Tokyo University of Agriculture Repository / 東京農業大学リポジトリ

金井, 一成

KANAI, Issei

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氏 名   金 井 一 成 
学位（専攻分野の名称）   博 士（農学） 
学 位 記 番 号   乙 第 960号 
学位授与の日付   令和 4年 10月 20日 
学 位 論 文 題 目   エネルギー作物エリアンサスの栽培•利用システムの構築に関 
する研究 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 上 地 由 朗 
               教 授・博士（農学） 西 尾 善 太 
               教 授・博士（農学） 松 田 浩 敬 
                    農 学 博 士  森 田 茂 紀＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
地球温暖化の影響が顕著に現れるようになり，低炭素社会ではなく，脱炭素社会が強く求
められている。そのための方途として再生可能エネルギーの利用があり，太陽光発電や風力
発電だけでなく，バイオマスエネルギーが国内外で注目されている。その際，食料生産との
競合を避けるために糖質系原料作物やデンプン系原料作物ではなく，セルロース系原料作物
の栽培利用が求められているが，事業化に向けた研究が遅れている。 
そこで，本研究では，セルロース系バイオマスエネルギーの原料作物として，不良環境条
件下でも高いバイオマス生産性を示す多年生草本作物のエリアンサス (Saccharum spp.) 
を取り上げ，低投入持続的に栽培してしたうえで，バイオマスをエネルギー利用するための
研究を進め，その成果を利用するシステムデザインを行った。 
 
１．群落の発育形態学的解析 
（１）群落構造と間引きの効果 
セルロース系バイオマスエネルギーの原料作物として，エリアンサスを選定し，物質生産
の背景となる群落構造について発育形態学的な研究を行った。 
定植 1 年目と 2 年目の群落の構造を解析した結果，分げつの生育が収量形成に大きく貢
献することが明らかとなった。また，定植 2 年目になると群落の発育に伴って収量は増加す
るものの，群落内の相対照度は高い位置で減衰して群落内の光環境が悪化した。そこで，間
引きを行い，栽植密度を下げることで，群落内の光環境を改善すれば，群落としての物質生
産を改善できると考察した。 
実際に，複数の群落において異なる年次に間引きを行ったところ，いずれの群落でも受光
態勢が改善され，収量が増加した。また，早期に間引きを行うと，必ずしも単年度の収量が
 ＊東京大学名誉教授 
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高くなくても，数年に亘る群落の累積収量が最大化する可能性を明らかにした。 
（２）群落内の生育変異の推移 
エリアンサス群落は年々，大型化するが，それに伴って群落を構成している株の生育に大
きな差異が認められる。そこで，群落を構成する株の生育変異とその年次推移について，茎
数/株に着目して個体群生態学的な観点から解析した結果，苗の定植後，茎数が増加しなが
ら株の生育変異が拡大した。 
また，生育変異について株の相互作用に着目して検討した結果，茎数/株が小さいと株が
受ける被圧が大きく，反対に大きいと被圧が小さい傾向が認められ，最終収量一定の法則が
成り立つ可能性が示唆された。さらに，間引きを行うと収量が増加するだけでなく，群落内
の株の生育変異が拡大しにくくなる可能性も明らかにした。 
 
２．群落を形成する株の発育形態学的解析 
（１）群落構造の機械的強度 
エリアンサスが高バイオマス生産性を発揮する背景として大型の群落構造があると考え，
群落構造の形成と維持について，形態学的観点から検討した。まず，葉身が自重を支える実
態を検討した結果，葉身が支えている自重 (葉身重) ＜葉身の各部位が支持できる最大の重
さ (支持重) であり，葉身が自立している事実と整合していることを確認した。葉身は主に
中肋によって支持されており，中肋の大型化と形態的変化が葉身の機械的強度に貢献してい
ることも明らかにした。 
茎の組織構造を走査型電子顕微鏡で観察を行った結果，茎周辺の円環状領域に多くの維管
束が密集していた。また，維管束周辺部分を細胞壁が肥厚した小型細胞が埋めているため円
環状領域の機械的強度が高く，茎は倒伏しにくいと考えられた。 
（２）株を構成する分げつの生育 
収量形成に大きく貢献することが明らかになった分げつの生育を解析した結果，エリアン
サスの株は発育形態学的に異なる 3 種類の分げつから構成されることや，新しい分げつの多
くは株の周辺側に形成され，それに伴って株が大型化することが明らかになった。また，そ
れぞれの分げつでは上位 3 枚程度の葉が同時に展開し，生長速度が速いだけでなく，生長期
間も長いため，多くの長大な葉身が形成される。葉身に比較して葉鞘は相対的に短いが，伸
長する節間が多く，葉鞘の着生する位置が相互に離れているため，受光態勢に優れ，高い物
質生産性を発揮していることを明らかにした。さらに，生育せずに枯死する分げつの生育に
は出穂と刈取り時期との前後関係が関わるため，穂の構造および幼穂形成過程も明らかにし
た。 
（３）根系形成とターンオーバー 
エリアンサスが大型群落を維持し，高いバイオマス生産性やストレス耐性を示すことには
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根系が関わると考え，定植 1 年目と 2 年目の群落において根の形成と枯死について定量的
な解析を行った。その結果，定植 1 年目から 2 年目にかけて根量が増えるとともに根系分
布が深くなることや，新しい根が形成される一方で，古い根が枯死していることが定量的に
確認できた。これに伴って土壌中に炭素が貯留され，エリアンサスを栽培することが地球温
暖化対策となる可能性を示した。 
 
３．エリアンサスの栽培・利用システムの構築 
エネルギー作物を栽培し利用していくには，単に原料作物の収量を検討するだけでは不十
分である。事業化のためにさらに検討すべき課題として，低投入持続的な栽培管理体系や，
それを踏まえた原料バイオマスの利用システムを構築する必要がある。 
栽培管理体系ではコスト・二酸化炭素排出量を削減するために，低投入持続的栽培システ
ムの構築が必要となる。栽培管理のなかで最も重要なものに栽植密度があり，この点につい
ては群落形成を発育形態学的に解析した。その他，栽培体系を構築するために，苗生産や乾
燥方法についても具体的な検討を行い，標準的な栽培システムを構築した。 
（１）苗生産と乾燥方法の確立 
エリアンサスの栽培と利用の事業化を考えた場合，新たにエリアンサス栽培を開始したり，
時間経過に伴う改植においては相当量の苗が必要となったりするため，組織培養を利用した
苗生産方法を確立した。また，バイオマス原料をプラントに搬入する段階で原料バイオマス
の含水率を 15％以下とすることが求められるため，乾燥方法について検討を行った。日本
国内において事業化を進める場合は，立ち枯れが十分に進んだ 3 月に刈取り，茎葉部を物理
的に損傷させた後，約 1 ヶ月，雨風の当たらない場所で風乾処理すると，強制乾燥せずに含
水率を 15％以下にできる技術開発に成功した。 
（２）システムデザインと評価 
以上の個別研究を踏まえて，エリアンサスのバイオマス利用システムについて検討した。
システムデザインの 1 つとして，東日本大震災による農業の復興普及支援の一環として，東
京電力福島第一原子力発電所の事故で飛散した放射性物質によって汚染された農地でエリ
アンサスを栽培し，収穫したバイオマスをペレットに変換して，ビニールハウスの暖房用燃
料として熱利用するシステムをデザインし，その事業性評価を行った。その結果，一定の規
模拡大を行うことによって，経済性・環境性・社会性を総合的に評価した場合の事業性が担
保されることが明らかとなった。 
 
以上，セルロース系エネルギー作物として多年生イネ科草本作物のエリアンサスの群落形
成に関する作物学・栽培学を展開したことは，従来の一年生作物の栽培とは異なる新たな学
術分野を確立することにつながった。また，得られた知見を踏まえてエリアンサスの栽培・
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利用システムを構築できた。このように新たな学術分野の確立にとどまらず，震災による被
災地の農業復興普及や全国で問題となっている耕作放棄地対策に利用すること，さらに気候
危機における土壌中への炭素の貯留という大きな問題に役立つ可能性が大きく，本研究の成
果は，様々な社会的問題の解決に役立つことが想定される。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
審査論文は，セルロース系バイオマスエネルギーの原料作物として，不良環境条件下でも
高いバイオマス生産性を示す多年生草本作物のエリアンサスを取り上げ，低投入持続的に栽
培してしたうえで，バイオマスをエネルギー利用するための研究を進め，その成果を利用す
るシステムデザインを行った成果である。概要は以下の通りである。まず，エリアンサス群
落および株の育形態学的解析を行い，間引きによる受光態勢の改善の結果，バイオマス収量
が収量の増大化の可能性があること，個体の生育量が揃う方向に向かうことすることを明ら
かにした。また，倒伏を軽減させる維管束構造，穂の構造および幼穂発育形成過程を解析し，
大型の群落構造が形成される要因を明らかにした。さらに，これらの結果を踏まえ，エリア
ンサスの標準的な栽培システムを構築した。 
これらの研究成果等を詳細に検討した結果，審査委員一同は博士（農学）の学位を授与す
る価値があると判断した。 


