Tokyo University of Agriculture Repository / 東京農業大学リポジトリ

東京農業大学博士（食品栄養学

横山, 友里

3648

YOKOYAMA, Yuri

3649

氏 名 横 山 友 里
学位（専攻分野の名称） 博 士（食品栄養学）
学 位 記 番 号 甲 第 716 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 28 年 3 月 20 日
学 位 論 文 題 目 地域在住高齢者の介護予防における食品摂取多様性の意義
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・保健学博士 川 野 因
教 授・医 学 博 士 中 江 大
教 授・博士（身体教育学） 上 岡 洋 晴
医 学 博 士 新 開 省 二＊
論文内容の要旨
はじめに
超高齢社会を迎えた我が国では，要介護状態を予防ま
たは先送りし，健康寿命を延伸させることが最重要課題
となっている。この課題解決にむけて，介護予防の分野
では，フレイル（虚弱）の重要性が注目されている。フ
レイルとは，高齢期に生理的予備能が低下することで
種々のストレスに対する脆弱性が亢進し，生活機能障
害，要介護状態，死亡などの転帰に陥りやすい状態とさ
れ，多くの高齢者がフレイルという中間的段階を経て，
徐々に要介護状態に陥ると考えられている。フレイルに
は，適切な介入により再び健常な状態に戻るという可逆
性が含まれていることから，要介護状態に至る前のフレ
イルの状態で適切な介入・支援ができれば，介護予防が
進み，要介護高齢者の減少が期待できる。
サルコペニア（骨格筋量の減少に伴う筋力の衰えある
いは歩行機能の低下）は，フレイルの主要な原因のひと
つとして位置づけられ，介護予防における介入のター
ゲットとして重要視されている。サルコペニアは筋量，
身体機能（握力，通常歩行速度）から評価でき，これら
の加齢に伴う低下を抑制するための改変可能な要因の解
明が求められている。栄養・食事は改変可能な要因のひ
とつとして注目されており，これまでにたんぱく質や抗
酸化ビタミン（ビタミン C，bカロテンなど）・ビタミ
ン Dなどの微量栄養素，食品群（果物・野菜，魚など）
との関連が多数報告されている。一方，ヒトは日々，食
品や栄養素を組み合わせた料理・食事を摂取しているこ
とから，特定の栄養素や食品群ではなく，これらを総合
的に捉えることが重要視され，「食事の質」を評価する
ための様々な Dietary quality indexが開発されている。
近年では，Mediterranean Diet Score（地中海式食事）
やアメリカの食事ガイドラインに基づく Healthy Eat-
ing Indexとサルコペニア（関連アウトカムを含む）と
の関連が報告されているが，これらはいずれも欧米人を
対象とした研究であり，食習慣の異なる日本人高齢者を
対象にこれらのエビデンスを適用することは難しいこと
が考えられる。我が国では，「食事の質」の評価法とし
て，熊谷らが 10食品群の摂取頻度による食品摂取多様
性得点を開発しており，これまで観察研究や介入研究で
用いられている。食品摂取多様性は，摂取した食品数を
考慮することにより，比較的簡便に「食事の質」を評価
することができるのが特徴である。しかしながら，サル
コペニアと食品摂取多様性との関連については，これま
で十分な検討がなされていない。
そこで，本研究では，1）国民健康・栄養調査のデー
タから日本人高齢者の食物摂取状況および栄養状態の現
状を把握するとともに，2）地域在住高齢者を対象とし
た疫学研究により，食品摂取多様性に焦点をあて，筋
量・身体機能（握力，通常歩行速度）との関連について
検討し，介護予防における食品摂取多様性の意義を明ら
かにすることを目的とした。
1章 国民健康・栄養調査からみた日本人高齢者におけ
る食物摂取状況および栄養状態の現状
国民健康・栄養調査の結果から，日本人高齢者におけ
る食物摂取状況および栄養状態の現状を検討することを
目的とした。国民健康・栄養調査は，国民の健康状態や
生活習慣を把握するために国が毎年行っており，健康増
進施策のモニタリング調査としての機能を果たしてい
る。本研究の遂行にあたり，2003年から 2011年までの
9年間の国民健康・栄養調査の個票データについて，厚
生労働省に二次利用申請を行い，これを入手した。対象
者は 65歳以上高齢者 22,692名であり，解析には，身体
─ 58 ─
＊東京都健康長寿医療センター研究所 副所長
計測，血液検査，栄養摂取状況（栄養素等摂取量・食品
群別摂取量）のデータを用いた。
国民健康・栄養調査の結果から，低栄養傾向（Body
Mass Index（BMI）20kg/m2以下または血清アルブミ
ン 4.0g/dl以下）を示す高齢者の割合は，加齢とともに
増加することが示された。また，加齢とともに，エネル
ギー摂取量はじめ，多くの栄養素や食品群の摂取量が低
下することが示された。したがって，高齢期は数多くの
栄養素や食品群の摂取不足が問題となる可能性があるこ
とから，特定の栄養素や食品群ではなく，これらを総合
的に評価し，健康アウトカムとの関連を検討する必要性
が示唆された。
2章 地域在住高齢者における食品摂取多様性と筋量，
身体機能との関連
研究 1．地域在住高齢者における食品摂取多様性と筋
量，身体機能との横断的関連
地域在住高齢者を対象に食品摂取多様性と筋量，身体
機能との横断的関連を検討することを目的とした。対象
は，埼玉県鳩山町（2012年）および群馬県草津町（2013
年）にて実施した高齢者健診の参加者 1184名とした。
本研究を実施するにあたり，東京都健康長寿医療セン
ター研究所倫理委員会の承認を得るとともに，すべての
対象者から書面による同意を得た。体組成の測定には，
生体電気インピーダンス法を使用した InBody 720
（Biospace Inc., Seoul, Korea）を用いて，除脂肪量（除
脂肪軟組織量），四肢骨格筋量（上肢と下肢の除脂肪軟
組織量の総和）を推定した。握力は，スメドレー式握力
計を用いて，利き手で測定した。通常歩行速度測定で
は，あらかじめ 3mと 8mの地点にテープで印をつけ
た 11mの路上を直線歩行してもらった。3mから 8m
の地点間の 5mを歩くのに要した時間を計測し，歩行
速度（m/s）を算出した。食品摂取の多様性は，肉類，
魚介類，卵類，牛乳，大豆製品，緑黄色野菜類，海草
類，果物，芋類，および油脂類の 10食品群の 1週間の
食品摂取頻度から調べた。各食品群に対して，「ほぼ毎
日食べる」に 1点，「2日に 1回食べる」，「週に 1，2回
食べる」，「ほとんど食べない」の摂取頻度は 0点とし，
その合計点を食品摂取の多様性得点（以下，多様性得
点）とした（熊谷ら，2003）。また，基本的属性（性・
年齢・世帯状況），教育年数，喫煙状況，飲酒状況，運
動習慣，主観的咀嚼能力は自記式質問票により尋ねた。
さらに，身長と体重を測定し，BodyMass Index（BMI）
を算出した。既往歴（高血圧，糖尿病，がん，脳卒中，
心疾患，慢性閉塞性肺疾患（COPD））および過去 1年
