Ehime University Institutional Repository

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)doctoral thesi

三谷, 亜里沙

MITANI, Arisa

（第７号様式）
学位論文審査結果の要旨
氏 名 三谷 亜里沙
審 査 委 員
主査 松田 正司
副査 北澤 荘平
副査 矢野 元
副査 村上 正基
副査 吉田 素平
論 文 名 ドキシサイクリン誘導性 SV40 大型 T 抗原導入細胞を用いた
ヒト不死化結膜上皮細胞株の作製と評価
審査結果の要旨
【研究開始当初の背景と目的】
ドライアイは、涙液の減少や質的変化によって涙液層が不安定になり、眼精疲労や実用視力の低
下など生活の質を著しく低下させる。このインターネット社会のなか、VDT(Visual Display Ter
minals)作業時間は増える一方であり、ドライアイ患者数は年々増加、有病者は 2200 万人程度
存在すると推定され、決して軽視できない疾患となっている。近年、ムチンによる粘膜バリアの
役割が明らかにされつつあり、ドライアイの臨床的観点からもその重要性が指摘されている。結
膜上皮は、ムチン分泌による粘膜バリア形成、イオンチャネル・ポンプの発現による涙液量コン
トロールの両面において重要な役割を担うと考えられ、臨床的観点からもその重要性が指摘され
ている。しかし、適切な結膜上皮培養細胞が存在しないために、詳細な検討が困難な現状がある。
今後、長期間増殖可能でかつ結膜上皮の特徴・分化能を保持した細胞株の樹立が可能になれば、
結膜上皮細胞の分子細胞レベルでのメカニズムや病態解明、治療薬開発が飛躍的に進むことが期
待できる。本研究では、ドキシサイクリン（Dox）の有無で SV40 大型 T 抗原（SV40LT）遺伝子
の発現が制御できる誘導性 SV40LT 導入不死化ヒト結膜上皮細胞の作製を行い、その増殖能につ
いて検討した。さらに、上皮細胞と実質細胞を３次元で共培養する３次元培養システムを結膜上
皮の培養に応用し、結膜上皮特有の分化能を保持しているかについて明らかにした。
【研究の方法と成果】
ヒト結膜上皮細胞は、結膜弛緩症の術中に切除された余剰組織を用い、Dox 誘導性 SV40LT 遺伝
子を導入し、不死化を誘導した。Dox 誘導性 SV40LT 遺伝子は、SV40LT の上流にテトラサイクリ
ン応答因子（TRE）を導入し、Dox 存在下で TRE の転写を誘導するリバーステトラサイクリン制
御性トランス活性化因子（rtTA）を組み込むことによって Dox の有無で SV40LT 遺伝子の発現を
制御できるようにしたものを用いた。Western Blotting 法にて、iHCjEC の Dox 有無による発現
変化を検討したところ、Dox 存在下では SV40LT の発現が認められ、Dox 非存在下では SV40LT の
発現が経時的に減少した。Dox 存在下では iHCjEC は高い増殖能を長期間維持できることが確認
でき、現時点で少なくとも 25 継代以上の培養が可能であった。リアルタイム PCR により Dox‐
群では Dox＋群に比べ、CK13、MUC4、MUC16 の発現が亢進し、Dox‐/ FBS＋群では、CK13、MUC1、
MUC４、MUC16 の発現亢進が認められた。全ての培養条件において iHCjEC の重層化が確認できた。
Dox＋群では CK13 の発現が認められなかったのに対して、Dox‐群および Dox‐/ FBS＋群では発
現が確認された。KL-6 は Dox の有無に関わらず発現を認めた。
【得られた成果の国内外における位置づけとインパクト】
本研究では Tet-On システムを応用し、ドキシサイクリン（Dox）の有無で simian virus 40 大
型 T 抗原（SV40LT）遺伝子の発現が制御できる誘導性 SV40LT 導入不死化ヒト結膜上皮細胞の作
製に成功した。この不死化培養細胞では、Dox 存在下で SV40LT が誘導され長期間の培養が可能
となる一方、 Dox 非存在下ではその発現が抑制され、正常結膜上皮と同様の分化形質を発現す
ることが期待できる。本細胞は、Dox 存在下で少なくとも 25 継代以上培養可能であり、Dox 非
存在下で SV40LT の発現が抑制されることが確認された。また我々の教室では角膜上皮の基礎研
究において３次元培養システムを用いており、上皮細胞と実質細胞を３次元で共培養することで、
それぞれの細胞が生体と類似した挙動を示すことを証明してきた。この技術を結膜上皮の培養に
応用することにより正常結膜に類似した環境で分化誘導を行ったところ、重層化した結膜上皮細
胞が得られ、また Dox 非存在下では、結膜上皮細胞の分化マーカーであるサイトケラチン（C
K）13 の発現が亢進し、SV40LT 発現抑制下において、成熟した結膜上皮細胞への分化が促進さ
れると推測された。さらに、ムチン（KL-6）の発現も確認でき、誘導性 SV40LT 導入不死化結膜
上皮細胞は、高い増殖能と共に分化能を有することから、機能的に分化した結膜上皮細胞を安定
して用いる実験が可能になると考えられる。
公開審査会は、令和元年７月２３日に開催され、申請者は、研究内容を英語で明確に発表し 
た後に，審査員から本研究に関する以下の質問がなされた。結膜初代培養と継代の困難な点、
生体モデルの可能性、角膜培養との相違、不死化細胞の分化度、細胞内小器官の形態、FBS の
細胞毒性、コラーゲンゲルと羊膜利用、クローン化の可能性、本研究の最終目的、ドライアイ
のタイプ、ドライアイ関連物質、ドライアイの地域差と性差、細胞株樹立の改良点と将来展望
等、多くの質問が出されたが、申請者はこれらの質問に的確に回答した。審査委員は，申請者
が本論文関連領域に対して学位授与に値する十分な見識と能力を有することを全員一致で確認
し，本論文が学位授与に値すると判定した。


