Ehime University Institutional Repository

松村, 暢彦

MATSUMURA, Nobuhiko

渡邉, 敬逸

WATANABE, Hiromasa

羽鳥, 剛史

HATORI, Tsuyoshi

Japanese

のむら復興まちづくりデザインワークショップの実践

Ehime University (愛媛大学)博士(学術)thesi

Arita, Dewi Nugrahini

（第３号様式）(Form No. 3) 
学  位  論  文  要  旨  
Dissertation Abstract 
 
 
氏名：  
Name 
Arita Dewi Nugrahini 
学位論文題目：  
Title of Dissertation 
Anti-allergic activity of bioactive compounds in coffee beans 
(Coffea arabica  L.) 
(コーヒー  (Coffea arabica  L.)豆に含まれる生理活性成分の
抗アレルギー効果 ) 
 
学位論文要旨：  
Dissertation Abstract 
 
 
 
 
 
 
C o f f ee  i s  a  p o p u l a r  b e v e ra g e  a l l  o v e r  t h e  w o r l d  t h a t  h a s  a  d i s t i n c t i v e  
t a s t e  a n d  a r o m a .  A p a r t  f r o m  b e i n g  c o n s u m e d  a s  a  d a i l y  d r i n k ,  c o f f ee  i s  a l s o  
b e l i e v e d  t o  h a v e  s e v e r a l  h e a l t h  b e n e f i t s .  T h e s e  h e a l t h  b e n e f i t s  a r e  
i n s e p a ra b l e  f r o m  t h e  b i o a c t i v e  c o m p o u n d s  c o n t a i n e d  i n  c o f f ee .  C a f f e i n e  a n d  
t r i g o n e l l i n e  a r e  m a j o r  t w o  o f  t h e  e s s e n t i a l  c o m p o u n d s  i n  c o f f e e .  B e s i d e s  
p l a y i n g  a  r o l e  i n  t h e  s t i m u l a t i o n  o f  t h e  c e n t r a l  n e r v o u s  s y s t e m ,  h ea r t  r a t e ,  
a n d  r e s p i r a t i o n ,  c a f f e i n e  a l s o  p r o v i d e s  h e a l t h  b e n e f i t s ,  s u c h  a s  a  s o u r c e  o f  
a n t i o x i d a n t s ,  a n t i - c a n ce r ,  a n t i - b a c t e r i a l ,  a n d  a n t i - i n f l a m m a t o r y  a c t i v i t i e s .  
M ea n w h i l e ,  t r i g o n e l l i n e  c a n  b e  u s e d  t o  i n h i b i t  t h e  i n v a s i o n  o f  l i v e r  c a nc e r  
ce l l s ,  t o  p r e v e n t  d e n t a l  c a r i e s ,  a n d  t o  t r e a t  h y p e r g l y c e m i a ,  h y p e r l i p i d e m i a ,  
a n d  k i d n e y  d y s f u n c t i o n s .  T h i s  s t u d y  a i m s  t o  d e t e r m i n e  t h e  a n t i - a l l e r g i c  
ac t i v i t y  o f  t h e s e  t w o  c o m p o u n d s .  
T h e  a n t i - a l l e r g i c  ac t i v i t y  w a s  d e t e r m i n e d  b y  i n  v i t r o  a n d  i n  v i v o  
e x pe r i m e n t s  b y  f o c u s i n g  o n  i n h i b i t i n g  d e g ra n u l a t i o n  o f  m a s t  c e l l s  t r e a t e d  
w i t h  ca f f e i n e  a n d  t r i g o n e l l i n e .  T h i s  s t u d y  e xa m i n e d  t h e  i n h i b i t o r y  e f f ec t  o f  
ca f f e i n e  a n d  t r i g o n e l l i n e  o n  β - h e x o s a m i n i d a se  r e l ea s e  f r o m  R B L - 2 H 3  c e l l s  