Japanese

エネルギー作物エリアンサスの栽培・利用システムの構築に関する研究

柳原, 尚之

4554

YANAGIHARA, Naoyuki

4555

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氏 名   柳 原 尚 之 
学位（専攻分野の名称）   博 士（醸造学） 
学 位 記 番 号   甲 第 853号 
学位授与の日付   令和 4年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   江戸期の酢に関する研究 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（生物産業学） 穂 坂   賢 
               教 授・博士（農芸化学） 前 橋 健 二 
               教 授・博士（農芸化学） 阿 久 澤 さ ゆ り 
               名誉教授・博士（農芸化学）  小 泉 幸 道 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
酢は，醬油，味噌，みりん，酒などと並ぶ醸造調味料として，日本料理にはなくてはならないもの
である。日本料理の発達の中で酢が重要な役割を果たしてきたにもかかわらず，江戸期の酢に関
する醸造学的検証はほとんどされていない。そこで本研究では，江戸期において酢がどのようなも
のであったかを推定することを目的として，江戸期の書物から当時の酢の使用法を調査するととも
に，江戸期の酢製造の再現を試みて，江戸期の酢の成分的特徴および調味特性について考察を
行った。 
 
１. 江戸期における酢の料理への使われ方 
江戸期に刊行された料理本を調査し，江戸料理における調味料としての酢の使われ方を整理し
た。江戸期の料理本 33 冊から，酢を用いた記述がみられる料理を抽出した。その結果，酢の総出
現数は 1371回であり，醤油の総出現数1317回よりやや上回っていた。特に，江戸前期だけでみる
と，酢は醬油の 1.5倍の出現数が確認された。料理別の出現数でみると，「なます」が 602回，「さし
み」が 170 回と合わせて全体の 56.3％を占めており，生の魚を使った料理で多く使われていたこと
が分かった。また，酢は単品で使うより合わせ酢にしていることが多く，香辛料，食材，他の調味料
との合わせ酢が122種類みられ，そのうち61種類は酢味噌として使われていた。その他，江戸期の
酢の特徴的な使い方として，酢を利用した加熱料理が見られ，代表的な料理に「すいり」がある。こ
の調理法は，室町期から江戸期を通して作られていた長い歴史を持つ料理である。すいりは主に
煮物としての調理法であったが，酢を加えてから煮る場合と，煮た後に酢を加える 2 種類の方法が
みられた。その他，すいり以外にも酢の加熱調理があり，食材を酢の中で煮る調理法や，生の肉や
魚に熱い酢をかける方法もみられた。 
 現代の日本料理ではほとんど行われない，酢の加熱調理への使用は，江戸期には一般的なもの
であった可能性が示唆された。 
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2. 江戸期の酢製造の再現 
 江戸期及びそれ以前の 16 冊の書物から 33 件の米酢製造法を抽出し，原料配合，仕込時期，
醸造期間，添加剤及び副原料，および仕込容器について整理して江戸期と現代の酢製造法の比
較を行った。現代の酢製造法は，江戸後期に創業し現在でも伝統的製法による壺酢製造を続けて
いる坂元醸造株式会社が行っている方法とした。 
江戸期の米酢製造法では，現代と比べて汲水歩合が著しく低く，仕込み時期は夏が多く，仕込
み期間は 1 週間から 1 ヶ月程度と短いものが多いという特徴が見られた。現代の汲水歩合が 300%
以上であるのに対し，江戸期の米酢製造で見られた汲水歩合は，28 件中 26 件が 250％未満で， 
そのうち 11件は 150％未満であった。 
江戸期書物記載の方法による再現仕込試験は，坂元醸造株式会社にて行った。対象として坂
元醸造の方法，汲水歩合の異なる酢製造法として本朝食鑑，黒白精味集，萬金産業袋，及び和
漢三才図会の 4 種類の方法で行った。その結果，汲水歩合が現代と同様およそ 300%の和漢三才
図会の仕込みでは30日目以降に酢酸発酵が認められた。汲水歩合がおよそ 100～250%の本朝食
鑑及び黒白精味集の仕込みにおいては，仕込初期に乳酸発酵で1～2g/100mlの乳酸が生成され，
9～13g/100ml という高いエタノール濃度となって酢酸発酵へは移行しなかった。本朝食鑑と現代
の仕込後 199 日のもろみの菌叢解析を行った結果，現代仕込のもろみでは酢酸菌および乳酸桿
菌が優勢菌であったのに対し，本朝食鑑の仕込みにおいて酢酸菌は検出されず，Lactobacillus属
乳酸桿菌または Pediococcus属乳酸球菌が優勢菌として検出された。 
本朝食艦の汲水歩合によって，米酢製造について実験室スケールの仕込み試験によって確認
を行った。原料は坂元醸造のものを用い，酢酸菌は坂元醸造の壺酢もろみより分離された
Acetobacter pasteurianusを仕込時に添加して1L容ポリ容器にて仕込を行った。その結果，坂元醸
造の汲水歩合によるもろみでは，壺製造の際と同様に酢酸発酵がみられたのに対して，本朝食艦
の汲水歩合によるもろみでは旺盛な乳酸発酵およびエタノール発酵が見られたものの酢酸発酵へ
は移行しなかった。江戸期書物に記載されている米酢製造法では，初期の乳酸発酵終了時には
高いエタノール濃度となるため，安定的に酢酸発酵を行うことが困難であると考えられた。このこと
から，江戸期には，米酢製造法によって乳酸を酸味の主体とする発酵物が広くつくられていた可能
性が示唆された。 
 
３. 江戸期の酢の成分的特徴 
  江戸期の酢製造の再現実験において製造された本朝食鑑の方法による乳酸酢（本朝酢）及び
現代の製造法による壺酢（現代酢）のそれぞれ仕込み後199日の酢もろみ上清について，メタボロ
ーム解析により成分の比較を行った結果，検出された412種類の化合物のうち，乳酸をはじめとす
る有機酸類やアミノ酸類を含む13種類が本朝酢の方で著しく含量が高かった。また，本朝酢の方
で著しく含量の低かった化合物は，ジペプチド類を中心とする16種類であった。 
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本朝酢と現代酢の香気成分についてGC/MSにより分析し比較した。本朝酢は，酢酸エチル及
びアセトインが少なく，アセトアルデヒド及び1-プロパノールが多い傾向がみられた。これらは酢酸
菌の増殖と関連することが知られており，酢酸発酵が観察されなかった本朝酢では現代酢と香気
成分が大きく異なることが確認された。 
 
４．江戸期の酢の調味特性 
本朝酢の味についての客観的評価として，味覚センサーを用いた味覚測定を行った。市販米酢
を基準として，本朝酢及び加熱した本朝酢の味覚測定を行った結果，本朝酢及び加熱本朝酢に
は酸味，苦味雑味，渋味刺激，旨味，塩味，苦味，旨味コクのシグナルが検出され，市販米酢より
も酸味は弱いが旨味は強いことが示された。また，塩味，苦味刺激，渋味刺激，及び旨味コクも本
朝酢の方が市販米酢より強く，加熱によりさらに強まることが示された。 
呈味に関連すると思われる遊離アミノ酸について，本朝酢と市販黒酢とで比較を行った結果，本
朝酢は黒酢の2倍近い総遊離アミノ酸量であり，アミノ酸組成は黒酢と大きく異って，グルタミン酸及
びアスパラギン酸の割合がそれぞれ1割を占める特徴がみられた。さらに，本朝酢を火入れしてエ
タノールを除去した際には，総遊離アミノ酸量はおよそ1.5倍に増加した。 
本朝酢及び本朝酢で調味した料理の味及び香りについての官能評価をプロの和食・洋食また
は中華の料理人19名により市販米酢を対照として行った。その結果，本朝酢そのものでは米酢より
酸味が弱く，穀物香とアルコール香を強く有すると評価された。しかし鶏ささみを酢で炒めた料理
（すいり）については，本朝酢で調味したものの方が酸味の強さ及び刺激が強いと評価された。そこ
で本朝酢を加熱したときの酸度の変化について市販黒酢と比較を行った。100mlの本朝酢を8分間
加熱したところ，およそ10%含まれるエタノールが除かれ，さらに水分が蒸発して成分が濃縮され，
その結果酸度が黒酢と同等にまで上昇することが確認された。これは本朝酢の酸味の主体が不揮
発性の乳酸であることが原因と考えられ，このような乳酸発酵物が江戸期には加熱調理に適した酢
として用いられていた可能性が示唆された。 
 
