data_UMR - Forschungsdatenrepositorium (Philipps-Universität Marburg)
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Analyse der Haftkraft eines experimentellen Calciumphosphat-Sealers in Kombination mit verschiedenen Lösungsmitteln
No full textHintergrund und Zielsetzung:
Als Endodontologie wird der Bereich der Zahnheilkunde bezeichnet, welcher die Erkrankungen des Pulpa-Dentin-Komplexes sowie der periradikulären Strukturen umfasst. Das Ziel der Endodontologie ist es, Zähne langfristig als funktionsfähige Kaueinheit zu erhalten. Im Zuge einer Wurzelkanalbehandlung werden die Wurzelkanäle in der Regel mit Guttaperchapoints und einer Wurzelkanalfüllpaste (Sealer) in Kompaktionstechnik abgefüllt. Dabei sollte der Sealer eine Vielzahl an Anforderungen erfüllen. Obwohl mittlerweile eine große Menge unterschiedlicher Sealer auf dem Markt erhältlich ist, gibt es bislang noch keinen Sealer, der sowohl klinisch als auch materialtechnisch alle Kriterien erfüllt. In dieser In-vitro-Studie wurde der Einfluss verschiedener Lösungsmittel auf den Haftverbund eines experimentellen Sealermaterials auf der Basis von α-TCP untersucht.
Material und Methode:
Dafür kamen 60 extrahierte, einwurzelige, humane Zähne zum Einsatz. Sie wurden in sechs Gruppen à zehn Zähne eingeteilt. Anschließend erfolgte die Dekapitation der Zahnkronen und die maschinelle Aufbereitung mit F360-Feilen auf 8 mm Arbeitslänge. Alle Wurzelkanäle wurden mit demselben Spülprotokoll (3 % Natriumhypochlorit, 15 % EDTA, 3 % Natriumhypochlorit) gespült und mit zwei Papierspitzen getrocknet. Das benötigte Pulver des experimentellen Sealers wurde manuell abgewogen und mit der geforderten Menge Lösungsmittel im Silamat angemischt. In allen Gruppen wurde das identi-sche Pulver auf der Basis von α-TCP verwendet, welches nebst α-TCP teilweise hydrolysiertes Calciumoxid, Natriumfluorid sowie Quervernetzer enthielt. Dabei unterschied sich die Gruppe 6 im Mahlgrad von den anderen Gruppen. Als Lösungsmittel kam Glycerintriacetat (Gruppe 1), Dipropylenglycolmethylether (Gruppe 2), Polyethylenglycol (400 g/mol) (Gruppe 3), Methoxy-2-Propanol (Gruppe 4) und Aqua dest. (Gruppe 5 und 6) zum Einsatz. Unverzüglich nach dem Anmischvorgang erfolgte die Insertion des Sealermaterials sowie eines vorbehandelten Stahlspreaders. Die gefüllten Wurzeln wurden 28 Tage bei 37 °C in einer Dunkelkammer in feuchtem Milieu gelagert. Im Anschluss wurden die Haftwerte durch den Pull-Out-Versuch bestimmt.
Ergebnisse:
Die ermittelten Medianwerte der Gruppen 1 bis 4 lagen zwischen 0,63 (Gruppe 1) und 1,39 MPa (Gruppe 4). Die Gruppe 5 wies einen Medianwert von 5,68 MPa auf und Gruppe 6 lieferte mit 5,75 MPa den höchsten Medianwert. Anhand des Games-Howell-Tests konnte ein signifikanter Unterschied der Medianwerte der Gruppen 1 bis 4 zu den Gruppen 5 und 6 festgestellt werden (p < 0,001). Allerdings zeigten letztere auch ein höheres Interquartil, wobei jedoch auch die niedrigsten Haftverbundwerte signifikant höher ausfielen als in den Lösungsmittelgruppen.
Die Auswertung der Frakturmodi ergab keine signifikante Korrelation zwischen den Frakturmustern und Haftwerten. Insgesamt war Kategorie B mit einem kohäsivem Haft-verbundverlust innerhalb des Sealermaterials der häufigste Frakturmodus, wohingegen in Gruppe 6 die Kategorie D (Kombination aus adhäsivem und kohäsivem Versagen) vor-ranging auftrat. In der Gruppe 5 war der Frakturmodus auf die Kategorien B und D mit je 50 % gleich verteilt.
Schlussfolgerung
Die verwendeten Lösungsmittel reduzieren den Haftverbund des experimentellen Sealermaterials signifikant, was eine Vielzahl von Gründen haben kann: So könnten die Lösungsmittel die Quervernetzter in ihrer Funktion hemmen oder die Mischzeit und der Anmischvorgang sind möglicherweise unzureichend, um die Pulverpartikel zu homogenisieren. Des Weiteren ist ein zu schnelles Abbinden des Materials an der Grenzschicht oder eine Hemmung des gewünschten Austauschprozesses des Lösungsmittels mit Was-ser, sowie eine Hemmung des abschließenden Abbindevorgangs denkbar.
Es sollte daher untersucht werden, ob eine genaue Vordosierung der Komponenten in einem Kapselsystem und/oder eine Verbesserung des Anmischvorgangs zu einer gewünschten Steigerung der Haftwerte führen.
Alternativ ist Aqua dest. das beste Lösungsmittel, wobei auch in diesem Falle eine exakte Vordosierung im Rahmen einer Kapselapplikation von Vorteil wäre.Background and aim:
Endodontology is the field of dentistry that covers diseases of the pulp-dentine complex and periradicular structures. The aim of endodontology is the long-term preservation of teeth as a functional chewing unit. In case of root canal treatment, the root canals are usually filled with guttapercha points and a root canal filling paste (sealer) using a compaction technique. The sealer should fulfill a variety of requirements. Although many different sealers are now available on the market, there is still no sealer that fulfills all criteria in terms of both clinical and material properties. In this in-vitro study, the influence of different solvents on the adhesive bond of an experimental sealer material based on α-TCP was investigated.
