Ehime University Institutional Repository

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)thesi

沢田, 雄一郎

SAWADA, Yuichiro

（第７号様式）
学位論文審査結果の要旨
氏     名 沢田 雄一郎
審 査 委 員
主査 東山 繁樹
副査 飯村 忠浩
副査 北澤 理子
副査 阿部 雅則
副査 亀井 義明
論  文  名 GPRC5A は前立腺癌の細胞増殖と骨転移を促進する
審査結果の要旨
【背景】
前立腺癌は発症頻度の高い疾患で、早期治療により高い確率で根治が見込める癌腫であるが、 
治療抵抗性前立腺癌や進行性前立腺癌はリンパ節転移や、内臓転移を起こし、予後の悪化による
QOL の低下を招くこととなる。前立腺癌の治療戦略としてアンドロゲン除去療法は重要な位置
づけにあるが、アンドロゲン除去療法の問題点は治療経過とともにアンドロゲン非依存的な腫瘍
増殖機構により治療抵抗性となることにある。近年、G 蛋白質共役型受容体(GPCR)を起点とし
たシグナル伝達機構が多くの癌腫の治療、創薬ターゲットとなっており、前立腺癌においてもア
ンドロゲン受容体を介さない GPCR 依存性の増殖機構が注目されている。なかでもリガンドが
不明な Orphan GPCR は様々な癌腫において創薬ターゲットとなるポテンシャルを秘めているが、
前立腺癌における報告はほとんど存在せず、前立腺癌の治療標的として未だ多くの可能性を秘め
ている。申請者は、この点に着目し、ビックデータ解析により前立腺癌進展の制御因子の一つと
して Orphan GPCR より GPRC5A を見出し、前立腺癌における GPRC5A の機能解析を行い、治療
標的分子としての可能性を検討した。
【方法】
(1)代表的な前立腺癌細胞株である PC3 及び DU145 において GPRC5A をノックアウトし、in
vitro において細胞増殖能、細胞遊走能、細胞浸潤能、細胞接着能の変化を解析した。
(2) In vivo における細胞増殖能の解析のため、ヌードマウスにコントロール細胞及び GPRC5A ノ 
ックアウト細胞を皮下投与し、in vivo imaging で経時的な腫瘍の増大を評価した。
(3) コントロール細胞と GPRC5A ノックアウト細胞の RNA シークエンスを行い、GPRC5A ノッ
クアウトにより有意に発現変動する遺伝子群を抽出し、Gene ontology (GO) 解析にて発現変動す
る遺伝子群の機能を分類した。GO 解析にて変動を認めた細胞周期関連遺伝子群の発現変動を改
めてサンプルで確認し、フローサイトメトリーで細胞周期の変動を解析した。
(4) GPRC5A のシグナル伝達経路解析は、cAMP/PKA 経路を中心に解析した。
(5) 前立腺癌骨転移成立に及ぼす影響を確認するため、ヌードマウスの脛骨にコントロール細胞
及び GPRC5A ノックアウト細胞を播種し、細胞生着と増大を in vivo imaging で経時的に評価し
た。また、マイクロ CT による画像評価、骨密度測定、HE 染色および TRAP 染色による組織学
的評価を行った。
【結果と考察】
GPRC5A をノックアウトしたところ、in vitro、in vivo 共に増殖能が著明に抑制されるとともに
遊走能が抑制された。RNA シークエンスによる解析の結果、GPRC5A ノックアウトにより細胞
周期関連遺伝子群が有意に発現亢進していた。細胞周期の解析では GPRC5A ノックアウト細胞
において、G2/M 期の割合が増加し、G1 期の割合が減少していた。GPCR のシグナル活性の解析
においては GPRC5A ノックアウト細胞で CREB のリン酸化が亢進していた。一方で、GPRC5A 
ノックアウト細胞における GPRC5A の過剰発現により細胞増殖は上昇することが確認できた。
これらの結果からは GPRC5A は前立腺癌細胞において細胞周期関連遺伝子の発現を調節し、細
胞増殖を促進させているものと考えられた。脛骨骨髄内異種移植においては、GPRC5A ノック
アウト群の骨転移の成立が著明に抑制された。また、データベースを用いた解析では GPRC5A 
の発現と前立腺癌の予後との相関を認めた。これらのことから、GPRC5A は前立腺癌の増殖・
進展に関与し、新規の予後予測マーカーあるいは創薬のターゲットとなりえることが示された。
本論文は、新規な前立腺癌治療標的分子として GPRC5A を見出し、前立腺癌における GPRC5A 
の機能解析を行った結果、治療標的分子としての高いポテンシャルを提示した。公開審査会は、
平成３１年１月７日に開催され、申請者は、研究内容を英語で明確に発表し、１）GPRC5A の
正常機能は何か、２）GPRC5A ノックアウトによる表現系は複数の前立腺癌細胞株に共通して
いるか、３）ヒト前立腺癌生検試料での GPRC5A 組織染色はどのようになっているのか、４）
GPRC5A のリガンドは何か、どのような方法で同定するのか、５）前立腺癌細胞の骨転移と悪
性化における GPRC5A の役割は何か、６）GPRC5A のシグナル伝達分子機構の特徴的な点は何
か、などに関する多くの質問に対し日本語で的確に応答した。
審査委員は、申請者が本論文関連領域に対して学位授与に値する十分な見識と能力を有するこ
とを全員一致で確認し、本論文が学位授与に値すると判定した。


