Tokyo University of Agriculture Repository / 東京農業大学リポジトリ

鈴木, 駿也

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Suzuki, Shunya

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氏 名   鈴 木 駿 也 
学位（専攻分野の名称）   博 士（農芸化学） 
学 位 記 番 号   甲 第 843号 
学位授与の日付   令和 3年 9月 30日 
学 位 論 文 題 目   Ligilactobacillus agilisの動物腸管内での生存における運動性 
および走化性の役割 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・農 学 博 士 五十君 靜 信 
               教 授・博士（醸造） 遠 藤 明 仁 
               教 授・博士（獣医） 梶 川 揚 申 
               准 教 授・博士（バイオサイエンス）  佐 藤 拓 海 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
乳酸菌は一般的にヒトや動物の腸管内に生息し，宿主の健康に寄与する共生細菌として知
られている。これら乳酸菌の大部分は非運動性であるが，一部はべん毛を持ち運動性を示す。
しかし，運動性乳酸菌に関する知見は少なく，どういった動物種の腸管に共生するのか，な
ぜ運動性を示すのか，さらにはどのような物質を感知し，遊走するのか（走化性）など，生
態については不明な点が多い。本研究では運動性乳酸菌の検出・分離法を検討し，その宿主
域を調査した。また，多様な動物種の腸管に生息することが判明した運動性乳酸菌
Ligilactobacillus agilis において，運動性・走化性が腸管内で果たす役割を明らかにするこ
とを試みた。 
まず多様な動物由来の糞便を対象に運動性乳酸菌の選択的な検出・分離を試みた。運動性
乳酸菌 15 菌株の運動性関連遺伝子群を対象に相同性比較及びアライメント解析を行い，保
存性が高かった fliG を標的遺伝子としてプライマーを作製した。このプライマーを用いて
糞便試料から抽出した DNA を鋳型に PCR を行ったところ，44/120 の試料で fliG 遺伝子の
増幅が確認された。次に，45 の糞便試料を軟寒天 MRS 培地に穿刺・培養後，運動性によ
り培地中に拡散した菌体の分離を試みた。その結果，七面鳥やリスザルなど新規の分離源を
含む 8 つの試料から L. agilis を，1 つの試料から Ligilactobacillus ruminis を分離した。
これらの結果から，L. agilis が広く恒温動物の腸管内に共生していることが明らかとなった。 
L. agilis において運動性が宿主腸管への定着に寄与するという仮説に基づき，その検証を
行った。べん毛のモータータンパク質 MotB のアミノ酸置換により，運動性を欠失した L. 
agilis 変異株を作製した。ストレプトマイシンの投与により競合する腸内細菌の生育を抑制
させた Balb/c マウスへ，運動性と非運性 L. agilis をそれぞれ経口投与し，糞便中の各 L. 
agilis の菌数を経日的に測定した。その結果，運動性を保持する方が糞便中の菌数は高い傾
向にあった。また，無菌マウスにおいても同様の腸管定着性試験を行ったところ，運動性の
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有無で糞便中の菌数に変化は無かった。一方，腸管における各 L. agilis の局在を調べた結
果，回腸の粘液層でより多くの運動性 L. agilis が検出された。これらのことから，他の腸
内細菌が存在する腸管内で，L. agilis は運動性により粘液層へと移動し，定着性を向上させ
ていることが推察された。 
L. agilis の腸管定着に運動性の関与が示唆されたため，走化性試験により L. agilis の腸
管由来物質に対する走化性を調べた。その結果，L. agilis は細胞傷害性を示す胆汁酸の構成
成分や低 pH，腸内細菌が産生する短鎖脂肪酸から忌避する一方で，粘液の主成分であるム
チンへ遊走することが分かった。また，腸管由来の非運動性乳酸菌 3 菌種と L. agilis の酸
や胆汁酸に対する耐性を調べたところ，非運動性乳酸菌と比べて L. agilis の酸・胆汁酸耐
性は低かった。これらのことから，L. agilis は走化性により他の腸内細菌や酸・胆汁酸から
逃れて粘液層へと向かうことで，腸管内での生存・定着性を向上させていることが示唆され
た。続いて，走化性物質を認識する受容体の同定を試みた。L. agilis ゲノム上には推定走化
性受容体遺伝子が 5 つ（mcp1～mcp5）存在し，これらをそれぞれもしくは全て欠失させた
L. agilis を用いて走化性試験を行った。その結果，胆汁酸構成成分に対する走化性は Mcp1
または Mcp2 欠損株で減弱した一方で，その他の物質に対する走化性は何れの Mcp 欠損株
でも野生株と同程度であった。また，5 つの MCP 遺伝子を欠失した株では何れの物質に対
しても走化性を示さなかった。これらの結果から，少なくとも Mcp1 と Mcp2 が胆汁酸構成
成分への走化性に関与し，その他の走化性には Mcp1 から Mcp5 の複数の Mcp が補完的に
関与することが示唆された。 
これまでの研究より，非運動性乳酸菌は酸や胆汁酸には耐性を示し，腸粘膜に接着するこ
とで腸管内に定着すると考えられている。一方，本研究では運動性乳酸菌 L. agilis が運動
性・走化性を利用し，酸や胆汁酸からは逃れ，粘膜深部へと遊走することで定着性を高めて
いることが推察された。本研究を通じて，運動性乳酸菌が多様な動物腸管内に生息している
こと，さらには非運動性乳酸菌とは異なり運動性を駆使した生態をもつであろうことが示さ
れた。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
乳酸菌は一般的に非運動性であるが，一部はべん毛を有し運動性を示す。これらの運動性
乳酸菌については過去の知見に乏しく，その生態や運動性を示す意義については不明である。
本研究では，この運動性乳酸菌のうち動物腸管内に共生する Ligilactobacillus agilisに
焦点を当て，その運動性および走化性が当該生物の生態においてどのような役割を果たすか
を明らかにすることを目的とした。まず，様々な動物糞便中から L. agilisを効率よく分離
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する手法を確立した。また，運動性欠損変異株を使用して，運動性が動物腸管定着に関わる
ことを動物実験で示した。走化性に関しては，腸管由来成分の酸・胆汁酸や腸内細菌由来の
有機酸から忌避する一方，粘膜成分のムチンに対しては誘引されることが見出された。さら
に，走化性受容体欠損変異株を構築し，走化性試験を行うことで走化性因子に対応する受容
体を一部同定することに成功した。これらの成果は，これまで病原性との関連を中心に議論
されてきた運動性が，腸内共生においてどのような意義を持つのかを明らかにするうえで極
めて重要な知見となるものであり，農芸化学分野における重要な成果となった。審査員一同
はこれらの学術的成果に対し，博士（農芸化学）の学位を授与するに値すると判断した。 