間の入院歴は，問診により調査した。
対象者を多様性得点により 0-2点の Low群，3-5点
のMedium群，6点以上の High群の 3区分に分類し，
対象者特性を比較した結果，多様性得点が高いほど，年
齢が高く，教育年数が長く，現喫煙者および現飲酒者が
少なく，運動習慣有の者の割合が多く，過去 1年間の入
院歴有の者の割合が少なかった。交絡要因で調整した除
脂肪量および四肢骨格筋量を多様性得点 3区分で比較し
た結果，多様性得点が高いほど，除脂肪量（High : 39.0
kg vs Low : 37.9kg, P for trend＝0.006）および四肢骨
格筋量（High : 16.8kg vs Low : 16.1kg, P for trend＝
0.001）は有意に高値を示した。同様に，多様性得点が
高いほど，握力は有意に高値を示し（High : 29.1kg vs
Low : 27.7kg, P for trend＝0.005），通常歩行速度は高
値を示す傾向がみられた（High : 1.34m/s vs Low : 1.31
m/s, P for trend＝0.075）。また，多様性得点（連続量）
と除脂肪量，四肢骨格筋量，握力，通常歩行速度との関
連を重回帰分析にて検討した結果，いずれも有意な正の
関連が見られた。
研究 2．地域在住高齢者における食品摂取多様性と筋
量，身体機能との縦断的関連
研究 1は，横断研究デザインのため，因果関係につい
て明らかにすることはできない。そこで，研究 2では，
4年間のコホート研究にて，地域在住高齢者における食
品摂取多様性と筋量，身体機能との縦断的関連を検討す
ることを目的とした。
対象は，群馬県草津町または埼玉県鳩山町の高齢者健
診に参加した 65歳以上高齢者とした。草津町では 2008
年を，鳩山町では 2010年をベースラインとし，その後
4年間追跡した。ベースラインおよび追跡調査の両方に
参加した 935名のうち，両年ともに筋量，握力，通常歩
行速度のデータのあるものを解析対象者とした。本研究
を実施するにあたり，東京都健康長寿医療センター研究
所倫理委員会の承認を得るとともに，すべての対象者か
ら書面による同意を得た。ベースライン時および 4年後
の体組成，握力，通常歩行速度の測定，ベースライン時
の食品摂取多様性得点の評価は研究 1と同様の方法で実
施した。また，ベースライン時に，基本的属性（性・年
齢・世帯状況），教育年数，喫煙状況，飲酒状況，運動
習慣，主観的咀嚼能力，Body Mass Index（BMI），既
往歴（高血圧，糖尿病，がん，脳卒中，心疾患，慢性閉
塞性肺疾患（COPD）），過去 1年間の入院歴，抑うつ
（15-item Geriatric Depression Scale（GDS）により評
─ 59 ─
価），認知機能（Mini-Mental State Examination（MMSE）
により評価）のデータを収集した。アウトカム（除脂肪
量，四肢骨格筋量，握力，通常歩行速度の低下）を定義
するにあたり，ベースライン時の除脂肪量，四肢骨格筋
量，握力，通常歩行速度の結果より，最下位 4分位の値
をカットオフ値とした。各アウトカムの定義は，ベース
ライン時における上位 3分位の者のうち，4年後の追跡
調査でカットオフ値以下に低下した場合とした。
対象者を多様性得点により 0-3点の Low群，4-6点
のMedium群，7点以上の High群の 3区分に分類し，
ベースライン時の対象者特性を比較した結果，多様性得
点が高いほど，年齢が高く，女性の割合が多く，教育年
数は短く，現喫煙者・現飲酒者は少なく，うつ状態を評
価する GDSの点数は低かった。各アウトカムの発生割
合は，除脂肪量低下が 8.0%（34/423），四肢骨格筋量低
下が 9.1%（39/428），握力低下が 11.0%（71/632），通常
歩行速度低下が 11.9%（75/632）であった。交絡要因を
調整した多変量ロジスティック回帰分析の結果，多様性
得点 3区分と除脂肪量低下との関連はみられなかったも
のの，多様性得点が高いほど四肢骨格筋量低下のオッズ
比が低下する傾向がみられた（P for trend＝0.068）。ま
た，多様性得点が高いほど握力低下および通常歩行速度
低下のオッズ比が有意に低下した。多様性得点 3群にお
ける握力低下のオッズ比（95%信頼区間）は，Low群
から順に，1.00（基準群），0.60（0.30-1.19），0.43（0.19-
0.99）であり（P for trend＝0.043），通常歩行速度低下
のオッズ比（95% 信頼区間）は，1.00（基準群），0.59
（0.30-1.14），0.43（0.19-0.99）であった（P for trend＝
0.039）。
おわりに
本研究では，国民健康・栄養調査のデータから日本人
高齢者の食物摂取状況および栄養状態の現状を把握する
とともに，地域在住高齢者を対象とした疫学研究によ
り，食品摂取多様性と筋量，身体機能との関連について
検討した。その結果，国民健康・栄養調査のデータか
ら，加齢とともに低栄養傾向にある高齢者（Body mass
index（BMI）20kg/m2以下または血清アルブミン 4.0
g/dl以下）の割合が増加することが示され，エネルギー
摂取量はじめ，多くの栄養素や食品群の摂取量が低下す
ることが示された。さらに，地域在住高齢者を対象とし
た横断研究および縦断研究から，食品摂取多様性は筋
量，身体機能の低下抑制に関わる可能性が示された。す
なわち，介護予防における食品摂取多様性の意義が明ら
かになった。
本研究は，特定の栄養素や食品群ではなく，「食品摂
取多様性」が高齢期のサルコペニア予防に防御的に働く
ことを示した国内外で初めての研究である。介護予防に
おける食生活面からの対策において「食品摂取多様性」
の意義が明らかになったことから，多様な食品摂取が要
介護状態を予防または先送りし，健康寿命の延伸につな
がる可能性が示唆された。
審査報告概要
超高齢社会に突入した我が国は要介護状態の予防また
は先送りによる健康寿命の延伸が最大の関心事となって
いる。要介護状態に至る前の虚弱（フレイル）な状態で
適切な介入・支援ができれば，要介護者の減少に繋げら
れる可能性がある。申請者はそこでまず，国民健康・栄
養調査結果の二次利用申請を行い，日本人の 65歳以上
高齢者の食物摂取状況と栄養状態の現状を把握する事，
また，フレイルの主要原因とされるサルコペニアと食生
活との関わりを明らかにする事を目的に地域在住高齢者
を対象とする栄養疫学研究に参画し，仮説に基づくデー
タ解析を担当した。その結果，日本人高齢者は加齢とと
もに「低栄養傾向」者が増えること，地域在住高齢者の
横断及び縦断的な栄養疫学研究から，10食品群で構成
される「食物摂取多様性得点」の高いことがサルコペニ
アの構成要素である筋量や身体機能（握力，通常歩行速
度）の低下リスクを抑えることを明らかにした。
今後の介護予防における食生活面からの対策において
「食品摂取多様性」の意義を示めした本研究の新規性を
評価した。
よって，審査員一同は博士（食品栄養学）の学位を授
与する価値があると判断した。
─ 60 ─