Japanese

GPRC5Aは前立腺癌の細胞増殖と骨転移を促進する

中曽, 久雄

NAKASO, Hisao

携帯電話の位置情報とプライバシー-Carpenter v. United States1

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)doctoral thesi

村上, 朱里

MURAKAMI, Akari

English

Cullin-3/KCTD10 E3 complex is essential for Rac1 activation through RhoB degradation in human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer cells

柳原, 裕太

YANAGIHARA, Yuta

 （第３号様式）     
 
 
学 位 論 文 要 旨 
 
 
 
        氏   名 柳原 裕太 
 
 
 
        論 文 名  Zscan10 はハプトグロビンの転写を介して破骨細胞分化を負に制御する 
 
 
 
 
 
 
 
学位論文要旨 
我々は、ゲノムワイドなクロマチン構造変換情報解析から、破骨細胞分化における新規転写
因子として Zinc finger and SCAN domain containing 10（Zscan10）を同定してきた（Inoue
 K et al. JBMR 2014）。Zscan10 は多能性幹細胞の未分化性やゲノム安定性の維持に関与す
ることが報告されているものの、その分子機能には未だ議論の余地がある。また他の細胞種に
おける役割については大部分が不明である。本研究では、Zscan10 による破骨細胞分化制御機
構の解明を目的とし、CRISPR/Cas9 により Zscan10 をノックアウトしたマクロファージ様細胞
株である RAW264 細胞 (KO 細胞)を樹立し、その機能について解析した。コントロール細胞（C
trl 細胞）および KO 細胞に対し、RANKL 刺激による分化誘導前後の経時的な破骨細胞分化マー
カー及び分化抑制因子の mRNA 発現量を RT-qPCR により測定した。また、成熟した破骨細胞に
おいて、その大きさ、数および TRAP 活性を測定した。その結果、Ctrl 細胞と比較して KO 細
胞では破骨細胞分化マーカーの mRNA 発現量、破骨細胞の大きさと数、TRAP 活性は顕著に増加
していた。さらに、分化抑制に関与する因子の mRNA 発現量は RANKL による分化誘導前から変
動していた。以上の結果から、Zscan10 は破骨細胞分化を負に制御することが示唆された。ま
た、分化誘導前から分化抑制因子の減少が認められたことから、KO 細胞では分化誘導前の遺
伝子発現プロファイルの変化が破骨細胞分化促進に寄与しているのではないかと考えられた。
そこで、RNA-seq により分化誘導前の RAW 細胞における網羅的遺伝子発現解析を実施した。そ
の結果、Ctrl 細胞と比較して KO 細胞では 173 遺伝子の発現量が 1/2 以下に減少、87 遺伝子の
発現量が 2 倍以上に増加していた。これらの遺伝子群の Gene ontology 解析を実施した結果、
減少した遺伝子群は B 細胞と脾臓に発現が多いこと、免疫系システムに関与していることが明 
氏名 柳原 裕太  
 
らかとなった。破骨細胞は免疫系の細胞である単球/マクロファージから分化することが知ら
れており、減少遺伝子群が破骨細胞分化に深く関与していると考えられた。 
そこで発現が減少した遺伝子群が、転写因子である Zscan10 により直接制御されるのか検索
するため、RNA-seq データに加え、Zscan10 結合塩基配列モチーフのゲノムワイド情報および
RAW264 細胞のクロマチン構造変換を解析した DNase-seq データを組み合わせ、統合的なゲノ
ムワイド解析を行った。その結果、Zscan10 の KO により遺伝子発現が低下し、遺伝子座近傍
ゲノム領域に結合モチーフ及びクロマチン構造変換を伴う遺伝子として Haptoglobin (Hp)を
同定した。実際に Zscan10 が Hp の遺伝子座近傍に結合しているのか確認するために ChIP-qPC
R を行った結果、Zscan10 は Hp 遺伝子座の 3’末端以遠と転写開始点に結合することが明らか
となった。以上の結果から、Zscan10 は Hp の転写を活性化させることで、破骨細胞分化を負
に制御している可能性が示唆された。 
Hp は主に肝臓で産生され、血中の酸化ストレスの原因となる遊離ヘモグロビンと結合し、
マクロファージに取り込まれることで、酸化ストレスから生体を保護する重要な役割を担って
いる。また、Hp は破骨細胞を活性化させることが報告されている。一方で Hp KO マウスは骨
量の減少と破骨細胞数の増加を示し、破骨細胞分化の抑制に関与していることが報告されてい
る。このように破骨細胞における Hp の役割は依然として議論の余地がある。そこで、Hp が破
骨細胞分化に及ぼす影響を確認するため、KO 細胞および骨髄細胞由来初代培養破骨細胞にリ
コンビナント Hp を添加し解析した。その結果、破骨細胞の大きさ、数、TRAP 活性及び分化マ
ーカーの mRNA 発現量がすべて抑制された。さらに、Hp が低値を示す溶結性貧血の患者では、
骨量の減少を引き起こすことが報告されていることからも、in vivo においても Hp が骨代謝
に対し保護的作用を示すことが示唆された。 
本研究の結果および過去の報告から、Zscan10 は Hp の転写を直接的に制御することで、破
骨細胞分化を負に制御していることが、Zscan10 KO 細胞における分化促進の一因であること
が明らかとなった。また、本研究において Hp が破骨細胞分化を負に調節し、骨代謝への保護
効果があることが明らかとなった。 
 
【本研究における倫理委員会の承認】 
本研究は愛媛大学医学部遺伝子組換え実験委員会及び愛媛大学動物実験委員会の承認を得てい
る。 
 
キーワード（３～５） 
 
 
 