Material and methods:
For this purpose, 60 extracted, single-rooted, human teeth were used. They were divided into six groups of ten teeth each. The teeth were then mechanically prepared to a working length of 8 mm using F360 files and the crowns were decapitated. All root canals were rinsed with the same rinsing protocol (3 % sodium hypochlorite, 15 % EDTA, 3 % sodium hypochlorite) and dried with two paper points. The required powder of the experimental sealer was manually weighed and mixed with the required amount of solvent in the Silamat. In all groups, the identical α-TCP-based powder was used, which, in addition to α-TCP, contained partially hydrolysed calcium oxide, sodium fluoride and crosslinkers. Group 6 differed from the other groups in the degree of grinding. The solvents used were glyceryl triacetate (group 1), di(propylene glycol)methyl ether (group 2), polyethylene glycol (400 g/mol) (group 3), methoxy-2-propanol (group 4) and distilled water (groups 5 and 6). Immediately after mixing, the sealer material and a pre-treated steel spreader were inserted. The filled roots were stored for 28 days at 37 °C in a darkroom in a humid environment. The adhesion values were then determined using the pull-out test.
Results:
The median values determined for groups 1 to 4 ranged from 0.63 MPa (group 1) to 1.39 MPa (group 4). Group 5 had a median value of 5.68 MPa and group 6 had the highest median value with 5.75 MPa. Using the Games-Howell test, a significant difference of the adhesion was found between groups 1 to 4 and groups 5 and 6 (p < 0.001). However, the latter showed a higher interquartile, with the lowest values also being significantly higher than in the solvent groups.
The evaluation of the fracture modes did not show any significant correlation between the fracture patterns and adhesion values. Overall, category B with a cohesive loss of adhesion within the sealer material was the most frequent fracture mode. In contrast, cat-egory D (combination of adhesive and cohesive failure) was the most common in group 6. In group 5, the fracture mode was equally distributed between categories B and D with 50 % each.
Conclusion:
The solvents used significantly reduce the adhesive bond of the experimental sealer material. There may be a variety of reasons for this: For example, the solvents could inhibit the function of the crosslinkers, or the mixing time and mixing process may be insufficient to homogenise the powder particles. It is also conceivable that the material sets too quickly at the boundary layer or that the desired exchange process of the solvent with water and the final setting process is inhibited.
Therefore, it should be investigated whether a precise pre-dosing of the components in a capsule system and/or an improvement of the mixing process would lead to the desired increase in the adhesion values.
Alternatively, distilled water is the best solvent, although in this case an exact predosing in a capsule application would also be advantageous
Reduzierung des Kontaktwiderstands in organischen Dünnschicht-Feldeffekttransistoren mit p- und n-Kanal
No full textPerformance of organic field-effect transistors (OFETs) is generally defined by two processes: injection of charge carriers at the electrode-organic interface and transport of charge carriers across the conduction channel at the gate dielectric-organic interface. In recent years, progress in understanding the electronic structure of π-conjugated organic solids and advancements in methods of chemical synthesis have allowed to develop organic semiconductor (OSC), whose effective mobility in devices exceeds that of amorphous silicon. However, as the efficiency of charge transport in the conduction channel increases, the inefficiency of the charge-carrier injection starts to play an ever more important role in the performance of OFETs. Nowadays contact resistance – a property that summarizes the effects of an inefficient charge-carrier injection in a device – is one of the main factors limiting the performance of OFETs. Therefore, in order to further advance the field of organic electronics, it is crucial to be able to understand the physical origin of contact resistance and its interplay with other performance characteristics of a device.
While contact resistance has been a topic of extensive research in recent years, its effects on the device performance are not yet completely understood. In particular, this is influenced by the fact that methods used for characterisation of OFETs are often adopted directly from the field of inorganic semiconductors. However, the van der Waals nature of intermolecular bonds in organic solids results in a much higher rates of disorder in comparison to inorganic semiconductors. Therefore, even extremely pure organic single crystals only exhibit a band-like transport, while the theory of inorganic semiconductors mostly deals with ideal electronic band structures. Another contribution stems from the specifics of thin films of OSCs not being taken into account during the preparation and electrical characterisation of devices. This includes, in particular, exposure to ambient air, which is known to affect the current-voltage characteristics of both p- and n-channel OFETs. Furthermore, the measured current-voltage characteristics implicitly include a complex interplay of phenomena at metal-organic and dielectric-organic interfaces, making the development of a simple analytical model a rather challenging task. As a result, unravelling the effects of individual interfaces on the device performance is often not possible. Finally, the importance of investigating devices with well-defined interfaces to establish a proper physical understanding of the involved phenomena cannot be underestimated.
To address the aforementioned issues, it was decided to develop a full-high vacuum (HV) process chain, which encompasses preparation and electrical characterisation of OFETs. Devices with a bottom gate-bottom contact geometry are used, which ensures well-defined interfaces between the organic layer, the source-drain electrodes and the gate dielectric. The use of a full-vacuum process allows to exclude the effects of exposure to ambient air and thus isolate the influence of the interfaces on the device performance. This makes it possible to demonstrate an interplay between the contact resistance and the effective mobility in OFETs. Furthermore, it is shown that even a short exposure to ambient air drastically alters the current-voltage characteristics, influencing extracted performance characteristics. To allow a deeper insight into the charge-carrier injection and transport phenomena in OFETs, a variable-temperature transfer length method (TLM) analysis is developed and used in combination with the full-HV process chain. As a result, a connection between the height of the injection barrier and the activation energy of charge transport is uncovered in both ?- and ?-channel devices. This connection indicates that a low activation energy of charge transport is required to ensure a low contact resistance. Furthermore, the reproducibility of the TLM analysis is investigated, whereby the importance of precisely defining the actual channel length of devices is demonstrated.
