Ehime University Institutional Repository

Ehime University (愛媛大学)博士(農学)thesi

武森, 文子

TAKEMORI, Ayako

（様式５）(Style5) 
学位論文全文に代わる要約 
Extended Summary in Lieu of Dissertation 
 
 
氏名： 
Name 
武森 文子 
 
学位論文題目： 
Title of Dissertation 
トライコーム腺細胞内における標的プロテオーム動態の高感度定量質量
分析法の開発 
 
学位論文要約： 
Dissertation Summary 
 
・研究の背景 
維管束植物に見られる腺性トライコームは、腺細胞内において主にテルペノイド、フラボノイド、
アルカロイド、アシル糖などの二次代謝産物を大量に合成し、貯蔵することから、天然の化学工場と
よばれる。腺性トライコームの代謝メカニズムをシステム的に理解するためには、腺細胞内のメタボ
ローム解析に加えて、代謝関連プロテオームの解析が不可欠である。現在までにショットガンプロテ
オミクスの手法を用いて、いくつかの植物種において腺細胞プロテオームの解析例が報告されている。
しかしショットガンプロテオミクスのアプローチは、一度の測定に多量のトライコーム試料を必要と
し、さらに再現性の高い定量解析には適していない。そのため腺細胞に含まれる微量な標的タンパク
質成分の定量情報を高精度に取得するための新しい分析技術の開発が必要とされている。 
 
 
・研究の目的 
本研究では、標的のトライコーム腺細胞（TGC）におけるタンパク質成分を包括的にモニタリング
するための新たな質量分析（MS）ベースの定量プロテオミクス法の開発を行った。具体的には、ト
リプル四重極型MSによる選択反応モニタリング法（SRM）を用いて、標的プロテオームを高感度に
計測するためのアッセイ系を開発し、さらにSRMによるタンパク質の絶対量解析に不可欠な内部標準
試料のハイスループット合成基盤を確立した。腺性トライコームの解析モデルには、高品質なゲノム
配列情報や、各種変異体が利用可能な栽培種トマト（Micro-Tom）を選択し、トマトのトライコーム
で最も豊富なVI型トライコームの腺細胞プロテオームを標的とした大規模SRMアッセイの構築と器
官特異的なプロテオームプロファイル解析への活用を試みた。 
 
 
・TGC採取技術の開発 
TGCプロテオームの定量解析基盤の確立に向けて、まずは特定の腺細胞種のみを回収する実験手法
の開発に取り組んだ。開発手法では、実体顕微鏡下で標的TGCのみをピンセットの先端を用いて採取
し、タンパク質溶解緩衝液へと回収することにより、コンタミネーションを排した精度の高い回収が
可能であった。TGC試料を回収した後は、超音波処理による破砕処理により細胞内タンパク質成分を
抽出した。Micro-Tomの果実体を用いた検証実験では、100個のVI型トライコームからTGCを10分以
内に回収可能であった。 
 
 
・トマトVI型TGCプロテオームのGeLC-MS/MS解析 
タンパク質のSRMアッセイ構築に必要となるMS情報をプロテオームワイドに取得するために、ト
マトVI型TGC試料（800トライコームより採取）から抽出したタンパク質成分のプロテオミクス解析
を行った。果実体・葉・萼におけるTGCのタンパク質成分を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動と
液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）を組み合わせたGeLC-MS/MSのアプロー
チを用いて解析した結果、合計485種類のタンパク質成分を同定することに成功した。最大の同定数
（380タンパク質）が得られた果実体のTGCプロテオームを遺伝子オントロジー（GO）に基づいて
分類した結果、30種類の機能カテゴリーに分類可能であり、168タンパク質が細胞内代謝過程
(GO:0008152およびGO:0044237)に関与することが同定された。また腺性トライコームの生理機能か
（様式５）(Style5) 
ら予想されるように、34種類の刺激応答性タンパク質(GO:0050896)が含まれていることが明らかと
なった。 
 