 
Zscan10 
ハプトグロビン 
破骨細胞分化 
破骨細胞 
転写因子 
 


Zscan10 suppresses osteoclast differentiation by regulating expression of Haptoglobin

Ehime University (愛媛大学)博士(農学)thesi

米山, 仰

YONEYAMA, Aogu

 
 
（第５号様式）  
                        学位論文審査の結果の要旨 
 
    氏    名 米 山  仰 
審 査 委 員 
       
 
 
         論  文  名 
 
 東南アジア熱帯林樹木における環境ストレス下の被食防衛特性 
 
         審査結果の要旨 
 
長きに渡って固着生活をしいられる樹木にとって、光合成器官である葉を植食者からいか
にして守るかは、その樹木の適応度を決定する重要な要因となる。特に、一年を通して高温
な熱帯の環境では、常に生物活動が活発であるため、樹木と植食性動物の間の相互関係もよ
り複雑になる可能性が高い。樹木が備える葉の防御方法には、一般に炭素を主原料とするも
のが多く、同じく炭素を主原料とする成長や繁殖、貯蔵といった諸生命活動との間には、ト
レードオフの関係があると考えられている。そのため、樹木が生育場所で受ける種々の環境
ストレスは、樹木の光合成生産、ひいては成長や防御といった光合成産物の分配にも大きな
影響を及ぼす。 
申請者は、熱帯の森林生態系の中でも特に大きな環境ストレスを受ける熱帯雨林の林冠部
および泥炭湿地林に注目し、それぞれの環境下における樹木の葉の形質や生理生態特性を詳
細に調査した。本論文はそれらの成果をまとめたものである。 
 
1. 熱帯雨林の林冠構成種の葉の防御特性 
熱帯雨林の林冠部は、光の獲得を巡って樹木の葉が集中し、葉を狙う植食者の活動や個体
数も最大となる。中でも、樹木の被食被害は展葉した直後の葉において最も高いことがわか
っている。これは、展葉直後の葉が軟らかく、蛋白源となる窒素濃度も高いために、植食者
にとって好適な餌資源となるためである。そのため、新葉をいかに展開し、防御するかが熱
帯雨林の林冠構成木の生存戦略に直結する。本研究は、東南アジア熱帯雨林で優占するフタ
バガキ科の林冠構成種 5 種について、葉の展葉様式と防御特性の関係に着目して研究を行っ
た。マレーシア・ランビル国立公園内に設置された林冠アクセス用のツリータワーやクレー
ンシステムを用いて、フタバガキ科の代表的な林冠構成種 5 種について、展葉頻度や一回の
展葉あたりの展葉枚数を定期的に観察し、同時に葉の乾燥重量や面積、硬さ、総フェノール
濃度、縮合タンニン濃度、窒素濃度、最大光合成速度、被食面積率を測定した。その結果、
 
 
調査した 5 種の展葉様式には、樹種によって明確な違いが見られた。また、展葉頻度や一回
の展葉あたりの展葉枚数は、様々な葉の被食防衛特性と相関があった。展葉頻度が少なく、
一回の展葉枚数の多い樹種は、より硬い葉を持ち、高い最大光合成速度を示すが、総フェノ
ール濃度や縮合タンニン濃度は低かった。一方、展葉頻度が多く、一回の展葉枚数の少ない
樹種では逆の傾向を示した。つまり、高頻度に展葉する樹種ほど、展葉直後から防御可能な
化学的防御に投資することで葉を防御しているのに対し、低頻度に展葉する樹種ほど、光合
成を阻害する恐れの少ない硬さによる物理的防御に投資し、高い光合成能力を備えるという
戦略の違いが明らかになった。 
 
2. 熱帯泥炭湿地林の樹木の葉の防御特性 
熱帯の泥炭湿地林は、高い酸性度、貧栄養な土壌、高い地下水位による嫌気的な立地など、
樹木にとって極めて過酷な生育環境である。このようなストレス環境下における樹木の被食
防衛方法の理解は、熱帯樹木の資源分配特性を把握する上で重要な知見となる。インドネシ
ア、中央カリマンタンの泥炭湿地林には、農地転換のために 1990 年代に建設された水路の影
響により、地下水位の下がった泥炭地が多く残されている。本研究は、地下水位の異なる隣
接する泥炭湿地林において、両森林に共通に出現する 14 樹種の葉の形質の違いを調べ、泥炭
湿地林の環境ストレスが樹木の葉の防御特性に及ぼす影響を評価した。葉の形態的特性とし
て単位面積当たりの乾燥重量(LMA)を、生理的特性として C/N 比、窒素濃度、δ13C を、防御特
性として葉の硬さ、総フェノール濃度、縮合タンニン濃度、リグニン濃度を測定した。その
結果、LMA、窒素濃度、δ13C はほとんどの種で排水を受けた森林で高くなった。これは水位の
低下による環境改善が光合成特性への投資を促進させた可能性と、水位低下がもたらす乾燥
に対する樹木の適応の結果という 2 つの可能性が考えられる。一方、縮合タンニン濃度は排
水を受けた森林で高かったものの、葉の硬さや総フェノール濃度、リグニン濃度には有意な
変化が観察されなかった。つまり、泥炭湿地林のストレス環境下では、光合成生産物を優先
的に物理的防御や化学的防御に投資し、葉を防御している可能性が示唆された。 
 