４．総括 
本論文では，江戸期書物から酢料理及び酢製造の記述を抽出して整理し，江戸期の酢製造の
再現実験を行って江戸期の酢の特性を検討した。その結果，江戸期には，米酢の製造法によって，
乳酸を酸味の主体とした乳酸発酵液がつくられ，酢として様々な料理に用いられていた可能性が
推察された。このことから，江戸期における酢料理は，現代の食酢を用いた再現料理とは顕著に異
なる風味であった可能性が見いだされた。本論文の成果は，日本での酢の歴史に新しい見解を与
える結果となった。 
 
 
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審 査 報 告 概 要 
 
本論文では，江戸期の酢がどのようなものであったかを推定することを目的として，江戸期の書
物から酢の使用法を調査するとともに，江戸期の酢製造の再現を試みて，江戸期の酢の特性につ
いて考察を行った。酢の加熱調理への使用は，現代の日本料理ではほとんど行われないが，江戸
期には「すいり」という加熱調理が一般的なものであった可能性が示唆された。江戸期の書物から
米酢製造法を調査したところ，江戸期の米酢製造法では，現代と比べて汲水歩合が著しく低く，仕
込み時期や仕込み期間など多くの点で大きな違いが見られた。江戸期の方法で酢の再現仕込み
試験を行った結果，江戸期の濃厚仕込みでは酢酸発酵が起こりにくいと判断された。江戸期には，
乳酸発酵による乳酸を酸味の主体とする発酵液が，酢として一般的に使われていた可能性が示唆
され，この不揮発酸の酢は江戸期に特徴的な酢煎りに適した酢であったと考えられた。 
以上の本研究の成果は，日本の酢製造及び酢利用の歴史において新しい見解を示しているこ
とから，審査委員一同は博士（醸造学）の学位を授与する価値があると判断した。 


江戸期の酢に関する研究

東京農業大学博士（国際農業開発学

内田, 一臣

4566

UCHIDA, Kazuomi

4567

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氏 名   内 田 一 臣 
学位（専攻分野の名称）   博 士（国際農業開発学） 
学 位 記 番 号   甲 第 859号 
学位授与の日付   令和 4年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   青葉アルデヒドを利用した GABA 高含有緑茶製造方法の検討 
および生理的メカニズムの解明 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 小 塩 海 平 
               教 授・博士（農学） 妙 田 貴 生 
               教 授・博士（農学） 志和地 弘 信 
               教 授・博士（農学）  山 田 隆 一 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
ＧＡＢＡ（γアミノ酪酸）は血圧降下作用があり，人体の脳や脊髄などの中枢神経系にお
いて，主に抑制的な働きを持つ神経伝達物質として機能していることが知られている。ＧＡ
ＢＡ含量が多いギャバロン茶は睡眠を助けることが報告されており，ストレプトゾトシン誘
導糖尿病マウスにおける大脳皮質のアポトーシスやオートファジーを緩和することが知ら
れている。チャは開発途上国でも重要な換金作物の一つであり，簡易な方法でＧＡＢＡ含量
の高い機能性チャを製造できれば，経済的にも資するところが大きいものと考えられる。 
これまでにチャのＧＡＢＡ含量を高めるために様々な方法が開発され，例えば，嫌気処理
と好気処理の繰り返し，赤外線処理，マイクロ波処理，グルタミン酸ナトリウム溶液への浸
漬処理などが有効であることが知られているが，一方でＧＡＢＡ含有量が高いギャバロン茶
は半発酵茶に近くカテキン含量が低くなることなどが報告されている。本研究では，品質を
低下させずに，安価かつ簡易な方法で，ＧＡＢＡ含有量の多い緑茶を製造する方法について
検討を行った。さらに，メタボローム解析およびトランスクリプトーム解析によってＧＡＢ
Ａ蓄積のメカニズムについて検討を行った。 
 
1. 青葉アルデヒドがチャの緑葉中ＧＡＢＡ含量に及ぼす影響 
収穫した茶葉を異なる濃度（１，１０，１００ｐｐｍ）および処理時間（１時間，３時間，
６時間）で青葉アルデヒドに曝露し，茶葉のＧＡＢＡ含有量に与える影響を調査した。その
結果，１０ｐｐｍ以上の濃度で３時間以上処理することにより，ＧＡＢＡ含量を約８〜１０
倍に高めることができることが明らかになった。 
 
 
 
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2. 密封低温条件下における青葉アルデヒド処理がチャの緑葉中ＧＡＢＡ含量に及ぼす影 
 響 
簡易かつ大量製造を可能とするために，収穫直後の茶葉を大量に袋内に投入し，その後，
対応量の青葉アルデヒドに曝露し，ＧＡＢＡ含量の消長について検討した。結果，ＧＡＢＡ
の含量は増加せず，密封低温条件下における製造は好適ではないことが明らかとなった。褐
変を防止するため低温条件下で処理を行ったが，酵素の活性が阻害され，ＧＡＢＡの生成が
促進されなかったものと推察された。 
 
3. 通風乾燥中における青葉アルデヒド処理がチャの緑葉中ＧＡＢＡ含量に及ぼす影響 
密閉低温条件下でＧＡＢＡ生成が促進されなかったことから，採取直後の茶葉を大量に通
風乾燥しながら青葉アルデヒドに曝露する製造方法を検討した。その結果，ＧＡＢＡ含量を
１０倍近く増加させることができ，簡易かつ安全な方法において，大量の緑茶葉を処理する
製造方法を見出すことができた。 
 
4. 青葉アルデヒド処理で製造したＧＡＢＡ高含有な緑茶の香り成分の解析 
ＧＡＢＡが高含有となる好適な条件で製造した緑茶について，ＧＣ－ＭＳおよびＧＣ－Ｏ
により香り成分の解析をおこなった。その結果，アルデヒド，エステルやケトン，酸が検出
され，香調として豆臭（Ｃ９やＣ１０のアルデヒド由来）の上に，熟したイチゴ感が香る通常
の緑茶に近い雰囲気を醸すことが明らかとなった。青葉アルデヒド処理で製造することで，
ギャバロン茶のような敬遠される匂いは発生せず，マイナス面での懸念が小さいことが確認
された。 
 
5. 青葉アルデヒド処理によるＧＡＢＡ含量向上メカニズムの解析 
青葉アルデヒド処理により製造した茶葉のメタボローム解析およびトランスクリプトー
ム解析を行った。その結果，ＧＡＢＡの他に，αケトグルタル酸，ピルビン酸およびアラニ
ン含量が増加し，グルタミン酸，グルタミン，アスパラギン酸が減少することが明らかとな
り，グルタミン酸デカルボキシラーゼが活性化し，ＧＡＢＡトランスアミナーゼが不活性化
することによりＧＡＢＡ生成が促進されることが明らかになった。 
 
英文要旨 
Practical method to produce GABA (γ-aminobutyric acid) rich green tea was examined by the 
vapor treatment of trans-2-hexenal. Though the treatment with trans-2-hexenal in closed plastic bag 
at 5℃ for 4 hours failed to enhance GABA concentration in tea leaves, trans-2-hexenal vapor 
treatment in ventilation system succeeded in enhancing GABA concentration up to 8 to 10 times 
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higher, namely around 2 µmol/g. According to the result of flavor profiling by GC-O and GC-MS, 
GABA rich tea produced by this method was found to possess slight strawberry and bean like odor in 
addition to the original green tea flavor.  
Since trans-2-hexenal is a ubiquitous green odor generated from plant leaves and originally rich in 
tea leaves as well, this method can be regarded as highly safe and environmentally friendly technique 
and might well contribute to tea industry and tea market of developing countries. It could also play 
an important role in promoting local public health as a functional tea to cope with stressful mental 
conditions. 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
内田一臣君は，青葉アルデヒドを緑茶葉に曝露処理することで緑葉内の GABA 含量を高
めることを明らかにし，GABA 高含有緑茶の新たな製造方法を考案した。青葉アルデヒドに
おける曝露処理の最適条件について検討した結果，濃度 10ppm 以上，3 時間以上であれば，
チャ緑葉の GABA 含量を 8～10 倍に高めることが可能である。さらに，メタボローム解析
およびトランスクリプトーム解析を駆使し，代謝物や酵素活性を特定することで，青葉アル
デヒド処理により GABA が増加するメカニズムについて考察し，青葉アルデヒド処理によ
りグルタミン酸脱炭酸酵素が 4 倍程度活性化し，GABA が蓄積することが明らかとなった。
これらの知見と発見は，学術的に価値の高いものと認め，審査員一同は学位請求者に博士（国
際農業開発学）の学位を授与するに値すると判断した。 