English

ドキシサイクリン誘導性SV40大型T抗原導入細胞を用いたヒト不死化結膜上皮細胞株の作製と評価

梶原, 克彦

Japanese

第一次世界大戦におけるドイツ兵捕虜と〈アルザス=ロレーヌ人〉の解放問題

田中, 雅人

愛媛大学教育学部紀要、第 66巻、2019 
主観的・感覚的なことばと視覚情報による動きの調節 
 
（保健体育講座）田中雅人 
 
Control of movement by the subjective, sensuous words  
and visual information 
Masato TANAKA 
 
（令和元年９月２日受理） 
 
 
１．はじめに 
２．実験１ 
2-1．目的 
2-2．方法 
１）実験参加者 
愛媛大学教育学部紀要　第66巻　61~66　2019
主観的・感覚的なことばと視覚情報による動きの調節
２）映像（視覚情報）の作成 
３）課題 
図1．課題２で用いた映像 
４）力学的変数の計測 
５）手続き 
図2．実験状況 
２-３．結果と考察 
１）言語情報による動きの調節 
愛媛大学教育学部紀要、第 66巻、2019 
図3-1．動きの調節（跳躍高） 
 
図3-2．動きの調節（離床時速度） 
 
図3-3．動きの調節（最大床反力） 
２）視覚情報による動きの調節 
愛媛大学教育学部紀要　第66巻　61~66　2019
主観的・感覚的なことばと視覚情報による動きの調節
図4-1．情報による違い（跳躍高） 
図4-2．情報による違い（離床時速度） 
図4-3．情報による違い（最大床反力） 
３）言語情報と視覚情報により形成される運動表象 
図5-1．跳躍高と離床時速度（言語情報） 
図5-2．跳躍高と離床時速度（視覚情報） 
図5-3．離床時速度と最大床反力（言語情報） 
愛媛大学教育学部紀要、第 66巻、2019 
図5-4．離床時速度と最大床反力（視覚情報） 
３．実験２ 
3-1．目的 
3-2．方法 
１）実験参加者 
２）課題 
３）手続き 
3-3．結果と考察 
１）空間的調節に関わる動き 
２）時間的調節に関わる動き 
３）力動的調節に関わる動き 
表１．動きを表現することば 
たかく ひくく おおきく ちいさく ゆっくり はやく つよく よわく
たかく 57.6 0.0 16.7 1.5 9.1 3.0 12.1 0.0
ひくく 1.5 31.8 0.0 31.8 1.5 13.6 1.5 18.2
おおきく 19.7 0.0 47.0 0.0 6.1 0.0 27.3 0.0
ちいさく 0.0 15.2 3.0 33.3 0.0 3.0 0.0 45.5
ゆっくり 24.2 0.0 19.7 1.5 50.0 1.5 3.0 0.0
はやく 0.0 13.6 1.5 30.3 0.0 42.4 1.5 10.6
つよく 45.5 0.0 36.4 0.0 4.5 0.0 13.6 0.0
よわく 0.0 21.2 0.0 18.2 16.7 6.1 0.0 37.9
愛媛大学教育学部紀要　第66巻　61~66　2019
主観的・感覚的なことばと視覚情報による動きの調節
４）視覚情報に対する言語的コード化 
４．まとめ 
付記 
文献 
Berger， G．H． and Gaunitz， S．C．B．（1979）
Self-rated imagery and encoding strategies 
in visual memory．The British Journal of 
Psychology，70：21-24． 
稲垣 敦（1994）運動イメージとその言語表現－
短距離走の場合－．体育の科学，44（3）：
201-206． 
大道 等（1997）動作記述における伝達内容の劣
化．体育の科学，47（8）：617-623． 
Paivio，A．（1971）Imagery and verbal processes．
Holt， Rinehart and Winston：New York． 
田中雅人（2017）動きの調節をあらわすことばと
力学的変数．愛媛大学教育学部紀要，64：
15-20． 
田中雅人（2014a）動きの印象を表す感性語の構
造分析．愛媛大学教育学部保健体育紀要，９：
29-37． 
田中雅人（2014b）感性情報を定量化する試み ―
「うまさ」と空間的・時間的物理量―．愛媛
大学教育学部紀要，61：111-116．


主観的・感覚的なことばと視覚情報による動きの調節

徐, 祝旗

XU, Zhuqi

部品のピッキング遅れを考慮した生産スケジュール決定に関する研究

Ehime University (愛媛大学)博士(農学)thesi

森, 拓也

MORI, Takuya

学  位  論  文  要  旨   
Dissertation Abstract 
 
 
氏名：  
Name 
森 拓也  
学位論文題目：  
Title of Dissertation 
遺伝的多様性および血清中総炭水化物含量を用いたアコヤ
ガイ母貝育種に関する研究  
 
学位論文要旨：  
Dissertation Abstract 
 
 
 
 
 
 
 