以上のように、本研究は知見の乏しかった東南アジアの熱帯林樹木の被食防衛に対する資
源投資について、①土壌が貧栄養であることが知られる熱帯林の環境において、特に環境ス
トレス下におかれた状況では、樹木は量的な化学的防御物質であるフェノール性化合物に優
先的に炭素を投資して葉を防御していることを明らかにした点、②それぞれの樹種ごとで展
葉様式を変化させるなどによって、防御に対する資源投資量を減らし、光合成や成長に回す
などの対応を行っていることを明瞭に示した点、において高く評価できる。また、これらの
知見は、熱帯林の多様性維持メカニズムや生物間相互作用の理解の向上につながるだけでな
く、生態系修復・再生のための植林を行う際にも、重要な情報として活用することが期待さ
れる。 
 
本論文に関する学位論文公開審査会は、平成 31 年 2 月 9 日に愛媛大学農学部で開催され、
論文発表と質疑応答が行われた。引き続いて開催された学位論文審査委員会において、本論
文の内容を慎重に審査した結果、審査委員が全一致して、本論文が博士（農学）の学位を授
与するに値するものと判定した。 


東南アジア熱帯林樹木における環境ストレス下の被食防衛特性

SYED, MOSTAFIZUL HAQUE

 
 
（第５号様式）   
                        学位論文審査の結果の要旨 
 
    氏    名 SYED MOSTAFIZUL HAQUE 
審 査 委 員 
      
 
         論  文  名  
 
Studies on organogenesis of Cymbidium in vitro under controlled environments  
（制御環境下における in vitro でのシンビジウムの器官形成に関する研究） 
         
審査結果の要旨 
 
  SYED MOSTAFIZUL HAQUE は 2016 年 4 月に入学し、上記のテーマで研究を行った。 
光は植物の成長および発育に影響する重要な要因の一つである。閉鎖環境下におい
て LED 光源を利用した作物の周年生産が可能である注目されているが、植物の種類や
品種によって応答性が異なることが明らかにされている。園芸作物の中で重要な種類
の一つであるシンビジウムの苗生産の多くは人工照明下で組織培養によって行われて
いる。本研究は組織培養技術を使用したシンビジウムの短期間かつ環境負荷の少ない
条件での苗生産方法を開発する目的で行った。また、シンビジウムのプロトコーム様
球体の異なる光条件に置いて、培地に添加トレハロースおよび成長調節物質の最適濃
度について検討した。Cymbidium debonianum において、白色蛍光管照明の下で 20 お
よび 25 g/L トレハロース区のＰＬＢ形成が促進され、緑色 LED、青色 LED および赤色
LED 下では、25 g/L トレハロースは培養 3 週間で最大の PLB 形成を誘導し C.pumilum
では、白色蛍光照明、緑色 LED および青色 LED 区のいずれも 25 g/L トレハロース区
で最大の PLB およびシュート形成を誘導した。赤色 LED 下では 20 g/L トレハロース
区で PLB およびシュート形成が促進的に作用した。C.insigne では 15 g/L トレハロ
ース区では６週間以内の培養で PLB およびシュートの形成、シュートの発根が認めら
れ、緑色 LED 区でこれらの器官形成が最も促進てきであり、植物生長調節剤を使用し
ないで器官形成誘導に成功した。この研究では、トレハロースは培地の炭素源として
使用されたが、植物成長調整物質添加時と同様に短期間の器官形成誘導に成功した。 
 
  植物成長調節剤の組み合わせ、濃度および比率は in vitro での培養技術にとって
極めて重要である。 ６− ベンジルアミノプリン（ＢＡ）は、植物成長および発生応
答誘導する合成サイトカイニンである。ヒアルロン酸（ＨＡ）は植物成長調節剤とし
 
 
て作用することが報告されている。本研究では、BA と HA の組み合わせが白色蛍光管
の下で C. insigne と C. finlaysonianum の組み合わせで行われた。この研究の結果、
全ての濃度および組み合わせの中で、0.1 mg/L BA + 0.1 mg/L HA が C.insigne の
PLB、シュート形成および PLB の最大生体重増加に有効な組み合わせ濃度であること
がわかった。 C.finlaysonianum では、0.1mg/L の BA + 1 mg/L HA 区で PLB 形成数が
最大値を示し、シュート形成が BA および HA 処理の単独添加に有効であることがわか
った。エリシターは植物に生体防御反応を引き起こす物質です。ジャスモン酸メチル
（Me-JA）はよく知られている。ヒアルロン酸（HA）とジャスモン酸メチル（Me-JA）
2 種のエリシターの組み合わせ効果を検討した。白色蛍光管下で材料は
C.finlaysonianum の PLB を使用し、培養は白色蛍光管下で行った。C. 
finalaysonianum の PLB 培養において、0.1 mg/L HA＋0.1 mg/L Me-JA を含有する培
地上でＰＬＢは 100%の形成率、シュートは７３％の形成率,シュートの発根は５３％
であった。HA 添加培地で６週間培養後、PLB、苗条、根、および生体重ともに最大値
を示した。 
 本研究の結果から in vitro において異なる LED 光源下でのトレハロースは、PLB、
シュートおよびシンビジウム属の根の形成率を急速に増加させ、ジャスモン酸メチル、
ヒアルロン酸は人工合成ホルモンである 6-ベンジルアミノプリントと併用することで
より効果的であることが示された。 
以上は、シンビジウムの組織培養に技術の改良に貴重な知見であり、学位論文とし
て十分に評価できる。 
本論文に関する公開審査会は、平成 31 年 2 月 9 日に愛媛大学農学部で実施され、
申請者の論文発表と質疑応答が行われた。また、引き続き行われた、学位論文審査委
員会において本論文の内容について慎重に審議した結果、申請者が博士（農学）とし
ての学識を有するものと判断し、審査委員全員一致して博士（農学）の学位を授与す
るに値するものと判定した。 
 