青葉アルデヒドを利用したGABA高含有緑茶製造方法の検討および生理的メカニズムの解明

東京農業大学博士（環境共生学

安部, 由香子

4574

ABE, Yukako

4575

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氏 名   安 部  由 香 子 
学位（専攻分野の名称）   博 士（環境共生学） 
学 位 記 番 号   甲 第 863号 
学位授与の日付   令和 4年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   農業高校における ESD を意識した熱帯果樹カカオの教材化 
および実践に関する研究 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農芸化学） 武 田 晃 治 
               教 授・博士（文学） 熊 澤 恵里子 
               教 授・博士（農学） 藤 澤 弘 幸 
               助 教・博士（農学）  御手洗 洋 蔵 
                    修士（教育学） 佐 藤   環＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
序 章 
 持続可能な開発のための教育（Education for Sustainable Development：以下，ESD）
の実践は，2015 年に国連によって採択された持続可能な開発目標（Sustainable 
Development Goals：以下，SDGs）の 17 目標全てに貢献するものである。2018 年 3 月の
高等学校学習指導要領改訂をうけて教科農業でも ESD を意識した授業を展開し，地域の発
展に貢献する産業人の育成が求められている。農業高校では従来からプロジェクト学習を主
体とした課題解決型の学習が行われているものの，ESD を意識した教材開発は緒に就いた
ばかりである。農業は環境と深い関わりがあり，環境教育を基盤とした ESD において農業
高校で活用できる教材を開発することは，その活性化に大きな役割を果たすものである。本
研究では，チョコレートの原材料として広く知られている熱帯果樹「カカオ」の商業的栽培
が日本ではいまだ報告されていないことに着目し，ESD を意識したカカオの教材化と授業
実践の可能性について検討した。カカオはチョコレートとして食するためには栽培のみなら
ず様々な製造工程を要し，気候変動や国際開発とも密接に関わっている。これらのことから，
熱帯果樹カカオは新たな価値観や行動変容を育む教材として ESD の目的に資する農作物で
あると考えられる。本研究では，農業高校における ESD と SDGs の関係を構造的に明らか
にするとともに，これまでほとんど活用されてこなかった熱帯果樹カカオの教材化について，
新たな知見を加える。 
第 1部 農業高校にみる ESD と SDGs の連関構造 
第 1章 農業高校における持続可能な開発のための教育（ESD）と持続可能な開発（SDGs） 
目的：他国の事例も交えた先行研究のレビューを行い，日本の ESD の特徴，ESD と SDGs
 ＊茨城大学 教育学部学校教育教員養成課程教育実践科学コース 教授 
- 2 - 
 
の連関構造を明らかにした。また，日本の農業高校において今後どのような ESD 実践が可
能であるのか，ESD 実践を通してどのような能力や資質が育まれるのかについて考察した。 
結論：ESD は各国の産業や歴史的背景を基盤とした環境教育に関連した実践が中心であり，
SDGｓと相互補完的な関係にあることを明らかにした。連関関係にある ESD と SDGs では
あるが，現在教育現場では，ESD は SDGs に置き換わりつつある。ESD の普及促進のため
には，フランスやドイツが導入している｢エコ・デレゲート｣や｢マルチプリケーター｣などの
認証制度の導入が有効である。農業高校では以前から農業生産工程管理(以下，GAP)に関す
る教育が行われており，ESD 認証制度の導入は比較的容易であると考えられる。環境教育
を基盤とする日本の ESD 実践に鑑み，農業高校での ESD 研究が今後の継続的な課題であ
ることを明らかにした。 
第 2章 農業高校における ESD と SDGs 実践に関する考察 
―全国農業高校教員・教育実践アンケート調査のテキストマイニング分析から― 
目的：農業高校教員を対象として，ESD および SDGs の理解に関する基礎的知見を得るこ
とを目的とした。アンケート調査により，職業に関する教科の一つである農業高校での ESD
および SDGs の認識および理解について量的・質的な分析を行い，現状と課題を明らかに
した。 
結論：農業高校教員が教育現場で行っている ESD と SDGs 実践には，「環境」という共通
項が見られ，相互補完的な連関関係の存在が確認できた。ESD および SDGs の実践を通し
た教員の変容は，進路の選択や地域への意識変革等，様々な場面での多角的な物事の考え
方・捉え方へとつながった。また，既存の教育課程やカリキュラム，学校教育目標等に ESD お
よび SDGs の観点を取り入れることで，多様な価値観および地域社会との連携が学校教育の
中に生ずる等，断片的ではなく学校組織として，教科横断的に様々な視点からの学びの場の
提供につながったことが明らかになった。いまだ ESD あるいは SDGs の実践に取り組んで
いない農業高校においては，既存の GAP 教育が活用できると考えられる。農業高校は職業
に関する教科の一つとして，地域農業をはじめ地域社会に根付いた存在であり，地方自治体
や社会教育施設との連携も多くみられることから，ESD が地域創生の鍵にもなる可能性が
ある。 
第 2部 農業高校における熱帯果樹カカオを教材とした ESD 実践 
第 1章 熱帯果樹カカオから学ぶ ESD 授業：青年海外協力隊（JOCV）によるカカオ・プ 
ロジェクトの現状と課題―フィリピン・レイテ島マタグオブ町の事例― 
目的：本章では，著者が参加した青年海外協力隊（以下，JOCV）が，フィリピン・レイテ
島マタグオブ町住民の生計向上を目的として約 6 年間取り組んだカカオ産業を分析・考察す
るとともに，JOCV の国際支援について ESD 教材としての可能性を探った。 
結論：フィリピン・レイテ島マタグオブ町におけるカカオ・プロジェクトの現状と課題につ
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いて，教員の体験的アプローチによる授業に参加した高校生からは様々な反応があった。著
者が担当する食品化学科生徒の中から，カカオについて関心を持った者も多く，担当教員の
助言を受けながら主体的なカカオに関する活動が始まった。JOCV の経験や農家とのつなが
りを教育現場に還元することは，海外の諸課題を生徒たちが自分事として感じ，解決に向け
て考え行動する ESD 実践の教材に成り得ると結論づけた。 
第 2章 熱帯果樹カカオを教材としたプロジェクト学習―生徒の主体的・対話的で深い学 
び― 
目的：本章では，農業高校の生徒がフィリピン・レイテ島におけるカカオ栽培の授業を動機
づけとして主体的に取り組んだプロジェクト学習を通じて，ESD 教材としての熱帯果樹カ
カオの可能性を探った。 
結論：専門科目でも教科や科目横断を意識した授業展開を取り入れることにより，幅広い知
識を応用したより実践的な学びとなり，結果として ESD や SDGs を意識した教科横断的な
授業展開ができることを明らかにした。カカオ栽培が抱える諸課題の解決に向けて，生徒自
らが課題を立案して計画および行動する，カカオを活用した教科横断型の ESD は，新学習
指導要領で重要とされている探究活動に資するものであった。新たな価値観の創造が生徒の
みならず，農家などの地域住民にも広がる可能性を明らかにした。また，プロジェクト学習
は「カカオ栽培」，「国際交流」，「加工品の製造・販売」の 3 つの側面を有し，これらが ESD
実践の 3 つの側面に呼応していることからも，熱帯果樹カカオの教材としての有効性が検証
できた。 
第 3章 熱帯果樹カカオを活用した ESD 教材開発と実践 
目的：熱帯果樹カカオを ESD 教材として活用し，農業高校で履修する「果樹」，「微生物利
用」，「食品製造」，「食品化学」を科目横断的に学習することで，6 次産業を通じた経営感覚
の醸成も視野に入れた授業実践について検討した。 
結論：日本では栽培データの乏しいカカオ苗栽培ではあるが，関東圏のガラス温室でも冬場
に加温した空間であれば，栽培が可能であることを明らかにした。今後結実が可能となれば，
カカオは ESD 教材として新たな可能性を発揮できると考えられる。また，教科「英語」，「家
庭科」，「地理歴史・公民」においても教科横断的学習が提供できる可能性が導き出された。
教科横断的に多くの教員を巻き込んだ熱帯果樹カカオを教材とした ESD 実践は，地域住民
も対象にした生涯学習の題材にもなることを示唆した。 
終 章 
本研究では，ESD 教材としてこれまでほとんど取り上げられてこなかった熱帯果樹カカ
オに着目し，農業高校における ESD の教材化および実践について検証した。本研究は理論
と実践の２部構成とし，第 1 部では，農業高校における ESD を意識した教材開発を考える
上で SDGs との関係に着目し，先行研究や諸外国の事例から総合的な検討を行った。第 2
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部では ESD 実践として，熱帯果樹カカオの教材化の可能性について検証した。 
第 1 部では，SDGs 採択以前から，環境教育を基盤とした諸外国の積極的な ESD 実践の
実態をたどり，ESD と SDGs の相互補完的な連関関係を明らかにした。また，ESD 普及の
ためにドイツ，フランスの認証制度の導入を提案した。「全国農業高校教員へのアンケート
調査」では，成果の表現や評価基準の難しさが明らかになった。ESD および SDGs の実践に係
る評価については記述式とする等，個々の生徒がどのように成長したかを評価する個人内評
価が有効であり，評価基準の明確化が必要である。また，教科・科目横断的な ESD の可能
性についても解明した。年間指導計画や学校教育目標に ESD を明記している学校はわずか
であることからも，長期的視座からの ESD 実践と学校全体を巻き込んだホールスクールア
プロ―チの実現が，学校という組織全体の基盤作りに貢献できると考えられる。今回の研究
では，ESD を各教科や科目の年間指導計画にどのように導入するかまでは研究するに至ら
なかった。今後，ESD を通した教科・科目横断的な学習については，さらなる研究を進め
ていく必要がある。 
本研究第 2 部では，熱帯果樹カカオの ESD 教材としての可能性について，新たな視座を
提示した。生徒によるプロジェクト学習は「カカオ栽培」，「加工品の製造・販売」，「国際交
流」という 3 つの側面に分類でき，これらが ESD 実践の 3 つの側面と呼応することから，
ESD 教材としての熱帯果樹カカオの有効性が検証できた。本研究で取り上げたプロジェク
ト学習は，2018 年の開始から 4 年目であり，いまだその教育的効果や汎用性についてはさ
らなる検討が必要である。今後，本研究でも取り上げた環境教育を中心とした ESD が活発
であるフランスの事例も参考に研究を進めたい。熱帯果樹カカオを ESD 教材として活用す
るためには，まずは日本でのカカオ苗について，その栽培方法の確立が必要である。 
熱帯果樹カカオの ESD 教材としての可能性を探る上で，教育学的視座のみならず，栽培
や食品化学など自然科学分野からも研究することは，教科農業の目的の一つでもある「職業
人に求められる倫理観を踏まえ合理的かつ創造的に解決する力を養う」ために，重要な意味
を持つ。今後は年齢や組織を超え，他分野が協働したさらなる研究を進めていきたい。そし
て，農業高校での熱帯果樹カカオを活用した ESD を通じて，「幅広い視野を持った持続可
能な社会形成に寄与する人材育成」に貢献していく所存である。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
本研究では，ESD（持続可能な開発のための教育）教材としてほとんど取り上げられてこ
なかった熱帯果樹カカオに着目し，農業高校における ESDの教材化および実践について新た
な知見を加えた。本研究は理論と実践の 2部構成とし，第 1部では ESDを意識した教材開発
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を考える上で SDGsとの関係に着目しドイツやフランスの認証制度が研修制度を有する点で
日本の GAP指導員と類似することを明らかにした。また，全国農業高校教員への意識調査の
テキストマイニング解析から ESDと SDGsの相互補完的関係を明らかにした。第 2部では ESD
実践として生徒のプロジェクト学習及び授業実践により，カカオが，｢栽培・国際交流・加
工品の製造・販売｣という ESDの 3側面(環境･社会･経済)すべてに対応し，教科等横断的 ESD
としてのホールスクールアプローチに貢献する新たな教材に成り得ることを明らかにした。
以上，本研究成果の重要性を評価した結果，審査委員一同は博士(環境共生学)の学位授与に
値すると判断した。 