 
・トマトVI型TGCのLC-SRMアッセイ構築 
次に SRM を活用して TGC プロテオーム動態を定量的に計測するための標的プロテオミクス解析
基盤を構築した。具体的には、GeLC-MS/MS により同定したトマト VI 型 TGC タンパク質リストか
ら、高品質なMS/MS情報が取得可能であったペプチド 529種類（298タンパク質に由来）をSRMア
ッセイの標的として選択し、ナノ流量（300 nL/min）の液体クロマトグラフとオンライン接続された
トリプル四重極型質量分析システム（SCIEX QT5500）を用いてLC-SRMアッセイを開発した。SRM
の分析パラメーターや測定データはアッセイ情報の共有を目的に開発されたパブリックリポジトリ
サーバPanoramaWeb (https://panoramaweb.org/tomatotgc.url)より公開を行った。開発したLC-SRMアッ
セイを用いることで、微量な TGC 試料（100 トライコームより採取）に含まれる 221 タンパク質成
分の一斉定量解析が可能であった。 
 
確立したSRMアッセイを用いて、異なる器官（果実体、葉、萼）に由来するVI型TGCの比較定
量プロテオーム解析を行い、器官特異性の高いプロテオーム成分を明らかにした。その結果、昆虫お
よび病原体に対する防御応答（Q05540、K4B9P3、およびQ7XBB3）、寒冷および干ばつへのストレ
ス応答（K4BVU7）、活性酸素種に対するストレス応答（Q7YK44）に関連するタンパク質成分は、
果実体と比較して葉または萼において高発現であることが明らかとなった。一方、プロテオームレベ
ルの器官特異性は二次代謝産生（K4AS92、K4ASM0、K4C235、K4C6Q9、K4CJ96、K4CMI0、K4CW40、
K4CYV4、およびQ8GT30）に関わる 9つのタンパク質においても観察された。この結果は、TGCの
二次代謝産物生産能に器官間で差があることを強く示唆している。 
 
 
・QconCAT によるTGC二次代謝関連プロテオームの包括的定量 
次にSRM によるタンパク質の絶対量解析のための内部標準をハイスループットに生産することを
目的として、コムギ無細胞タンパク質合成系を活用したペプチドコンカテマー（QconCAT）の生合成
基盤を構築した。TGC の二次代謝関連タンパク質成分 50 種類の SRM 標的ペプチド配列を連結した
QconCAT 配列を設計し、コムギ無細胞系で 13C/15N標識体の合成を行った。その結果、240 μLの小ス
ケール反応によりSRM アッセイに十分な量（~10 μg）の 13C/15N標識QconCAT が合成可能であった。
開発したLC-SRMアッセイを用いて、QconCAT トリプシン消化産物の解析を行った結果、QconCAT
配列設計に使用した全ての標的ペプチドの 13C/15N標識体が検出された。QconCAT 合成基盤の構築に
加えて、TGCプロテオームを網羅した大規模な内部標準ライブラリーの開発を支援するために、TGC
タンパク質の詳細な標的ペプチド配列情報を収録したオンラインリファレンスデータベース
（ESRDB: 愛媛大学SRM/MRMリファレンスデータベース）を開発した（http://esrdb.m.ehime-u.ac.jp）。 
 
 
・総括 
本研究では、LC-SRMアッセイをベースとする定量解析技術を活用することにより、微量なTGC試
料から、標的のタンパク質成分に関する定量情報を高感度かつ包括的に計測するための新たな定量プ
ロテオミクス戦略を確立した。本研究では、アッセイ開発のモデルとしてトマトVI型TGCを選択した
が、同様のアプローチは他の植物種のTGCにおけるアッセイ構築や、さらには他の植物の様々な器官
を標的とした高感度なプロテオーム解析法の開発においても適用可能であろう。本研究の重要な成果
として、トライコーム研究コミュニティと定量プロテオミクスを結びつける解析パイプラインが確立
された。MSに精通していない研究者でも、ESRDBから得られたペプチド情報に基づいてQconCATを
設計し、コムギ無細胞系でQconCATを合成、そしてSRMアッセイによる定量解析が可能となる。コ
ミュニティ内で開発したアッセイ情報や内部標準を共有化するプラットフォームの確立は、トライコ
ーム研究における標的プロテオミクス解析の大きなブレイクスルーとなり、TGCプロテオーム動態の
システム的理解が急速に発展することが期待できる。 
 