  アコヤガイ養殖に用いるアコヤガイPinctada fucataは、真珠品質向上、赤変病へ
の耐病性など健苗性を高めるために、人工貝が用いられている。人工貝を用いる
ようになった結果、これらの品質向上につながってきた。一方で、選抜育種を繰
り返した結果、成長不良、生残率の低下等の近交弱勢が疑われた。アコヤガイ養
殖の持続的な発展には、近交弱勢を防ぎつつ優良な親貝を選抜することが非常に
重要である。  
本研究では、まずアコヤガイ育種において近交弱勢が見られるか検証をおこな
った。次に、近交弱勢を防ぎつつ育種を進めるために、地先海域から栄養状態の
優れたアコヤガイを選抜でき形質が次代に遺伝できるような指標開発をおこなっ
た。   これまで報告が無い日本産アコヤガイPinctada fucata martensiiの遺伝的多様性
評価のためのマイクロサテライトDNAマーカー開発を、中国産で報告のあるプラ
イマー21種で試みた。真珠養殖業がおこなわれている宇和海に面している愛媛県
宇和島市、愛南町および高知県宿毛市、土佐清水市に自生している天然アコヤガ
イ集団、また、アコヤガイ真珠養殖業がおこなわれていない日本海の石川県穴水
町に自生している天然アコヤガイ集団計 276個体の遺伝的多様性および集団の遺
伝的分化についてDNA断片の増幅を行った。  
マイクロサテライトDNAマーカー4座で解析にたえる結果が得られ、ナルアリル
頻度が0.2以下の2座を用いて検討した。結果、すべての天然集団において、検出ア
リル数が多く（12.0～16.5）、ヘテロ接合体率も高かった（ 0.833～0.874）ことか
ら多様性が保たれていると考えられた。Hardy-Weinberg平衝からの逸脱がみられた
ものの、他の二枚貝の遺伝的傾向を反映していることから、アコヤガイのマイク
ロサテライトDNA分析は集団の遺伝的多様性を把握できるものと考えられた。   アコヤガイ真珠養殖の選抜形質における遺伝的多様性の影響を評価するため、1
対1交配の8組の家系をつくり、成長・生残、真珠生産およびマイクロサテライト
DNA解析による遺伝的多様度を比較した。全湿重量とヘテロ接合体率の期待値
（He）には強い正の相関が見られ、生残率の最も低い区はHeが他の試験区より低
い傾向にあり、近交弱勢が示唆された。真珠生産で真珠採取率の低い試験区はHe
が最も低い傾向であったが、品質に明確な差は示されなかった。今後のアコヤガ
イ真珠養殖には遺伝的多様性指標の導入も重要であることが示唆された。   近交弱勢を防ぎつつアコヤガイ育種を進めるために、地先海域から栄養状態の
優れた優良なアコヤガイを選抜することを目的とし、アコヤガイ血清中の炭水化
物量（血清中総炭水化物含量）を、アンスロン法を用いて簡便に測定する手法の
開発を試みた。栄養蓄積状態を示すグリコーゲン含量が高いアコヤガイ家系選抜
のために、様々な家系や天然のアコヤガイの血清中の炭水化物含量、閉殻筋 a値、
グリコーゲン含量および血清タンパク質含量を複数年に渡って評価した。  
評価をおこなった結果、血清中総炭水化物含量は、グリコーゲン含量と類似し
た季節変動を示した。また、血清中総炭水化物含量、タンパク質含量はグリコー
ゲン含量と高い相関性を示した。これらから、血清中の炭水化物含量は、栄養状
態の優れたアコヤガイの選抜指標となることが示唆された。   開発した選抜指標が次代に影響を与えるかどうかを検証するために、血清中総
炭水化物含量を指標として親貝を選別し種苗生産した。高含量親貝由来の家系は
低含量由来に比べ血清中総炭水化物含量が高く、血清タンパク質含量と閉殻筋グ
リコーゲン含量は高い傾向、閉殻筋の赤色度は低い傾向にあった。高含量由来の
家系と継代された日本貝、中国貝由来の2家系を母貝に用い真珠生産試験をした結
果、高含量由来の家系は日本貝家系に劣らない成績であった。この結果から血清
中総炭水化物含量による天然貝からの選抜が有効であると示唆された。  
これらの試験結果の総括として、日本産アコヤガイ集団の遺伝的多様性を把握
する手法としてマイクロサテライトDNA解析が有効であることを明らかにした。
また、有効であることがわかったマーカーを用いて継代家系を調査すると、多様
性が低くなると生育および真珠品質に悪影響があることを明らかにした。次に、
多様性を維持しつつ育種を続けるために、地先海域からの栄養状態の優れた天然
貝を選抜することを試みた結果、血清中総炭水化物含量による選抜が生理状態の
みでなく真珠品質も次代に影響を与えられることを明らかにした。  
 


遺伝的多様性および血清中総炭水化物含量を用いたアコヤガイ母貝育種に関する研究

Akkharapimon, Yotsombat

（様式５）(Style5) 
学位論文全文に代わる要約 
Extended Summary in Lieu of Dissertation 
 
 
氏名： 
Name 
Akkharapimon Yotsombat 
学位論文題目： 
Title of Dissertation 
Cloning and functional expression of the D-glucoside 3-dehydrogenase  
complex from Rhizobium sp. S10 in Escherichia coli and its application  
for rare sugars production 
（Rhizobium sp. S10由来 D-グルコシド3-デヒドロゲナーゼ遺伝子複合体の
クローニングと大腸菌内での組換え酵素生産および希少糖生産への応用） 
 