Ligilactobacillus agilisの動物腸管内での生存における運動性および走化性の役割

富田, 駿

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TOMITA, Shun

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氏 名   富 田  駿 
学位（専攻分野の名称）   博 士（農芸化学） 
学 位 記 番 号   甲 第 811号 
学位授与の日付   令和 3年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   きのこを腐敗させる毒素 tolaasin に対する Microbacterium 属細 
菌による解毒機構 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 横 田 健 治 
               教 授・農 学 博 士 五十君 靜 信 
               教 授・博士（農学） 篠 原 弘 亮 
               教 授・博士（農学） 對 馬 誠 也 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
研究背景 
きのこ腐敗病は Pseudomonas tolaasii を病原菌とする細菌病であり，広範な食用きのこに
対して，子実体の褐変・腐敗を生じることから，国内外の原木および菌床きのこ栽培におけ
る重要病害である。P. tolaasii が分泌生産する tolaasin は，本病害の毒素成分として知られ
ており，病徴を引き起こす原因物質として同定されている。Tolaasin はオクタデカペプチド
と β-ヒドロキシオクタン酸から構成され，Thr14 残基の水酸基と Lys18 のカルボキシ基がエ
ステル結合した環状構造を形成する環状リポペプチド（以下，cLP）である。 
国内では，きのこ細菌病全般に対する登録農薬はなく，その防除には栽培環境の管理が唯
一の策となっているため，野外で栽培を行う原木栽培ではその管理がままならない状況にあ
る。一方で，環境影響負荷が小さく収穫間際の子実体に対しても施用できるなどの利点から，
本病害に対しては生物農薬の開発が期待されており，これまでに本病害に対して防除活性を
示す微生物株の探索が世界各国で行われてきた。本病害の生物防除を目的とした研究事例
には，病原菌 P. tolaasii に対して生育阻害活性を示す拮抗微生物やバクテリオファージの選
抜や機能解析が散見されるが，実用化には至っていない。 
共同研究者の篠原は，本病害に対する新たな生物防除戦略として，tolaasin の無毒化によ
る生物防除法を考案し，健全なシイタケ子実体を分離源として tolaasin 解毒活性を示す数種
の有用菌株を分離した。実用的な生物農薬の開発には，病害抑制効果をより高めるために，
その有用生物の病害抑制機構を理解することが必要となる。そこで本研究では，有用分離菌
株の中でも，とりわけ高い tolaasin 解毒能を示した Microbacterium 属細菌について，tolaasin
解毒機構を解析した。 
 
 
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１. Microbacterium sp.  K3-5 による tolaasin 解毒機構 
Microbacterium sp. K3-5（以下，K3-5）は，シイタケ子実体から分離された tolaasin 解毒菌
株である。K3-5 培養液へ tolaasin を添加すると，上清中の tolaasin を高効率に除去する。本
菌の tolaasin除去機構を明らかにするため，K3-5培養液を菌体懸濁液と培養上清に分け，各々
の tolaasin 除去活性を評価した。K3-5 の tolaasin 除去活性は菌体懸濁液のみに認められ，培
養上清には活性が認められなかった。そして，菌体懸濁液処理後の上清を LC-MSMS により
分析したところ，tolaasin の分子内環状構造となる Thr14 残基の水酸基と Lys18 のカルボキ
シ基間のエステル結合を加水分解し，開環した生成産物が同定された。K3-5 菌体処理によ
る tolaasin 解毒能をジャガイモ塊茎切片の褐変化およびエノキタケ(Flammulina velutipes )に
対する抗真菌活性を指標とした生物検定により評価したところ，顕著な解毒効果が確認され
た。以上の結果から，K3-5 の tolaasin の解毒機構は，K3-5 菌体で tolaasin を加水分解し，生
成産物を上清へ移行することを特定した。cLP の生分解については，surfactin 及び daptomycin
について，各々，Streptomyces 属による機構が報告されており，何れも分泌型の加水分解酵
素による環状構造の開環による抗菌活性の消失が挙げられる。K3-5 の tolaasin 解毒機構は，
既報の他の cLP 分子種の生分解様式と類似するが，分泌型ではなく，K3-5 菌体にのみ活性
が認められる新規の cLP 生分解様式であった。 
 
2．Microbacterium 属基準菌株による tolaasin 解毒特性比較 
Microbacterium 属基準株について，前項の実験方法に従い，tolaasin 解毒活性を評価した。
基準株 30 菌株は，K3-5 と同様に，何れの菌株も培養上清に tolaasin 解毒活性は認められなか
った。一方で，何れの菌株も培養菌体に tolaasin 除去能が認められた。しかし，tolaasin 処理
した菌体を，きのこ子実体の褐変を指標とした生物検定により解毒能を評価すると，供試し
た基準菌株の中で，M. foliorum NBRC 103072T を除く，全ての菌株で tolaasin 処理菌体に毒素
活性が認められた。さらに，tolaasin 解毒能を示さない M. paraoxydans NBRC 103076Tについ
て，tolaasin 処理した菌体を１M NaCl もしくはメタノールで抽出したところ，抽出液中に
tolaasin が検出された。このことは，tolaasin 吸着能は Microbacterium 属に広く分布するが，
tolaasin の解毒には不十分であることを明らかにした。一方，tolaasin 解毒能を示す M. foliorum 
NBRC 103072Tの tolaasin 処理菌体からは，tolaasin は回収されなかった。さらに，K3-5 で明ら
かにした tolaasin の開環による分解生成産物は検出されなかったことから，M. foliorum NBRC 
103072Tの tolaasin 解毒機構は新規性が高いことが強く示唆された。 
 