 
(注) 要約の文量は，学位論文の文量の約１０分の１として下さい。図表や写真を含めても構いません。
(Note)  The Summary should be about 10％ of the entire dissertation and may include illustrations 


Japanese

トライコーム腺細胞内における標的プロテオーム動態の高感度定量質量分析法の開発

KRISHNA, RANY DAS

（第３号様式）(Form No. 3) 
学  位  論  文  要  旨  
Dissertation Abstract 
 
 
氏名：  
Name 
KRISHNA RANY DAS 
 
学位論文題目： 
Title of Dissertation 
Allelopathic potential and allelopathic substances of three 
medicinal plants in Bangladesh 
(バングラデシュ産薬用植物3種のアレロパシー活性とアレロパシー物質 ) 
 
学位論文要旨：  
Dissertation Abstract 
 
 
 
 
 
 
Allelopathy is a biological phenomenon, in which one plant directly or indirectly 
interferes with the growth and development of other plants through the release of 
allelochemicals. This phenomenon creates consideration as an alternative tool for 
eco-friendly management of weeds in a sustainable way. Much effort has gone into 
searching for potential allelochemicals from medicinal plants, which appear to be promising 
sources of secondary metabolites. In the present study, three medicinal plants comprising 
Swietenia mahagoni  L. (Meliaceae), Coccinia grandis L. (Cucurbitaceae) and Cassia alata  
Linn. (Caesalpiniaceae) were used to assess their allelopathic potential and to identify 
allelopathic substances.  
 The aqueous methanol extracts of S. mahagoni  seeds were examined on seedling 
growth of four dicotyledonous plants; cress, alfalfa, rapeseed, lettuce, and three 
monocotyledonous plants; barnyard grass, timothy and foxtail fescue at six concentrations 
(1, 3, 10, 30, 100, and 300 mg dry weight equivalent extract /mL). The suppression activity 
of S. mahagoni seed extracts was concentration-dependent. Concentrations required for 50% 
inhibition (I50) of seedling growth of test plants were also differed. 
Concentration-dependent and species-specific growth inhibitory effects of the seed extracts 
of S. mahagoni suggest that this plant may possess growth inhibitory substances and 
therefore, might have possibility to be used in the biological weed management option.  
 The extracts of C. grandis were examined for its effect on the seedling growth of 
cress, alfalfa, rapeseed, lettuce, barnyard grass, timothy, foxtail fescue, and Italian ryegrass 
at different concentrations. The growth inhibitory effect of the extracts on the test plant 
species varied and depended on extract concentration. The I50 values of the shoots and roots 
of the test plant species were 6.3–220.8 and 4.8–80.9 mg dry weight equivalent extract/mL 
of C. grandis, respectively. These results suggest that C. grandis may have allelopathic 
potential and might be useful in developing a bio-herbicide in an eco-friendly management 
system. 
（第３号様式）(Form No. 3) 
 The effect of aqueous methanol extracts of C. alata on the seedling growth of alfalfa, 
cress, lettuce, rapeseed, broccoli, cabbage, radish, barnyard grass, foxtail fescue, Italian 
ryegrass, and timothy was examined. The level of inhibition of the extracts corresponded to 
concentration and varied among the test species. After bioassay -guided separations of the 
extracts, two active substances were isolated and characterized as rutin and  syringone. 
These two active substances significantly inhibited the seedling growth of cress and foxtail 
fescue. The range of I50 values of rutin and syringone for the seedling growth of cress and 
foxtail fescue were 129.5–417.8 and 160.1–466.5 µM, respectively. These results indicate 
that the two identified growth inhibitory substances from C. alata may be responsible for 
its allelopathic properties.  
 From another active fraction of silica gel column of the C. alata  leaf extract, two 
active compounds were also isolated through several chromatographic steps and identified 
using spectral data as (+)-rhododendrol and 3-hydroxy-α-ionone. These two active 
compounds significantly inhibited the seedling growth of cress in a 
concentration-dependent manner. The required concentrations for 50% growth inhibition of 
cress seedlings were 192.0–296.1 µM for (+)-rhododendrol and 132.4–195.3 µM for 
3-hydroxy-α-ionone. These results suggest that these two growth inhibitory substances also 
might have responsibility for the allelopathic activity of C. alata  leaves. 
 The results of three medicinal plants have shown the growth inhibitory activity on 
the seedling growth of the test plant species, indicates their allelopathic potential. Four 
putative allelochemicals were isolated and identified from the leaf extracts of C. alata , have 
shown inhibitory activities on the seedling growth of the test plant species. Those findings 
may provide an insight into managing weeds to replace the common practice of using 
synthetic herbicides.  