学位論文要約： 
Dissertation Summary 
 
 
A D-Glucoside 3-dehydrogenase (G3DH) is a FAD-related enzyme that catalyze the oxidation reaction of 
hydroxyl group at C-3 position of various glucosides to their corresponding 3-ketoglucosides. It transfers electron via 
cytochrome to terminate the oxidation reaction, however, this enzyme can use some other artificial electron acceptors, 
for example, 2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP), phenazine methosulfate (PMS), and ferric cyanide. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure 1 Oxidation reaction of sucrose by 
D-glucoside 3-dehydrogenase (G3DH); 
G3DH has physiological importance as a common factor for glucosides and amino acids transportation in the 
energy-supplying system, as a membrane structure to maintain the transport reactions, and as a member of respiration 
system that prepares 3-ketoglucosides, the first intermediates in carbohydrate metabolic pathway. G3DH seems to play 
a key role in microorganisms’ sugar metabolism. 
G3DH has attracted interest by its broad substrate specificity and site-selective oxidation properties. The 
conversion product, 3-ketoglycoside, shows potential as a starting material for the chemical industry such as in polymer 
and surfactants since the keto group becomes a specific site for selective chemical synthesis. Several glucose 
oxidoreductases are known and have been used as a component of enzyme biosensors for blood glucose level 
measurement. Nevertheless, G3DH has practical applications over other glucose oxidoreductases because of its 
cofactor binding structure that would not be affected by oxygen in the reaction mixture. Another advantage is the 
property of reducing glycosides that lack of a hydroxyl group at the C-1 position, for example, the 
1,5-anhydro-D-glucitol measurement in clinical diagnostics 
（様式５）(Style5) 
G3DH producing microbe, Agrobacterium tumefaciens, was discovered in the early 1960s by Bernaerts and 
De Ley. G3DH enzyme was isolated and purified by Hayano and Fukui. Later, this enzyme was found and identified in 
other bacteria as well as in fungi, for example, Flavobacterium saccharophilum, Cytophaga marinoflava, Agaricus 
bisporus, Halomonas (Deleya) sp. α-15, and recently Sphingobacterium faecium.  
Those G3DHs were purified and characterized, but only a few have been cloned and overexpressed in 
Escherichia coli. The recombinant G3DH from Halomonas (Deleya) sp. α-15; however, was less active than the wild 
type. In 1997 and 2006, a fragment containing the G3DH gene from A. tumefaciens was cloned and overexpressed into 
E. coli, though the outcomes were insoluble G3DH and inactive G3DH. Newly isolated S. faecium ZJF-D6 was cloned 
and functionally expressed in E. coli, but its activity was lower than that from the natural organism. Recently, G3DH 
from R. radiobacter (A. tumefaciens) was expressed in E. coli by a co-expression vector as a heterodimeric complex 
that showed dye-mediated G3DH activity toward methyl-α-D-glucoside. 
From the first discovery of the G3DH, many researchers have been working on the screening for novel 
organisms with G3DH activity. Despite its prominent properties, only limited information of G3DH has been reported, 
even though it is necessary to improve G3DH utilization. This work is divided into three chapters; isolation of a novel 
G3DH, the cloning of a G3DH gene from Rhizobium sp. S10, and rare sugars production using aldo-keto conversion 
application of G3DH. 
The first chapter is about screening for G3DH producing microbes, then purified and characterized G3DH 
from a selected microbe. The screening method was done in two steps; medium screening and G3DH activity assay. 
Lactitol was used as a carbon source for selecting glucoside-degradable microbes from soil. G3DH activity was then 
observed in the next step by following the reduction rate of 2,6-dichlorophenolindophenol at a wavelength of 600 nm. 
In the oxidized form, DCPIP is blue but when DCPIP is reduced, it would turn to colorless. From screening method, ne 
microorganism named ‘L35’, having the highest activity was selected. The 16s ribosomal RNA sequence of L35 was 
paired to the sequence database using BLAST and the result indicated that L35 showed 100% identity to Rhizobium sp., 
therefore is named ‘Rhizobium sp. L35’. 
To purify G3DH, Rhizobium sp. L35 cells were cultivated in 10 L jar fermenter using YE medium containing 
1.0% maltitol and the crude enzyme was prepared according to the previous described method. G3DH was purified in 
three steps using column chromatography. The enzyme was purified 150-fold and to 7.2% yield from crude extract. 
The specific activity was 7.628 U/mg.  
 
 
 
 
 
 
 
Figure 2 SDS-PAGE analysis of purified G3DH. M; 
molecular weight marker, Lane 2; crude enzyme, 
Lane 3; Hi-trap Phenyl, Lane 4; Hi-trap Q, and Lane 
5; purified G3DH. 
（様式５）(Style5) 
 The optimal temperature for enzyme activity was determined to be 37-40°C, and the half-life of G3DH was 
approximately 3 h at 40°C and 50 min at 45°C. The optimum pH for enzyme activity was 7.0-7.5 when DCPIP was 
used as the artificial electron acceptor, and the enzyme was stable between pH 6.0-11.0 (Fig 3). Most of the investigated 
metal ions did not affect G3DH activity, however, the activity was slightly enhanced by adding 1 mM FeSO4 to the 
reaction mixture (15% increase). Activity was inhibited by the addition of CuCl2 and MnCl2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure 3 Effects of temperature on G3DH activity (a) and stability (b). Effects of pH on G3DH activity (c) and stability 
(d). Citrate buffer (pH 3.0–4.0; ●), acetate buffer (pH 4.0–6.0; ▲), sodium phosphate buffer (pH 6.0–8.0; □), Tris-HCl 
buffer (pH 7.5–9.0; ◆), glycine-NaOH buffer (pH 9.0–11.0; ○) 
 