農業高校における ESD を意識した熱帯果樹カカオの教材化および実践に関する研究

東京農業大学博士（国際バイオビジネス学

犬田, 剛

4572

INUTA, Takeshi

4573

農業法人における経営理念の特性と経営成果との関係性に関する実証的研究

大穂, 清隆

4568

OHO, Kiyotaka

4569

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氏 名   大 穂 清 隆 
学位（専攻分野の名称）   博 士（国際農業開発学） 
学 位 記 番 号   甲 第 860号 
学位授与の日付   令和 4年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   ジャボチカバ(Plinia cauliflora (Mart.) Kausel) ‘Sabara’の生殖 
生理に関する基礎的研究 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 小 塩 海 平 
               教 授・博士（農学） 入 江 憲 治 
               教 授・博士（農学） 山 田 隆 一 
                    農 学 博 士  弦 間   洋＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
地球温暖化に伴う気温の上昇に対する対応策として，また食の多様化に伴う国内需要の拡
大に伴い，日本においても熱帯果樹の栽培地域が増加している。ブラジル原産のジャボチカ
バ(Plinia cauliflora (Mart.) Kausel)は，食味や機能性成分だけでなく，収穫の容易さなどの
メリットがある。加えて， ジャボチカバ‘Sabara’は周年生産・収穫ができるため，農家の安
定した収入が見込まれる。日本では関東以南，特に静岡県，鹿児島県，沖縄県で商業的な栽
培が始められた。しかし，ジャボチカバの安定した持続的な生産に資するための生殖生理の
調査はいまだ少ない。そこで本研究では日本において最も普及しているジャボチカバ
‘Sabara’を用いて開花から果実成熟までの生殖生理の基礎的知見を得ることを目的とし，１）
開花および受粉受精に関する研究，２）花粉発芽に及ぼす温度の影響，３）果実および種子
の発達と胚珠の退化，４）果実成熟に伴う生化学的変化の解明について検討を行った。 
 
1.開花および受粉受精に関する研究 
開花は午前 1 時から 5 時頃にかけて行われ，また年間を通じて開花時刻に大きな変化はな
いことが明らかとなった。しかし，気温が下がると開花時刻は遅くなる傾向にあった。葯は
花弁が開ききる以前に破裂し，その際に柱頭に花粉が付着する。その後花粉は柱頭で発芽し，
花柱内に花粉管を侵入させ，午後 2 時頃には花粉管が子房に到達することが明らかとなった。 
 ＊筑波大学 名誉教授 
- 2 - 
 
2. 花粉発芽に及ぼす温度の影響 
人工培地を供試して花粉発芽に対するショ糖濃度と温度の影響を調査した。花粉の発芽に
好ましいショ糖濃度は 10%であった。温度に関しては，花粉発芽率および花粉管長は 25℃
で最も高くなった。また花粉の発芽に好ましい温度は，20-30℃であった。次に日本におい
てジャボチカバ栽培の制限要因となりうる低温（10-15℃）および高温（35-40℃）の曝露
時間が花粉の発芽に及ぼす影響について検討した。花粉は，低温処理によって影響を受けな
かったが，高温処理では 35 ℃で 2 時間以上，40 ℃で 1 時間以上経過すると，花粉管の伸
長が抑制された。このことから開花当日における日中の気温には十分注意する必要があるこ
とが明らかとなった。 
 
3. 果実および種子の発達と胚珠の退化 
一つの果実に含まれている種子数は一つの果実が 48%，二つの果実が 42%，三つの果実
が 8.7%，四つの果実で 1%であった。しかし，いずれの場合も胚珠の数は四つであったこ
とから，ほぼすべての果実において発達段階のいずれかで胚珠が退化することが明らかとな
った。胚珠の退化時期を調査した結果，退化パターンには二種類があり，開花 2~3 日目に
生じる場合と開花 10~12 日目に生じる場合があった。また胚発生の過程を顕微鏡観察した
結果，果実肥大が顕著になる以前に珠心で複数の胚が同時に発生していた。 
 