The results of this dissertation advance the understanding of the contact resistance and its relation with charge transport in the conduction channel of OFETs. The developed full-HV process chain and analysis methods are flexible and have great potential for future studies, in particular in investigation of electrode functionalisation techniques to achieve true ohmic contacts in organic electronics.Die Leistung der organischen Feldeffeckttransistoren (OFET) ist generell durch zwei Prozessen zu definieren: die Injektion der Ladungsträger an der elektrod-organischen Schnittstelle und der Transport der Ladungsträger über den Leitungskanal am Gate-Dielektrikum-organischen Schnittstelle. In letzter Zeit, Fortschritt des Verständnis der elektronischen Struktur von π-konjugierten molekularen Festkörper und Verbesserung der organischen Synthesemethoden haben es erlaubt, organische Halbleiter (OSC) zu entwickeln, deren Effektivmobilität in Geräte übersteigt die vom amorphen Silizium. Aber je höher die Effizienz der Ladungstransport im Ladungskanal wird, desto größere Rolle spielt die Ineffizienz der Ladungsträgerinjektion in der Leistung der OFET. Heutzutage ist der Kontaktwiderstand – eine Eigenschaft, die die Effekte von der ineffizienten Ladungsträgerinjektion in einem Gerät charakterisiert, – ein der Hauptfaktoren, die die Leistung von OFET limitieren. Deswegen ist es entscheidend, den physikalischen Grund des Kontaktwiderstandes und das Zusammenspiel davon mit anderer Leistungscharakteristika des Gerätes zu verstehen, um weitere Fortschritte im Bereich organischer Elektronik zu machen.
Obwohl der Kontaktwiderstand schon seit Jahren extensiv recherchiert wird, seine Wirkung auf der Geräteleistung ist noch nicht komplett klar. Das wird insbesondere von der Tatsache beeinflusst, dass die Methoden der OFET-Charakterisierung oft direkt aus dem Bereich anorganischer Halbleiter angenommen werden. Aber die van der Waals Natur der Molekularkräfte der molekularen Festkörper erzeugt Unordnungsrate, die viel höher ist, als bei anorganischer Halbleiter. Deswegen sogar extrem reine organische Einzelkristalle zeigen nur Bandgetreuetransport, während die Theorie der anorganischen Halbleiter handelt von idealer Bandstrukturen. Weiterer Beitrag dazu kommt aus dem nicht-Berücksichtigung der Einzelheiten der molekularen Dünnschichten während der Herstellung und Charakterisierung der Geräten. Das beinhaltet insbesondere die Luftaussetzung, die sowohl auf die Strom-Spannung-Kennlinie der p-, als auch n-Kanal Transistoren auswirkt. Zudem bezieht die gemessene Strom-Spannung-Kennlinie eine komplexe Zusammenspiel von Phänomenen am metalorganischen- und dielektrikorganischen Schnittstellen implizit ein, womit die Entwicklung eines einfaches analytisches Modells nur herausfordernd wird. Hierauf ist oft das Enträtseln der Wirkung einzelner Schnittstellen auf die Geräteleistung nicht möglich. Schließlich ist es schwer zu überbewerten, die Wichtigkeit der Untersuchungen von Geräte mit scharf umgerissener Schnittstellen, um eine richtige Verständnis der Grundphänomen zu erstellen.
Um es zu versuchen, die obengenannte Fragen zu antworten, wurde es entschieden, eine Vollhochvakuumprozesse zu erstellen, die Herstellung und elektrische Charakterisierung der OFET umfasst. Geräte mit einer bottom-Gate-bottom-Kontakt Geometrie werden benutzen, um scharf umgerissene Schnittstellen zwischen der organischen Schichte, der Source-Drain-Elektroden und der Gate-Dielektrikum sicherzustellen. Die Verwendung einer Vollvakuumprozesse erlaubt den Ausschluss der Wirkung von Luftaussetzung und damit die Isolierung des Einflusses der Schnittstellen auf die Geräteleistung. Damit ist es möglich, ein Zusammenspiel zwischen den Kontaktwiderstand und die Effektivmobilität in OFETs zu zeigen. Zudem wird es demonstriert, dass sogar eine kurze Luftaussetzung in der Strom-Spannung-Kennlinie eine drastische Änderung erzeugt, die die extrahierende Leistungscharakteristika stark beeinflusst. Um neue Erkenntnisse über die Ladungsträgerinjektion und Ladungstransport in OFET zu gewinnen, eine temperaturvariabele Transfer-Length-Methode wird entwickelt und zusammen mit der Vollhochvakuumprozesse verwendet. Infolge wird eine Verbindung zwischen die Höhe der Injektionsbarriere und die Aktivierungsenergie der Ladetransport sowie in ?-, als auch in ?-Kanalgeräte entdeckt. Diese Verbindung deutet auf eine Voraussetzung hin, um einen niedrigen Kontaktwiderstand sicherzustellen, nämlich dass die Aktivierungsenergie der Ladetransport auch niedrig sein muss. Weiterhin wird die Reproduzierbarkeit der TLM-Analyse untersucht, womit die Wichtigkeit von der Festlegung der tatsächlichen Kanallänge der Geräte veranschaulicht wird.
Die Ergebnisse dieser Dissertation bringen das Verständnis des Kontaktwiderstandes und seine Verbindung mit der Ladetransport im Ladekanal der OFET voran. Die entwickelte Vollhochvakuumprozesse und Analysemethoden sind flexibel und verfügen über großes Potenzial an künftige Forschung, insbesondere an Untersuchungen der Elektrodenmodifikation, die eine Möglichkeit zu wahren ohmischen Kontakten für organische Elektronik bietet
Effectiveness of germ reduction by 445nm laser irradiation of periodontal pockets in vitro
No full textDiodenlaser finden heutzutage im Rahmen der Parodontitis Therapie ihren Einsatz vor allem in Form der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT). Dabei wird ein Photosensibilisator in den Sulkus appliziert und durch den Diodenlaser aktiviert. Das Ziel der vorliegenden Studie war es herauszufinden, inwiefern auch die Anwendung von Diodenlasern ohne den zusätzlichen Einsatz eines Photosensibilisators zur Desinfektion parodontaler Taschen und zur Reduktion des bakteriellen Keimspektrums innerhalb der Zahnfleischtasche geeignet ist.