 
 
 


Studies on organogenesis of Cymbidium in vitro under controlled environments

中, 伸嘉

NKATSUJI, Nobuyoshi

（第３号様式）(Form No. 3) 
学  位  論  文  要  旨  
Dissertation Abstract 
 
 
氏名：  
Name 
中辻󠄀 伸嘉  
 
学位論文題目：  
Title of Dissertation 
コラーゲン代謝関連遺伝子発現量を指標とした  
マダイ肉の物性評価に関する研究  
 
学位論文要旨：  
Dissertation Abstract 
 
 
 
 
 
 
マダイ（Pagrus major）は我が国の主要な養殖海産魚種である。一般的に刺身と
して食されることが多く，肉の歯ごたえ（物性）は重要な肉質評価の指標となる。
魚肉の物性には筋肉中のコラーゲンが関与することが知られており，コラーゲン
含量を分析することは肉質評価の重要な項目の1つである。しかし，同分析は抽出
操作が煩雑のため手間がかかること，試料の必要量（1-10 g以上）が多いことや筋
肉組織内での結合組織の局在性によりばらつきが生じやすいこと等の問題点があ
る。そこで本研究では，コラーゲン代謝関連因子の遺伝子発現量に着目し，簡便
かつ少量の試料で肉質評価が可能な新たな肉質評価手法の可能性について検証し
た。  
コラーゲン代謝関連因子としてProlyl 4-hydroxylase（P4H）はコラーゲン合成に
関与しコラーゲンに特異的構成アミノ酸であるヒドロキシプロリンを生合成する。
一方，コラーゲン分解酵素としてMatrix metalloproteinase-9（MMP-9），内因性の
MMPs阻害因子としてTissue inhibitor of metalloproteinase -2 (TIMP-2) が知られて
いる。また，定量PCR（qPCR）を用い上記の遺伝子発現量を測定する際，充分な
質のRNAを必要とする。しかし，現場養殖魚を対象とするとサンプリングの際，
迅速にRNA抽出を行えず，操作中に同分子は分解する可能性がある。そのため，
魚体筋肉RNAの分解動態を評価する必要がある。  
第1章では，氷蔵したマダイの筋肉RNAの安定性を調べた。その結果，氷蔵した
死後0及び5日の筋肉RNAのRNA Integrity Number (RIN)は8.0以上であり，RNAは
安定であったが，死後10日のRIN値は4.3まで減少し，RNAが分解していることが
示された。特定の遺伝子発現量（TIMP-2及びβ-actin）に関しても，上記同様に死
後5日まで安定であったが，死後10日で減少し，RNAの分解が示された。このこと
から死後数日（5日以内）経過したマダイを対象としてもqPCRに供する質のRNA
を抽出することができることが示された。  
第2章では，養殖マダイを対象として肉の物性，筋肉コラーゲン含量及び同分子
代謝関連遺伝子発現量を養殖業者及び季節間で比較し，それらの関連性について
検討した。養殖業者A（RA）の肉の破断強度及び筋肉コラーゲン含量は養殖業者B
（RB）のそれらと比べて有意に高い値を示した。RAではコラーゲン分解酵素であ
るMMP-9遺伝子発現量はRBと比べて有意に低い値を示した。一方，コラーゲン合
成に関与するP4H α(I)及びMMP阻害因子であるTIMP-2遺伝子発現量においてはR
Aで高くなるとの想定に反して，RAでRBと比べて有意に低い値を示した。季節間
比較に関しても成熟期と非成熟期の比較において破断強度及び筋肉コラーゲン含
量とコラーゲン代謝関連因子群の発現様式の関連性は上記とほぼ同様の傾向がみ
られた。以上から肉の破断強度及び筋肉コラーゲン含量の高かったマダイ筋肉で
はコラーゲン分解系（負の効果）のMMP-9の遺伝子発現量が抑制されていると同
時に正の効果を与えるはずのP4H α(I)及びTIMP-2の発現量も抑制されていること
が示された。  
（第３号様式）(Form No. 3) 
第3章では，天然マダイ（和歌山県加太産：RK）及び養殖マダイ（高知県産：R
C）を対象として肉の物性，筋肉コラーゲン含量，組織学的筋肉構造及び同分子代
謝関連遺伝子発現量を比較し，それらの関連性について調べた。その結果，RKの
肉の破断強度はRCのそれより有意に高い値を示した。従来から知られている破断
強度と関係性がある筋肉中のコラーゲン含量はRKで高い傾向があったが，有意差
はみられなかった。一方，組織学的観察からRKの筋繊維面積はRCのそれより有意
に小さく，筋繊維の結合組織である筋内膜の網目構造が密であることが観察され
た。歯ごたえの良いRKでは筋肉での結合組織網目構造の密度が肉の破断強度に関
与することが示唆された。RKの筋肉でP4H α(I)，MMP-9及びTIMP-2の遺伝子発現
量は，RCと比べていずれも約2.6，19.3及び6.2倍と高い値を示した。RK及びRC間
で肉の破断強度に顕著な差異がみられたにもかかわらず，筋肉コラーゲン含量は
差異がみられず，RKのP4H α(I)，MMP-9及びTIMP-2遺伝子発現量はRCと比べて顕
著に高い値を示した。この結果は第2章の養殖間での傾向とは異なった。  
以上の結果より，氷蔵したマダイの筋肉RNAは死後5日間，安定であり，死後迅
速にRNA抽出を行うことが困難な現場養殖マダイにおいても，遺伝子発現量を指
標とした評価系に必要な質のRNAを容易に確保できることが示された。また，養
殖マダイにおいてコラーゲン代謝関連因子の遺伝子発現量は肉の破断強度及び筋
肉コラーゲン含量と関係性が明らかになり，同遺伝子発現量を指標とした新たな
肉質評価手法の可能性が示された。一方で，筋肉コラーゲン含量が高く，歯ごた
えの良いマダイ筋肉ではMMP-9の遺伝子発現量が抑制されていると同時に正の効
果を与えるはずのP4H α(I)及びTIMP-2の発現量も抑制されていることが示された。
また，天然マダイにおいて肉の破断強度には，筋肉のコラーゲン含量ばかりでな
く，結合組織の密度も関与する。そのため，今後，本手法により高精度の結果を
得るためには，コラーゲン代謝関連因子の遺伝子発現量のみならず，筋繊維形成
に関与する因子を特定し，同因子の遺伝子発現量にも考慮する必要がある。  