In terms of substrates, the enzyme showed its highest activity toward cellobiose, followed by salicine (91.5%), 
lactose (84.7%), maltose (82.8%), gentiobiose (78.6%), maltotriose (75.3%), and D-glucose (63.3%). This enzyme 
exhibited slight activity towards D-xylobiose (7%) and D-mannobiose (5.1%). While G3DH showed almost no activity 
towards D-xylose and D-mannose. A disaccharide substrate is likely to be recognized and bound more easily by the 
active site because of the increased interactions between the pyranose rings and amino acid residues compared with a 
monosaccharide. 
 
The second chapter, G3DH gene cluster from newly isolated Rhizobium sp. S10 was extracted and analyzed 
for its nucleotide sequence. The result revealed that this fragment contains 1,686 bp of a complete open reading frame 
(ORF), which is encoded for a catalytic subunit of G3DH. This sequence was deposited in the Genbank database under 
accession number LC348386. The translated amino acid sequence of the catalytic subunit showed the FAD binding 
motif (GXGXXG), which could be found in FAD-harboring enzymes. Another two shorter ORFs were also pointed 
out. The first nucleotide of a 558-bp ORF, named as small subunit, has one nucleotide overlapping with the catalytic 
subunit. While the other 396 bp ORF, named as cytochrome C subunit, is located downstream of the former ORFs.  
(a) 
(c) 
(b) 
(d) 
（様式５）(Style5) 
To create a gene fragment with restriction sites for cloning, specific primers were designed. Then, the 
amplified gene was ligated into pQE30 and pQE3060 expression vectors, before transformed into E. coli. The 
recombinant E. coli JM109 was cultured in SB medium and incubated at 37°C, 180 rpm until the culture reached 
OD600 of 0.4-0.6. The protein expression was then induced by adding 1 mM IPTG and was continuously incubated at 
23°C for 16 h. The recombinant enzyme, identified as rG3DH, was overexpressed in a soluble fraction. The rG3DH 
from pQE30 expression vector was purified by 2-step column chromatography with a relatively high specific activity 
of 38.54 U/mg. While the rG3DH from pQE30 expression vector was purified by 4-step column chromatography.  
Table 1 Purification of rG3DH 
Expression 
vector 
Purification step Total protein 
(mg) 
Activity 
(U) 
Specific activity 
(U/mg) 
Recovery 
(%) 
Purification 
(fold) 
pQE30 
Crude enzyme 549.5 186.2 0.34 100 1 
His trap 16.74 67.23 4.02 36.12 11.85 
Hi-trap Q 1.10 42.51 38.54 22.84 9.59 
pQE60 
Crude enzyme  464  299  0.65 100 1 
Hi-trap phenyl  8.40  20.17  2.40 6.75 3.69 
Hi-trap Q  0.52  9.52  9.52 3.19 3.97 
Resource Q  0.14  1.65  11.87 0.52 1.25 
Gel filtration 0.09  1.62  20.61 0.54 1.74 
 
The purified pQE30-rG3DH showed a two- band with MW of 66 kDa and 18 kDa, which represented the 
catalytic subunit and the small subunit, respectively (Fig. 4). The purified pQE60-rG3DH showed a single band of 66 
kDa after four steps of purification; however, the 18 kDa band could not be detected (Fig. 5). The reason is that the 
small subunit might be separated throughout the purification steps. Although the MW of the purified rG3DH catalytic 
subunit was estimated to be 66 kDa in SDS-PAGE, it was analyzed to be 63303 Da by MALDI-TOF mass 
spectrometry, which is consistent with the calculated MW based on the predicted protein sequence (63350 Da). 
 
Figure 4 SDS-PAGE of pQE30-rG3DH purification. 
Lane 1, crude extract; lanes 2–3, sample of the 
enzyme from His-trap HP and Hi trap Q column 
(purified enzyme). Arrows indicate catalytic subunit 
(66 kDa) and small subunit (18 kDa). 
 
Figure 5 SDS-PAGE of pQE60-rG3DH purification. 
Lane 1, crude extract; lanes 2–5, sample of the 
enzyme from Hi trap Phenyl HP, Hi trap Q, Resource 
Q, and Gel filtration (purified enzyme). 
（様式５）(Style5) 
Remark: Even though the specific activity of the crude extract of rG3DH from pQE60 is higher than that of pQE30, the 
purification of a non-Histidine tag protein is quite difficult and takes time. Therefore, rG3DH form pQE30 expression vector 
was used in the following experiments. 
  
To investigate the effect of pH and temperature on activity and stability, G3DH activity was assayed in a pH 
range of 5.0–10.0 and the temperature range of 0–60°C. The results showed that rG3DH exhibited the highest activity 
in Tris-HCl buffer pH 7.0, 40°C with DCPIP as an electron acceptor. The rG3DH should be stored in the weakly-basic 
condition and low temperature. 
 