t h a t  a r e  i m m u n o l o g i c a l l y  i n d u c e d  u s i n g  d i n i t r o p h e n y l  ( D N P) - h u m a n  s e r u m  
a l b u m i n  ( H S A )  a s  a n t i g e n .  T h e  m e c h a n i s m  w a s  i n v e s t i g a t e d  f r o m  b o t h  t h e  
C a 2 + - de p e n d e n t  s i g n a l i n g  p a t h w a y  a n d  t h e  C a 2 + - i n d e p e n d e n t  p a t h w a y  
i n v o l v e d  i n  d e g r a n u l a t i o n .  T h e  p a s s i v e  c u t a n e o u s  a n a p h y l a x i s  ( PC A )  m o d e l  
m i c e  i n  v i v o  w e r e  c o n d u c te d  b y  p e r f or m i n g  l o c a l  e x t r a v a s a t i o n  t h a t  w a s  
i n d u c e d  t h r o u g h  a  l o c a l  i n j e c t i o n  o f  Ig E  a n t i b o d y ,  f o l l o w e d  b y  a  D N P‑ H SA  
（第３号様式）(Form No. 3) 
a n t i g e n  c ha l l e n g e .  
T h e  i n h i b i t o r y  e f f e c t  o f  ca f f e i n e  o n  a n t i g e n - s t i m u l a t e d  d e g r a n u l a t i o n  
wa s  p e r f o r m e d  a n d  ca f f e i n e  w a s  f o u n d  t o  b e  a b l e  t o  i n h i b i t  
a n t i g e n - s t i m u l a t e d  d e g r a n u l a t i o n  b y  r a t  b a s o p h i l i c  c e l l  l i n e  R B L - 2 H 3  c e l l s  
w i t h o u t  c y t o t o x i c i t y .  W h e r e a s  ca f f e i n e  s u p p re s s e d  t h e  [C a 2 + ] i  i n  R B L - 2 H 3  
ce l l s  i n d u c e d  b y  a n t i g e n  i n  a  d o s e - d e p e n d e n t  m a n n e r .  C a f fe i n e  i n h i b i t e d  
Fc ε R I - m e d i a t e d  i n t r a ce l l u l a r  s i g n a l i n g  pa t h w a y s  b y  s u p p re s s i n g  t h e  
p h o s p h o r y l a t i o n  l e v e l s  o f  S y k ,  B t k ,  PL C γ1 ,  P I 3 K ,  a n d  A k t  k i n a s e  i n  
a n t i g e n - s t i m u l a t e d  R B L - 2 H 3  c e l l s .  D e gr a n u l a t i o n  s u p p r e s s i o n  w a s  a l s o  
p r o v o k e d  b y  t h e  i n h i b i t i o n  o f  m i c r o t u b u l e  f o r ma t i o n .  
B y  i n  v i t r o  s t u d y ,  i t  s h o w e d  t h a t  t r i g o n e l l i n e  i n h i b i t e d  t h e  r e l ea s e  o f  
β - h e x o s a m i n i d a s e  f r o m  a n t i g e n - i n d u c e d  R B L - 2 H 3  c e l l s .  T r i g o n e l l i n e  
s u p p r e s s e d  t h e  d e gr a n u l a t i o n  i n  a  d o s e - de p e n d e n t  m a n ne r  w i t h o u t  
c y t o t o x i c i t y .  T h e  e f f ec t  o f  t r i g o n e l l i n e  wa s  n o t  c a u s e d  b y  i n h i b i t i o n  o f  
a n t i g e n -a n t i b o d y  i n t e r ac t i o n s  b u t  w a s  c a u s e d  b y  m o d u l a t i o n  o f  i n t r a c e l l u l a r  
s i g n a l i n g  p a t h w a y s  i n v o l v e d  i n  d e g r a n u l a t i o n  i n  b a s o p h i l  a n d  m a s t  c e l l s .  