3. Microbacterium foliorum NBRC 103072Tの tolaasin 解毒様式 
M. foliorum NBRC 103072Tの tolaasin 解毒機構を解析した。M. foliorum NBRC 103072T菌体へ
tolaasin を処理し，その上清を LC-MS/MS で解析したところ，tolaasin の Ser6 と Leu7 間，もし
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くは Val5 と Ser6 間のペプチド結合を加水分解した 4 種類の生成産物が検出され，M. foliorum 
NBRC 103072Tは，前述の K3-5 とは異なる，特異的な tolaasin 生分解様式により tolaasin を解毒
することを明らかにした。さらに，本菌の培養菌体の 0.5 % Triton X-100 抽出液中には，同様の
tolaasin 分解活性が検出された。菌体からのゲノム DNA 溶出量から，界面活性剤処理を行って
も細胞構造を維持していることが予想され，tolaasin 加水分解酵素は菌体の表層付近に局在する
ことが示唆された。以上の結果から，M. foliorum NBRC 103072Tの tolaasin 解毒機構は，cLP の
ペプチド鎖内部の特異的なペプチド結合を加水分解する新規の生分解様式によることを明らか
にした。 
 
4. Microbacterium foliorum NBRC 103072Tの tolaasin 生分解の特徴 
前項で tolaasin 分解活性が認められた M. foliorum NBRC 103072T菌体の 0.5 % Triton X-100
抽出液ならびに菌体懸濁液の tolaasin 分解特性を比較した。各試料へ tolaasin を添加し，上
清中の tolaasin 残存量と分解産物の生成量を経時的に解析したところ，抽出液中の tolaasin
は分解産物の生成量に反比例して直線的に減少したのに対し，菌体懸濁液の上清中の
tolaasin は，分解産物の生成量に反比例せずに，添加後速やかに減少した。また，両試料の
tolaasin の除去及び分解産物の生成に対する pH の影響を比較したところ，抽出液では，
tolaasin 除去と分解産物の生成は同じ挙動を示し，pH4 及び 5 で最も低く，pH9 で最も高い
値を示した。一方で菌体懸濁液では，tolaasin 除去と分解産物の生成は抽出液とおよそ同様
の傾向を示すものの，pH4 において，分解産物は検出されないが，tolaasin 除去能は認めら
れた。これらの結果は，本菌の菌体では，tolaasin の加水分解に先立ち，tolaasin が菌体へ吸
着することを示した。そして本菌の高効率な tolaasin の解毒は，菌体表面に未同定の tolaasin
結合因子が存在し，効率的に tolaasin を菌体へ吸着した後に，菌体表層に局在する tolaasin
分解酵素によって成し遂げられることが示唆された。 
 
5．Microbacterium foliorum NBRC 103072Tの tolaasin 分解酵素の推定 
M. foliorum NBRC 103072Tの tolaasin 分解酵素の同定を目的として，tolaasin 分解活性を指
標に酵素を精製し，ペプチドマッピングを行った。培養菌体の 0.5 % Triton X-100 抽出液を，
陰イオン交換及び疎水性クロマトグラフィーにより tolaasin 分解活性画分を精製した。得ら
れた粗精製物を，Blue Native-PAGE へ供し，泳動後のゲルの tolaasin 分解活性を評価したと
ころ，140～240kDa 付近に tolaasin 分解活性が検出された。ゲルを切り出し，トリプシンに
よるゲル内消化後，LC-MS/MS によりペプチドマッピングを行った。得られたペプチド断片
のアミノ酸配列から，タンパク質を探索（MASCOT サーチ）したところ数種のタンパク質
が同定され，その中でプロテアーゼとしての働きを持つものは Aminopeptidase N のみであっ
た。以上の結果より，M. foliorum NBRC 103072Tの tolaasin 分解酵素として，Aminopeptidase 
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N を推定した。今後は，本酵素の遺伝子破壊株の作出や組換えタンパク質を作製し，tolaasin
分解酵素の同定を行うとともに，その性状を明らかにする必要がある。 
 
総 括 
本研究では，きのこ腐敗病の毒素因子 tolaasin の解毒を戦略とした生物防除を目的として，
tolaasin 解毒能を示す Microbacterium 属細菌の tolaasin 解毒機構を明らかにした。そして，本
属の特定の菌株に見出された tolaasin 解毒能は，既報の cLP 生分解様式とは異なり，①tolaasin
加水分解酵素は分泌されず，菌体に存在すること，②菌株によって触媒部位が異なり，中で
も③cLP のペプチド鎖の内部を分断する活性を示す菌株が存在することなどの新規の知見に
より成し遂げられることを明らかにした。併せて，本属に共通した菌体への高い tolaasin 吸着
能は，tolaasin の菌体への吸着のみでは解毒に不十分であるが，菌体で tolaasin を加水分解す
る解毒菌にとっては，tolaasin の解毒を高効率なものとすることを明らかにした。 
有用微生物を利用した植物病害の生物防除については，詳細な病害抑制機構の解明が，よ
り効果的な生物防除法を企てる上での礎となる。例えば，本研究で得られた成果として，本
属の tolaasin 解毒には tolaasin 加水分解活性が鍵となる知見から，病害抑制に必要な酵素活
性量を推定し，指標とすることで，本属菌株を応用した微生物製剤の散布法や散布時期など
の最適化を図ることが可能となるであろう。将来，本研究の成果をもとに，生物防除剤を利
用した安定的なきのこ栽培法が確立され，きのこ産業の発展に貢献することを期待する。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
化学農薬の代替となる生物農薬は生き物を材料とすることから，その病害抑制機構が不明
なものが多い。生物農薬の機能解明は，その効果を向上させるための礎となる。本研究では，
化学農薬の登録がない，きのこ類に腐敗症状をもたらす細菌病の病原因子となる環状リポペ
プチド tolaasinの生分解機構を明らかにした。本研究で分離した菌株及びその近縁菌の解
析から，菌体で tolaasinを加水分解することやその触媒部位などにおいて，既報の他の環
状リポペプチド類の生分解機構とは異なる，新規の分解機構を明らかにした。さらに，菌体
には，分解因子とは異なる，未同定の tolaasin吸着因子が存在し，菌体への tolaasinの吸
着が tolaasin生分解の効率を向上させることを示した。これらの研究成果などを詳細に検
討した結果，審査委員一同は博士（農芸化学）の学位を授与する価値があると判断した。 