コラーゲン代謝関連遺伝子発現量を指標としたマダイ肉の物性評価に関する研究

鈴木, 将彦

SUZUKI, Masahiko

 
 
（第５号様式）  
                        学位論文審査の結果の要旨 
 
氏     名 鈴木  将彦  
審 査 委 員  
         論  文  名 
 
Study on allelopathy of four invasive plant species  
（4 種の侵略的植物種のアレロパシーに関する研究） 
  
         審査結果の要旨 
 
アレロパシーはある植物が化学物質を介して他の生物に干渉する重要な機構であり， 植物から環境
中に放出されたアレロパシー物質は近隣の植物の生存や生長に影響している. 近年， 植物のアレロ
パシー活性とアレロパシー物質は雑草管理において持続的農業の構築に重要な手段であることが示
唆されており， アレロパシー活性を有する植物の探索が行われている.  
 
本研究では，侵略的植物は，しばしば他の植物を駆逐し，広大な単一群落を形成することで自然の
植物生態系に深刻な影響を与えるため，世界中で大きな問題となっている. そのような現象を理解
するために，侵略的植物種の生態的特性を理解することが重要である. 侵略的植物は強いアレロパ
シー活性を有しているものがあり，アレロパシーは侵略の成功に関与していることが示唆されてい
る.そのため，本研究の目的は，チガヤ(Imperata cylindrica (L.) Raeusch.)，メキシカンサンフラワー
(Tithonia diversifolia (Hermsl.))，チャイニーズバイオレット(Asystasia gangetica (L.) T. Anderson)，ゴ
ボウ(Arctium lappa L.)の 4 種の侵略的植物種のアレロパシー活性を評価し，その原因となるアレロパ
シー物質の単離と同定を目的とした. 
 
チガヤ根茎抽出物はイヌビエ，ライグラス，チモシー，クレス，レタス，アルファルファの根と子
葉鞘 /下胚軸の生長を抑制した .生物検定誘導分離により，抽出物から 5-methoxyflavone,5,2’-
dimethoxyflavone，methyl caffeate，abscisic acid を単離した.5-Methoxyflavone,5,2’-dimethoxyflavone，
methyl caffeate は，0.03–0.3 mM 以上の濃度においてクレスの根及び下胚軸の生長を有意に抑制した.
また，これらの物質の I50値はそれぞれ，0.079–0.24，0.23–1.1，0.59–0.88 mM だった.Abscisic acid は
強い生長抑制活性を有していることが報告されており，その I50値は 0.31–0.61 μM だった. 
 
 
メキシカンサンフラワーの葉抽出物はライグラス，チモシー，イヌビエ，クレスの生長を抑制した.
抽出物はいくつかのクロマトグラフィーによって精製され，生長抑制活性物質 tagitinin C を単離
した. Tagitinin C はライグラス，チモシー，イヌビエの生長を 0.1-0.3 mM 以上の濃度で抑制した. 
 
チャイニーズバイオレットの葉抽出物はクレス，レタス，アルファルファ，イヌビエ，ライグラス， 
チモシーの根と子葉鞘/下胚軸の生長を濃度依存的に抑制した. 抽出物を生物検定誘導分離に供した
結果，2 つの植物生長抑制物質 indole-3-carboxaldehyde and (6R,9S)-3-oxo-α-ionol を単離した. 
Indole-3-carboxaldehyde はクレスの根と下胚軸の生長をそれぞれ 100 and 30 μM の濃度で有意に
抑制し，I50 値はそれぞれ 210，127 μM だった. (6R,9S)-3-oxo-α-ionol はクレスの根と下胚軸の
生長を強く抑制したことが報告されている. 
 
ゴボウの葉及び根抽出物は共に，クレスとイヌビエの下胚軸/子葉鞘と根の生長を濃度依存的に抑制
した. 葉抽出物は根抽出物より 2.0-2.5 倍強い活性を有していた. 葉抽出物を生物検定誘導分離に
供し，植物生長抑制活性物質 onopordopicrin を単離した. Onopordopicrin はクレスの下胚軸と根
の生長を 0.3 mM 以上の濃度で有意に抑制し，イヌビエの子葉鞘と根の生長をそれぞれ 1，0.3 mM 以
上の濃度で有意に抑制した. 
 