4. 果実成熟に伴う生化学的変化の解明 
ジャボチカバ果実の成熟メカニズムの解明と成熟指標の探索を目的とし，メタボローム解
析を行った。初めに高速液体クロマトグラフィー（HPLC）およびガスクロマトグラフ質量
分析計（GC-MS）を用いて，3 つの成熟段階における一次代謝産物に着目したメタボロー
ム解析を行った。その結果，果実の成熟過程における個々の代謝物の消長やトリカルボン酸
サイクル（TCA サイクル），嫌気性呼吸，シキミ酸経路，γ-アミノ酪酸経路などの代謝経
路の変動が明らかになった。ジャボチカバ果実は，成熟適期の見極めが難しいことが課題と
なっているが，成熟ステージから過熟ステージに移行する直前にアセトアルデヒドの生成が
- 3 - 
 
顕著に高まり，過熟ステージに移行した後はエタノールの生成が始まることから，アセトア
ルデヒドの生成が収穫の目印になることが示唆された。メロンの熟期判定のために開発され
た発色シールを実用化しうると期待される。 
本研究の成果は日本におけるジャボチカバ栽培に資するのみならず，熱帯の途上国におけ
るジャボチカバ栽培や収穫，貯蔵，輸送などに関して有益な情報を提供するものと考えられ
る。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
本研究は，周年結実するジャボチカバ‘Sabara’の開花から成熟までの一貫した生殖生理の
プロセスを明らかにした。開花から受粉受精のプロセスを明らかにし今後の栽培や育種の基
礎的な知見を得た。花粉発芽への温度の影響を調査した結果，発芽適温帯は 20-30℃であり，
高温に数時間晒されると花粉管長が低下することを明らかにし，栽培時の温度管理の指針と
なる知見を提示した。果実は発達途中で胚珠を退化させること，また多胚の発達する過程を
解剖学的な研究から明らかにした。さらに果実成熟に伴う生化学的変化の解明を目的にメタ
ボローム解析と開花日ごとの調査を行い，未熟果から過熟果までの一次代謝物の変化を明ら
かにするとともに，アセトアルデヒドおよびエタノールが成熟の指標となりうることを提示
した。これらの知見と発見は学術的に価値の高いものと認め，審査員一同は学位請求者に博
士(国際農業開発学)の学位を授与するに値すると判断した。 


ジャボチカバ(Plinia cauliflora(Mart.) Kausel)'Sabara'の生殖生理に関する基礎的研究

東京農業大学博士（生物産業学

輿石, 雄一

4538

KOSHIISHI, Yuichi

4539

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氏 名   輿 石 雄 一 
学位（専攻分野の名称）   博 士（生物産業学） 
学 位 記 番 号   甲 第 845号 
学位授与の日付   令和 4年 3月 17日 
学 位 論 文 題 目   Development and application of molecular genetic markers in the 
            emu(Dromaius novaehollandiae) 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（獣医） 平 山 博 樹 
               教 授・博士（生物産業学） 和 田 健 太 
               教 授・博士（生物産業学） 亀 山 祐 一 
               名誉教授・農 学 博 士  横 濵 道 成 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
The emu (Dromaius novaehollandiae) is a ratite bird originally from Australia. In the recent years, 
emu have been expected to become a novel poultry producing low-fat meat, hypo-allergenic eggs, 
and oil containing high proportion of unsaturated fatty acids. Especially, emu oil is one of the most 
important products since it has anti-inflammatory properties and thus been utilized for skin care 
products. The domestication of emu began in the 1970s in Australia, and that were followed by 
America, China, Japan, and other countries. Unlike livestock such as cattle, pig, and chicken, genetic 
improvement for efficient production of the emu’s traits has not been progressed yet due to its short 
history of utilization. Therefore, genetic improvement of the emu is important challenge to its 
efficient production and development of the emu industry.  
The aim of this study was development of DNA markers for simple and cost-effective sexing 
method and of novel microsatellite markers for estimation of genetic relationship among populations 
and for development of accurate parentage method.  
 
Development of a simplified protocol for molecular sexing 
The accurate sexing of emu chicks is essential for the success of plans to establish high-quality 
pedigrees. However, male and female emus have nearly identical appearance not only chicks but also 
adults. Although morphological differences of the internal genital tract can be used to distinguish the 
sexes, a high degree of diagnostic skill is required for accurate sexing. DNA-based sexing methods 
are highly accurate and can be used to diagnose sex without requiring a high degree of technical 
skill. Kloet (2001) first developed the molecular method for sexing the emu, and designated the 
diagnostic marker loci ESEXZ and ESEXW. ESEXZ and ESEXW can be distinguished by PCR-RFLP 
using BglII based on sequence differences identified by Kloet (2001). However, conventional 
- 2 - 
 
PCR-RFLP is time consuming and costly, requiring the digestion of PCR products. In this study, the 
author attempted to simplify the protocol for sexing the emu by using multiplex PCR without 
restriction enzyme treatment. Multiplex PCR based on a W-specific primer, with the commonly 
designed primer set on both Z and W chromosomes, amplified both 197-bp and 272-bp bands in the 
female, and only the 272-bp band in the male. Sexing results obtained in this way were completely 
concordant with results obtained using the conventional PCR-RFLP method. Thus, development of 
simplified protocol for sexing the emu was succeeded, and this method might be useful tool to 
improve production efficiency by facilitating planned pairing and selection of individuals to establish 
high-quality pedigrees.  
 
Genetic diversity of emu population in a Japanese farm based on microsatellite DNA analysis 
To develop emu farming in Japan, its genetic improvement is one of the most important issues, 
and genetic diversity is the foremost parameters for efficient and sustainable breeding of these 
animals. In general, genetic diversity of livestock should be managed by selective mating while 
preventing inbreeding. Meanwhile, the genetic structure of emu populations in Japanese farms is 
scarcely known. Microsatellite sequences are useful genetic markers to evaluate genetic diversity in 
animal populations. The aim of this study was to determine the genetic diversity and population 
structure in the largest emu farm in Japan based on microsatellite markers.  
The feather pulps of emu chicks (N = 131) were collected from 40, 20, 23, and 48 individuals 
hatched at 2013, 2014, 2015, and 2016, respectively, in the Okhotsk Emu farm (OEF) in Abashiri, 
Hokkaido, Japan. Using six microsatellite markers, genetic diversity and structure were investigated 
in this farmed emu population. The number of alleles (NA) were 4.83, 4.17, 4.17, and 7.17, in 
animals hatched in 2013, 2014, 2015, and 2016, respectively. Expected and observed heterozygosity 
(HE; HO, respectively) was 0.47/0.34, 0.43/0.33, 0.43/0.38, and 0.55/0.35, in each year, respectively. 
A high inbreeding coefficient (FIS) was observed in all tested generations (0.11-0.37). The Structure 
program and unrooted phylogenetic tree analysis showed that the OEF population is largely divided 
into three to five different clades. Our results suggested that the genetic diversity in the OEF 
population is low, and that it contains three to five genetic lineages. These data may help guide a 
more sustainable breeding of emus in Japan. 
 
Development and characterization of ten novel microsatellite loci and genetic diversity of 
Japanese farm populations 
The OEF population showed the low genetic diversity in previous section, indicating that there is 
necessity of genetic management via exchange of individuals among farms to increase genetic 
- 3 - 
 
diversity. However, genetic structure and relationships among farmed emu populations in Japan are 
unknown and the number of microsatellite markers for genetic analysis of the emu is insufficient. In 
this section, the author aimed to develop novel microsatellite markers and to genetically characterize 
OEF, Japan Eco System, Co., Ltd. (JES) and Tohoku Safari Park (TFP) populations.  
Total 102 microsatellite-enrichment genomic DNA libraries were isolated according to method 
provided by Glenn and Schable (2005), and 46 of those microsatellite regions could be amplified by 
PCR. Finally, 17 microsatellites were isolated from the 46 regions and developed 10 new 
polymorphic microsatellite markers. These microsatellite markers were used to characterize three 
farm emu populations in Japan. The number of alleles ranged from 3 to 13 and the expected (HE) and 
observed heterozygosity (HO) of these microsatellite loci was 0.19–0.80 and 0.18–0.65, respectively. 
The polymorphic information contents ranged from 0.18 to 0.79. Positive inbreeding coefficient (FIS) 
values were detected in all tested populations, and they ranged from 0.30 (TSP) to 0.13 (JES). 
Although these results suggest that farm populations of the emu in Japan resulted from inbreeding, 
JES population maintained a relatively higher genetic diversity compared with OEF and TSP 
populations. The fixation index (FST) values ranged from 0.03 to 0.06, and phylogenetic trees and 
population structure analysis confirmed no definitive genetic differentiation among the three 
populations. Therefore, these populations are at a relatively low level of genetic differentiation at 
present. Despite the lack of clear genetic differentiation at K=5, a slight deflection in allelic 
composition was observed among the populations. Taken together, the results presented here suggest 
that three major Japanese farmed emu populations can be largely divided into four genetic groups 
with slight deflection of allelic composition. The microsatellite markers developed in our study can 
be utilized for genetic analysis and preservation of genetic resources in the emu.  
To more characterize genetic relationship among Japanese emu populations, composition of 
mitochondrial DNA (mtDNA) haplotypes was investigated. Nucleotide sequences of 348 bp on 
D-loop region were determined in 109 individuals derived from OEF, JES and TSP populations, and 
4 substitution sites and total 3 haplotypes (Hap-a, -b and -c) were detected. The AMOVA indicated 
that 9% of total variance were “among population”, the FST value was 0.09 with significant genetic 
differentiation (P < 0.01). Therefore, low level of genetic differentiation among Japanese populations 
were found. Hap-a was the most frequently detected haplotype in all of tested populations. Hap-b 
was found in OEP (0.13) and JES (0.21), but not TSP. Although Hap-c was rarely found in OEF 
(0.03), its frequency was relatively higher in TSP (0.32). In conclusion, the mtDNA variations among 
Japanese farmed emu populations based on D-loop polymorphisms were revealed and a rare 
haplotype in many individuals derived from TSP were found. These results will contribute to 
efficient extending the genetic diversity of Japanese emu populations by the exchange of individuals 
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among farms.  
 