Fc ε R I - m e d i a t e d  i n t r a ce l l u l a r  s i g n a l i n g  p a t h wa y s  w e re  i n h i b i t e d  b y  
t r i g o n e l l i n e  t h r o u g h  t h e  p h o s p h o r y l a t i o n  l e v e l s  s u p p r e s s i o n  o f  PL C γ1 ,  P I3 K ,  
a n d  A k t  k i n a s e  i n  a n t i g e n - s t i m u l a t e d  R B L - 2 H 3  c e l l s .  T h e  e f f e c t  o f  
t r i g o n e l l i n e  o n  m i c r o t u b u l e  f o r m a t i o n  wa s  o b s e r v e d  b y  f l u o r e s ce n ce  
m i c r o s c o p y .  T h e  r e s u l t  s u g g e s t e d  t h a t  t r i g o n e l l i n e  s u p p r e s s e s  d e gr a n u l a t i o n  
b y  n o t  o n l y  a f f e c t i n g  m i c r o t u b u l e  f o r m a t i o n ,  b u t  a l s o  t h e  e l e v a t i o n  o f  
i n t r a ce l l u l a r  c a l c i u m  c o n ce n t r a t i o n .  
In  a d d i t i o n ,  t h e  a n t i - a l l e r g i c  e f f ec t  o f  c a f f e i n e  a n d  t r i g o n e l l i n e  w a s  
e xa m i n e d  u s i n g  P C A  m o d e l  m i c e .  T h e  i n t e n s i t y  o f  t h e  b l u e  d y e  w a s  
d ec r ea s e d  i n  t h e  m i c e  t h a t  w e re  o ra l l y  a d m i n i s t e r e d  w i t h  ca f f e i n e  a n d  a l s o  
t r i g o n e l l i n e .  C a f f e i n e  a t  a  d o s e  o f  1  m g / k g  b o d y  w e i g h t  ( B W )  i n h i b i t e d  t h e  
PC A  r e ac t i o n  6 4 . 1 %  c o m p a r e d  w i t h  t h e  c o n t r o l  g r o u p .  W h i l e  a t  a  d o s e  o f  5  
m g / k g  B W ,  t h e  i n h i b i t i o n  w a s  4 9 . 7 %  c o m p a re d  w i t h  t h e  c o n t r o l  g r o u p .  
M ea n w h i l e ,  t r i g o n e l l i n e  a t  6  m g / k g  B W  i n h i b i t e d  t h e  P C A  r ea c t i o n  4 5 . 7 %  
c o m p ar e d  w i t h  t h e  c o n t r o l  g r o u p ,  w h i l e  t h e  d o s e  o f  3 0  m g / k g  B W  i n h i b i t e d  
t h e  r e a c t i o n  5 9 . 5 %  c o m p a re d  w i t h  t h e  c o n t r o l  g r o u p .  
In  g e n e ra l ,  c a f f e i n e  a n d  t r i g o n e l l i n e  i n h i b i t e d  d e g r a n u l a t i o n  o f  
Ig E - s e n s i t i z e d  b a s o p h i l  c e l l  l i n e  b y  a t t e n u a t i n g  b o t h  t h e  i n t r ac e l l u l a r  
C a 2 + - de p e n d e n t  a n d  C a 2 + - i n d e p e n d e n t  p a t h w a y s .  B o t h  o f  t h e m  i n h i b i t e d  
d e gr a n u l a t i o n  b y  s i m i l a r  m e c ha n i s m .  T h e  s i m i l a r i t y  i n  t h e  m e c h a n i s m  o f  
i n h i b i t i o n  i s  l i k e l y  b e c a u s e  b o t h  a r e  a l k a l o i d s  t h a t  h a v e  a l m o s t  i d e n t i c a l  
m o l e c u l a r  s t r u c t u re s .  
 