きのこを腐敗させる毒素tolaasinに対するMicrobacterium属細菌による解毒機構

東京農業大学博士（バイオサイエンス

辻, 竜平

4361

TSUJI, Ryuhei

4362

ビタミンB1欠乏を中心とした必須栄養素欠乏による記憶障害誘導機構の解析とその改善方法の開発

東京農業大学博士（食品栄養学

峰村, 貴央

4384

MINEMURA, Takao

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氏 名   峰 村 貴 央 
学位（専攻分野の名称）   博 士（食品栄養学） 
学 位 記 番 号   甲 第 818号 
学位授与の日付   令和 3年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   日本晴変異体米の炊飯米の性状と胚乳澱粉の理化学的性質に関 
する研究 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農芸化学） 鈴 野 弘 子 
               教 授・博士（農学） 服 部 一 夫 
               教 授・農 学 博 士 大 石 祐 一 
               教 授・博士（農芸化学） 阿久澤 さゆり 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
「米」は私たちの主食であり，重要な栄養源である。また，日本で国内自給しやすく，高
度な栽培技術により，日本各地で，「良質」「安定」「多収」などの特性を有した多くの品種
が育成されている。私たちが主に食用として利用しているのは，胚と果皮，糊粉層などを除
いた胚乳部である。精白された米胚乳部の主要成分は，水分が約 15％，タンパク質が約 6％
とともに，澱粉が約 75％以上を占めており，胚乳を構成する細胞内にアミロプラストがあ
り，さらにその中の澱粉粒は，鎖状分子のアミロースと多岐に分岐した 3 次元構造のアミロ
ペクチンの 2 種から構成されている。細胞壁成分及び澱粉の分子構造は，米飯の食味や炊き
上がりの性状に深く関与し，米の特徴を現す重要なファクターであると考えられている。ま
た，アミロースとアミロペクチンの分子構造の特徴が澱粉粒の結晶状態の違いとなり，水と
熱による分散系の糊液の特性をはじめ，澱粉の機能性の発現要因となっていることが明らか
になってきた。 
一方，イネを用いた澱粉合成メカニズムの研究も進められ，胚乳に蓄積された澱粉合成酵
素とそのアイソザイムの役割が解明されつつある。私たちの共同研究者らは，レトロトラン
スポゾン Tos17 の挿入により様々な遺伝子発現がノックアウトされたミュータントパネル
からイネの澱粉合成関連酵素のうち，スターチシンターゼ（SS）のアイソザイム SSI と
SSIIIa，デブランチングエンザイム（DBE）のアイソザイム PUL が欠損した変異体を単離
した。このような変異体の研究は，種子の収穫量が少量であるため，酵素の発現レベルと微
量サンプルで解析が可能な項目のみで，澱粉の糊化および糊液の粘弾性など，諸性質を広く
検討した報告は少ない。 
そこで本研究では，日本晴にレトロトランスポゾン Tos17 の挿入によって作出された変
異体米（SSI 変異体米：SSI，SSIIIa 変異体米：SSIIIa，Pullulanase 変異体米：PUL）の
米粒および炊飯米，胚乳部から分離した澱粉の理化学的特性を明らかにすることを目的とし
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た。 
種子形態は，SSI および PUL は日本晴（野生型）と比べて違いは認められないが，SSIIIa
は心白米と乳白米であり，炊飯米の形状も縦方向の伸長が顕著で，炊飯米の表層面も凹凸が
なく滑らかであった。分離澱粉の糊化特性および糊液の粘弾性測定の結果，糊液の特徴は，
PUL は粘度が高く，SSI と日本晴は近似し，SSIIIa は著しく低粘度を示した。また，澱粉
のアミロース含有量は，SSIIIa＞SSI＞PUL＞日本晴であり，アミロペクチンの単位鎖長分
布，平均分子量および慣性半径の測定より，変異体の澱粉の微細構造の変化を明らかにした。 
これらの結果より，3 種の変異体の澱粉の糊液の粘弾性特性は，アミロペクチンの鎖長分
布の違いから構成される房構造と平均分子量に相関性が示された。特に SSIIIa はアミロペ
クチンの長鎖を特異的に合成しながらも，平均分子量および慣性半径が小さい分子構造であ
ることが糊液の顕著な低粘弾性を発現する要因であり，3 種の変異体のうち，SSIIIa 遺伝
子制御によって，低粘度性を利用した食品や，新たな物性を有する米澱粉の作出の可能性を
示した。以上の研究結果を報告する。 
 