地域在住高齢者の介護予防における食品摂取多様性の意義

東京農業大学博士（バイオセラピー学

魯, 元学

3824

Lu, Yuanxue

3825

氏 名 魯 元 学
学位（専攻分野の名称） 博 士（バイオセラピー学）
学 位 記 番 号 乙 第 916 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 28 年 4 月 20 日
学 位 論 文 題 目 中国雲南省におけるペテロコスメア属およびシシンラン属
（イワタバコ科）の多様性と花卉資源としての活用に関する
研究
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・農 学 博 士 山 口 裕 文
教 授・農 学 博 士 宮 本 太
教 授・博士（農学） 雨 木 若 慶
農 学 博 士 三 位 正 洋＊
論文内容の要旨
全世界の熱帯から温帯地域に自生するイワタバコ科
（Gesneriaceae）植物は中国ではチベット南部，西南，
東南，中部の各省に分布している。雲南省の高地に分布
する種は寒さに対する耐性があり，耐陰性をもつため室
内花卉などに活用できる可能性が高いと推定されるが，
これまで品種改良には用いられていない。また，この分
類群の多くの種は，森林開発などの環境変化によって個
体数が減少し，絶滅の危険にさらされている。本研究で
は中国雲南省産イワタバコ科植物の中で，とくに花卉と
しての活用が期待されるペトロコスメア属（Petrocos-
mea）およびシシンラン属（Lysionotus）を中心として
持続的に保全活用するために必要な地理分布と多様性の
現状を把握し，その細胞遺伝学的特徴，種間交雑におけ
る稔実性および微細繁殖に関する知見を得た。主な結果
は以下のとおりである。
1． 雲南省産イワタバコ科植物の地理的分布の現状
中国にはイワタバコ科植物は 56属 450種あり，雲南
省には 34属 211種が記録されている。雲南省のイワタ
バコ科植物は，以下の 11の地理的分布パターンに整理
され，1）東アジアに広く分布する 7属 79種，2）雲南
高地から横断山脈に分布する 7属 17種，3）中国ヒマラ
ヤに分布する 5属 70種，4）インドシナ半島辺縁まで広
がる 4属 5種，5）旧熱帯に広くみられる 2属 16種，6）
南西中国から台湾に分布する 2属 13種，7）マレー半島
から南西中国に分布する 2属 5種，8）インド東部から
南中国に分布する 2属 3種，9）横断山脈から中国中央
に分布する 1属 1種，10）熱帯アジアからオーストラリ
アに分布する 1属 1種，11）熱帯アジアと熱帯アメリカ
に離れて分布する 1属 1種から構成されていた。
2． ペトロコスメア属植物の多様性と花卉資源としての
潜在力
ペトロコスメア属（Petrocosmea）は，中国中部から
ベトナム南部，タイ，ミャンマー，インド北東部まで分
布し，中国ヒマラヤ分布型に該当する。中国には 38種，
雲南省には 27種があり，P. barbata，P. begoniifolia，
P. coerulea，P. duclouxii，P. glabristoma， P. grandi-
flora，P. grandifolia，P. longipedicellata，P. mela-
nophthalma，P. menglianensis，P. minor，P. rosetti-
folia，P. sericea，P. shilinensis，P. yanshanensis の
15種は雲南省固有種である。ペトロコスメア属植物は
広域に分布するが，雲南省の本属植物には分布域の狭い
種が多い。
ペトロコスメア属は，3節（Petrocosmea，Anisochilus
および Deianthera）に区分される。本申請者が主に収
集したペトロコスメア属 36種を用いた葉緑体 DNAの
6領域と核 DNAの 2領域の塩基配列データから得られ
た分子系統樹は地理分布と生育型に対応した 5つのク
レードを示し，Deianthera節が系統樹の基部に位置し，
Petrocosmea 節および Anisochilus 節は派生的であっ
た。
雲南高原で最も高い多様性を示すペトロコスメア属
は，無茎の多年生草本で，多様な根生葉をもつ生育型と
鮮やかな青色や黄色，白色などの花色などに高い多様性
を示し，室内用花卉品種育成の遺伝資源としての活用が
期待された。
─ 73 ─
＊千葉大学 名誉教授
3． シシンラン属植物の多様性と花卉資源としての潜在
力
ヒマラヤ，中国，日本に分布する 40種のシシンラン
属植物のうち中国には 37種があり，雲南省には 20種が
分布している。雲南省のシシンラン属植物は，周辺地域
と多様な分布関係を示し，主要素は中国・ヒマラヤと雲
南高原および横断山脈に分布し，東へは台湾と日本に連
続して分布しているが，雲南省の西北部と東南部に分布
する種の多くは狭い分布域を示し，特に Lysionotus
longipedunculatus，L. mollifolius，L. sessilifolius，
L. sulphureus，L. sulphureoides（新記載種）は雲南省
の 1箇所から 2箇所にのみ生育する固有種であった。希
少種を含めて収集した 20種のシシンラン属植物を昆明
植物園で栽培して生態的特徴や園芸的活用の性質を調査
し，栽培の容易な 17種には変異に富む果実の形状や多
様な花色が認められ，新しい花卉品種および遺伝資源と
しての活用が期待された。
4． イワタバコ科植物の細胞遺伝学的特徴
染色体を観察した雲南省産 12属 28種には基本数を
9，10，16，17とする 2n＝18∼64の染色体数変異がみ
られ，ペトロコスメア属（14種）では 2n＝34，シシン
ラン属（7種）では 2n＝32（2倍体）など基本数と染色
体数に違いがみられ，Aeschynanthus 属と Primulina
属では個体群によって 4倍体が観察された。
5． 種間交配と雑種の確保
雲南省産シシンラン属 3種を用いた 4組合せ 23交配
から得られた未熟種子を培養して 10個体の後代植物を
得た。開花した個体の花の形態は交配親の中間的で，種
間雑種と推定された。シシンラン属の種間交雑では結実
率が低く，雑種の発芽率も低い傾向にあったが，野生採
集の種子を用いて調査した最適発芽条件下で開発した培
地で未熟種子を培養すると種間雑種を容易に獲得でき
た。
6． 雲南省産シシンランの微細繁殖
葉切片から植物体を効率的に再生させる技法を確立す
るために，雲南省産のシシンラン（Lysionotus pauci-
florus）を用い，カルス培養系を経た微細繁殖とその培
養条件について窒素源の種類および濃度と照射する
LEDの波長帯を検討した。
1）カルス培養系を用いた微細繁殖
3種の植物成長調節物質，ナフタレン酢酸（NAA），
ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）およびベンジルアデ
ニン（BA）を組み合わせたMS固化培地で葉切片から
カルスを誘導し，2mM 2,4-Dの単独添加培地で高いカ
ルス増殖を確認した。2mM2,4-Dを添加した液体培地を
用い，100rpmでカルスを旋回培養すると移植後 4週間
で直径 0.5∼1cmのカルスとなり生重量で約 4倍に増殖
した。これを分割し，サイトカイニンを含む再分化培地
に移植してシュートを誘導した。32mM の BA または
0.5mM のゼアチンを単独で添加した再分化培地では
シュートの再分化率は最大約 30% になった。再分化
シュートを植物成長調節物質を含まない培地で発根，順
化させ，66個体を得た。この再分化植物のうち 58個体
は二倍体で，8個体は四倍体であった。葉切片から直接
再生させた植物では四倍体植物は観察されず，倍数化は
カルス誘導やカルス増殖の初期の誘発と推定された。効
率的なクローン増殖を担保する高いシュート再分化能力
を持つ培養系を選抜したところ，当初の倍数性変化以外
の明らかなソマクローナル変異を示さず，2年以上培養
しても高い再分化能力を示している。
2）微細繁殖に及ぼす窒素源の種類および濃度
MS培地の窒素源の種類と濃度を変えた異なる 4種類
の培地で葉片からのシュート再生を検討した。葉片から
のシュート再生に最適な培地は無修正の MS 培地
（1650mg l−1 NH4NO3＋1900mg KNO3の窒素源を含
む）MS培地であった。シシンランの葉切片からのシュー
ト再生には NH4
＋は重要な要素であるが，シュートの
成長には不可欠ではなく，NH4
＋と Na＋は不定根形成
を抑制し，Na＋を含む培地ではシュートの成長が抑制
されることが解った。
3）微細繁殖における照射光の光質の影響
異なるピーク波長（白色，青色，オレンジ色，赤色）
の LED 光による連続照明（40mmol m−2s−1 PPDF）
および暗黒条件下で微細繁殖を評価した。シュートは，
すべての LED照射下で葉切片から形成されたが，暗黒
条件では形成しなかった。赤色 LED下でシュート数が
最も多かったが，シュートは徒長した。この徒長は節培
養による大量増殖には分割作業を行う上で有効であり，
白色蛍光灯下で節培養すると正常なシュートが得られ
た。すなわち苗の増殖段階では赤色 LEDを用いて，最
終段階に白色蛍光灯下で培養すると健全な苗を大量に生
産できる。
本研究で得られた雲南省産のペトロコスメア属とシシ
ンラン属植物の多様性の知見は，亜低木，草本，つる性
など多様な生活型や様々な花色を持つ花卉および遺伝資
源として人間生活の多様な場において活用する指針を与
─ 74 ─
える。また，細胞遺伝学的特徴と人工交雑品の確保技
術，シシンランにおける微細繁殖法に関する知見は，イ
ワタバコ科植物の育種に用いる交配親の選抜や大量増殖
に広く利用できる。本研究の成果は，イワタバコ科植物
の新しい園芸品種の育成を導くだけでなく，稀少種の保
全の実行にも有用で，生物多様性を人間生活の質の改善
に持続的に活用するバイオセラピー学の学術に寄与する
ものである。
審査報告概要
本論文は，雲南省原産ペテロコスメア属とシシンラン
属植物を中心に花卉資源となるイワタバコ科植物の植物
地理学および形態的生態的多様性の現状と染色体数を調
査分析するとともに種子繁殖および組織培養による微細
繁殖法の確立を試みたものである。染色体数 2n＝34の
ペテロコスメア属では分子系統解析で得られた 5個のク
レードに対応する生態的形態的変異が花卉としての活用
上のまとまりを示し，染色体数 2n＝32のシシンラン属
植物では雲南省産シシンランが台湾や日本のシシンラン
とは花の特徴などに異なり，低日照条件での利用に期待
される事を明らかにした。また，これらの結果をもとに
シシンラン属では種間雑種の作出にも成功している。さ
らに組織培養による微細繁殖の方法を検討して，カルス
経由の増殖，培地での適切な窒素源および LED照明で
の適切な波長を明らかにした。本研究は，森林内等の暗
い環境に生育するためこれまで花卉資源としてあまり使
用されなかったペテロコスメア属とシシンラン属植物を
室内花卉として活用する可能性を示し，雑種を含む植物
体の増殖方法の開発は生物多様性の持続的活用の方向を
示している。よって，審査員一同は博士（バイオセラ
ピー学）の学位を授与する価値があると判断した。
─ 75 ─