Development of 49 novel microsatellite markers from Next-generation sequencing data and a 
robust method for parentage tests 
Pedigree information is essential for genetic improvement, however it is difficult to record because 
of complex reproduction system in the emu. The breeding system of the emu is generally 
polygamous, and multiple females lays eggs in one nest, which are then brooded by the males. To 
identify parent-offspring relationships in the emu, parentage test based on polymorphic DNA 
markers have to be developed. First, the author attempted parentage test using 9 microsatellite 
markers developed in previous section and confirmed that its accuracy was low. This fact indicated 
the necessity of many microsatellite markers for accurate parentage tests in the emu. In this section, 
the author aimed to extensively develop novel microsatellite markers based on the Next-generation 
sequencing (NGS) data and QDD pipeline and establish accurate parentage tests in the emu.  
Feathers and eggshell membranes were collected from 28 adults and six chicks, respectively, at 
OEF. Although reproductive individuals at OEF are reared in mixed groups of more than 15 males 
and females, only two pairs were separated as a pilot study. Eggs laid from these pairs were collected, 
labeled and incubated in an incubator for approximately 50 days. Feathers collected from 24 
non-parent individuals were used for negative control in the parentage test.  
More than 25,000 microsatellite regions were isolated from NGS data via the QDD pipeline. The 
dinucleotide motifs, (AC)n, (AT)n and (AG)n, were the most frequently detected and were found on 
10,167 (38.55%), 8,114 (30.76%) and 4,796 (18.18%) contigs, respectively. Novel 49 microsatellite 
markers were characterized in 20 individuals and showed NA ranged from 2 to 12, with an average 
of 4.2. HE / HO ranged from 0.39/0.07 to 0.70/1.00 with an average of 0.60/0.52. PIC value ranged 
from 0.06 to 0.89 with an average of 0.53, and 17 of 49 markers showed a higher polymorphism than 
0.50. Thirty-four individuals were genotyped using 12 markers, and CERVUS simulations based on 
genotype showed that parents of all offspring were identified with 0.99-1.00 probability. Thus, the 
author succeeded to develop 49 novel polymorphic microsatellite markers and a robust method for 
parentage test for the Japanese emu. 
 
Conclusion 
This study succeeded to develop a simplified protocol for molecular sexing in the emu. In addition, 
the author revealed composition of microsatellites in emu genome and developed total 59 novel 
microsatellite markers. Finally, genetic structure and relationships were defined in Japanese major 
farm emu populations, and a system for robust parentage test was succeeded to established. These 
- 5 - 
 
results predict to contribute efficient conservation of genetic resources, acceleration of genetic 
improvement and genomic analysis in the emu.  
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
本研究は，エミューの簡便な雌雄判定法を確立し，54 種の新規マイクロサテライトマー
カーの開発を通じて，国内集団の遺伝的構造を明らかにし，高精度な親仔鑑定法を確立し
た。本研究の成果は，雌雄の外貌的判別な困難であったエミューの計画的なペアリングに
貢献し，近交度が高い国内集団の遺伝的多様度の拡大，その繁殖・飼育様式から困難であ
った親仔鑑定を可能とした。これらの意義は，ほとんど遺伝的改良のないエミューにおい
て，効率的な選抜育種を行う基盤が整備されたことにある。 
エミューは，生命力が強く，粗放な管理でも利用価値の高い畜産物を生産でき，特に有
益な生理活性物質である不飽和脂肪酸を生産するユニークな新規家畜として注目されて
いる。しかし，その生産効率は低い。一方で，ウシやブタに代表されるような家畜では，
数千年をかけて家畜化と遺伝的な改良が行われ，ウシであればホルスタイン種や黒毛和種
といったように，乳量や肉質に特化した品種が人為的に造成されている。さらに主要な家
畜では現状にとどまることなく遺伝的改良が継続され，DNA マーカーを用いた育種改良が
実際に活用されている。網走市は日本で最大羽数のエミューを飼育しているが，その収益
性を改善して産業として発展させていくために数千年をかけて地道な改良を続けるので
はなく，先端技術を導入してエミューの育種改良を進めていく必要がある。本研究は，エ
ミューの遺伝的改良を通じて産業に貢献することを目的としており，迅速で正確な雌雄鑑
別技術や個体識別に必須な多数の遺伝子マーカーを開発できたことは，先駆的研究として
大いに評価できた。これによって，今後，親仔判定を通して優良個体の選抜が可能となり，
開発したマーカーとの連関解析により脂肪酸の生理学的産生に関る遺伝子情報が蓄積で
きることとなった。これらの技術と情報は，今後，オイルや卵肉の生産形質との関係性に
ついて解析が進められることで，高能力エミューの強力な選抜ツールとなることが期待さ
れる。よって，本研究はエミューの遺伝的改良に貢献できる先駆的研究として，評価でき
ると判断した。 
以上のように，主査および 3 名の副査から審査報告を行い，専攻内可否を審議した結果，
審査員一同は輿石雄一氏に博士（生物産業学）の学位を授与する価値があると判断した。 


Development and application of molecular genetic marker in the emu(Dromaius novaehollandiae)

東京農業大学博士（バイオサイエンス

池田, 晋也

4546

IKEDA, Shinya

4547

- 1 - 
 
氏 名   池 田 晋 也 
学位（専攻分野の名称）   博 士（バイオサイエンス） 
学 位 記 番 号   甲 第 849号 
学位授与の日付   令和 4年 3月 20日 
学 位 論 文 題 目   レトロトランスポゾンが雌雄生殖細胞の機能に及ぼす影響
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 小 川 英 彦 
               教 授・博士（畜産学） 尾 畑 やよい 
               教 授・博士（医学） 中 澤 敬 信 
               客員教授・博士（理学）  宮 戸 健 二＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
【背景・目的】 
 雌雄配偶子の祖細胞である始原生殖細胞はマウスにおいて胎齢 7.25 日に体細胞の系譜か
ら分離することで出現する。始原生殖細胞では多分化能を獲得するために，全ゲノムレベル
でDNAの脱メチル化が行われるが，それに伴いレトロトランスポゾンが脱抑制してしまう。
こうしたレトロトランスポゾンの脱抑制はゲノムの完全性を維持し，それを子孫細胞や次世
代へ継承する上での脅威となりうる。雄性生殖系列において，レトロトランスポゾンは精子
幹細胞の前駆細胞である周産期前精原細胞の段階において piRNA 経路により再抑制される。
piRNA 経路は小分子 RNA である piRNA をガイドに DNA のメチル化を行うことでレトロ
トランスポゾンの抑制を担う。piRNA 経路の欠損は雄性生殖細胞系列において，レトロト
ランスポゾンの脱抑制と幼若期（2 週齢）以降における第二減数分裂前（一次精母細胞）で
の発生停止を引き起こすことが知られている。このように周産期でのレトロトランスポゾン
の抑制は出生後の正常な精子形成に必須の役割を持つ。しかしながら，piRNA 経路の欠損
は前精原細胞に顕著な表現型異常を生じさせない。前精原細胞は，精子幹細胞，精母細胞，
精子を含む雄性生殖細胞の根幹となる細胞であり，piRNA 経路の破綻によるレトロトラン
スポゾンの活性化が前精原細胞にどのような影響を及ぼし，後に精子形成不全に至らしめる
のか理解する生物学定義は大きい。一方，雌性生殖系列においては piRNA による DNA メ
チル化を介したレトロトランスポゾンの抑制機構が働いていないことが報告されてきてい
る。実際，前精原細胞と同時期の卵母細胞では DNA メチル化酵素は発現しておらず，また，
piRNA 経路に属する遺伝子を欠損しても雌の妊孕性には影響を与えない。このことから，
雌性生殖系列においては，前精原細胞では piRNA 経路により抑制される，レトロトランス
ポゾンの活性化がもたらす機能が許容されている可能性がある。あるいは DNA メチル化に
 ＊国立開発研究法人国立成育医療研究センター 再生医療センター細胞医療研究部生殖細胞機能研究室 室長 
- 2 - 
 