本研究の結果により，4 種の侵略的植物種がアレロパシー活性を有していること及び，単離された
アレロパシー候補物質がこれらの植物のアレロパシー活性において重要な役割を負っていることが
示唆された. これらの植物が有するアレロパシー活性はその侵略性に関与している可能性がある. 
本研究はこれら４種の侵略的植物種のアレロパシー活性に関する初めての報告であり，これらの知
見はアレロパシーの理解に貢献するとともに，持続的農業の構築にも応用できる可能性がある. 
 
本論文に関する公開審査会は，平成 31 年 2 月 9 日に愛媛大学農学部において開催され，論文発表と
質疑応答が行われた. 引き続いて行われた学位論文審査委員会で本論文の内容を慎重に審査した結
果，審査委員全員一致して博士（農学）の学位を授与するに値するものと判定した. 
 
 


Study on allelopathy of four invasive plant species

白米, 優一

HAKUMAI, Yuichi

（第３号様式）(Form No. 3) 
学  位  論  文  要  旨  
Dissertation Abstract 
 
 
氏名：  
Name 
白米  優一  
学位論文題目：  
Title of Dissertation 
Molecular Biology and Materials Engineering of 
Poly-γ-Glutamate 
(ポリ -γ-グルタミン酸の分子生物学と材料工学)  
 
学位論文要旨：  
Dissertation Abstract 
 
 
 
 
 
 
 
 
Poly-γ-glutamate (PGA) is biopolymer obtained from natto mainly. This polymer 
consists of nylon4-like backbone with linked carboxyl residues. Moreover, it has many 
abilities about biodegradation, coating and biocompatible materials. Although 
application of PGA to industries is focused, there are still many problems. Through my 
doctoral thesis, I reported molecular biology and materials engineering of PGA.  
In caper1, our investigations into the unique chromosomal DNA maintenance (EDM) 
system of B.subtilis  have identified two crucial factors,  FliF and EdmS. Among over 30 
structural genes in the B. subtilis  fla/che operon, the fliF gene was found to be essential 
for the EDM process . This finding indicated that FliF has two independent functions, 
namely FliF-dependent EDM and flagellation, similar to EdmS that also displays two 
distinct functions, namely EdmS-dependent EDM and PGA production. In this case, the 
“one gene, one protein (or function)” hypothesis is not applicable. Instead, the theory of 
moonlighting proteins, in which one gene does not necessarily encode only one protein 
with a single role, becomes accepted as an alternative hypothesis. To our knowledge, 
this is the first observation of the moonlighting role of FliF in DNA maintenance.  
Although the extremolyte-like (versatile) function of archaeal L-PGA has been 
revealed, it remains unclear whether this archaeal polymer can bind to critical metals. In 
chapter2, L-PGA was found to prefer trivalent metal ions (Ga 3+, In3+, Dy3+) and to 
discriminate against divalent metal ions (Co2+, Ni2+, Mn2+), and these properties could  
be used to develop a selective polymer for the collection of valuable (multivalent) metal 
ions. In this sense, the fact that L-PGA afforded a sigmoidal curve for its metal 
adsorption represents a considerable advantage, because a process for metal desorption 
could also be established using facile manipulation steps, which would have very little 
impact on the adsorption capability of the polymer. In contrast, PAC exhibited 
hyperbolic behavior, which would be more suitable for the removal of metal ions rather 
than their collection. Overall, this chapter highlights the potential of L-PGA as a useful 
metal adsorbent. 
In chapter3, the supra-molecular plastics of PGA ion complex (PGAIC) were 
effectively synthesized from archaeal, stereo-regular L-PGA using some cationic 
surfactants, viz. PGA/HDP, PGA/DDP, PGA/BZA, and PGA/BZT. These PGAICs 
possessed versatile coating performance to crea te bioactive (anti-staphylococcal  and 
anti-Candida) surfaces on different materials with no additional treatments for the 
stabilization. Interestingly, PGA/HDP-coated surfaces showed significant anti -influenza 
（第３号様式）(Form No. 3) 
activities, while they were safe (non-toxic) for human cells. We are therefore hopeful 
that PGAICs generate considerable interest among researchers seeking to develop 
advanced polymer coatings for infection prophylaxis.  
In chapter4, we focused on the performance of PGAIC as an antimicrobial coating 
material and succeeded in the development of PGAIC-ACs for effective bacterial 
elimination. Viable E. coli  cells were virtually eliminated (> 99.9%) from the laboratory 
model of highly contaminated water (~ 2.0 × 10 4 CFU/mL) using our 
PGAIC-AC–embedded column. We hope that the PGAIC-AC system serves to regenerate 
the resources of water from such undesirable (polluted) conditions, and the large -scale 
manufacture of PGAIC-AC products would now be required for in situ water 
purification. 
In chapter5, using a fine (sustainable) polymer from extremophiles, we have 
succeeded in developing a novel antimicrobial coating, showing the antithetical 
qualities of extreme durability and briefly controllable removability. This archaeal 
polymer, namely stereoregular PGA, possesses a peculiar functionality that enables it to 
bind cooperatively to various cationic compounds such as some critical metals  
(chapter2) and organic surfactants. PGAICs can be transformed into versatile 
nanofiberplastics and safe dispersants to create antimicrobial surfaces, and they may be 
used to contribute to hygienic control and infection prophylaxis in various public 
facilities such as schools, hospitals, hotels, and transportation , resulting in a decreased 
risk of airborne infections, contagions, and serious pneumonia, which are often fatal. 
Engineering advanced functional (e.g., controlled capture – killing) coatings would 
eventually prevent unforeseen epidemics caused by new contagions.  