中国雲南省におけるペテロコスメア属およびシシンラン属（イワタバコ科）の多様性と花卉資源としての活用に関する研究

白井, 智美

3830

SHIRAI, Tomomi

3831

インスリン抵抗性がレチノール結合タンパク質（RBP4）およびビタミンA代謝に与える影響の解析

東京農業大学博士（農業経済学

MAKOSA, Dan

3660

3661

氏 名 Makosa Dan
学位（専攻分野の名称） 博 士（農業経済学）
学 位 記 番 号 甲 第 722 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 28 年 3 月 20 日
学 位 論 文 題 目 Developing the Rice Markets in Uganda : A Value
Chain Analysis
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（農業経済学） 高 柳 長 直
教 授・農 学 博 士 立 岩 寿 一
教 授・博士（農学） 金 田 憲 和
教 授・博士（農学） 高 根 務
論文内容の要旨
Unlike most of the food crops grown to satisfy
household consumption and food security require-
ments in Uganda, rice is consumed more in urban
areas, where it is one of the major foodstuffs. As a
result, most of rice produced by rural farmers enters
the marketing system. Unfortunately, there is a prob-
lem of market access due to poor linkages between the
rural producers and the urban consumers. To address
this problem, the researcher has used a value chain
approach to study the rice marketing system by
delving into trade policies and quality aspects while
identifying the constraints encountered along the
distribution system and upgrading opportunities. Up-
grading refers to acquisition of technological, institu-
tional and market capabilities that allow resource-
poor rural communities to improve their competi-
tiveness and move into higher-value activities. The
study was based in Eastern Uganda which is the main
rice producing area of the country. The research
analyzed the marketing system by looking at its
governance, network structure and value adding op-
portunities. Although value chain approach has been
used by various studies in Uganda, it has concentrated
on mapping of distribution channel and gross margin
analysis. The aspect of incorporating upgrading
strategies and quality assessment has not been of
focus. This study therefore contributes to literature
by including the elements of policy, quality and up-
grading which are necessary for increasing the com-
petitiveness of the rice industry. There is no lead firm
in Uganda rice industry due to market liberalization
with minimum barriers to entry and exit. The in-
dustry is highly competitive with many uncoordinated
smallholder farmers and many less cooperative rice
traders. Value chain governance is in the form of
trade policies and rice standards formulated by the
government. Assessment of the role of such policies to
the rice sector formed the first section of this research.
Through mapping of the marketing channels, identifi-
cation of constraints and upgrading options ; the
network structure was revealed in the second section
of the study. To assess the competitiveness of the
sector, the study ended by analyzing the quality of rice
in the market and the possibilities of improving it.
To assess the policies influencing the rice sector, the
study relied on a range of data sources. It first ex-
plored the rice marketing situation in the country by
conducting on-desk review of relevant literature. It
then used secondary data from local, regional and
international databases. These data were helpful in
constructing balance sheets, calculating relevant in-
dicators such as self-sufficiency and import depend-
ency ratios, analyzing changes in trade directions,
analyzing market price trends and correlations. Such
information was important in revealing whether the
policy has been helpful. To study the network struc-
ture as well as market upgrading opportunities and
challenges, a field survey was conducted. The data
were captured from farmers, small scale millers and
large scale processors. Collection method was through
focus group discussions, individual semi-structured in-
terviews, personal observations and key informant
─ 80 ─
interviews. The major topics of interviews included
major clients and suppliers, prices and pricing mecha-
nism, support organizations, marketing challenges
and upgrading opportunities. The result of that sur-
vey was helpful in identifying who holds influence in
the marketing chain, trust and relationship between
actors among others. A similar survey was conducted
to assess the competitiveness of Ugandan rice to im-
prove its quality. The main respondents were the
Uganda National Bureau of Standards (UNBS), rice
distributors specifically retailers and farmers. The
topics for retailers included rice brands, sales, quality
management, suppliers and main clients. Such in-
formation was useful in estimating retailers’ profit-
ability, quality improvement procedures and con-
sumer preferences. In addition, personal observation
of retailer rice samples was conducted for important
attributes of physical quality such as stones and
broken rice through manual sorting, weighing and
calculating their respective percentages. The major
topics for farmers concentrated around postharvest
handling mainly drying, quality management proce-
dures and challenges. The findings of all studies are
as follow :
Developing the rice markets in Uganda requires
multifaceted approach including policies, governance,
quality, infrastructure and improvement of all the
processes along the entire marketing channel. In
terms of policy, the government of Uganda joined its
East African counterparts to enact a common external
tariff on rice imports as a way of promoting the local
industry. However, the policy is not successful due to
two major reasons : (i) less commitment by member
partners in terms of implementation due to other
conflicting interests and (ii) inflow of rice from one
member country (Tanzania) which has a competitive
advantage as a replacement for internationally traded
rice. Kenya’s interest in trading its tea with Pakistan
enabled it to levy less than required tariff on Pakistani
rice which is then repackaged by unscrupulous traders
and exported to Uganda. Similarly, Tanzania priori-
tizes food security and as such removes tariffs from
rice imports during periods of shortage. Such actions
enable Tanzanian traders to import excess rice which
is then smuggled to Uganda. Since the enactment of
import tariff, the volume of rice imported from Tan-
zania to Uganda has drastically increased to cover the
reduced imports from Pakistan and Viet Nam. This
has helped Uganda’s rice import dependency ratio to
remain unchanged. The implication is that the initial
purpose of the import tariff which was reducing for-
eign imports to motivate local farmers has not bene-
fited Ugandan but Tanzanian farmers. For Ugandan
farmers to benefit, it will require the cost and quality
of their rice to at least equal to that of Tanzanian rice
in Ugandan markets. This can be possible by reor-
ganizing and or improving the entire processes along
the rice value chain.
Ugandan rice value chain is long with many actors
who hold varying degrees of power and influence.
There are many smallholder farmers who produce rice
either individually or in groups. However, marketing
is mostly done on individual basis which significantly
reduces the bargaining power of farmers. Given that
most rice millers provide milling services at a com-
mission rather than engaging in buying of rice, market
power remains with village assemblers who purchase
rice from farmers and sale to wholesalers. Relative
coordination among village assemblers, high transport
costs to other markets and small volumes of rice
supplied by individual farmers are some of the factors
responsible for the assemblers’ bargaining power. For
farmers to raise their bargaining power there is need
for horizontal coordination and aggregate their pro-
duce before selling. Currently, many farmers have
joined groups aimed at joint production. Formation of
these groups has been facilitated by several develop-
ment organizations. However, marketing receives
less attention and is supported by few agencies. More
marketing support in terms of group formation, trust
and management skills is required. The poor road
conditions limit some traders from reaching the rural
areas, leading to an oligopsony which empowers
buyers at the expense of sellers. There is need for
improving the condition of rural roads to lower trans-
port costs and enable farmers to access better markets.
In liberalized rice sector of Uganda, market access
alone is not enough to improve the incomes of farmers.
The high rice milling costs will need to lower for
farmers to improve the profitability of rice farming.
─ 81 ─
Since electricity cost is relatively lower than diesel
cost, farmers can reduce milling cost if they use
electricity operated machines. Similarly, rice millers
make a better profit with electricity operated com-
pared to a diesel operated machine. Therefore, a
program aimed at rural electrification is beneficial to
all stakeholders and can play a major role in im-
proving the competitiveness of rice produced by
Ugandan farmers. Clustering of small scale millers as
practiced in the study area is good since the cost of
providing services to clusters is minimized. However,
allocation of a common electricity meter should be
discontinued since some defaulting members are
leading to electricity disconnection which affects the
milling operations of the rest of members. Lower cost
contributes to competiveness to a certain extent and
the rest is covered by high quality.
The quality of Ugandan rice is still low due to poor
postharvest handling and simple milling machines
without cleaning and grading capabilities. The most
critical stage of postharvest handling is drying where
farmers tend to over dry paddy before storage or
milling for fear of rotting which can cause more severe
losses. It is also at the drying phase that foreign
matter mixes with paddy leading to further quality
deterioration as paddy is spread on the bare ground.
If farmers were trustworthy, they would get advance
financial credit from millers to invest in basic drying
equipment like moisture meters and tarpaulin to
improve the quality of their rice. However, farmers’
failure to repay the credit has led to mistrust between
them and their lenders and as a result hampered any
credit advancement. This necessitates strengthening
of the linkages between different chain actors through
vertical coordination. Vertical coordination is essen-
tial in building the relationship and trust between
several actors across the chain which can result into a
win-win scenario for all the participants. As well as
being more profitable to traders, local rice brand Super
is more appealing to consumers compared to imported
brands due to its aromatic attributes. In addition,
Super rice has thick grains which are not easily
broken during milling thereby helping to keep its
quality relatively high. Focusing on promoting Super
rice as a replacement for imported rice and as a
possibility of improving quality is a viable considera-
tion. Also, improving quality will require training of
all value chain actors the required skills. Therefore
the government needs to strengthen the agricultural
extension services.
The development of rice markets in Uganda will
require increasing the competitiveness of Ugandan
rice value chain rather than protecting it through
policies. First, efforts towards strengthening the coor-
dination among actors at the same chain node should
be taken to receive the benefits of economies of scale
and smoothen the internal functioning of the groups.
Second, improving relationships between actors at
different nodes should be facilitated to build trust and
enable intra-chain financing to improve rice quality.
Third, improvement in public services such as rural
electrification to reduce milling costs and rural roads
to allow sellers access many buyers is another viable
option.
Although this thesis tries to employ a holistic ap-
proach of assessing the policies, quality and upgrading
options of Uganda rice markets, many questions re-
main unanswered. In terms of policy, the study finds
that the import tariff has not been helpful. This is
mainly because implementation by member countries
is weak. What is not clear however is what the impact
would be if all member countries were committed to
the policy implementation as stated in the protocol. A
study addressing such scenario would be helpful.
Also, the study indicates that consumers who buy rice
for home consumption consider price while those who
buy for hotel and restaurant business consider quality.
However, it does not go into details of consumer
preferences and willingness to pay for quality rice.
Therefore a study in that area is worth considering. In
Uganda, supermarkets are coming up at a high rate.
Studies about their role on the quality of rice are still
limited and are therefore recommended.
─ 82 ─
審査報告概要
本論文は，ウガンダをはじめとするアフリカにおい
て，商品作物として近年着目されている米産業の生産・
流通構造を，バリュー・チェーン分析の手法を援用して
解明したものである。研究資料の乏しい状況の中で，米
の生産農家，精米業者，流通ブローカー，小売業者，普
及員，政策担当者など，米産業の関連アクターを広範か
つ多数対象として調査を行なった。米産地では小規模な
米農家が多数いるのに対し，ごく少数の流通業者という
買い手独占の市場構造であること，そのため米の品質が
正当に評価されず米農家の収益が抑制されていること，
収穫後の調整作業をどのアクターがどのような方法で行
うのかということが米農家の収益に関わってくること，
東アフリカの共通市場化によって第三国からの米の密輸
が深刻化して，米の価格形成に影響を与えていることな
ど，今後のウガンダにおける米産業の発展にとって重要
な論点を解明した。本論文のオリジナリティは十分あ
り，高い学術的価値を有していると判断できる。
よって，審査員一同は，博士（農業経済学）の学位を
授与する価値があると判断した。
─ 83 ─