Hierfür wurden zwei Diodenlaser (SiroLaser: Denstply Sirona, Bensheim, Deutschland; und Aquamarine Laser: FONAdental, Slowakei) in unterschiedlichen Leisstungsstufen (0.4W, 0.6W und 0,75W) einer digitalen Leistungsmessung unterzogen, um die tatsächliche Laserleistung zu verifizieren. Anschließend wurden Titanstäbchen, vorab mit einem spezifischen paropathogenen Keimspektrum beimpft, in eine präparierte Zahnfleischtasche eines Schweineunterkiefers platziert und für 30 Sekunden mit der jeweiligen Leistungsstufe des Diodenlasers bestrahlt. Als Referenzwert wurde in einer weiteren Testgruppe eine Spülung mit 0.2% Chlorhexidin Spüllösung für 30 Sekunden durchgeführt. Eine weitere Testgruppe stellte eine Scheinanwendung des Diodenlasers dar (Laserleistung 0W), sowie eine Kontrollgruppe unbehandelter Titanstäbchen. Anschließend wurde in einem externen Labor (Orodentale Mikrobiologie, Kiel) die Restkeimbelastung auf den behandelten Teststäbchen ermittelt.
Die Auswertung der Bakterienlast auf den behandelten Titanstäbchen ergab beim Vergleich der fünf Versuchsgruppen (n = 16) eine signifikant höhere Keimreduktion in allen drei Versuchsgruppen, in denen eine Laserdesinfektion stattgefunden hat. Die geringste Restkeimbelastung erzielte der Laser mit 0.75W und einer Wellenlänge von 970nm (Median: 1,1E+06), dicht gefolgt von dem 0.6W Laser mit einer Wellenlänge von 445nm (Median: 1,4E+06) sowie dem 0.4W Laser und einer Wellenlänge von 970nm (Median: 2,9E+06). Eine deutlich höhere Keimbelastung (Median 7,1E+06) wies die Testgruppe mit CHX Spüllösung vor. Die Kontrollgruppe (Median 2,7E+07) sowie die Gruppe, in welcher der Laser im ausgeschalteten Zustand angewendet wurde (Median 2,6E+07), wiesen keine statistisch signifikanten Unterschiede auf.
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass eine Keimreduktion durch Diodenlaser der Wellenlängen 445nm und 970nm möglich ist. Eine direkte Korrelation zwischen der Höhe der angewandten Laserleistung und der Höhe der Keimreduktion konnte nicht abschließend erfasst werden und bedarf weiterer Untersuchungen. Die Studie zeigt, dass die Keimreduktion bei allen drei Leistungsstufen der Diodenlaser signifikant höher ausfällt als bei der konventionellen Spülung mit einer Chlorhexidin-Spüllösung.At present, diode lasers are used mainly in periodontitis therapy in the form of antimicrobial photodynamic therapy (aPDT). A photosensitizer is applied to the sulcus and activated by the diode laser. The aim of the present study was to find out to what extent the use of diode lasers without the additional use of a photosensitizer is suitable for disinfecting periodontal pockets and reducing the bacterial germ spectrum within the gingival pocket.
For this purpose, two diode lasers (SiroLaser: Denstply Sirona, Bensheim, Germany; and Aquamarine Laser: FONAdental, Slovakia) in different power levels (0.4W, 0.6W and 0.75W) were subject to a digital power measurement in order to verify the actual laser power. Then titanium rods, previously inoculated with a specific paropathogenic germ spectrum, were placed in a prepared gingival pocket of a pig's mandible and irradiated for 30 seconds with the respective power level of the diode laser. As a reference value, rinsing with 0.2% Chlorhexidine (CHX) rinsing solution for 30 seconds was carried out in a further test group. Another test group represented a sham application of the diode laser (laser power 0W), as well as a control group of untreated titanium rods. The residual germ load on the treated test strips was then determined by an external laboratory (Orodentale Mikrobiologie, Kiel).
The evaluation of the total bacterial load on the treated titanium rods showed, when comparing the five test groups (n = 16), a significantly higher germ reduction in all three test groups in which laser disinfection took place. The lowest residual germ load was achieved by the laser with 0.75W and a wavelength of 970nm (median: 1.1E + 06), closely followed by the 0.6W laser with a wavelength of 445nm (median: 1.4E + 06) and the 0.4W laser with a wavelength of 970nm (median: 2.9E + 06) . The test group with CHX rinsing solution showed a significantly higher bacterial load (median 7.1E + 06). The control group (median 2.7E + 07) and the group in which the laser was used when switched off (median 2.6E + 07) showed no statistically relevant differences.
The results of the present study show that a germ reduction by diode lasers of wavelengths 445nm and 970nm is possible. A direct correlation between the amount of laser power used and the amount of germ reduction could not be conclusively proven and requires further investigations. The study shows that the germ reduction with all three power levels of the diode laser is significantly higher than with conventional rinsing with Chlorhexidin solution
Quality-controlled characterization of a monoclonal antibody specific to an EC5-domain of human desmoglein 3 for pemphigus research
No full textBackground: Pemphigus vulgaris (PV) is a life-threatening autoimmune blistering
disease caused mainly by IgG autoantibodies (auto-abs) against the cadherintype
adhesion molecules desmoglein (Dsg) 1 and 3. Pathogenic anti-Dsg3 autoabs
bind to different Dsg3 epitopes, leading, among others, to signalling that is
involved in pathogenic events, such as Dsg3 depletion. As central tools in
research on PV, a limited number of antibodies such as AK23 are frequently
used by the autoimmune bullous disease community.
Methods: Previously, we have introduced a novel Dsg3 EC5-binding antibody
termed 2G4 that may potentially serve as a superior tool for numerous PV related
analysis. The purpose of this study was to develop a quality-controlled production
and verification process that allows I) a continuous quality improvement, and II) a
verified and comprehensible overall quality with regard to pathogenic antigenspecific
binding in a variety of pemphigus assays for each batch production.
Results: Thus, a workflow based on a standardized operating procedure was
established. This includes the verification of purity and in-vitro binding capacity
(SDS-page, direct and indirect immunofluorescence) as primary parameters, and
size analysis by mass-spectrometry and ex-vivo pathogenicity by monolayer
dissociation assay.