English

Anti-allergic activity of bioactive compounds in coffee beans (Coffea arabica L.)

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)thesi

田口, 聖

TAGUCHI, Satoru

（第３号様式） 
学 位 論 文 要 旨
 氏 名 田口 聖 
   論 文 名 ラット外傷性脳損傷モデルにおける急性期トレッドミル運動の悪影響
：リハビリテーションはいつ開始すべきか？ 
学位論文要旨    
【はじめに】 
外傷性脳損傷は、毎年世界中で数百万人の人々に影響を及ぼす不治の神経障害および心理的問
題の主要な原因の 1 つとされている。 障害後には、性格の変化、学習と記憶の障害やアルツハ
イマー病などの神経変性変化のリスク増加に起因する。深刻な病理学的状態を改善する確立され
た治療はごく限られている。その一つとしてリハビリテーションプログラムが機能予後改善に有
効とされ、発症後 24〜72 時間以内に早期に運動を開始する方が有益であることが示されている。
一方、重症外傷性脳損傷に対する超急性期運動は、悪影響を及ぼすことも報告されている。この
ように、外傷性脳損傷後の早い段階からの運動が潜在的に有害であるかどうかは十分解明されて
いない。 さらに、介入時期ではなく運動強度が悪い影響を及ぼしている可能性もある。このよ
うに急性期リハビリテーションの運動療法実施に至る指標は不明確であり、その分子メカニズム
も十分に理解されていない。本研究では、それらの解明のためにラット外傷性脳損傷モデルを用
い検討した。 
【方法】 
7-9 週齢の雄性 Wistar ラットを用い、頭頂部頭蓋骨を穿孔し、注射針を刺入し扇型に前後に
動かす方法で脳傷害を作成した。ラットは非運動群と、術後 24 時間後に運動する群、48 時間後
に運動する群の 3 群に分け、運動群は分速 5m の走速度で 10 分間のトレッドミル走運動を 1 回の
み実施し、2 週間後より運動機能および学習行動実験を行い、急性期単回運動の機能的予後への
影響を調べた。また、術後 3、4 日目に採取した脳組織等を定量的リアルタイム PCR、ウェスタ
ンブロット、ELISA やフローサイトメトリーの手法を用い、機能的予後増悪機序を検討した。 
氏名 田口 聖      
なお、本研究における動物実験は、愛媛大学動物実験委員会の承認を得て行った。 
【結果】 
 術後 3 日目、4 日目に副腎重量および血中コルチコステロンを、体重は術後毎週測定したとこ
ろ、それらの変化は認められなかった。 
行動実験では、学習能力や空間認知機能に変化はなかったものの、特に 24 時間後に多動性や
左前肢の運動障害の悪化を認めた。行動実験終了後には損傷脳組織体積も測定したが有意な差は
認められなかった。 
24 時間後運動の損傷脳組織では CCL2 等のケモカイン、IL-1βや IL-6 等の起炎症性サイトカ
インや脳浮腫増悪に起因する AQP4 mRNA 発現の増加および 4 日目に IκB キナーゼのリン酸化を
増加させるなど起炎症反応を増強した。一方で、48 時間後の運動は 4 日目に起炎症性サイトカ
インやケモカインを抑制した。 
【考察】 
 本運動モデルは、血中コルチコステロンレベルの上昇または副腎重量の変化を引き起さなかっ
たことから外傷性脳損傷ラットにとってストレス負荷の低い運動であると考えられた。しかし、
各種行動実験から明らかになったように、特に受傷後 24 時間後での運動は外傷性脳損傷による
運動機能障害を悪化させた。これらのことより、本研究におけるリハビリテーションプログラム
では、運動強度の問題ではなく、介入時期が問題であることが推察される。また、外傷後の運動
による損傷脳組織体積の変化はないためにこの運動誘発性の運動機能障害の悪化は、脳組織喪失
の増加と関連していなく、むしろ外傷性脳損傷後の急性期リハビリによる起炎症反応の増強が起
因する可能性がある。 
【結論】 
結論として、運動の早期開始は、損傷脳に有害な炎症誘発性反応を引き起こす可能性があるた
め、開始のタイミングには細心の注意が必要である。本研究の結果よりリハビリテーション運動
プログラムは、発症 48 時間後の開始が最適な可能性がある。しかし、皮質の影響によっては術
1 週間後に運動を開始した場合でも、IL-1βなど発現の増加が観察されている報告もある。 し
たがって、最良の結果を得るためには、重症度と脳損傷の性質を考慮して、開始のタイミングを
決定する必要がある。 
 
 
 
 
 
 
 
 
キーワード（３～５） 
 
 
 
Cylinder test 
Beam test 
IL-1β 
CCL2 
TGFβ 


ラット外傷性脳損傷モデルにおける急性期トレッドミル運動の悪影響:リハビリテーションはいつ開始すべきか?

上甲, 智規

JYOKO, Tomonori

（第７号様式） 
 
学位論文審査結果の要旨 
 
   氏     名 上甲　智規    
 
 
 
 
 
   審 査 委 員 
 
 
 
 
 
 
 
 
主  査       松田　正司                            
副  査       竹葉　淳                            
副  査       高崎　康史  
副  査       永井　将弘                            
副  査       三浦　史郎                            
 