Developing the Rice Markets in Uganda：A Value Chain Analysis

東京農業大学博士（環境共生学

宮下, 美香

3786

MIYASHITA, Mika

3787

タイ産発酵食品由来乳酸菌および Staphylococcus 属の多様性評価と特性

東京農業大学博士（バイオサイエンス

北本, 綾

3638

KITAMOTO, Aya

3639

日本人集団を用いたメタボリックシンドローム感受性遺伝子多型の探索

東京農業大学博士（国際バイオビジネス学

BAYARSAIKHAN, Dangaasuren

3662

3663

モンゴル国における小麦生産の生産性に関する経営学的研究

森下, 良一

3626

MORISHITA, Yoshikazu

3627

氏 名 森 下 良 一
学位（専攻分野の名称） 博 士（バイオサイエンス）
学 位 記 番 号 甲 第 710 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 28 年 3 月 20 日
学 位 論 文 題 目 BMAL1/CLOCKによって産生されるサーカディアン転写
リズムに対する細胞内情報伝達因子群の役割の解析
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（農学） 喜 田 聡
教 授・農 学 博 士 河 野 友 宏
教 授・農 学 博 士 千葉櫻 拓
博士（医学） 中 澤 敬 信＊
論文内容の要旨
地球上のほぼ全ての生物は内因的な生物時計（circa-
dian clock）を有しており，生物時計が様々な生命現象
に見られるサーカディアンリズムを産み出している。哺
乳類において，生物時計によるサーカディアンリズム産
生の分子基盤は，時計遺伝子である転写調節因子
BMAL1と CLOCKとのヘテロ二量体による標的遺伝子
のリズム性の転写制御である。現在までに，BMAL1/
CLOCKによる転写活性化を起点とする，転写・翻訳・
翻訳後修飾を介した正と負の転写翻訳フィードバック
ループによってリズム性の遺伝子発現が産生されること
が明らかとなっている。
興味深いことに，BMAL1/CLOCKによるリズム性の
転写制御は生物時計の中枢である視床下部の視交叉上核
（suprachiasmatic nucleus ; SCN）のみならず，末梢
組織にも同様に観察され，SCNはマスタークロックと
して，末梢の生物時計を同調する役割を果たしていると
考えられている。重要なことに，生物時計は光をはじめ
とする外的な刺激や食事などによっても調整されてお
り，生体内外の環境変化を受けて順応することも知られ
ている。以上のように，末梢細胞の生物時計は，SCN
からのトップダウン制御と体内外の環境変化に対する反
応により，個々の転写リズムを調整していることは確か
であるものの，末梢組織の細胞内において転写リズムが
調整を受ける分子メカニズムは不明である。以上の背景
から，本研究では，細胞内情報伝達因子群にフォーカス
し，生体内の環境変化に応じて細胞内で転写リズムが調
節されるメカニズムを解明することを目的とした。
1． BMAL1/CLOCK を介した標的遺伝子の転写制御
機構に対する PI3Kの役割
情報伝達因子群の選択的阻害剤を用いたスクリーニン
グによって，Phosphatidylinositol 3-Kinase（PI3K）
が BMAL1/CLOCK 標的遺伝子 Dbp の mRNA 発現量
を正に制御することが示唆された。PI3Kはイノシトー
ルリン脂質をリン酸化することでセカンドメッセン
ジャーである Phosphatidylinositol 3,4,5- trisphosphate
（PIP3）産生に寄与し，細胞の増殖，生存，糖代謝など
に重要な役割を果たしている。PI3Kは末梢の生物時計
を調節する細胞内メディエーターとしての役割を果たす
ことが示唆されているものの，BMAL1/CLOCKを介し
た転写リズム制御に対する役割は未だ不明である。そこ
で，PI3Kによる BMAL1/CLOCKを介した遺伝子発現
制御機構を解析した。
1-1． BMAL1/CLOCK 標的遺伝子の mRNA 発現レベ
ルに対する PI3K薬理学的阻害の影響の解析
NIH3T3細胞において Dbp mRNA発現レベルに対す
る PI3K 選択的阻害剤（LY294002）添加の影響を解析
した。各細胞の転写リズムを同調させるため，2時間の
50%ウマ血清による処理（血清ショック ; serum shock）
を行った。Serum shock終了時を起点として，6時間毎
に，Dbp mRNA発現レベルを real-time PCR法により
解析した。その結果，過去の報告と一致して，Serum
shock 18時間後をピークとした Dbp mRNA発現変動が
観察された。続いて，この同調系において，Serum
shock時及びその後の培地に LY294002添加し，その影
響を解析した結果，最大濃度（50µM）の LY294002添
加による Dbp mRNA発現量の劇的な低下，さらには，
LY294002による発現量低下の濃度依存性が観察された。
─ 32 ─
＊大阪大学 特任准教授
また，PI3K情報伝達経路下流の基質である Aktのリ
ン酸化レベルを指標にしたウエスタンブロット分析によ
り，本実験系における LY294002の PI3K活性阻害効果
を検証した結果，LY294002の添加により Aktのリン酸
化が消失することが観察され，一方で，total Akt量に
は変化が認められなかったことから，LY294002添加が
PI3Kの活性を阻害していることが示された。以上の結
果から，PI3Kを中心とする情報伝達経路が Dbp mRNA
量を正に制御することで，Dbp mRNAのリズム性発現
制御に貢献することが示唆された。
1-2． Dbp mRNA発現レベルに対する内因性 PI3K触
媒サブユニット p110ノックダウンの影響の解析
PI3Kは触媒サブユニットと調節サブユニットにより
構成され，NIH3T3 細胞では，触媒サブユニットに
p110aおよび p110bの 2種類のアイソフォームが存在
する。そこで，Dbp 発現制御に対する p110a と p110b
の役割を明らかにするため，shRNA を用いて Dbp
mRNA量に対する p110aあるいは p110bのノックダウ
ンの影響を解析した。その結果，p110bのノックダウン
により Dbp mRNA 量の有意な低下が観察されたが，
p110aのノックダウンでは変化が観察されなかった。以
上の結果は，薬理学的解析の結果と一致して PI3K活性
が Dbp mRNA量を正に制御し，特に，この制御に p110b
触媒サブユニットが寄与していることが示唆された。
1-3． Dbp 遺伝子の転写制御に対する PI3K の役割の
解析
PI3Kによる Dbp mRNA量の発現制御の分子機構を
明らかにすることを試みた。まず，Serum shock直後
から LY294002添加を行っても，Serum shockの 18時
間後に Dbp mRNA発現量の顕著な低下が観察された。
従って，1-1で観察された LY294002添加による Dbp
mRNA量の低下は，Serum shock時の転写リズムの同
調が損なわれたためではないことが示唆された。さら
に，LY294002添加による Dbp mRNA発現量の低下は
添加時間の長さ依存的に大きくなったものの，3時間処
理によっても有意な mRNA量の低下が観察された。以
上の結果から，PI3Kが Dbp mRNAの発現量を直接的
に制御すること，特に，LY294002添加後数時間以内で
その影響が現れることから，mRNA合成の早い段階，
すなわち，PI3Kは Dbp遺伝子の転写を制御する可能性
が示唆された。
続いて，Dbp遺伝子の転写制御に対する PI3Kの役割
を明らかにするために，ルシフェラーゼレポーターコン
ストラクトを用いたレポーターアッセイにより，Dbp
遺伝子プロモーターからの転写活性を解析した。その結
果，LY294002添加濃度依存的に Dbp プロモーターか
らの転写量の減少が観察された。さらに，BMAL1/
CLOCKを共発現させた場合には，LY294002添加によ
る Dbp遺伝子プロモーターからの転写活性の低下率が
より大きくなることが観察された。また，BMAL1/
CLOCK標的遺伝子 Per2遺伝子プロモーターのレポー
ターアッセイにおいても同様の結果が観察された。従っ
て，PI3K が BMAL1/CLOCK を介して Dbp 遺伝子プ
ロモーターの転写活性を正に調節することが示唆され
た。
次に，PI3K による BMAL1/CLOCK を介した Dbp
遺伝子の転写制御機構を明らかにするため，BMAL1抗
体および CLOCK 抗体を用いた Chromatin Immuno-
precipitation(ChIP)-qPCR 解析により，Dbp 遺伝子内
で E-box がそれぞれ存在する２つの領域（プロモー
ター領域と 2nd intron 領域）への BMAL1/CLOCK の
結合に対する PI3K の役割を解析した。その結果，
BMAL1抗体および CLOCK 抗体によるこれら E-box
領域の特異的沈降が検出され，LY294002の添加はこれ
らの特異的沈降を阻害することが観察された。一方，
E-box 配列が存在しないネガティブコントロール領域
（Clock exon6）では，各抗体による特異的沈降は観察さ
れなかった。従って，PI3K は BMAL1/CLOCK の E-
box配列への結合を正に制御することが示唆された。
1-4． BMAL1/CLOCKの二量体形成に対する PI3Kの
役割の解析
BMAL1と CLOCKはヘテロ二量体を形成した後に，