１．変異体米の性状及び炊飯特性 
 試料は，日本晴にレトロトランスポゾン Tos17 の挿入によって作出された変異体米（SSI
変異体米：SSI，SSIIIa 変異体米：SSIIIa，Pullulanase 変異体米：PUL）の米粒および胚
乳部から分離精製した澱粉を試料とし，日本晴（野生型）を対象とした。この変異体米は（独）
生物研で開発されたレトロトランスポゾン Tos17 が挿入された日本晴のイネ集団から選抜
されたもので，秋田県立大学の圃場内の水田およびポット栽培で完熟させた種子を用いた。 
米粒の形状観察では，外観は日本晴と SSI，PUL は透明感のある一般的な米粒であるの
に対し，SSIIIa は心白米が約 8%，乳白米が約 88%であった。この白濁粒は高温障害によ
って起こるとされるが，変異体米は同一条下で栽培されていることから，形状の差異は
SSIIIa の特性であると考えられた。米粒の大きさは，3 種の変異体米は日本晴と比較して
やや縦に長い形状であったが，米粒の割断面を走査型電子顕微鏡で観察したところ，すべて
の米粒において中心部から表層に向け，複数の澱粉粒を含むアミロプラストが放射状に規則
正しく配置された同様な構造であった。 
米粒重量の 1.5 倍量の水で炊飯し，炊飯米のデジタルマイクロスコープによる表面観察，
表面のずり応力（付着性）および楔型プランジャーによる破断測定（レオナー（Rheoner
Ⅱ RE33005S）を行った。炊飯米の形状は，日本晴と SSI，PUL はジャポニカ米に特有の
丸みを帯びた形状であったが，SSIIIa は生米粒に対して炊飯米は，長さ 1.82 倍，厚さ 1.01
倍，幅 1.03 倍に伸長しており，インディカ米のように縦に伸びた形状であった。炊飯米の
表面構造をデジタルマイクロスコープで観察した結果，日本晴は表面に凹凸がありうねるよ
うな表面状態が観察されたが，SSIIIa は凹凸やうねるような表面状態ではなく，滑らかで
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あり対照的であった。 
炊飯米の表面状態を数値化するためにクリープメータ・2 軸物性試験システムを用いて，
炊飯米表面の水平方向の摩擦応力を測定した。日本晴および SSIIIa ともに水平移動に伴い，
急激にずり応力が発生し，ピークを示した後にずり応力が減少する曲線であったが，SSIIIa
はずり応力が小さく，摺動距離が短いことから，表面の付着性が低い炊飯米であることが示
された。また，炊飯米の破断特性では日本晴，SSl および PUL では明確な破断点を示さな
い延性破断を示し，SSIIIa は明確な破断点を示す脆い炊飯米であった。 
 
２．胚乳分離澱粉の糊化特性および糊液の粘弾性特性 
示差走査熱量計（DSC）による熱測定では，SSIIIa の糊化開始温度（To）が顕著に低く，
吸熱エンタルピーが日本晴 11.7ｍJ／mgに比べてPULは 13.6ｍJ／mgと高い値であった。
また，澱粉粒の膨潤力および溶解度ともに，4 種の澱粉間で有意に差が認められ，4 種とも
に澱粉粒の結晶性と分子構造が異なることが示唆された。さらに，糊液を遠心分離により，
上澄み区分（低分子画分）と沈殿区分（高分子画分）に分画して各糖量を測定し，さらに各
区分の糖をイソアミラーゼで枝切りを行い，ゲルろ過による分子量分布を測定した。日本晴
と SSI，PUL は，上澄み区分（低分子画分）と沈殿区分（高分子画分）の全糖量は近似し
ており，SSIIIa は有意に上澄み区分（低分子画分）が多く，さらに，上澄み区分（低分子
画分）中の Fr.1 の溶出割合が低く，Fr.III が高い値であった。これは，SSIIIa の糊液を構
成する低分子量のアミロペクチンが多い分散系であることが考えられた。 
ラピット・ビスコ・アナライザー（RVA）によるペースト特性は，PUL の最高粘度（193.5cP）
および最終粘度（286.0cP）が最も高く，日本晴と SSI が類似しており SSIIIa は最高粘度
（19.5cP）および最終粘度(30.0cP)で，著しく低い曲線を示した。また，4％澱粉糊液の動
的粘弾性の周波数依存性の測定では，日本晴，SSI および PUL では貯蔵弾性率（G’）が
損失弾性率（G”）より高くゲルを形成していたが，SSIIIa は G’＜G”であり，さらに周
波数依存性が著しかったことから，SSIIIa の糊液はネットワーク構造を形成していない分
散状態であることが示された。また，損失正接（Tanδ）では SSI は日本晴と近似していた
が，PUL はやや低値であり，弾性要素の存在割合が多い分散系であることが示された。 
 
３．胚乳分離澱粉の構造解析 
アミロペクチンの単位鎖長分布を HPAEC-PAD を用いて測定し，日本晴の鎖長分布との
差分を算出し，変異体の単位鎖長の変化を検討した。日本晴に比べて，SSI はグルコース重
合度（DP）8－13 が減少し，DP14－30 が増加した。SSIIIa は DP6－8，DP15－19，DP31
以上が減少し，DP10－15，DP20－30 が増加した。また，PUL は DP17－20，DP26 以上
が減少し，DP8－16，DP21－25 が増加した。さらに，澱粉を DMSO で分散させた後，
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GPC-MALLS システムを用いて，アミロペクチンの平均分子量と慣性半径を測定した。平
均分子量は，日本晴（3.7×107g/mol），SSI（2.8×107g/mol）， SSIIIa（2.6×107g/mol），
PUL（3.4×107g/mol）であり，慣性半径は日本晴（100.0nm），SSI（97.7nm）， SSIIIa
（79.7nm），PUL（104.3nm）であった。単位鎖長分布および平均分子量の結果から，日
本晴に比べて SSI はアミロペクチンの房を構成する A 鎖が減少したが，その房内を構成す
る B1 鎖が増加していた。分子量は日本晴に比べて小さく算出されたが，溶液中の慣性半径
は顕著に減少しなかったと推測された。SSIIIa では，A 鎖の短鎖が減少したが長鎖は増加
した。しかし，房内の広がりを担う B1 鎖が減少し，2 つの結晶部を渡る B2 鎖が増加した
が，さらに長い鎖長は減少していたことから，アミロペクチンの房内も隣接するグルコース
鎖が粗の状態と推測された。平均分子量および慣性半径ともに低値となったのではないかと
推察された。PUL は，A 鎖のうちの長鎖と B1 鎖のうちの短鎖が増加したことから房内の
グルコース鎖は密であるが，長鎖である DP26 以上の B2 鎖と B3 鎖は減少している。この
鎖長分布から分子量が小さい特性であるという結果として現れないことは，B2 鎖と B3 鎖
の分岐箇所に要因があるのではないかとも考えられるが，詳細は引き続き検討する必要があ
る。 
これらの結果より，SSIIIa の欠損により，澱粉の分子構造は顕著に変化することが示さ
れた。 
 
