migration - が見
出されている。扁平上皮がんにはこの細胞移動様式をとるものが見出されている。 
ナトリウムイオン・プロトン交換輸送体 1（NHE1）は 細胞内 pH の制御因子としてのほ
か、アクチン細胞骨格の形質膜への繋留点としての意義が見出された膜蛋白質であり、細
胞の運動性制御や細胞極性の維持への寄与が示唆されている。 
 申請者は、ヒト頭頸部扁平上皮がん組織における NHE1 発現亢進を見出した。頭頸部扁
平上皮がん細胞におけるこうした発現亢進は知られていないことから、その意義を追求し
た。 
その結果、樹立したリンパ節転移モデルにおいて高転移性を示す扁平上皮がん細胞が集
団的細胞運動を行うことが観察され、NHE1 の過剰発現はこの様式の細胞運動に寄与してい
た。NHE1 の分子機構のうち、とくにアクチン細胞骨格制御能が集団的運動性の亢進に大き
い寄与をなしていた。NHE1 ノックダウン細胞が転移性の減少を示したことから、NHE1 の
過剰発現は実際に扁平上皮がんのリンパ節転移に寄与していることが示唆された。 
 collective migration の分子機構にはいまだ不明な点が多く、特に NHE1 の寄与につい
ては既報がない。本研究は、頭頚部扁平上皮がんにおいて発現亢進した NHE1 が、そのア
クチン細胞骨格制御能を通じた collective migration への寄与によって転移のリスクを
高める危険な細胞運動に貢献しており、したがって転移抑制治療の標的足る可能性がある
ことを示唆している。 
 
発表後審査員より、 
① NHE1のEIとKRの２種の変異体を用いた実験で、両方とも細胞運動に影響を及ぼしてい
る点について、どのような分子機構を想定するのか、 
② NHE1タンパク質の臨床検体での高い発現は、常に観察されるのか、 
③ NHE1タンパク質によるアクチン制御に低分子量G-タンパク質は、どのように絡んでい
るのか、 
④ NHE1のKR変異体発現細胞での細胞膜rufflingの判定は、統計処理をなされた上で有意
なのか、 
⑤ マウス移植モデルでのNHE1インヒビター投与では、どのような効果が認められるのか、 
⑥ NHE1発現亢進によるがん細胞の局所浸潤は、どのように変わるか、 
⑦ NHE1発現亢進は、がん細胞の転移よりむしろ局所浸潤に関わっているのではないか、 
⑧ NHE1発現の有無で抗がん剤の感受性はどのように違うのか、 
⑨ NHE1発現変化による接着因子インテグリンの細胞膜局在変化は認められるか 
⑩ 他のNHEファミリー分子のがんへの関与は、またファミリーメンバー分子間の階層性
は見られるのか、 
などの活発な質疑がなされた。上田氏はこれらの質問に対して明確に返答した。 
 
 審査委員は、申請者が本論文関連領域に対して学位授与に値する十分な見識と能力を
有することを全員一致で確認し、本論文が学位授与に値すると判定した。 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 


Elevated Na^+/H^+ exchanger-1 expression enhances the metastatic collective migration of head and neck squamous cell carcinoma cells

根本, 淳子

吉田, 明恵

仲道, 雅輝

田中, 寿郎

Japanese

学生にとって初めてのフルオンライン型ラーニング科目の履修動向と学習継続支援 : 実践からの一考察

柳, 光子

フランス語E-ラーニング教材開発の試み : 文法ならびに仏検対策編

山﨑, 哲司

Moodleとポートフォリオを活用した授業実践

山下, 奈緒子

福田, 里砂

山脇, 孝

都築, 和宏

中村, 勝

e-learningを活用した周手術期実習の事前学習教材の開発 : 「周手術期看護:手術直後の患者の観察と対処方法」における取り組み

中曽, 久雄

憲法13条と私生活上の自由

立川, 信子

文化とモラルの関係について : ジッドに対するマラルメの役割

中川, 未来

『香川新報』の東学農民戦争報道 : 地域からのまなざしをいかに捉えるか

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