       論  文  名 冷却障害による難治性高度顔面神経麻痺モデル 
      審査結果の要旨 
ヒトの顔面神経麻痺は様々な原因によって引き起こされるが、一部では難治性の症例を経験
する。これらの症例に対する新たな治療法が求められるが、それには適切な動物モデルを用い
た基礎研究が不可欠である。過去の報告では切断モデルや圧迫モデルなどが用いられているが、
いずれも自然に治癒するモデルであり、難治性顔面神経麻痺の研究には難治性の動物モデルが
必要である。そこで、本研究では冷却障害により治癒率の低い高度顔面神経麻痺モデルを作製
した。その結果、15 週後でも 70％の動物で麻痺が継続する動物モデル作成に成功した。   
方法：8 週齢のハートレイ系モルモットのメスを 10 匹用いた。ケタミンとキシラジンで麻
酔後、左耳後部の骨包を開放し、スプレーフリーザーで顔面神経管を 5 秒冷却した。この時、
顔面神経管は開放しなかった。冷却後から顔面運動の肉眼的評価を 15 週間行った。冷却 1 週
後に Synacs（NEC 社）にて ENoG 値を測定した。口輪筋の正中に記録電極を挿入し、側頭骨外
の顔面神経を電極で刺激した。正常側との比率で ENoG 値を計算した。冷却 1 週後・15 週後に
組織学的評価を行った。2%グルタールアルデヒド、4%パラホルムアルデヒドで経心灌流固定し、
四酸化オスミウムで後固定を行い、アルコール系列で脱水、エポン包埋した後にトルイジンブ
ルー染色を行った。標本は 1μm でスライスし、光学顕微鏡 BZ9000（Keyence 社）にて観察し
た。1 匹のモルモットに対して温度変化を測定した。顔面神経管から顔面神経を抜去し、熱電
対温度計（A＆D 社）のプローベの先端を茎乳突孔側から顔面神経管に挿入し、鼓室内からス
プレーフリーザーで顔面神経管を 5 秒冷却し、その後 5 分間温度変化を測定した。この動物実
験は、愛媛大学医学部の動物実験の倫理委員会によって承認されている。 
氏名 上甲 智規  
結果：全ての動物は冷却直後から完全麻痺を呈した。冷却後 3 週目から徐々に麻痺の回復を
認めたが、15 週後でも 70％の動物では治癒していなかった。冷却 1 週後で測定した ENoG 値は
全例で 0%だった。冷却 1 週後の組織標本では、冷却部において著明に脱髄している所見を認
めた。冷却 15 週後では多くの神経で髄鞘化を認めたが、正常に比べると小さく、形状はいび
つであった。冷却後の温度は-30℃まで急速に低下し、その後徐々に上昇していった。冷却 5
分後にはほぼ元の温度に戻っていた。 
考察：これまで数々の顔面神経麻痺モデルの報告がある。ウイルス感染モデル、再活性化モ
デル、虚血モデルでは麻痺が軽度であり、またすぐに治癒していた。圧迫モデル、切断モデル
では高度麻痺は呈していたが、麻痺が長く続くものでも 13 週後には全例が治癒に至っていた。
また、経鼓膜的に冷却したモデルもあったが、温度低下は-2～-8℃程度であり、5 週後には全
例治癒していた。 
冷却されると神経の内外では氷晶が生成され、神経軸索膜が障害される。髄鞘がマクロファ
ージ等に貪食されると脱髄を起こし、ワーラー変性が進んでいく。冷却温度による障害の程度
については過去の研究において、-20℃以下まで低下すると治癒までの期間が有意的に長くな
ると報告されている。本研究では-30℃まで低下しているため、過去の冷却モデルに比べ、麻
痺の持続期間が長期間持続したと考えられる。 
現在、様々な分野において、神経の再生治療が行われている。過去の報告では、顔面神経管
切断後に、basic fibroblast growth factor(bFGF)をカテーテルから持続的に投与することに
より期間限定的ではあるがコントロール群に比べて有意的に改善していたと報告している。た
だし、用いられている切断モデルはそもそも自然に治癒するモデルである。今後難治性の顔面
神経麻痺に対する新たな治療を開発していくうえで、自然に治癒しない難治性の冷却モデルを
用いることは基礎研究において非常に有益であると考える。 
結論：顔面神経管を冷却することにより、治癒率の低い高度顔面神経麻痺モデルを作製する
ことができた。肉眼的評価、電気生理学的評価、組織学的評価では高度に障害されており、一
定の回復傾向は認めるものの、15 週後においても 70％の動物において麻痺が継続していた。 
 
 公開審査会は、令和２年１月６日に開催され、申請者は、研究内容を英語で明確に発表し
た。審査員から、実験手技、本モデルと疾患との関係、病理所見、病的共同運動の有無、冷
却剤の毒性、観察期間の正当性、顔面神経３枝の治癒速度の差、ヒトと本モデルの快復率の
比較、盲検法、栄養血管の障害、運動スコア、完治個体と個体差、障害部位の範囲等につい
て質問がなされ、申請者は明快に回答した。審査委員は，申請者が本論文関連領域に対して
学位授与に値する十分な見識と能力を有することを全員一致で確認し，本論文が学位授与に
値すると判定した。 
 