まとめ 
本研究では，イネの澱粉合成関連酵素のうち，スターチシンターゼ（SS）のアイソザイ
ム SSI と SSIIIa，デブランチングエンザイム（DBE）のアイソザイム PUL が欠損した変
異体の米粒および胚乳部から分離した澱粉の糊化特性，糊液の粘弾性，澱粉の構造を解析し
た結果，いずれの澱粉合成関連酵素が欠損しても，米粒の炊飯後の特性および澱粉の諸性質
は変化した。しかし，SSIIIa を欠損させることで，炊飯米の性状と澱粉の構造変化に起因
する糊液の粘弾性特性を顕著に改変できることが示された。また，この米粒は表面ずり応力
（付着性）が低く，糊液の粘性が顕著に低いことから，高齢者を含む咀嚼・嚥下の機能が低
下した人に対して，粥として炊いた場合も低付着性などが利用でき，口腔中内の付着による
残存の減少などの利点があるのではないかと期待できる。 
これらの成果は，イネの澱粉合成酵素を欠損させた変異体の米粒および分離澱粉粒を解析
することで，澱粉の構造に起因する澱粉糊液の物性発現のメカニズムの解明の基礎データに
なるとともに，澱粉合成関連酵素の制御による変異体米の作出が，米粒および新素材澱粉と
して利用できる可能性を示した意義のある成果と考える。 
 
 
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審 査 報 告 概 要 
 
「米」は国内自給しやすく，高度な栽培技術により多くの品種が育成されているが，新た
なコメ改良法として，レトロトランスポゾン Tos17の挿入により，イネの澱粉合成関連酵素
のうち，スターチシンターゼ（SS）のアイソザイム SSIと SSIIIa，デブランチングエンザ
イムのアイソザイムである PULが欠損した変異体を作出し単離した。これらの変異体米の澱
粉の糊化および糊液の粘弾性など，諸性質を広く検討した報告は少ない。本研究では，日本
晴および作出した変異体米 3種（SSI，SSIIIa，PUL）の米粒および炊飯米，分離澱粉の理化
学的特性を詳細に検討し，澱粉合成酵素の欠損による構造変化のモデル図を示し，糊液の物
性との相互関係を明らかにした。この研究により，澱粉合成関連酵素を制御することで，目
的に応じた米の作出が可能であることが示唆されたことは，米の調理加工および利用におい
て意義がある。これらの研究成果等を詳細に検討した結果，審査員一同は博士（食品栄養学）
の学位を授与する価値があると判断した。 


日本晴変異体米の炊飯米の性状と胚乳澱粉の理化学的性質に関する研究

小島, 周作

4398

KOJIMA, Shusaku

4399

神奈川県平塚市吉沢地区にみる市街化調整区域の里地里山の土地利用と地域住民意識の変遷

東京農業大学博士（バイオセラピー学

奥山, 健太郎

4425

OKUYAMA, Kentaro

4426

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氏 名   奥 山  健 太 郎 
学位（専攻分野の名称）   博 士（バイオセラピー学） 
学 位 記 番 号   甲 第 838号 
学位授与の日付   令和 3年 3月 21日 
学 位 論 文 題 目   有鱗目の多様化機構解明に向けたトカゲ類の発生学的基盤研究
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（理学） 佐々木   剛 
               教 授・博士（獣医学） 増 田 宏 司 
               教 授・博士（畜産学） 小 川   博 
               教 授・博士（理学） 松 林 尚 志 
                    博士（理学）  二階堂 雅 人＊ 
                    博士（理学） 土岐田 昌 和＊＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
第 1章 序論 
生物多様性とその創出機構の理解は，生物学の主要な命題の一つである。脊椎動物の形態
的多様性は，主要な器官形成に関わる共通の発生過程と，各系統の派生的な器官形成に関わ
る特徴的な発生過程の両者を通じて獲得されてきた。そのため，形態的多様化の進化史を理
解するためには，進化発生学的視点に基づき発生過程を比較解析することで，その共通性と
特殊性の両面を明らかにする必要がある。次世代シーケンス解析や遺伝子改変技術に代表さ
れる近年の科学技術の発展は，様々な脊椎動物のモデル動物種を対象とした進化発生学的研
究に応用され，これら研究により脊椎動物の形態進化に関わる発生学的メカニズムが明らか
にされてきた。一方で，地球上の様々な環境に適応し四肢動物の中で最も多くの種を含むこ
とが知られる爬虫綱有鱗目を研究材料に用いた進化発生学的研究は少ない。四肢動物の進化
史の初期に分化した有鱗目の生物学的特徴を理解し，その著しい多様性が獲得された仕組み
を解明することは，我々ヒトを含む羊膜類，四肢動物が如何にして陸上環境に適応放散した
かを理解するために重要である。 
動物の感覚器官は彼らの生存活動，生殖活動に不可欠であり，それゆえ種の多様性獲得に
も重要な役割を担う。感覚器官のうち嗅覚器は，遠隔化学刺激を受容することにより環境認
知を司る。四肢動物は複数の嗅覚器を持つことが知られるが，中でも鋤鼻器官は同種の他個
体の放出する化学物質であるフェロモンを受容し，繁殖行動などを含む個体間相互作用に関
与することで種の分化および維持に重要な役割を担ってきたと考えられている。一方，他の
四肢動物とは異なり，有鱗目は個体間相互作用のみならず採食や外敵の回避など生態の様々
な側面において鋤鼻器官に依る化学受容を行うことが知られる。このことから，有鱗目の多
 ＊東京工業大学 生命理工学院 准教授 
＊＊東邦大学 理学部 講師 
- 2 - 
 