Figure 6 (a) Optimum pH for rG3DH. (b) Effect of pH on rG3DH activity. The effect of pH on rG3DH activity was 
examined with acetate buffer (pH 3.0–6.0; open square), sodium phosphate buffer (pH 6.0–8.0; open triangle), 
Tris-HCl buffer (pH 7.0–10.0; open circle), MES buffer (pH 6.0–7.0; close diamond), and sodium bicarbonate buffer 
(pH 10.0–11.0; close square). (c) Optimum temperature for rG3D. (d) Effect of temperature on rG3DH activity. 
Thermostability of rG3DH was examined at 30°C (square), 40°C (circle), 50°C (triangle), and 60°C (diamond). 
 
A wide range of disaccharides such as cellobiose, gentiobiose, and lactose served as good substrates for 
rG3DH.  Among the monosaccharides used in this study, rG3DH showed high activity toward glucose and its 
derivatives harboring pyranose rings but low activity toward monosaccharides with furanose rings. Toward various 
metal ions, rG3DH activity was not affected much. Except Co2-, Mn2-, Cu2+ and Ag+ that could inhibit rG3DH activity. 
On the other hand, FeSO4 slightly increased the activity by 12%. 
Based on the deduced amino acid sequence of the catalytic subunit of rG3DH, we found sequence features 
that are highly conserved in FAD-harboring dehydrogenase. Interestingly, several dehydrogenases share similarity of 
（様式５）(Style5) 
having hetero-oligomeric structure composed of a catalytic subunit containing FAD, a multiheme cytochrome complex 
subunit, and a chaperon-like subunit. From the primary structure resemblance between G3DHs and sorbitol 
dehydrogenase from Gluconobacter oxidans and 2-keto-D-gluconate dehydrogenases from Erwinia herbicola and 
Pantoea citrea, which are oligomeric enzymes made up of three subunits. The nucleotide sequencing of the gene 
fragment from Rhizobium sp. S10 also revealed three ORFs, therefore, we predict that G3DH is a three-component 
enzyme. 
 
In the third chapter, the partial purified G3DH from Rhizobium sp. L35 was utilized to produce D-allose 
from cellobiose by a three-step process of enzymatic-dehydrogenation, chemical reduction, and acid-hydrolysis. The 
final yield of D-allose was approximately 30%, which was three-time higher than the conventional method. The 
recombinant E. coli harboring pQE60-G3DH expression vector also exhibited an outstanding activity, therefore, the 
resting cell reaction was performed. The glycosides oxidizing activity combined with chemical reaction, could produce 
D-gulose from lactitol via 3-ketolactitol with roughly 8% yield. 
 
Over decades, many researchers have been exploring novel G3DH or more deeply analyzing those G3DHs 
discovered in different organisms but only a limited number of studies about gene cloning and overexpression of this 
enzyme have been reported. To conclude this research, a novel G3DH producing microbe was screened. Additionally, 
G3DH gene from a newly isolated Rhizobium sp. S10 was cloned in E. coli and the recombinant protein was 
successfully expressed in the soluble fraction with an outstanding G3DH activity. Finally, this new process of 
microbiological reaction together with chemical reaction can be applied not just for D-allose and D-gulose, but also 
various rare sugars production. Despite the importance of, the secondary-tertiary structure and the mechanism of 
G3DH are still unknow. Further research on genetic information is necessary to clarify the native structure of G3DH 
and its substrate binding mechanism. So that we could make use of the enzyme more efficiently. 


Rhizobium sp. S10由来D-グルコシド3-デヒドロゲナーゼ遺伝子複合体のクローニングと大腸菌内での組換え酵素生産および希少糖生産への応用

Dan, Quang Tran

Studies on the halophilism in a halophyte, the common ice plant, Mesembryanthemum crystallinum L.

Ehime University (愛媛大学)博士(学術)thesi

Niken, Pujirahayu

Chemical Constituents, Botanical Origin and Biological Activity of Propolis of Tetragonula sapiens, a Stingless Bee, in Southeast Sulawesi, Indonesia