Conclusion: We here present an extensive point-by-point quality controlled IgG
production protocol, which will serve as a basis for a standardized antibody
assessment in PV research.Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg
Entwicklung von in vitro Methoden für das Engineering von allosterischen Transkriptionsfaktoren, Enzymen und Stoffwechselsystemen
No full textAnthropogenic climate change, caused by the emission of more greenhouse gases
such as carbon dioxide than the global carbon cycle can fix, is drastically affecting our
planet and life on it. While humanity can decarbonize its energy needs, we will continue
to rely on carbon-based molecules for food, medicine, and materials of all kinds. 34%
of anthropogenic greenhouse gas emissions come from industrial processes such as
the production of chemicals, plastics and fertilizers, and are primarily caused by the
need for high heat and pressure in industrial processes. Biocatalysis allows the
production of chemicals at ambient pressure and lower temperatures, as well as the
use of substrates derived from waste streams, biomass or atmospheric carbon
dioxide. In recent years, many methods have been developed to tailor enzymes to the
needs of industrial biocatalysis, but low throughput in testing enzyme variants limits
progress.
The aim of this work was to develop tools to increase the throughput of enzyme
engineering and the testing of metabolic systems such as enzyme cascades. Allosteric
transcription factor (aTF)-based biosensors allow the rapid and label-free detection of
metabolites using common laboratory equipment, making them attractive for highthroughput enzyme assays. aTFs transduce the formation of the aTF ligand by the
enzyme variant tested (the input) into the generation of a reporter signal such as
fluorescence or DNA replication (the output).
To demonstrate the rapid and inexpensive testing of a complex enzyme cascade and
its individual enzymes, we developed an in vitro transcription (IVT)-based biosensor
to read out the product formation of the CETCH cycle, a complex synthetic CO2 fixation
cycle that produces glycolate from CO2. Notably, several cofactors of the CETCH cycle
inhibited IVT, but we still achieved high correlations of r = 0.94-0.98 between IVT
output and LC-MS quantification.
However, suitable aTFs that recognize metabolites of interest in the required
concentration range are rare, limiting the widespread application of biosensing. To
address this deficiency, I have developed a new concept for rapidly engineering aTFs
for new substrate specificities and other optimized properties such as sensitivity. The
concept is based on one major principle. Despite the many advantages of living cells,2
their active metabolism, metabolome and membrane pose challenges to the
engineering of aTFs, such as product degradation, interference with the native
metabolome leading to low sensitivity and crosstalk with structurally similar
compounds, and exclusion of membrane-impermeable ligands. To overcome these
limitations, the PURE system, an in vitro transcription-translation system reconstituted
from purified components, allows the testing of protein variants without competing
metabolism, metabolome and membrane, allowing the use of metabolites that cannot
be tested in living cells. Recently, a powerful in vitro compartmentalization method for
engineering transcription-translation-related enzymes, called compartmentalized
partnered replication (CPR), has been demonstrated. In CPR, the activity of an aTF is
coupled to the production of a thermostable DNA polymerase in Escherichia coli, the
cells are encapsulated in water-in-oil emulsions, and functional aTF genes are
replicated by emulsion PCR. The better the encoded aTF, the more DNA polymerase
is produced and the more the aTF gene is enriched in the gene population. However,
the previously published CPR approach is not compatible with the PURE system.
We have laid the foundation for CPR in the PURE system by establishing the
genetically encoded control of DNA replication in the PURE system, called
transcription-translation coupled DNA replication (TTcDR). We present data on
several TTcDR systems, general design rules for genetic circuits in the PURE system,
and improved DNA polymerase mutants that yield a genetic circuit based on the model
aTF TetR with >1000-fold DNA replication under non-repressing conditions, ~150-fold
repression by TetR, and ~4-fold derepression by the ligand anhydrotetracycline.
We will use the genetic circuit-controlled TTcDR system to establish selection for the
evolution of allosteric transcription factors in the first place, and enzymes and
metabolic systems in the future.Der anthropogene Klimawandel, der durch die Emission von mehr Treibhausgasen
wie Kohlendioxid (CO2) verursacht wird, als der globale Kohlenstoffkreislauf binden
kann, hat gravierende Auswirkungen auf unseren Planeten und das Leben auf ihm.
Während die Menschheit ihren Energiebedarf dekarbonisieren kann, werden wir
weiterhin auf kohlenstoffbasierte Moleküle für Nahrung, Medizin und Materialien aller
Art angewiesen sein. 34 % der anthropogenen Treibhausgasemissionen stammen
aus industriellen Prozessen wie der Herstellung von Chemikalien, Kunststoffen und
Düngemitteln und sind vor allem auf den hohen Wärme- und Druckbedarf dieser
Prozesse zurückzuführen. Die Biokatalyse ermöglicht die Herstellung von
Chemikalien bei Umgebungsdruck und niedrigeren Temperaturen sowie die Nutzung
von Substraten aus Abfallströmen, Biomasse oder atmosphärischem Kohlendioxid. In
den letzten Jahren wurden viele Methoden entwickelt, um Enzyme an die Bedürfnisse
der industriellen Biokatalyse anzupassen, aber der geringe Durchsatz beim Testen
von Enzymvarianten begrenzt den Fortschritt.
Ziel dieser Arbeit war es, Methoden zu entwickeln, um den Durchsatz beim EnzymEngineering und beim Testen von Enzymkaskaden zu erhöhen. Biosensoren, die auf
allosterischen Transkriptionsfaktoren (aTFs) basieren, ermöglichen eine schnelle,
markierungsfreie Messung von Metaboliten mit herkömmlichen Laborgeräten, was sie
für Enzymassays im Hochdurchsatz attraktiv macht. Dabei wandeln aTFs die
Produktion des aTF-Liganden durch die zu testende Enzymvariante (Input) in die
Erzeugung eines Reportersignals wie Fluoreszenz oder DNA-Replikation (Output) um.