DNA上の E-box配列に結合するため，PI3Kがこのヘ
テロ二量体を制御する可能性がある。そこで，共免疫沈
降解析および GAL4 one-hybrid assay により BMAL1
と CLOCK の二量体形成に対する PI3K 活性阻害の影
響を解析した。共免疫沈降解析の結果，NIH3T3細胞に
強制発現させたMyc-BMAL1とMyc-CLOCKとの発現
レベルに LY294002添加の影響は観察されなかった一方
で，BMAL1と CLOCKの共沈降効率は有意に低下する
ことが観察された。この結果に一致して，GAL4 one-
hybrid assayでは，GAL4 DNA結合ドメインを融合さ
せた BMAL1あるいは CLOCKが GAL4応答領域を介
してプロモーター上に結合した条件下において，
LY294002添加により BMAL1/CLOCKを介した転写活
性化が阻害されることが観察された。従って，PI3Kが
BMAL1と CLOCKのヘテロ二量体形成を促進すること
が示唆された。
1-5． 結論及び考察
以上より，PI3Kは Dbp mRNA量を正に制御し，さ
─ 33 ─
らに，このメカニズムとして，PI3K は，BMAL1 と
CLOCKのヘテロ二量体化，その後の Dbp遺伝子プロ
モーター領域の E-box配列への結合を正に制御するこ
とが示された。以上の結果から，PI3K情報伝達経路が
BMAL1/CLOCK を標的として Dbp 遺伝子の転写リズ
ムを制御すると結論した。
2． BMAL1/CLOCK を介した標的遺伝子の転写制御
機構に対する CRESTの役割
Calcium Responsive Transactivator（CREST）は，
細胞内 Ca2+濃度上昇依存的に活性化される転写仲介因
子であり，胎児期における神経細胞の樹状突起の発達に
必須であることや，成長後も海馬，小脳，及び嗅球で発
現していることが報告されている。所属研究室では，
CRESTのノックダウンにより BMAL1/CLOCK標的遺
伝子群の発現量が低下すること，さらに，CREST が
Per1のプロモーター活性を正に制御することが発見さ
れ，CREST が BMAL1/CLOCK の転写コアクチベー
ターとして機能することが示唆されている。そこで，
CRESTがカルシウムイオン情報伝達経路の下流因子と
して外因的なシグナルを BMAL1/CLOCK転写制御に媒
介するとの仮説を立て，本研究では，この仮説の検証と
して，分子生物学的手法，マウス遺伝学的手法を用い
て，BMAL1/CLOCK を介した転写制御機構に対する
CRESTの役割の解明を試みた。
2-1． 共免疫沈降法を用いた BMAL1/CLOCKと CREST
との相互作用解析
NIH3T3細胞に CLOCK，BMAL1及び CRESTを強
制発現させた場合には，CLOCK抗体および BMAL1抗
体を用いた共免疫沈降によって，CRESTが沈降するこ
とが観察された。この結果に一致して，CREST抗体を
用いた免疫沈降によって BMAL1および CLOCKが共
沈降することが観察された。従って，CRESTと BMAL1/
CLOCKが直接的あるいは間接的な相互作用を介して，
複合体内に存在することが示唆された。
2-2． in vivo ChIP-qPCRを用いた BMAL1/CLOCK標
的遺伝子群のプロモーター領域への CRESTの結合状態
の解析
マウス海馬から調製したクロマチン産物を用いて in
vivo ChIP-qPCR を行った。過去の報告に一致して，
CREST抗体によって c-fosプロモーター領域の特異的
免疫沈降が確認された。重要な点として，同様に，
Control IgG に比較して CREST 抗体による Dbp 及び
Per1遺伝子の E-boxを含むプロモーター領域の特異的
沈降が観察された。一方，E-boxを含まないネガティブ
コントロール領域では特異的沈降は確認されなかった。
従って，BMAL1/CLOCK標的遺伝子群の E-box領域に
CRESTが存在することが示唆された。
2-3． Crest コンディショナルノックアウト（cKO）マ
ウスの作製と解析
2-3-1 Crest 遺伝子コンディショナル変異マウスの作
製
loxP配列を Crest遺伝子の exon4と 5の 5’側及び 3’
側に挿入させた Crest-floxマウスを作製した。この flox
マウスを全身で Cre-recombinaseを発現する CAG-Cre
マウスあるいは大脳皮質，海馬，嗅球の興奮性ニューロ
ン特異的に Cre-recombinaseを発現する Emx1-Creマ
ウスと交配させた。loxP配列の組込みと Crest exon4-5
の欠失は尾より調製したゲノム DNAあるいは前脳より
調製したmRNAの解析により確認した。野生型（WT）
マウスと比較して，CREST 遺伝子ヘテロ欠損を示す
Crest-flox/CAG（+/-）マウスの海馬では，約 50% の
CREST mRNA発現量が観察され，一方，Emx-1特異
的 CREST遺伝子ホモ欠損コンディショナル変異マウス
Crest-flox/Emx1-Cre（-/-）の海馬では，約 10% 程度
の CREST mRNA 発現量が観察され，CREST 遺伝子
の欠損が発現レベルで確認された。
2-3-2 Crest遺伝子 exon4-5の欠失により産生される
⊿CRESTの機能解析
CREST-flox遺伝子座からは，loxP配列の組み換えに
よる exon 4と 5の欠失後には，exon3と 6が連結され
た mRNAが産生され，この場合，フレームシフトによ
り exon6内に現れる stopコドンまでの 240bpがアミノ
酸に翻訳されることが予想される。まず，CREST変異
マウスから調製した total RNAを用いて cDNAを作製
し，⊿CRESTをクローニングして，塩基配列を確認し
た。その結果，予想と一致して，exon3と exon6が連
結され，フレームシフトのために予想される位置に終止
コドンが出現するmRNAが転写されていることが確認
された。さらに，GAL4 one-hybrid assay を用いて
BMAL1/CLOCKを介した転写活性化能に対する⊿CREST
共発現の影響を解析した結果，⊿CREST の共発現は
BMAL1/CLOCKによる転写活性化に影響を与えないこ
とが観察され，⊿CRESTは BMAL1/CLOCKに対する
コアクチベーターとして機能しないことが示された。
2-3-3 Crest変異マウス海馬における BMAL1/CLOCK
標的遺伝子発現量の解析
BMAL1/CLOCKによる発現制御に対する CRESTの
欠損の影響を解析するため，real-time PCR 法を用いて
12h/12hの明暗周期下で飼育した Crest-flox/CAG（+/-）
─ 34 ─
マウスの海馬の発現解析を行った結果，WTマウスに比
較して，Dbp及び Per1の mRNA発現量並びに，その
リズム性発現にはヘテロ欠損の影響は観察されなかっ
た。この理由として，ヘテロ欠損による CREST発現量
の約 50%の低下は BMAL1/CLOCKの標的遺伝子の発
現に影響を及ぼさない可能性が考えられた。
2-4． 結論及び考察
本研究により，CRESTは E-box上で BMAL1/CLOCK
と複合体を形成し，時計遺伝子群の転写制御に貢献する
ことが示唆された。また，Crest遺伝子コンディショナ
ル変異マウスの作製に成功した。今後，この Crest 変
異マウス群を用いた RNA-seq，あるいは ChIP-seq に
より，CREST 標的遺伝子群を網羅的に探索すること
で，サーカディアン転写リズム制御機構の分子基盤の解
明に貢献できると考えられた。
3． 総 括
本研究結果から，PI3Kによる BMAL1/CLOCKを介
したリズム性転写調節機構の存在が初めて明らかとな
り，また，CREST が Ca2+情報伝達下流因子として
BMAL1/CLOCKを介する転写を調節することが示唆さ
れた。以上のように，本論文において，細胞内情報伝達
因子群による BMAL1/CLOCKを介した転写リズム調節
機構の一端が明らかとなった。
審査報告概要
哺乳動物の有する約 24時間周期の生物時計は，多様
な外部環境の変動に適応しているものの，細胞レベルの
転写リズムが外的シグナルに順応する細胞内分子機構は
未だ不明である。本研究では，この外的シグナルに応じ
たリズム性転写調節機構の分子基盤を理解するために，
外的シグナルを媒介する細胞内情報伝達因子群を同定
し，これら因子群により BMAL1/CLOCKによる転写制
御を調節する分子機構の解明を試みた。まず，情報伝達
因子群の選択的阻害剤を用いたスクリーニングから，
Phosphatidylinsositol 3-Kinase が BMAL1/CLOCK の
二量体化を促進して，BMAL1/CLOCK標的遺伝子 Dbp
のプロモーター上への誘引が促進されることにより，
DBP mRNA発現量が正に制御されることを示した。続
いて，カルシウムイオン情報伝達因子である転写因子
CREST が BMAL1/CLOCK と同一複合体を形成し，
BMAL1/CLOCK標的遺伝子群のプロモーターに誘引さ
れることを示した。以上，本研究において，細胞内情報
伝達因子群による BMAL1/CLOCKを介した転写リズム
調節機構の一端が明らかとなった。
主査および副査から審査報告がなされ，専攻内可否を
審議した。その結果，学位請求者の経歴や学術業績が学
位記申請の要項を満たしていること，外国語を含む最終
試験に合格していること，学位請求論文の研究内容や発
表会での質疑応答の内容が十分であることが認められ
た。
よって，審査員一同は博士（バイオサイエンス）の学
位を授与する価値があると判断した。
─ 35 ─