English

Allelopathic potential and allelopathic substances of three medicinal plants in Bangladesh

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)doctoral thesi

中村, 由子

NAKAMURA, Yoshiko

B細胞活性化因子の非アルコール性脂肪性肝疾患モデルマウスにおける肝脂肪化への影響

丸田, 雅樹

MARUTA, Masaki

 （第３号様式）     
 
 
学 位 論 文 要 旨 
 
 
 
            氏   名  丸田 雅樹 
 
 
 
論 文 名  
改変抗体 CAR/BiTE で誘導されるがんに対する T 細胞反応性の比較解析 
 
 
【背景】改変抗体を応用した T 細胞療法は難治性腫瘍に対する治療法として有望視されている。 
近年の遺伝子改変技術の進歩により、キメラ型抗原受容体 (CAR: chimeric antigen receptor)と
二重特異性抗体 (BiTE: bispecific T-cell engager)の研究開発が進み、臨床試験でも難治性造血
器腫瘍に対して有効性が示された。CD19 分子を認識する CAR および BiTE に代表されるよう
に、これまでに報告された多くの CAR/BiTE は、HLA/ペプチド複合体とは異なる表面抗原を
認識する一本鎖抗体 (scFv: single chain fragment variable)を用いて作製されている。そのため、
T 細胞受容体 (TCR: T-cell receptor)と異なり、治療効果と安全性に深く関わる標的特異性や交
差反応性について詳細な解析を行うことが困難であった。そこで今回我々は、がん細胞表面に
選択的に発現されている HLA/ペプチド複合体を認識する同一の scFv を保持した CAR/BiTE を
使用し、ペプチド配列と HLA アリルとを変化させながら、CAR および BiTE の標的抗原に対
する特異性、がん細胞に対する反応性および安全性に繋がる潜在的な交差反応性について、in
 vitro/in vivo ともに詳細な比較検討を行った。 
【方法】NY-ESO-1 は難治性骨髄腫を含めたがん細胞内において発現がみられるがん精巣抗原
である。さらに、HLA-A*02:01/NY-ESO-1157-165複合体 (A2/NY-ESO-1157)が、がん細胞表面にお
いて発現されていることが報告されている。そこで、A2/NY-ESO-1157を特異的に認識する scF
v をもとに CAR および BiTE を作製し、A2/NY-ESO-1157を発現する骨髄腫細胞をモデルとして、
標的特異性と交差反応性とを詳細に検討した。HLA-A*02:01 陽性 T2 細胞株、HLA-A*02:01 分
子、もしくは A*02:06 分子を遺伝子導入した K562/A*02:01 (K562/A2)、K562/A*02:06 細胞株、
K562/A2 に NY-ESO-1 遺伝子を導入した K562/A2/NY-ESO-1 細胞株、骨髄腫細胞株などを標的
細胞として用いた。また、NY-ESO-1157ペプチド、ならびに類似ペプチドを合成して、標的親
和性と交差反応性の検討を行った。CAR/BiTE で活性化された T 細胞の標的細胞に対する反応
性については、細胞内サイトカイン染色、51Cr 放出試験を用いて比較検討した。また、HLA-A
2 陽性 NY-ESO-1 陽性の骨髄腫細胞株である U266 にルシフェラーゼ遺伝子を導入して樹立し
た U266/SLR 細胞株を NOG マウスに移植し、CAR/BiTE で活性化された T 細胞の in vivo 抗腫
瘍効果について発光イメージング法を用いて比較検討を行った。 
氏名 丸 田 雅 樹  
 