Hoang, Quoc Anh

（第５号様式）
学位論文審査の結果の要旨
氏    名 Hoang Quoc Anh
審 査 委 員
主査 高橋  真
副査 石橋 弘志
副査 多田 邦尚
副査 木場 章範
副査 鈴木  剛
論  文  名
Contamination Status, Emission Sources, and Risk Assessment of Organic Micro-Pollutants in the Air and 
Settled Dust: A Comprehensive Monitoring Study in Urban, Industrial, and Informal Waste Recycling Areas 
in Northern Vietnam
（大気およびダストにおける微量有機汚染物質の汚染実態の解明と発生源およびリスク評価：ベト
ナム北部の都市・工業および廃棄物処理地域における包括的モニタリング研究）
審査結果の要旨
近年、経済成長の著しいアジアの途上国や新興国では、都市・工業活動の拡大に伴って、環境汚 
染が深刻化している。また、様々な廃棄物や使用済み物品の再資源化・不適正処理に伴う周辺環境
の汚染や作業従事者への有害物質曝露も問題となっている。とくに最近の問題として、使用済み電
気機器や自動車（ELV）等の解体処理現場における不適正処理が注目されている。ベトナムにおい
ても、都市域における深刻な大気汚染や廃棄物処理現場における有害物質の排出等が指摘されてい
るが、未だ情報は断片的である。とくに高い環境残留性や有害性を有するポリ塩素化ビフェニル
（PCBs）やポリ臭素化ジフェニルエーテル（PBDEs）などの残留性有機汚染物質（POPs）につい
ては、その発生源やリスク評価に関する基礎情報の拡充が求められている。また PCBs のようにす
でに規制されている物質以外にも、実際の都市・工業活動等からは多環芳香族炭化水素（PAHs）等
をはじめ、様々な汚染物質が排出されていると考えられる。しかしながら、モニタリングにかかる
コストや分析法上の問題点等から、未規制の物質に関する情報は極めて限定的である。そこで本研
究では、多様な微量有機汚染物質（MOPs）を対象とした包括的な分析法を開発し、ベトナム北部
の都市・工業地域および ELV 等の廃棄物処理地域から採取した大気・ダスト試料を対象として、
MOPs による環境汚染の実態とその発生源について解明・解析するとともに、住民や作業従事者へ
の曝露リスクについて評価した。得られた研究成果の概要は、次のようにまとめられる。
１）MOPs に関する新規スクリーニング法および一斉分析法の確立
ガスクロマトグラフ-四重極型質量分析計（GC-qMS）および全自動同定・定量データベースシス 
テム（AIQS-DB）を用いた MOPs 942 種の一斉スクリーニング法を開発した。大気中 MOPs の捕集
には、電源を必要としないパッシブ型サンプラーを用い、簡便かつコスト的に優れたモニタリング
法を確立した。さらに従来の PCBs や PAHs に関する分析法を改善し、従来法よりも迅速かつ多種
の異性体や関連化合物を同時定量可能な一斉分析法を確立した。
２）大気およびダスト中 MOPs の一斉スクリーニングと発生源の解析
上記で開発した MOPs の一斉スクリーニング法をベトナム北部の都市域や工業地域、廃棄物処理 
地域で採取した大気試料および路上ダスト・フロアダスト試料に適用した。その結果、100 種類を
超える MOPs を検出するとともに、都市域においては、フタル酸エステル類や抗酸化剤などの日常
生活由来の化合物が主要な MOPs であるのに対して、廃棄物処理地域では PAHs などの燃焼・石油
起源の汚染物質やピレスロイド系殺虫剤などが多いことを指摘した。
３）大気およびダスト中 PCBs および臭素系難燃剤の汚染実態と発生源の解析
上記２）と同様の大気・ダスト試料について、PCBs 全異性体と主要 PBDEs 異性体および新規臭 
素系難燃剤（NBFRs）4 成分を測定した。その結果、ELV の解体処理施設において特異的な PCBs 
発生源があること、都市域において非意図的生成の PCB 異性体（PCB-11）が卓越的であること、
などを明らかにした。また、PBDEs については、ほとんどの試料において 10 臭素化体の BDE-209 
が主要異性体であること、過去の研究に比べ PBDEs に対する NBFRs（DBDPE）の濃度比が増加し
ていることを指摘した。
４）大気およびダスト中 PAHs 関連物質の汚染実態と発生源の解析、毒性同定評価
上記２）と同様の大気・ダスト試料について、PAHs およびメチル化 PAHs（Me-PAHs）を測定す
るとともに、in vitro レポーター遺伝子アッセイ“PAH-CALUX”を用いて PAHs 関連物質の毒性同
定評価を行った。その結果、ほとんどの地域において PAHs は燃焼起源由来が卓越的であること、
ELV 解体処理施設では、石油起源由来の PAHs や Me-PAHs の寄与が大きくなることを明らかにし
た。加えて、PAH-CALUX により得られた BaP（ベンゾ[a]ピレン）毒性当量値と機器分析の測定結
果に基づく理論的な BaP 毒性当量値の比較から、ダスト試料中に未知（未同定）の PAH 様活性物
質が多く存在することを示唆した。
５）MOPs 摂取量の推算と住民・作業従事者への曝露リスク評価
上記で得られた大気・ダスト試料中 MOPs の測定値をもとに、都市住民（成人・小児）、廃棄物 
処理地域住民（成人・小児）、都市路上作業従事者、廃棄物処理作業従事者のモデルケースについ
て、MOPs の摂取量を推算した。その結果、都市または廃棄物処理地域の小児のケースが最も高い
MOPs 摂取量を示し、PCBs や PAHs は大気経由、PBDEs 等臭素系難燃剤はダスト経由での摂取割
合が高いことを明らかにした。さらに、個別の物質について、上記の推算摂取量を米国 ATSDR 等
の報告する許容摂取量と比較したところ、全ての物質について許容摂取量を下回っていた。一方、
上記の PAH-CALUX で得られたダスト中 BaP 毒性当量値に着目すると、ELV の解体処理地域や都
市幹線道路ではカナダ環境省の土壌ガイドライン濃度を上回っており、PAHs 関連物質の曝露リス
クについてさらなる調査・検証が必要であることを指摘した。
以上、本研究により、これまで情報が欠落していた多くの MOPs について、ベトナム北部におけ
る汚染実態や発生源、住民・作業従事者に対する曝露リスク等に関する基礎情報が得られた。また、
MOPs の包括的モニタリングや曝露リスク評価に有効な新たな手法論も得られた。成果の一部は、
すでに国際的な学術誌において公表されており、ベトナムや他の途上国等における環境関連の研究 
・行政機関において貴重な基礎情報や手法論を提供するものと期待される。とくに PAHs 関連物質
について、従来から測定されている化合物以外にも潜在的な活性物質が存在する可能性を指摘した
点は、学術的に新規性の高い成果といえる。上記学位論文の内容は、分析化学、環境化学、生態毒
性学、資源循環工学等の広範囲かつ複数の分野に渡っており、学際的である。
本学位論文の公開審査会は、令和元年８月３日に高知大学農林海洋科学部で開催され、口頭発表 
と論文発表と質疑応答が行われた。引き続いて学位論文審査委員会を開いて本学位論文の内容を審
査した。その結果、本学位論文に記載された研究成果は、学術性が高く、学際的な分野において高
く評価されることから、審査委員全員一致して博士（学術）を授与するに値するものと判定した。