BMAL1/CLOCKによって産生されるサーカディアン転写リズムに対する細胞内情報伝達因子群の役割の解析

志賀, 孝宏

3632

SHIGA, Takahiro

3633

氏 名 志 賀 孝 宏
学位（専攻分野の名称） 博 士（農芸化学）
学 位 記 番 号 甲 第 712 号
学 位 授 与 の 日 付 平成 28 年 3 月 20 日
学 位 論 文 題 目 Megalin依存性エンドサイトーシスのビタミン B12欠乏に
起因する阻害機構の解析
論 文 審 査 委 員 主査 教 授・農 学 博 士 山 本 祐 司
教 授・博士（農芸化学） 内 野 昌 孝
教 授・博士（農学） 阿 部 尚 樹
博士（農芸化学） 真 野 博＊
論文内容の要旨
背 景
ビタミン B12（コバラミン）は，主にメチオニン合成
酵素とメチルマロニル CoAムターゼの補酵素として機
能しており，肝臓と腎臓を含む抹消組織に貯蔵されてい
ることが知られている。ビタミン B12は，高等動物にお
いて葉酸やビタミン B6といった水溶性ビタミンと相互
作用することで，アミノ酸代謝などに重要な役割を果た
している微量栄養素である。
食餌性由来のビタミン B12は胃においてハプトコリン
（HC）と結合し，腸管において内因子（IF）と結合す
ることにより体内へと吸収される。また，他の経路とし
て腸管において微生物により合成され生体内へと吸収さ
れることも報告されている。その後，血液中にて結合タ
ンパク質であるトランスコバラミンⅡ（TCⅡ）と結合
することで末梢組織へと輸送される。体内を循環したビ
タミン B12は，腎臓の近位尿細管にて再吸収され，尿中
への漏出が防がれることで生体内での再循環が行われ
る。このような機構が存在することにより生体内におけ
るビタミン B12の恒常性が維持されている。このよう
に，腎臓は尿の排出器官としての機能だけではなく，近
年の研究報告により肝臓に次ぐ第二の栄養貯蔵器官とし
ての機能も認知されるようになった。
腎臓におけるビタミン B12の再吸収に関わるタンパク
質としてmegalinが同定された。megalinは分子量 600
kDaの非常に大きな膜タンパク質であり，ビタミン B12
のみならずビタミン Aやビタミン Dといった化学的構
造が異なるビタミン，さらにはアルブミンなどの生体内
に重要なタンパク質をリガンドとし，細胞内へ取り込む
機構を持つ膜貫通タンパク質である。従来の報告では，
megalinの機能は細胞質側に存在する結合タンパク質に
よって制御されていることが示されているが，細胞外部
に存在するリガンド自体が megalinの制御機構に関わ
るかは依然不明である。そこで，数多のリガンドの中で
ビタミン B12が他の臓器と比較して腎臓に多く含有され
ていることから，ビタミン B12が megalin を介したエ
ンドサイトーシスの制御因子になり得ると著者らは予想
した。
本研究は，ビタミン B12欠乏モデルラット及び培養細
胞を用いて腎臓における megalinを介した再吸収機構
に着目し，1）ビタミン B12欠乏ラットにおける免疫染
色を用いたmegalinの局在の解析，2）蛍光染色を用い
たmegalinを介するリガンドの取り込みの観察，3）培
養細胞を用いたメチルマロン酸（MMA）存在下におけ
る megalin を介したエンドサイトーシスの解析，4）
megalin 変異体を用いた細胞外ドメインと MMA の関
連性の解析，上記 4課題に着目し生化学的手法及び分子
生物学的手法により解析を行った。
ビタミン B12欠乏モデル動物の作成
Wistar系 10週齢の雌雄ラットを用い，妊娠・授乳期
を通じてビタミン B12欠乏飼料を給餌した雌親ラットか
ら出生した雄ラットを実験に使用した。この雄ラットを
離乳後，対照群，ビタミン B12欠乏群，1 day-Cyano
B12（CNB12）群，7 days-CNB12群の 4群に分けて 100
日間飼育した。対照群は，ビタミン B12欠乏飼料で飼育
し，CNB12（1µg/日）を毎日投与した。ビタミン B12欠
乏群は，ビタミン B12欠乏飼料で飼育した。1 day-
CNB12群は，ビタミン B12欠乏飼料で飼育し，飼育終
了 1 日前に CNB12（1µg/日）を投与した。7 days-
CNB12群は，ビタミン B12欠乏飼料で飼育し，飼育終
─ 40 ─
＊城西大学薬学部 医療栄養学科 教授
了 7日間前に CNB12（1µg/日）を投与した。飼育終了
後，血液を採取するとともに，腎臓を摘出し解析に用い
た（岡山大学教育学部との共同研究）。血中ビタミン
B12濃度を測定した結果，ビタミン B12欠乏群において
有意に減少した。また，飼育終了前にビタミン B12を供
給することによって投与回数依存的に血中のビタミン
B12濃度が回復することを確認した。
1）ビタミン B12欠乏時における megalinへの影響の解
析
megalinは，近位尿細管を構成する管腔形質膜上皮細
胞に存在しており，複数のリガンドと結合することで
様々な栄養素を取り込むスカベンジャー受容体である。
具体的には，ビタミン B12を取り込む際には，輸送タン
パク質である TC Ⅱが megalin に結合することで，細
胞内部へとクラスリン依存エンドサイトーシスにより取
り込まれる。その後，取り込まれたビタミン B12は腎臓
内で一部が貯蔵され，残りは基底膜を介し血液中へと再
循環される。
細胞外部に存在するビタミン B12が枯渇することに
よってmgalinの局在が変動するかを確認するため，著
者らはmegalin抗体を用いた腎臓の免疫染色を行った。
その結果，対照群では megalinの陽性像が近位尿細管
細胞内に拡散していることが観察されたのに対して，ビ
タミン B12欠乏群では近位尿細管の管腔膜に密集して局
在していることが観察された。一方で，ビタミン B12を
再供給した群においては，管腔側に密集しておらず対照
群と同様に megalinの陽性像は拡散していた。次に，
ビタミン B12量の変動が megalinの発現量に影響を与
えているかを確認するため，WB及び qPCR法を用い
て定量を試みた。しかしながら，タンパク質及びmRNA
量においては各群での有意な差は認められなかった。こ
れらの結果を踏まえてビタミン B12は megalinの発現
を調節しているのではなく megalinの局在を制御して
いる可能性が示唆された。また，ビタミン B12欠乏群に
おいて管腔膜に megalinが密集して細胞内に拡散して
いないことから，ビタミン B12がエンドサイトーシスの
機能を制御する一要因であることが推察された。
2）megalinを介したビタミン Aの取り込みの解析
megalinは，ビタミン B12以外にも化学的分類が異な
るビタミン Aの取り込みも行うことが報告されている。
具体的には，ビタミン Aの結合タンパク質であるレチ
ノール結合タンパク質（RBP）が megalinを介したエ
ンドサイトーシスにより取り込まれる。
そこで，著者らは RBPの取り込みがビタミン B12濃
度に依存していると考え，共焦点顕微鏡を用いて RBP
と megalinの細胞内局在性の観察を行った。対照群に
おいて，近位尿細管細胞内に RBPの小胞が多量に観察
されたことから megalinを介したエンドサイトーシス
により正常に取り込まれている事が確認された。しかし
ながら，ビタミン B12欠乏群においては megalin と
RBPが管腔膜に留まり共局在していることから管腔膜
上で RBPの取り込みが抑制されていることが示唆され
た。一方で，ビタミン B12が再供給されるとこの共局在
は緩和され，大部分の RBPが細胞内部へと取り込まれ
ていることを見出した。これらの結果からビタミン B12
が低下すると，megalin の局在が尿細管管腔側に蓄積
し，RBPを含む他のリガンドの取り込みも抑制される
ことを推察した。さらに，腎臓での RBPの取り込みが
減少したことにより，再循環がされず血中の RBP及び
ビタミン A濃度も顕著に減少することを明らかにした。
また，ビタミン B12を再供給した結果，血液中の RBP
及びビタミン A濃度が回復した。以上の結果を踏まえ
て，ビタミン B12の低下は腎臓内の megalin を介した
エンドサイトーシスの抑制を通じて血液中への再循環も
低下させることが示唆された。
興味深いことに，このような megalinを介したエン
ドサイトーシスの機能不全はビタミン A欠乏ラットに
おいては確認されなかった。これらの結果より，mega-
linを介したリガンドの取り込みにはビタミン B12が重
要な役割を果たしていることを見出した。
3）MMAがmegalinの細胞内移行の阻害を行う
ビタミン B12欠乏時，メチルマロニル CoAムターゼ
の機能不全が引き金となり多量の MMAが尿中へと排
出されることが知られている。ビタミン B12欠乏モデル
ラットにおいても，尿中に多量の MMAが排出されア
シドーシスが誘導されることを確認している。そこで，
著者らはビタミン B12欠乏時に産生された高濃度の