【結果】A2/NY-ESO-1157特異的 CAR-T 細胞および A2/NY-ESO-1157特異的 BiTE により活性化
された末梢血 T 細胞は、いずれも A2/NY-ESO-1157ペプチド特異性を示し、A2/NY-ESO-1157を
内在性に発現する K562/A2/NY-ESO-1 細胞株、HLA-A2 陽性 NY-ESO-1 陽性の骨髄腫細胞株を
認識し傷害した。また、活性化 T 細胞を用いた検討において、CAR-T 細胞と BiTE 刺激 T 細胞
が、標的細胞に対して同等の標的親和性を示すことが明らかとなった。その結果、U266 移植
NOG マウスを用いた in vivo 実験系においても同等の抗腫瘍効果を確認した。さらに、CAR-T
細胞と BiTE により活性化された末梢血 T 細胞は、HLA-A*02:01 により提示された類似ペプチ
ドおよび HLA-A2 アリル (A*02:01、A*02:06)により提示された NY-ESO-1157ペプチドに対して
それぞれ異なる強度で交差反応性を示したことから、CAR および BiTE の立体構造が交差反応
性に影響する可能性が示唆された。 
【結論】改変抗体 CAR/BiTE を用いた T 細胞免疫療法は、HLA/ペプチド複合体をも標的とで
きること、そして T 細胞が活性化された条件においては、骨髄腫に対して CAR/BiTE ともに同
等の治療効果が期待できることが示された。また、scFv を応用した CAR/BiTE であっても、T
CR と同様に潜在的交差反応性を保持しうるが、その反応性は改変抗体のとる立体構造に影響
される可能性が示された。従って本研究成果は、今後様々な改変抗体を用いた T 細胞免疫療法
の開発研究において、有効性と安全性とを把握する上で重要な知見となることが期待される。 
 
【承認された倫理審査機関】 
本研究は、愛媛大学医学部医学系研究科のヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理委員会、遺伝子
組換え実験安全委員会、動物実験委員会により承認されている。 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
キーワード（３～５） 
 
 
 
Chimeric antigen receptor (CAR) 
Bispecific T-cell engager (BiTE) 
標的親和性 
交差反応性 
多発性骨髄腫 


改変抗体CAR/BiTEで誘導されるがんに対するT細胞反応性の比較解析

中川, 未来

雑誌『国光』の創刊と吉井友実

石黒, 聡士

瓶ヶ森山頂における植生調査のための精密地形計測

中山, 晃

Belief-Mediation Model: Role of self-confidence beliefs in a latent factor model of Japanese intermediate English as a foreign language learners

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トライコーム腺細胞内における標的プロテオーム動態の高感度定量質量分析法の開発

Allelopathic potential and allelopathic substances of three medicinal plants in Bangladesh

B細胞活性化因子の非アルコール性脂肪性肝疾患モデルマウスにおける肝脂肪化への影響

改変抗体CAR/BiTEで誘導されるがんに対するT細胞反応性の比較解析

雑誌『国光』の創刊と吉井友実

瓶ヶ森山頂における植生調査のための精密地形計測

Belief-Mediation Model: Role of self-confidence beliefs in a latent factor model of Japanese intermediate English as a foreign language learners

大学生における社交不安と英語学習

カント「美的判断力の批判」の一考察(三)

モザンビーク北部農村協働調査のための調査ノート

5,362

5,403