Contamination Status, Emission Sources, and Risk Assessment of Organic Micro-Pollutants in the Air and Settled Dust: A Comprehensive Monitoring Study in Urban, Industrial, and Informal Waste Recycling Areas in Northern Vietnam

川村, 智恵

KAWAMURA, Tomoe

 （第３号様式）     
 
 
学 位 論 文 要 旨 
 
 
 
            氏   名  川村 智恵 
 
 
 
      論 文 名 ヒトモチリン受容体トランスジェニックマウスを用いての 
モチリン受容体アゴニストとグレリンの作用発現に関する研究 
 
 
 
 
学位論文要旨     
 [背景と目的] 
消化管運動は神経性因子と液性因子により制御されている。モチリンとグレリンは消化管運
動促進系ホルモンであり、モチリン受容体(MLNR)、グレリン受容体(GHSR)の作動性物質は糖尿
病性胃麻痺などの消化管運動機能低下例の治療などに期待されているが、両者の関連に関して
は不明である。ヒトではモチリン系とグレリン系が存在するが、げっ歯類にはモチリン系が存
在せず、両ホルモン系の研究は困難であった。申請者らはこれまで in vitro でモチリン系と
グレリン系の相互作用を明らかにしてきた(J Biol Chem 2001,2002,2006, J Pharmacol Exp T
her 2005, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008, Regul Pept 2011,2012,2013)。
また in vivo ではヒト消化管における MLNR、GHSR の発現様式を明らかにし(J Gastroenterol 
2006)、動物モデルとして human motilin receptor transgenic(Tg)マウスを作成した(Regul 
Pept 2012)。本研究ではこの Tg マウスを用いて、モチライドが及ぼす消化管運動への影響と、
グレリンとの相互連関を明らかにすることを目的とした。 
 
[材料と方法] 
1. 10 週齢の human MLNR Tg マウスと、対象として C57BL/6J のマウスを使用した。Tg マウス
は Human MLNR の cDNA を挿入したプラスミドを受精卵に前核注入し、作成した。仔マウス
の尾より PCR で MLNR-DNA が導入されていることを確認した。 
2. Real-time RT-PCR にて Human MLNR, GHSR, グレリンの mRNA を定量した。内在性コントロー
ルとして GAPDH を用いた。 
3. Erythromycin とグレリンの投与経路は脳室内投与(中枢投与)と腹腔内投与(末梢投与)とし 
た。その他の薬剤(Mosapride, Loperamide, Atropine)は腹腔内投与を行った。 
 
 
氏名  川村 智恵   
4. 脳室内投与は bregma より 0.5mm 後方、1 ㎜側方の 3 ㎜の深さに針を注入し、2μl/2min で行
った。 
5. 胃排出能の測定は phenol red 法を用いて行った。phenol red 溶液を経口投与 20 分後にお
ける胃内に残存した phenol red の吸光度と 0 分後の吸光度との比より算出した。各リガン
ド投与はゾンデ挿口の 30 分前とした。 
6. 血漿アシルグレリンは ELISA kit を用いて測定した。 
7. 組織学的評価の検体は、Erythromycin 脳室内投与 1 時間における時点で取得した。 
8. この動物実験は、愛媛大学大学院医学系研究科等遺伝子組換え実験安全委員会および愛媛大学動
物実験委員会によって承認されている(承認番号：05TI80-16)。 
 
[結果と考察] 
1. Real-time RT-PCR において MLNR mRNA は消化管を中心として、全身に発現していた。GHSR
 mRNA はほとんどが脳に発現していたが消化管では低発現であった。グレリンの mRNA は胃
にて高発現であった。 
2. Erythromycin とグレリンには末梢投与、中枢投与ともに胃排出促進効果を認めた。Eryt
hromycin においては、中枢投与の際に Atropine にてその効果が消失することから、遠
心性ニューロンは迷走神経を介することが同定され、また末梢投与の際には Atropine に
てその効果が消失しないことから、消化管平滑筋に存在する MLNR への直接作用が示唆さ
れた。 
3. Mosapride での胃排出効果に対する Erythromycin の上乗せ効果を確認した。 
4. Loperamide による gastroparesis に対する Erythromycin の改善効果を確認した。 
5. Erythromycin を中枢投与した際に、血漿アシルグレリンが抑制されること、胃組織にお
けるグレリンの免疫染色にてグレリン陽性細胞が減少していることが確認され、モチリ
ン系とグレリン系は相補的な関係にあることが示唆された。 
 
 [結論] 
開発したヒトモチリン受容体Tgマウスはヒトの消化管機能評価可能な動物モデルとして有用
であり、同モデルを用いてモチライドが胃排出を改善するメカニズムを証明し、グレリンとの
相補的な関係が示唆された。本研究の成果は、新たな消化管運動機能改善剤の開発、モチリン
およびグレリンを介した消化管運動機能を改善させる治療への臨床応用につながることが期待
される。 
 
キーワード（３～５） モチリン グレリン エリスロマイシン 胃排出 
 


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