Molecular Biology and Materials Engineering of Poly-γ-Glutamate

西岡, 信治

NISHIOKA, Shinji

（第７号様式） 
 
学位論文審査結果の要旨 
 
   氏     名 西 岡 信 治 
 
 
 
 
 
   審 査 委 員 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
                                      
 
                                      
 
                                      
 
                                      
 
                                      
 
 
       
論  文  名  非外科的歯周治療が耐糖能異常を有する地域住民のインスリン抵抗性 
に及ぼす影響；ランダム化比較試験 
 
      審査結果の要旨 
【背景・目的】 
 糖尿病の合併症である歯周病は、血糖コントロール不良例ほど重症化し、歯周病に伴う慢性
炎症はインシュリン抵抗性を惹起して耐糖能を悪化させるといわれている。これまで歯周病に
対する非外科的歯周病治療が糖尿病に与える影響を検討してきた報告があるものの、その結果
は一定せず、またすでに糖尿病に対する治療が行われている患者が対象であり、歯周病に対す
る非外科的歯周病治療単独の糖尿病に対する影響を検討した報告はほとんどない。 
 本研究では、内科的治療を受けていない耐糖能異常者に対して非外科的歯周病治療がインス
リン抵抗性に及ぼす影響を明らかにするためにランダム化比較試験を用いて検討した。 
【方法】 
方法：2011～2012 年に東温市の一般住民 30～79 歳を対象に実施した「東温スタディ」参加者 92
4 名において、耐糖能異常と判定された 185 名のうち、糖尿病の要医療、もしくは内服治療を受
けている者を除いた 74 名を研究対象とした。1～6 ヶ月に歯周治療と歯科保健指導を実施する
「前期介入群」(n=38)と、7～12 ヶ月に歯周治療と歯科保健指導を実施する「後期介入群」(n=3
6)に無作為割り付けを行った。ベースライン時、6 ヶ月後、12 ヶ月後、両群に対して歯周病検査
（ポケットの深さ；PPD（㎜）,プロービング時の出血；BOP（%））、血液検査（HbA1c、空腹時
と負荷後の血糖値およびインスリン値、血清中の高感度 C 反応性タンパク値、総コレステロール
値など）を実施。75gOGTT による各指標からインスリン抵抗性を示す HOMA-IR、膵β細胞機能を
示す HOMA-β、インスリン感受性を示す Matsuda Index の値を算出。介入期間中、前期介入群か
ら 1 名、後期介入群から 2 名が脱落し、最終的にそれぞれ 37 名、34 名、合計 71 名で分析を行
った。 
【結果】 
 歯科の指標である BOP(%)､PPD(mm)は、介入による有意な改善を認めた(P<0.001)が、グルコー
スおよびインスリン濃度は、介入による有意な改善は認められなかった。しかし、介入前の BOP
(%)を中央値で BOP＜37(%)(n=36)と BOP≧37(%)(n=35）の 2 グループに分け層別化すると BOP(%)
が低いグループにおいて BMI(P=0.01)、空腹時インスリン値(P=0.01)、HOMA-IR(P=0.03)、HOMA-
β(P=0.03)、Matsuda Index(P=0.03)において有意な改善を認めた。 
さらに介入前の BOP(%)、BMI 変化量（＝介入後－介入前）と各指標の変化量との相関を確認し
たところ、介入前の BOP(%)と BMI の変化量との間に、正に関連する傾向を認め（P＝0.06）、血
糖 2 時間値の変化量との間には、有意な正の相関を認めた(P＝0.005)。また BMI の変化量は HbA
1c、HOMA-IR、HOMA-β、空腹時インスリン値、インスリン 2 時間値の変化量と正の相関を認め(P
＜0.05)、Matsuda Index の変化量とは負の相関を認めた(P＝0.007)。 
【結論】 
 耐糖能異常者において歯周病治療の介入によりインスリン抵抗性の改善は認められなかったが、
介入前の BOP(%)が低いほど、インスリン抵抗性やインスリンの感受性などの糖尿病関連指標の
改善が認められやすいことが示唆された。 
 
本研究の公開審査は、平成 30 年 8 月 22 日に開催された。申請者から研究内容が英語で口頭発表
された後に、審査委員から本研究に関する以下の質問がなされた。 
1） ランダム化の具体的な方法はどのように行ったのか。 
2） インターベンションの期間を 6 ヶ月とした理由は。 
3） BOP の中央値で 2 群に分類して評価した理由は。 
4） PPD と BOP を評価する部位は同一部位か、また測定するプローブの安定性はどの程度か。 
5） 早期介入群と後期介入群では、栄養指導などの影響が危惧されるが影響はなかったか。 
6） 歯周病と糖尿病の関係は指摘されているが、齲歯と糖尿病の関係はあるのか。 
7） PPD については 6mm 以上群と 6mm 以下の群に分けて評価する方法もあるのではないか。 
8） 今回は境界型が対象であったが、糖尿病患者が対象であった場合にはどのような結果が推測
されるか。 
9） 本研究結果から、糖尿病患者に対してどのような歯科治療の介入が望ましいと考えているか。 
 
 これらの質問に対して申請者は、質問の意図を十分に理解した上で、詳細かつ明確に応答した。
本論文は、ランダム化比較試験を用いて、耐糖能異常者における歯周病の炎症が軽度の症例では、
歯周病治療によりインスリン抵抗性が改善することを示した有用な知見を含んだ研究であり、今
後の発展が期待される。審査委員は全員一致して本論文を高く評価し、博士（医学）の学位論文
に値するものと結論した。 
 


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