様化の進化史において鋤鼻器官の進化が重要な役割を担ってきたと考えられている。 
 
第 2章 有鱗目トカゲ類 2種を用いた発生学的基盤研究 
発生学研究は，複数の種間あるいは動物群間で発生過程の比較解析を行うために，胚発生
の進行度を標準化する発生段階定義を確立してきた。有鱗目のうちトカゲ類を対象としては，
Dufaure and Hubert (1961) の発生段階定義 (DH ステージ) が広く用いられてきた。しかしト
カゲ類では，発生段階定義に用いられる形態的特徴の一部の発生順序が科間，上科間などの
系統間で異なる場合があり，それら発生順序の差異は系統関係を反映しない。このことから，
有鱗目の発生過程の比較解析が活発に行われるためには，少なくとも各科を網羅した共通の
発生段階が定義され，分類群間に存在する発生順序の差異が理解される必要がある。しかし，
現在の分類体系で認識されるトカゲ類 40 科以上のうち連続した発生段階が詳細に観察され
ているのは 14 科に留まる。このような発生過程に関する知見の不十分さは，有鱗目を用い
た進化発生学的研究を活性化するために解決すべき課題の一つである。 
本研究では，今後の有鱗目を用いた進化発生学的研究への貢献を目的として，トカゲ類の
うち発生過程に関する情報が不十分であったカナヘビ科ニホンカナヘビ Takydromus 
tachydromoides およびトカゲ科ヒガシニホントカゲ Plestiodon finitimus の産卵から孵化まで
の一連の産卵後発生段階 (DH ステージ) を定義した。ニホンカナヘビの一連の産卵後発生
過程の観察はカナヘビ科の産卵種としては 3 例目であり，一連の産卵後 DH ステージの観察
は同科の卵生種として 1 例目である。また，ヒガシニホントカゲの一連の産卵後 DH ステー
ジの観察はトカゲ科の種としては 2 例目である。さらに本研究では，両種の産卵後胚発生の
特徴を明らかにし，今後の発生学的研究におけるこれらトカゲ類 2 種の活用の可能性につい
て議論した。加えて，ヒガシニホントカゲの母個体が産卵後に卵を保護し世話をする生態に
注目し，卵を母個体の保護下で発生させた群と，卵を母個体から回収しインキュベータ内で
発生させた群の間で，胚の正常発生率および発生段階の進行度を比較した。 
多くの産卵性トカゲ類の胚が DH ステージ 30 前後で産卵され，60 日間前後の孵卵期間を
経て DH ステージ 42 前後で孵化する一方，ニホンカナヘビ胚は初期咽頭胚期にあたる DH
ステージ 26–28 で産卵され，約 28 日間の孵卵期間を経て DH ステージ 42 で孵化に至った。
また，ヒガシニホントカゲ胚は後期咽頭胚期にあたる DH ステージ 32 で産卵され，約 24 日
間の孵卵期間を経て DH ステージ 42 で孵化に至った。これらのことから，本研究で観察し
たトカゲ類 2 種は共通して孵卵日数が短く，産卵後の胚発生が他のトカゲ類と比較して短期
間に進むことが明らかになった。両種の外部形態的特徴の発生順序の大部分は DH ステージ
の定義に用いられたコモチカナヘビ Zootoca vivipara と類似していたが，近縁な科間でも差
異がある場合が知られる色素形成開始のタイミングはそれぞれ異なっていた。ヒガシニホン
トカゲの母個体による卵の世話が胚発生に与える影響を調べた結果，胚の正常発生率および
- 3 - 
 
発生段階の進行度に孵卵条件間で有意な差は認められなかった。しかし，母個体から回収し
インキュベータ内で発生した胚の正常発生率が 86.7 % であったのに対し，母個体の世話の
下で発生した胚の正常発生率は 100 % であった。このことは，同種の母個体が卵の世話を
する際にとる行動が胚の正常発生率を向上させる可能性を示唆する。この可能性を検証する
ため，今後は母個体の詳細な行動観察を行いつつ，さらに多くの胚試料数を用いて比較解析
を行う必要がある。 
本研究で観察したトカゲ類 2 種は，日本国内で容易に採集，飼育繁殖して胚試料を入手す
ることが可能である。また，単一のクラッチから複数の胚試料を得ることができ，それらの
胚発生が一定の速度で進行する。さらに，産卵後の胚発生の進行が速く，目的の発生段階の
胚試料を短期間に入手することができる。加えて，ニホンカナヘビの産卵のタイミングは他
のカナヘビ科の種と同様にトカゲ類中では比較的早く，肢芽形成の開始以前である。そのた
め，同種の産卵後胚発生においては一連の四肢形成過程を観察することができる。また，ヒ
ガシニホントカゲでは母個体が卵の世話をする際の何らかの行動により非常に高い正常発
生率で胚試料を入手できる可能性がある。以上の特徴から，これらトカゲ類 2 種は発生学的
研究で活用されるために十分な利点を備えていると考えられた。 
 