Um das schnelle und kostengünstige Testen einer komplexen Enzymkaskade und
ihrer einzelnen Enzyme zu demonstrieren, haben wir einen auf in vitro Transkription
(IVT) basierenden Biosensor entwickelt, der die Produktbildung des CETCH-Zyklus
misst, eines komplexen synthetischen CO2-Fixierungszyklus, der Glykolat aus CO2
produziert. Mehrere Cofaktoren des CETCH-Zyklus hemmen IVT, dennoch konnten
hohe Korrelationen von r = 0,94-0,98 zwischen dem IVT-Signal und der LC-MSQuantifizierung erzielt werden.
Geeignete aTFs, die Metaboliten im erforderlichen Konzentrationsbereich erkennen,
sind jedoch selten, was die breite Anwendung von Biosensoren einschränkt. Um
diesen Mangel zu beheben, habe ich ein neues Konzept für das schnelle Engineering4
von aTFs für neue Substratspezifitäten und andere optimierte Eigenschaften wie z.B.
Sensitivität entwickelt. Das Konzept basiert auf einem grundlegenden Prinzip. Trotz
der vielen Vorteile, die lebende Zellen bieten, stellen ihr aktiver Stoffwechsel, ihr
Metabolom und ihre Membran Herausforderungen für das Engineering von aTFs dar,
wie z.B. Produktabbau, Interferenzen mit dem nativen Metabolom, die zu geringer
Sensitivität und Verwechslungen mit strukturell ähnlichen Verbindungen führen, und
der Ausschluss von Liganden, die für die Membran undurchlässig sind. Um diese
Einschränkungen zu überwinden, ermöglicht das PURE-System, ein in vitro
Transkriptions- und Translationssystem, das aus aufgereinigten Komponenten
besteht, das Testen von Proteinvarianten ohne konkurrierenden Stoffwechsel,
Metabolom und Membran, wodurch die Verwendung von Metaboliten ermöglicht wird,
die nicht in lebenden Zellen getestet werden können. Kürzlich wurde eine
leistungsfähige in vitro Kompartimentierungsmethode für die Entwicklung von
Transkriptions- und Translations-assoziierten Enzymen demonstriert, die als
„compartmentalized partnered replication“ (CPR) bezeichnet wird. Bei der CPR wird
die Aktivität eines aTF mit der Produktion einer thermostabilen DNA-Polymerase in
Escherichia coli gekoppelt, die Zellen in Wasser-in-Öl-Emulsionen eingekapselt und
funktionelle aTF-Gene mittels Emulsions-PCR repliziert. Je besser der kodierte aTF,
desto mehr DNA-Polymerase wird produziert und desto mehr aTF-Gene werden in
der Genpopulation angereichert. Der zuvor veröffentlichte CPR-Ansatz ist jedoch nicht
mit dem PURE-System kompatibel.
Wir haben die Grundlagen für CPR im PURE-System gelegt, indem wir eine genetisch
kodierte Kontrolle der DNA-Replikation im PURE-System etabliert haben, die als
Transkription-Translation-gekoppelte DNA-Replikation (TTcDR) bezeichnet wird. Wir
präsentieren Daten zu verschiedenen TTcDR-Systemen, allgemeine Designregeln für
genetische Schaltkreise im PURE-System und verbesserte DNA-PolymeraseMutanten, die einen genetischen Schaltkreis basierend auf dem Modell-aTF TetR mit
>1000-facher DNA-Replikation unter nicht-repressiven Bedingungen, ~150-facher
Repression durch TetR und ~4-facher Derepression durch den Liganden
Anhydrotetracyclin erzeugen.
Wir werden das genetisch kontrollierte TTcDR-System nutzen, um zunächst die
Selektion für die Evolution allosterischer Transkriptionsfaktoren und in Zukunft von
Enzymen und Stoffwechselsystemen zu etablieren
Die Schulfarm Insel Scharfenberg (Berlin) nach 1945
No full textDie Schulfarm Insel Scharfenberg wurde 1922 gegründet und entwickelte sich innerhalb weniger Jahre zu einer der beachtenswertesten öffentlichen Reformschulen der Weimarer Republik. Initiator und Leiter der Schulfarm war der Pädagoge Wilhelm Blume (1884-1970). 1932 übernahm Blume neben der Leitung der Schulfarm auch die der Humboldtschule Tegel, einer der größten höheren Schulen Berlins. Ziel dieses 'Doppeldirektorats' war es, zu erproben, inwieweit reformpädagogische Erfahrungen der Schulfarm auf eine höhere 'Normalschule' übertragbar gemacht werden könnten. 1934 wurde diesem Übertragungsversuch, der recht verheißungsvoll angelaufen war, ein Ende gemacht: Wilhelm Blume, dem auf Scharfenberg schon 1933 ein nationalsozialistischer Heimleiter zur Seite gestellt worden war, verließ zusammen mit einigen Kollegen und einer größeren Zahl von Schülern die Schulfarm - blieb aber das ganze Dritte Reich hindurch Leiter der Humboldtschule. Die Schulfarm entwickelte sich von 1934 bis 1945 zu einer nationalsozialistischen Erziehungsstätte
Automatische Atemflussanalyse im Schlaf bei Gesunden und Patienten mit Schlafapnoe
No full textZiel der Studie war es, einen neuen automatischen Algorithmus zur Erkennung von Flusslimitationen im Schlaf zu verwenden, um hiermit die Atemphysiologie im Schlaf zu beschreiben. Hierzu erfolgte die Aufzeichnung einer vollständigen Polysomnographie von 25 Probanden inklusive des aktuellen Goldstandards zu Detektion von Flusslimitationen, dem Ösophaguskatheter sowie der neuen Methode, dem Obstruktionskoeffizienten.
Mit Hilfe des Obstruktionskoeffizienten ist es nun erstmals möglich, alle Atemzüge einer nächtlichen Messung im Schlaf bzgl. der Merkmale von Flusslimitierung objektiv zu beschreiben. Entgegen der Annahmen aus den bisherigen Publikationen ergibt sich aber überhaupt kein Zusammenhang zwischen dem Anteil stark flusslimitierter Atemzüge, und dem Schweregrad einer obstruktiven schlafbezogenen Atmungsstörung.