 
 
 
 
 


冷却障害による難治性高度顔面神経麻痺モデル

Ehime University (愛媛大学)博士(工学)doctoral thesi

野村, 俊介

NOMURA, Shunsuke

 
 
（第３号様式）(Form No. 3) 
学 位 論 文 要 旨 
Dissertation Summary 
 
氏   名 (Name) 野村 俊介  
論 文 名： ヘルパーT細胞サブセット分化制御に対する薬剤開発と分化機構に関する研究 
(Dissertation Title):  Studies on drug development and mechanism for the regulation of helper T cell  
 subsets differentiation 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 免疫システムの司令塔であるヘルパーT細胞は、ナイーブT細胞から複数種のヘルパーT細
胞サブセット(Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、制御性T細胞)へと機能獲得することで、ウイルス
や細菌などの病原体から身を守っている。その一方で、ヘルパーT細胞の機能破綻は、アレル
ギー疾患や自己免疫疾患を引き起こす原因となりうる。これらの免疫疾患に対する治療薬の開
発のためには、ヘルパーT細胞サブセットへの機能獲得における制御方法の理解、および機能
分化を制御するメカニズムを解明することが求められる。 
 各種のヘルパーT細胞サブセットへの分化誘導では、各サブセットへの運命決定を担うマスタ
ー転写因子が同定されている。抗原刺激およびサイトカインによって誘導される、それらマスタ
ー転写因子を介した協調的かつ網羅的な遺伝子発現の制御がヘルパーT細胞サブセットの分
化において必須である。 
 これらの細胞分化を伴う網羅的な遺伝子発現制御は膨大な細胞内エネルギーを必要とし、
活性化したT細胞は細胞内エネルギー代謝状態を変化させることで供給していると考えられて
いる。近年、細胞内の代謝状態がT細胞の種類ごとに異なっていることが報告されてお
り、選択的な代謝経路の調節がアレルギーや自己免疫疾患に対する治療方法となりう
ることが示唆されている。しかしながら、ヘルパーT細胞サブセットの分化においてど
の代謝経路が重要であるかはよくわかっていない。  
 本論文では、Th2細胞分化のマスター転写因子GATA3のDNA結合活性を標的とした阻害
剤の開発及び、ヘルパーT細胞サブセットの分化に対するグルタミン代謝酵素Gls1の機能解析
を行った研究成果を報告する。 
 
 
 
PyrrothiogatainはGATAファミリータンパク質の阻害剤として働くことで in vitroにおけ
るTh2細胞分化を阻害する  
	 マスター転写因子であるGATA3はTh2細胞への分化制御を担い、Th2サイトカイン
(IL-4, IL-5, IL-13)の発現を制御する。これらのTh2サイトカインの産生Th2細胞の過剰分
化は、アレルギー疾患発症の一因となることから、Th2細胞の分化やその機能を抑制す
ることでアレルギー疾患の根治治療となりうると予想される。  
	 Chapter 1では、Th2細胞のマスター転写因子GATA3のDNA結合活性を指標として構築
し新規薬剤スクリーニングを実行し、 pyrrothiogatain (3-(2,5-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl) 
-thiophene-2-carboxylic acid) を同定した。Pyrrothiogatainは、in vitroにおいてTh1細胞への
分化を抑制することなく、Th2細胞の分化およびTh2サイトカイン産生を抑制すること
を見出した。さらに、pyrrothiogatainは、Th2サイトカイン遺伝子座に対するGATA3の
ゲノム上での結合を阻害することを示した。これらの結果から、pyrrothiogatainは細胞
内でGATA3の結合活性を阻害することにより、Th2細胞分化を抑制する世界初の薬剤で
あることが示唆された。  
 