第 3章 有鱗目の鋤鼻器官とその関連構造の関係性の進化史 
有鱗目の鋤鼻器官は，他の四肢動物の同器官と同様に嗅上皮の一部から発生する。しかし，
鼻腔と完全に隔絶して口蓋に開口する点や，器官内部に分泌腺構造を持たず，その内腔が眼
窩のハーダー腺で分泌される内腔液で満たされる点など，他の四肢動物と異なる形態的特徴
を持つ。有鱗目の鋤鼻器官には，1) 外界の化学物質を付着させ器官の開口部に運ぶ舌，2) ハ
ーダー腺から鋤鼻器官へ伸長し内腔液の経路となる鼻涙管，3) 内鼻孔から鋤鼻器官へ伸長
し，鼻涙管が開口する内鼻溝などの機能的関連構造が知られる。これら鋤鼻器官関連構造は
目内で形態的に多様化していることが知られ，中でも舌の形態的特徴やその機能的意義，進
化史は盛んに議論されてきた。一方，鼻涙管および内鼻溝の形態的多様性は統合的に整理さ
れておらず，その進化史や機能的意義に関して議論した研究は非常に少ない。また，鋤鼻器
官およびその関連構造の発生過程を詳細に観察した研究は少なく，上述の形態分化の仕組み
には未解明な点が多く残されている。 
そこで本研究では，まず有鱗目ニホンカナヘビの鋤鼻器官およびその関連構造の連続組織
切片を作製して三次元構造を再構築し，形態的特徴を明らかにした。カナヘビ科の種の鋤鼻
器官関連構造の形態的特徴に関しては，鼻涙管が内鼻溝との融合により形成する派生構造で
ある鼻涙-内鼻溝が鋤鼻器官まで伸長するという複数の報告と，同構造が鋤鼻器官に接触せ
ず終端するという Lemire (1985) の報告が混在しているが，ニホンカナヘビの形態的特徴は
Lemire (1985) の報告したものと類似していた。この鼻涙管あるいはその派生構造が鋤鼻器
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官に接触しないという形態は，有鱗目内ではカナヘビ科および一部のカメレオン科の種のみ
で知られる特徴的なものである。 
次に，同様の手法により同種の胚発生における鋤鼻器官および関連構造の形態形成過程を
観察した。その結果，本種の鋤鼻器官および関連構造の発生過程は DH ステージ 36 以前で
は他のカナヘビ科の種などに類似していることが明らかになった。また，上述の本種に特徴
的な形態，すなわち鼻涙管の派生構造の鋤鼻器官からの分離が，一部の有鱗目で観察される
口蓋形成による内鼻溝の鋤鼻器官からの分離とよく類似した挙動により，DH ステージ 37
で形成されることが明らかになった。 
さらに，先行研究で示された有鱗目の鋤鼻器官関連構造の形態的特徴に関する知見を整理
統合し，鋤鼻器官と鼻涙管，鋤鼻器官と内鼻溝，鼻涙管と内鼻溝の三種類の構造的関係性を
それぞれ 4 種類の形質状態に分類した。続いて，現在広く支持されている有鱗目の系統関係
に基づき，それら形質状態の祖先形質状態推定を推定した。その結果，鋤鼻器官，鼻涙管，
内鼻溝が互いに連続する形質状態が有鱗目にとって祖先的であると推定された。また，有鱗
目の進化史において，鼻涙管派生構造の鋤鼻器官からの分離，内鼻溝の喪失，内鼻溝の鋤鼻
器官からの分離，鼻涙管と内鼻溝の融合といった複数の非相同同形形質 (ホモプラシー) が
平行的に進化したと推定された。 
 
第 4章 総論 
本研究は有鱗目の著しい多様性に注目し，以下の二つの研究内容によりその創出機構の理
解に貢献することを目的とした。まず，有鱗目トカゲ類の胚発生に関する基礎的知見を充実
させるために，胚試料の外部形態の観察に基づきトカゲ類 2 科 2 種の産卵後発生段階を新た
に定義し，それら種の発生過程の特徴およびその発生学研究への活用の利点を示した。また，
有鱗目の多様化に重要な役割を担った可能性がある鋤鼻器官関連構造の形態的多様性につ
いて，以下の新たな知見を示した。まず，カナヘビ科ニホンカナヘビのそれら構造の形態を
組織学的に観察し，同種が有鱗目内で特徴的な形態を持つことを解明した。加えて，鋤鼻器
官関連構造の形態的多様化の進化史を推定し，複数の非相同同形形質の平行進化の可能性を
示した。 
本研究の内容に関連し，今後の有鱗目の形態学的および発生学的研究の研究基盤を整備す
るにあたり解決すべき課題として，多くの種の軟組織や体内器官の形態や，胚発生における
体内の器官形成過程の大部分が十分に理解されていないことが挙げられる。今後これら課題
を解決するためには，体内器官の立体構造を網羅的に観察するために強力な手段となる非破
壊的三次元イメージングと，各器官の組織形態の詳細な観察に利点のある連続組織切片作製
の両手法を併用することが求められる。これら手法により得られるデータを統合した進化発
生学的解析は，有鱗目の形態的多様性の理解に大きく貢献するだろう。 
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審 査 報 告 概 要 
 
有鱗目は陸上脊椎動物の中で最も多様化した分類群の一つであり，その多様化機構解明は
羊膜類の陸上環境への適応放散の仕組みを理解するために重要である。本研究はトカゲ類 2
種の産卵後の発生段階を定義したことで有鱗目の形態分化機構の解明を目指す比較発生学
分野に貢献する成果をあげている。加えて，有鱗目の嗅覚において重要な役割を担う鋤鼻器
官とその機能的関連構造についてニホンカナヘビを材料に組織学的観察を行ったところ，本
種が有鱗目の中でも特異な形態を有していることが明らかにした。さらにこの鋤鼻器官と関
連構造の進化史を明らかにするため，有鱗目の分子系統樹に基づいて祖先形質復元を行った。
その結果，鋤鼻器官とその関連構造の関係性が平行的に進化し多様化したことを明らかにし
た。これら研究成果は両生爬虫類学ならびに発生生物学の発展に寄与する業績と認め，審査
員一同は博士（バイオセラピー学）の学位を授与する価値があると判断した。 


有鱗目の多様化機構解明に向けたトカゲ類の発生学的基盤研究

吉田, 智佳史

4439

YOSHIDA, Chikashi

4440

森林バイオマス収穫作業システムの構築に関する研究

杉浦, 総一郎

4197

SUGIURA, Souichirou

4198

English

Substance Transport Characteristics and Salt Tolerance Mechanism of Zoysia matrella Merr.

東京農業大学博士（国際バイオビジネス学

宮ノ下, 智史

4213

MIYANOSHITA, Tomofumi

4214

食料品製造業におけるイノベーション活動と企業業績の関係に関する実証分析

東京農業大学博士（環境共生学

佐々木, 胤重

4217

SASAKI, Ikushige

4218

Study on the Strategy for the Food Value Chain of Rice Liquor in Northern Rural Areas of Lao People’s Democratic Republic

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