Die wichtigste Erkenntnis dieser Untersuchung ist, dass die Begrenzung des Inspirationsflusses nicht unbedingt mit einer Zunahme der Atemanstrengung verbunden ist. Die Atemanstrengung unterscheidet sich in den verschiedenen Schlafstadien und verhält sich bei Gesunden und Patienten mit milder und schwerer OSA unterschiedlich.
Eine erhöhte inspiratorische Anstrengung ist ein Merkmal der schweren, aber nicht der milden OSA, und scheint unabhängig von der Flusslimitation zu sein. Die Rolle von intrathorakalen Druckschwankungen, die nichts mit Obstruktionen und Flusslimitationen zu tun haben, sollte daher weiter untersucht werden.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung legen nahe, sich in der Therapie der OSA in erster Linie auf die Schlafphasen N2 und N3 zu konzentrieren, da hier der negative intrathorakale Druck am meisten erhöht ist.Aim of this study is the use of a new automatic algorithm that allows the detection of flow limitations during sleep in order to describe the physiology of breathing in this phase. For this purpose, a complete polysomnography of 25 subjects was recorded, including the current gold standard for the detection of flow limitations, the oesophageal catheter as well as the new method, the obstructive coefficient.
With the help of the obstructive coefficient, it is now possible for the first time to objectively describe all breaths of a nocturnal measurement during sleep with regard to the characteristics of flow limitation. Contrary to the assumptions made in previous publications, however, this research comes tot he conclusion that there is no correlation at all between the proportion of severely flow-restricted breaths and the severity of obstructive sleep-disordered breathing.
The major finding of this investigation is that inspiratory flow limitation is not necessarily linked to increased respiratory effort and that effort behavouir differs between sleep stages and behaves differently in healthy subjects and patients with sleep-related breathing disorders.
Increased inspiratory effort is a feature of severe but not mild OSA and appears to be not related to flow limitation. The role of intrathoracic pressure swings unrelated to obstructions and flow limitation deserves further investigation.
The results of this study suggest that treatment of OSA should focus primarily on N2 and N3 sleep stages, as this is where negative intrathoracic pressure is most elevated
Klinische Validität und Nutzbarkeit der Netzwerkanalyse in der klinischen Praxis
No full textDiese Dissertation zielt darauf ab, die klinische Validität und Nutzbarkeit der vollständig idiographischen Netzwerkanalyse (FINA) in der klinischen Praxis zu untersuchen. Ausgehend von einer Erkundung empirischer FINA-Forschung, die darauf abzielt, personenbezogene Netzwerke bei Personen mit psychischen Erkrankungen zu schätzen, wird anschließend das Potenzial von FINA in der klinischen Praxis untersucht. Kapitel 1 bietet eine Einführung in die Bedeutung der Erforschung der Validität und Nutzbarkeit der Netzwerkanalyse in der klinischen Praxis. Kapitel 2 präsentiert eine systematische Scoping-Review von Studien, die FINA im Bereich der psychischen Gesundheit anwenden, und hebt häufige methodische Praktiken und Trends hervor, während Verbesserungsbereiche identifiziert werden. Diese Übersicht legt die Grundlage für das Verständnis, wie FINA bisher angewendet wurde, und zeigt auf, welche Weiterentwicklungen für eine effektive Anwendung in der klinischen Forschung und Praxis erforderlich sind. Kapitel 3 beschreibt eine empirische Studie, die die klinische Validität und Nutzbarkeit von FINA testet, indem empirische Symptomenetzwerke, die anhand von Patientendaten mit FINA geschätzt wurden, mit klinisch vorhergesagten Symptomenetzwerken in Bezug auf ihre Fähigkeit verglichen werden, die nachfolgende Patientenfunktionalität vorherzusagen. Zusätzlich untersucht die Studie die Perspektiven von Klinikern und Patienten zur Nutzbarkeit von FINA in der routinemäßigen klinischen Praxis. Kapitel 4 präsentiert eine allgemeine Diskussion über die klinische Validität und Nutzbarkeit der Verwendung von Netzwerkanalysen zur Konstruktion personenbezogener Netzwerke, mit einem Fokus auf die Ergebnisse, Einschränkungen und Implikationen sowohl der Scoping-Review als auch der empirischen Studie sowie auf zukünftige Forschungsrichtungen. Das übergeordnete Ziel dieser Dissertation besteht darin, personalisierte, datenbasierte Ansätze in der Klinischen Psychologie voranzutreiben, indem die klinische Validität von FINA untersucht und deren Anwendbarkeit in der klinischen Praxis bewertet wird. Diese Arbeit bewertet das Potenzial von FINA als Instrument zur Vorhersage der Patientenfunktionalität und zur Verbesserung der Behandlung durch Unterstützung individuellerer Interventionen.This dissertation aims to investigate the clinical validity and utility of fully idiographic network analysis (FINA) in clinical practice. Moving from an exploration of FINA empirical research using FINA to estimate person-specific networks in individuals with mental health conditions, it then explores FINA’s potential in clinical practice. Chapter 1 presents an introduction on the importance of exploring the validity and utility of network analysis in clinical practice. Chapter 2 presents a systematic scoping review of studies applying FINA in mental health, highlighting common methodological practices and trends, while identifying areas for improvement. This review sets the stage for understanding how FINA has been applied to date and highlights further developments needed for its effective application in clinical research and practice. Chapter 3 describes an empirical study testing the clinical validity and utility of FINA by comparing empirical symptom networks, estimated on patient data using FINA, with clinician-predicted symptom networks in their ability to predict subsequent patient functioning. Additionally, the study explores both clinicians’ and patients’ perspectives on FINA’s utility in routine clinical settings. Chapter 4 presents a general discussion on the clinical validity and utility of using NA to construct person-specific networks, with a focus on the findings, limitations, and implications of both the scoping review and empirical study, as well as directions for future research. The overarching goal of this dissertation is to advance personalized, data-driven approaches in clinical psychology by examining the clinical validity of FINA and evaluating its applicability in clinical practice. This work assesses FINA’s potential as a tool for predicting patient functioning and improve treatment through support for more individualized interventions