Glutaminase 1 (Gls1)依存的なグルタミン代謝はTh17細胞依存的な免疫応答制御する  
	 グルタミンはT細胞の活性化および機能分化において必須なアミノ酸であり、抗原刺
激に依存して細胞内に取り込まれる。細胞内に取り込まれたグルタミンは、酸化的脱
アミノ化およびアミノ基転移反応によって代謝されるが、ヘルパーT細胞サブセットの
分化においてどの代謝経路が重要であるかは、未解明である。Glutaminase 1(Gls1)は、
酸化的脱アミノ化によってグルタミンをグルタミン酸に代謝する酵素であり、グルタ
ミン代謝において最上流に位置する。  
	 Chapter IIでは、T細胞特異的Gls1欠損マウスを用いて、ヘルパーＴ細胞サブセット分
化に対するGls1の役割を評価した。Gls1の欠損によって、細胞内グルタミン酸濃度の低
下が認められ、グルタミンの蓄積が確認された。In vitroにおけるTh17細胞分化は、Gls1
の欠損によって著しく損なう一方で、Foxp3陽性 iTeg細胞の誘導が亢進した。また、 in 
vitroにおける解析では、Gls1の欠損によってIL-5およびIL-13産生Th2細胞の分化が有意
に増加したが、in vivoにおけるTh2細胞依存的な気道炎症の病態はWTと同程度であった。
しかしながら、T細胞特異的Gls1欠損マウスは、Th17細胞依存的な自己免疫疾患モデル
であるEAEに対して抵抗性を持つことが示された。これらの結果から、Gls1依存的なグ
ルタミン代謝経路がTh17細胞依存的な免疫応答に必須であることが示唆された。  
 


Studies on drug development and mechanism for ????the regulation of helper T cell subsets differentiation

Ehime University (愛媛大学)博士(医学)doctoral thesi

甲谷, 秀子

KOTANI, Hideko

 
（第３号様式） 
 
 
学 位 論 文 要 旨 
 
 
 
            氏   名    甲谷 秀子 
 
 
 
            論 文 名    腟内細菌環境におけるヒトβ-デフェンシン２の重要性について 
 
 
 
学位論文要旨 
 ＜はじめに＞腟細菌叢は女性生殖器における最初の防御機構であり、特に乳酸桿菌は重要な
役割を担うことが知られている。以前より、細菌性腟症の臨床診断には Nugent score(NS)が広
く使われているが、必ずしも症状や程度を正確に反映するとは言えないと報告されている。さ
らに、乳酸桿菌の構成は人種により異なると指摘されていることから、乳酸桿菌やある種の腟
内細菌、あるいは NSだけに基づく細菌性腟症の診断は望ましくない。抗菌ペプチドは、自然免
疫機構において複数の役割を果たし、女性生殖器の感染防御にも関与している。主要な抗菌ペ
プチドであるヒトβ-defensin（HBD）は HBD1〜4の種で構成され、HBD 1〜3は腟上皮に発現し
ている。HBD1は上皮細胞で恒常的に発現しているが、HBD2・3は微生物の感染や炎症反応によ
って誘導される。本研究では腟内環境を評価するための生化学的マーカーとして、NS と HBD2
を測定し、種々の微生物感染との関連性について検討した。対象は、愛媛大学と NTT西日本松
山病院を受診した女性 98人であり、全員から書面による同意を得た。この研究は愛媛大学医学
部臨床研究倫理審査委員会によって承認されている（No.1206212）。<方法>a）NS評価：腟分泌
液を綿棒で採取してスライドガラスに塗抹し、グラム染色して顕微鏡下に観察する。
Lactobacillus・Gardnerella・Mobiluncusの菌数を計測したスコアから NSを評価した。b）腟
HBD2・IL-6濃度：生理食塩水 4mLで腟内を洗浄し採取した腟洗浄液中の HBD2・IL-6濃度を ELISA
を用いて測定した。c）微生物解析：腟洗浄液に対して、t-RFLPおよび PCRを用いて微生物解析
を行った。t-RFLPの結果については DNAバンドの本数により解析を行い、バンド数 3本未満、3
〜5 本、6 本以上に分類し、NS と比較した。Mycoplasma hominis・Mycoplasma genitalium・
Ureaplasma ulealyticum・Chlamydia trachomatis を PCR を用いて解析した。d）腟上皮細胞株
培養：HBD2 とカンジダの関連性を検討するため、ヒト腟上皮細胞株(VK2/E6E7)を培養し、カン
ジダ抗原刺激による培養上清中の HBD2 濃度の変化について検討を行った。VK2/E6E7 細胞に
HKCA(heat-killed Candida albicans)あるいは LPSを添加し、24時間 incubationし、上清中の
HBD2濃度を ELISA法によって測定した。e）受容体発現解析：Candida albicansによる HBD2刺
 