MMA が megalin を介したエンドサイトーシスを抑制
する可能性について検討した。MMAの濃度変化や添加
時間による megalin の挙動を観察するため，megalin
を高発現するラット胚由来の細胞である L2 Yolk Sac
cells（L2 cells）を用いて解析を行った。一般的に，培
養細胞における受容体を介したエンドサイトーシスは氷
冷により一時的に停止し細胞膜上へと滞留する。その
後，細胞を 37℃でインキュベートをすることで細胞膜
上から細胞内へとエンドサイトーシスが再開することか
ら，この手法を用いて MMA の有無における megalin
を介したエンドサイトーシスの挙動を検討した。L2
cellsを用いた従来の報告では，氷冷によるエンドサイ
トーシスの停止から 37℃で 15分間インキュベートした
─ 41 ─
後に megalinは細胞膜からエンドソームへと移行し，
30分後には再び膜へとリサイクリングされることが示
されている。MMA 存在下においては，15分後に一部
の megalinが濃度依存的にエンドソームに移行せず，
細胞膜上に滞留していることが観察された。さらに，細
胞膜上に滞留していることを確認するため，細胞膜上で
結合するアダプタータンパク質であるクラスリン及び
Disable2（Dab2）との共局在を検討した。その結果，
従来の報告では 15分後においては，アダプタータンパ
ク質と結合しないことが示されているのにも関わらず，
MMA 存在下においては megalin とともに細胞膜上で
共局在していることが観察された。また，HEK293T細
胞に FLAG-Dab2と HA-megalinを導入し MMAを 15
分間処理した後に免疫沈降法において両者の結合を確認
したところ，MMA 添加した細胞においては Dab2と
megalinが強固に結合していることを見出した。
次に著者らは，MMA添加においてアダプタータンパ
ク質と megalinが共局在していることから細胞膜表面
上に滞留している megalin の量を確認するため，sur-
face biotinylation assay を用いて解析を行った。sur-
face biotinylation assay とは細胞に sulfo-NHS-biotin
を細胞に処理することで細胞表面上に存在するタンパク
質及び細胞膜をビオチン標識し，アビジンビーズを用い
て精製することで細胞表面上に存在しているタンパク質
を検出する方法である。しかしながら予想に反し，
MMA 存在下において細胞膜上の megalin の量は非存
在下に比べて有意に減少していることが示された。この
結果より，megalinは細胞膜上に滞留しているのではな
く，細胞膜直下いわゆるエンドソームに到達するまでの
初期形成クラスリン小胞に蓄積していることが強く示唆
された。また，細胞表面上の megalinが減少している
ことから MMAは megalinを介したエンドサイトーシ
スを抑制するとともに細胞膜へのリサイクリング機構に
も影響を及ぼす可能性が示唆された。
著者らは，MMA以外の有機酸としてケトアシドーシ
スを誘導する b-ヒドロキシ酪酸（B-OH）や MMA が
引き起こすアシドーシスの尿中環境を擬似的に再現した
酸性環境下においても megalin を介したエンドサイ
トーシスには MMAを添加したような変化は認められ
なかった。これらの結果より，高濃度の MMA が存在
することにより細胞膜上に megalinが滞留しエンドサ
イトーシスは抑制されることが示唆された。さらに，こ
のエンドサイトーシスの抑制は MMA特異的であるこ
とを見出した。
4）MMAが megalinの ligand binding domain に与え
る影響の解析
megalin を介したエンドサイトーシスが MMA に
よって抑制されることが示唆されたことから，次に
MMA が megalin のどのドメインに影響を与えること
でエンドサイトーシスを抑制しているかについて解析を
行った。そこで，N末端側に存在する complement-like
repeat（LDLa），EGF-like repeat，YWTD motif の三
つのドメインを含む ligand binding domain（LBD）と
いう細胞外ドメインに着目した。LBD 内に存在する
EGF-like repeat及び YWTD motifはエンドサイトーシ
ス後に細胞内にてリガンドと解離する上で非常に重要な
ドメインであることが報告されている。そこで，LBD
内のどのドメインが MMAの影響を受けるのかを解析
するために，エンドサイトーシスの機能を維持し，さら
に HA-tagを付加した mini-megalin（HA-WT）の発現
プラスミドを作製するとともに，各ドメインを欠失させ
たプラスミド（HA-del.LDLa，HA-del.EGF，HA-del.
YWTD）の構築を行った。その後，L2 cellsに各プラス
ミドを導入した後にMMA処理を 15分間行い，HA抗
体を用いた免疫染色に供することで megalinの細胞内
局在を解析した。その結果，MMA存在下の HA-WTは
巨大な小胞に局在することが観察された。これは，細胞
膜直下に megalin を含む多量のクラスリン小胞が留
まっているためにこのような megalinとの共局在が観
察されたものと考えられた。HA-del.LDLa 及び HA-
del.EGFにおいても MMAを添加することにより同様
に巨大な小胞とともに局在することが確認された。しか
しながら，HA-del.YWTD においては MMA 存在下及
び非存在下において megalinが局在する小胞の大きさ
には差異は見られなかったことから，MMAは YWTD
motif に作用して megalin をクラスリン小胞に留まら
せ，エンドサイトーシスのサイクルを破綻させているこ
とが示唆された。最後に，MMAにより誘導された巨大
な小胞にはリガンドが含まれているかを Alexa488-BSA
を用いて観察を行った。その結果，MMA存在下におけ
る巨大な小胞においても微量であるが，リガンドを有し
ていることが観察された。これらの結果より，megalin
を介したリガンドの取り込みの低下に加え，エンドソー
ムに到達できずリガンドの解離が行われないことが考え
られる。
総 括
従来，腎臓は尿の排出器官として位置づけられていた
が，栄養素の再吸収に関わり生体内の恒常性維持に重要
─ 42 ─
な臓器であることが認知されるようになってきた。その
中でも，複数の栄養素の再吸収を行う megalinは様々
な栄養素の恒常性に貢献している。本研究では，mega-
linを介したエンドサイトーシスにおけるビタミン B12
の制御に焦点を当て解析を行った。本研究によって，ビ
タミン B12欠乏モデルラットを用いた in vivo解析にお
いて，1）ビタミン B12欠乏状況下では megalinが尿細
管管腔膜上に蓄積すること，2）megalinの管腔膜の蓄
積によりビタミン B12と同様の機構で取り込まれる
RBPの取り込みが抑制されることを明らかにした。以
上のことから，megalinを介したエンドサイトーシスに
はビタミン B12が重要である。また，L2 cells を用いた
in vitroの解析において 3）megalinを介したエンドサ
イトーシスはビタミン B12欠乏時に産生されるMMAに
より阻害される。4）megalinの細胞外ドメインである
YWTD motif に MMAが作用することで，細胞膜直下
のクラスリン小胞に megalinが多量に存在することを
見出した。
本研究により，ビタミン B12欠乏時に産生される
MMA が megalin の機能を負に調節する新たな機構を
発見したとともに，微量栄養素であるビタミン B12は
megalin を介したエンドサイトーシスのリガンドであ
り，megalinの制御因子の一つでもあることを示した。
審査報告概要
本研究は，ビタミン B12の新たな機能の探索に焦点を
おき，腎臓内の近位尿細管に存在する megalinを介し
たエンドサイトーシスがビタミン B12濃度に依存し制御
されていることを明らかにした論文である。その結果，
ビタミン B12欠乏時に産生されるメチルマロン酸が
megalinの細胞内部への移行を抑制することによって機
能不全を引き起こすことを明らかにした。本研究によ
り，ビタミン B12欠乏時に産生される有機酸がmegalin
の機能を負に調節する新たな機構を発見したとともに，
微量栄養素であるビタミン B12は megalinを介したエ
ンドサイトーシスの制御因子の一つであることを明らか
にした。
よって，審査員一同は博士（農芸化学）の学位を授与
する価値があると判断した。
─ 43 ─


Megalin依存性エンドサイトーシスのビタミンB12欠乏に起因する阻害機構の解析

藤田, 裕

3634

FUJITA, Yutaka

3635

茨城県の黒ボク土ナシ園における堆肥施用および施肥改善が地下水・土壌・大気環境に及ぼす影響

Not a member yet