C3a Mediates Endothelial Barrier Disruption in Brain-Derived, but Not Retinal, Human Endothelial Cells
No full textNeuromyelitis optica spectrum disorder (NMOSD) is associated with pathological aquaporin-4
immunoglobulin G (AQP4-IgG), which cause brain damage. However, the impact of AQP4-IgG
on retinal tissue remains unclear. Additionally, dysregulated complement anaphylatoxins C3a and
C5a, known to modulate the endothelial barrier, are implicated in NMOSD. This study evaluates
the susceptibility of human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) and human retinal
endothelial cells (HREC) to C3a- and C5a-mediated stress using real-time cell barrier analysis,
immunocytochemical staining, qPCR and IgG transmigration assays. The findings reveal that C3a
induced a concentration-dependent paracellular barrier breakdown and increased transcellular
permeability in HBMEC, while HREC maintained barrier integrity under the same conditions. C5a
attenuated C3a-induced disruption in HBMEC, indicating a protective role. Anaphylatoxin treatment
elevated transcript levels of complement component C3 and increased C5 gene and protein expression
in HREC, with no changes observed in HBMEC. In HBMEC, C5a treatment led to a transient
upregulation of C3a receptor (C3AR) mRNA and an early decrease in C5a receptor 1 (C5AR1) protein
detection. Conversely, HREC exhibited a late increase in C5aR1 protein levels. These results indicate
that the retinal endothelial barrier is more stable under anaphylatoxin-induced stress compared to
the brain, potentially offering better protection against paracellular AQP4-IgG transport.Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg
Eignung eines rekombinanten vesikulären Stomatitis-Virus als Surrogatsystem der biologischen Schutzstufe 2 zur Untersuchung neutralisierender Ebolavirus-Antikörper in Patientenproben
No full textDas Ebolavirus ist ein hochpathogenes Virus, das beim Menschen ein hämorrhagisches Fieber
mit einer hohen Letalität verursachen kann. Aufgrund fehlender Therapieoptionen wird das
Ebolavirus in die biologische Risikogruppe der Schutzstufe 4 eingeordnet. Ebolaviren sind
regelmäßig für Epidemien in Ländern Zentralafrikas verantwortlich. Den bislang größten
Ausbruch mit über 28.000 Infizierten und über 11.000 Toten gab es jedoch in den
westafrikanischen Ländern Sierra Leone, Guinea und Liberia im Zeitraum von 2014 bis 2016.
Die Messung von neutralisierenden Antikörpern bei Überlebenden oder geimpften Personen,
mittels eines Virusneutralisationstests, liefert wichtige Informationen zur Immunantwort, der
Immunogenität von Impfstoffen oder dem therapeutischen Einsatz von Rekonvaleszenzseren. Im
Rahmen dieser Arbeit sollte die Eignung eines Biosicherheitslevel 2-Surrogatmodells unter
Verwendung eines replikationskompetenten, rekombinanten vesikulären Stomatitis-Virus (VSV)
zur semiquantitativen Bestimmung neutralisierender Antikörper gegen das Ebolavirus
untersucht werden.
Das vesikulären Stomatitis-Virus trägt in diesem Fall das Glykoprotein des Ebolavirus. Nach der
Versuchsetablierung unter Verwendung eines polyklonalen Ebolaantikörpers erfolgten weitere
Tests mit Referenzseren der Weltgesundheitsorganisation. Die Referenzseren wurden im
Rahmen einer internationalen Vergleichsstudie der Weltgesundheitsorganisation zur Etablierung
eines Antikörperstandards verwendet. Im Anschluss erfolgte die Testung von insgesamt 344
Patientenseren aus einer serologischen Studie über die Immunantwort von EBOVÜberlebenden, die
im Rahmen des Ebolaausbruchs in Westafrika durchgeführt wurde. Die Seren
stammen aus drei unterschiedlichen Kohorten von Studienteilnehmern aus Guinea. Der
durchgeführte Neutralisationstest mit den rekombinanten Viren zeigte im Vergleich zum
Wildtypvirus in allen Patientenproben eine gute Korrelation.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass das rekombinante
VSV-Surrogatsystem ein geeignetes Testsystem darstellt, um neutralisierende Antikörper gegen
das Ebolavirus unter BSL2-Bedingungen zu untersuchen.Ebolavirus is a highly pathogenic virus causing haemorrhagic fever or Ebola virus disease in
humans with high lethality. Due to the high lethality and missing therapeutic options, Ebola virus
is classified a biosafety level 4 pathogen. Regular epidemics are seen in central African countries.
So far, the biggest outbreak with over 28,000 infected people and over 11,000 deaths occurred
in the West African countries Sierra Leone, Guinea and Liberia from 2013 to 2016.
The measurement of neutralising antibodies in disease survivors or vaccinated people using a
virus neutralisation assay gives important information about the immune response, the
immunogenicity of vaccines or the therapeutic use of serum from convalescent people. This
dissertation aims to evaluate the suitability of a biosafety level 2 surrogate system with a
replication competent, recombinant vesicular stomatitis virus (VSV) for semi-quantitative
determination of neutralising antibodies against Ebola virus.
In this case the vesicular stomatitis virus expresses the glycoprotein of Ebola virus. After
implementation using a polyclonal Ebola antibody, more tests with reference sera from the
World Health Organization followed. The reference sera have been developed within the
framework of an international comparison study by the World Health Organization aiming to
establish antibody standards. Thereafter the tests of in total 344 patient sera from a serologic
study about the immune response against Ebola virus, performed during the West African Ebola
outbreak, followed. The sera are from three different cohorts of study participants in Guinea.
The performed neutralisation assay with the recombinant virus showed to have a good
correlation in comparison with wildtype virus in all patient sera.
In summary of the results of this work, it has been shown that a recombinant VSV based
surrogate system is an appropriate tool to access neutralising antibodies against Ebola under
biosafety level 2 conditions