氏名 甲谷秀子  
 
激には Dectin-1 受容体が関与することが知られている。そこで、VK2/E6E7 を HKCA によって刺
激し、Dectin-2・Mincle・Mannose受容体と Dectin-1の発現を real-time PCR・免疫染色・ルシ
フェラーゼアッセイを用いて比較した。＜結果＞a）NS の結果は、正常群（NS:0-3）60.2%、中
間群(NS:4-6)22.4%、腟炎群(NS:7-10)17.3%であった。b）NS正常群、中間群、腟炎群の腟洗浄液
中 HBD2濃度はそれぞれ 84.7±147.5 ng/ml（平均±SE）, 53.4±53.7 ng/ml, 37.6±36.2 ng/ml
であった。NSの増加にともなって HBD2が低値をとる傾向があったが統計学的に有意ではなかっ
た。腟分泌液中の Lactobacillusに限定して検討すると、Lactobacillusが≧1/視野存在する場
合、HBD2濃度は 88.0±140.0 ng/mlと＜１/視野の場合(30.6±32.7 ng/ml)に比し有意に高値を
示した（p < 0.01）。IL-6については有意な変化を認めなかった。c）バンド数と NSとの間に高
い相関を示した(kappa 係数 0.76)。さらに、Mycoplasma hominis・Mycoplasma genitalium・
Ureaplasma ulealyticum・Chlamydia trachomatis と HBD2 との間には相関を認めなかったが、
Candidaの存在下で HBD2は有意に高い濃度を示した（311.4±617.5 ng/ml vs. 58.1±99.7 ng/ml; 
p < 0.05）。また、Candida陽性例に対して治療を行った後、HBD2濃度は治療前に比べ有意に低
下した（37.7±12.7 ng/ml; p < 0.05）。d）LPS刺激では HBD2濃度に変化はなかったが（44.2
±11.5 ng/ml vs. 57.8±24.6 ng/ml[control]）、HKCA刺激によって有意な高値を示した（128.2
±54.5 ng/ml, p < 0.05）。e）HKCAによる刺激によって、Dectin-2・Mincle・Mannose・Dectin-1
受容体のうち Dectin-1 mRNA 発現のみが増強された。また、Dectin-1 の発現は、Triton X で膜
処理後に免疫蛍光染色を行うことでさらに確認することができた。さらに、ルシフェラーゼアッ
セイにより、HKCA存在下では NF-kBシグナル活性の誘導を認めた。＜考察＞以上のように、HBD2
は IL-6や NSとは無関係に Lactobacillusの菌数と相関することが明らかになった。NS分類で
は Lactobacillus は重要であるが、他の菌の存在も影響している。今回の分析で NS と t-RFLP
が強い相関を示したように、NSは実際の細菌全体を反映することが明らかである。一方、HBD2
は Lactobacillusの増加を強く反映することがわかった。また、HBD2は腟内の Candida存在下
で増加するが、今回検討を行った他の微生物の影響を受けないことを示した。本研究において
腟内の Candida陽性例の 69%は NS正常であったように、Candidaは Lactobacillusと共存し、
HBD2 はこれら二つの因子の影響を腟分泌液中で受けていると考えられた。真菌は Toll 受容体
や C型レクチン受容体などのパターン認識受容体を介して認識され、Dectin-1および Dectin-2
は、上皮細胞（肺上皮細胞、角膜上皮細胞、腸上皮細胞など）に発現していると報告されてい
るが、今回初めて腟上皮細胞での Dectin-1 の発現を証明した。また、HBD2 は腟上皮細胞を
Candida で刺激することによってその産生が有意に増加することを示した。また、その
signaling pathwayには NF-kBが重要な役割を果たしていることが考えられた。これらの結果か
ら、HBD2は腟内の微生物による感染を防御する重要な因子であると考えられた。 
 
 
キーワード（３～５） 
 
 
 
Bacterial vaginosis 
Human β-defensin 2 
Vaginal Candidiasis 
Vaginal environment 
 


腟内細菌環境におけるヒトβ-デフェンシン2の重要性について

曽我, 亘由

SOGA, Nobuyuki

折戸, 洋子

ORITO, Yohko

園田, 雅江

SONODA, Masae

職場環境が女性の昇進意欲に与える影響

山口, 由等

YAMAGUCHI, Yoshito

地方経済団体による地域偉人顕彰活動 -松山商工会議所の事例

淡野, 寧彦

タピオカで地域も「映ば える」のか? -愛媛県松山市中心部の大街道・銀天街商店街に関する大学生による手描き地図の変化を手がかりに-

張, 貴民

地理学第三法則「地理的類似性」の内容およびその考察

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