依存しない，レトロトランスポゾンを抑制する別の機構が存在する可能性が示唆される。 
 そこで本研究では，レトロトランスポゾンの活性化が初期の雌雄生殖細胞の機能に及ぼす
影響を解明することを目的とし，まず第一に piRNA 経路のマスターレギュレーターである
ankyrin repeats, SAM, and basic leucine zipper domain-containing 1 (Asz1) 遺伝子の欠
損マウスを解析することとした。第二に，DNA メチル化に依存的なレトロトランスポゾン
の抑制機構が存在しない初期雌性生殖系列において，レトロトランスポゾンが Asz1 欠損マ
ウスの前精原細胞と同様に活性化し，機能しているかを検証することとした。 
 
【結果】 
1. Asz1 欠損マウスの表現型 
 研究を進めるにあたり，Asz1 欠損マウスの表現型を詳細に解析した。3 週齢の精巣に対
してウェスタンブロットを行ったところ，野生型とは対照的に Asz1 欠損マウスの精巣では
ASZ1 タンパク質が検出されなかった。精巣の組織学的な解析を行った結果，Asz1 欠損マ
ウスの精巣では，野生型の精巣で伸長精子細胞が出現する時期になってもそれらの細胞は見
られず，精子形成が途中で停止していた。それに伴い，野生型の精巣と比較して Asz1 欠損
マウスの精巣は萎縮していた。これらの表現型は過去に報告さている Asz1 欠損マウスの表
現型と一致していた。 
 次に，Asz1 欠損マウスにおける精子形成の停止時期を正確に把握するために，3 週齢精
巣由来の精母細胞におけるシナプトネマ複合体に対する蛍光免疫染色を行った。その結果，
野生型では第一減数分裂前期を構成するレプトテン期，ザイゴテン期，パキテン期とディプ
ロテン期の全てのサブステージの精母細胞が確認されたのに対し，Asz1 欠損マウスでは最
も減数分裂が進行している精母細胞はザイゴテン期に相当する精母細胞であり，相同染色体
の対合が完了するパキテン期以降の精母細胞は確認されなかった。これらの表現型は，同じ
く piRNA 経路の構成遺伝子である Mili や Miwi2 の欠損マウスでも報告されており，Asz1
欠損マウスにおいてもそれらの遺伝子と同様に piRNA 経路の機能不全が起きていることが
示唆された。 
 
2. Asz1 欠損マウス前精原細胞における MIWI2 の核内局在の消失 
 Asz1 欠損マウスの前精原細胞においてはレトロトランスポゾン mRNA の分解と piRNA
の産生を同時に担う MILI の発現が著しく発現低下することが知られている。その一方で，
piRNA 依存的にレトロトランスポゾンへの DNA メチル化導入を担う MIWI2 の Asz1 欠損
による挙動の変化は明らかになっていない。そこで，胎仔期前精原細胞における MIWI2 の
発現を解析した。その結果，野生型の前精原細胞において MIWI2 は細胞質と核の両方に局
在していたが，Asz1 欠損マウスの前精原細胞では MIWI2 の核内局在が消失し，細胞質に
- 3 - 
 
のみ局在していた。このことから，Asz1 欠損マウスの前精原細胞では DNA メチル化導入
の失敗により，全ゲノムレベルでレトロトランスポゾンの転写抑制が破綻していることが示
唆された。このことを支持するように，前精原細胞においてレトロトランスポゾン LINE1
の発現が上昇していた。 
 
3. piRNA 機構の破綻が前精原細胞の遺伝子発現に及ぼす影響 
 これまでの結果からAsz1欠損マウスの前精原細胞ではレトロトランスポゾンの転写レベ
ルおよび転写後レベルでの抑制機構が破綻していることが示唆された。次に Asz1 欠損が前
精原細胞の遺伝子発現に与える影響を RNA-seq により解析した。想定される通り，Asz1
欠損マウスの前精原細胞では LINE 型および LTR 型のレトロトランスポゾンが野生型に対
して発現上昇していた。遺伝子については，それぞれ 275 と 216 の遺伝子が有意に発現上
昇および発現低下していた。発現上昇遺伝子のうち，100 倍以上の著しい発現上昇比を示し，
精子形成におけるアポトーシスへの関与が示唆されている Apoh 遺伝子に着目した。その結
果，Asz1 欠損マウスの前精原細胞で発現上昇していた Apoh 遺伝子は，Apoh のイントロン
上に存在するレトロトランスポゾン IAPLTR1_Mm と Apoh の 4 番から 8 番エクソンが融
合した異常なトランスクリプトバリアントであることが明らかとなった (以降 IAP-Apoh
と呼称する)。このことから，Asz1 欠損マウスの前精原細胞では脱抑制したレトロトランス
ポゾンが新たな転写開始点を形成し，異常トランスクリプトバリアントを産生することが示
唆された。 
 
4. 前精原細胞における異常な融合トランスクリプトの検出 
 次に，Asz1 欠損マウスの前精原細胞で存在が示唆された異常な融合トランスクリプトの
検出を試みた。その結果，32 の遺伝子について異常な融合トランスクリプトの発現が確認
された。これら 32 遺伝子について野生型と Asz1 欠損マウスの前精原細胞での発現パター
ンを元に階層的クラスタリング解析を行ったところ，大きく二つのグループに分けられるこ
とがわかった。一つ目のグループは，典型トランスクリプトが野生型と Asz1 欠損前精原細
胞のどちらでも発現していないが，Asz1 欠損前精原細胞において異常な融合トランスクリ
プトが発現しており，発現が著しく上昇しているように見えるグループである。このグルー
プには IAP-Apoh が含まれた。2 つ目のグループは，典型トランスクリプトが両方の遺伝子
型の前精原細胞で発現しているが，Asz1 欠損前精原細胞では典型トランスクリプトに加え
て異常な融合トランスクリプトが発現しており，発現量を傘増ししているグループである。
後者のグループは正常な精子形成に必要な Fancd2 遺伝子の異常な融合トランスクリプト
である IAP-Fancd2 が含まれた。検出された 32 の異常な融合トランスクリプトは，ほとん
どが上流 1 kb 以内に 1 つ以上の LINE 型もしくは LTR 型のレトロトランスポゾンを含ん
- 4 - 
 
でいた。以上のことから，Asz1 欠損前精原細胞において，異常な融合トランスクリプトに
より遺伝子発現の恒常性が失われていることが明らかとなった。 
 
5. Asz1 欠損前精原細胞における DNA メチル化 
続いて，異常な融合トランスクリプトの転写への関与が疑われるレトロトランスポゾンの
DNA メチル化解析を行った。その結果，IAP-Apoh と IAP-Fancd2 の上流に存在するレト
ロトランスポゾン IAP はどちらも野生型の前精原細胞では高メチル化であったのに対し，
Asz1 欠損前精原細胞では高メチル化されたアレルを保持してはいるものの低メチル化傾向
にあることがわかった。この二峰性の DNA メチル化パターンは 2 週齢の精巣生殖細胞にお
いても確認された。これらの結果から，レトロトランスポゾンの活性化および異常な融合ト
ランスクリプトの転写は DNA メチル化不全により引き起こされていることが示唆された。 
 
6. 新生仔卵母細胞における IAP-Fancd2 の DNA メチル化非依存的な抑制 
レトロトランスポゾンの DNA メチル化に重要な MIWI2 は卵子形成においては発現して
おらず，加えて新生仔卵母細胞では DNA メチル化酵素も発現しないことが知られている。
しかしながら，qRT-PCR 解析の結果，レトロトランスポゾン由来の異常な融合トランスク
リプトの１つである IAP-Fancd2は Asz1欠損前精原細胞に比べて発現が著しく低いことが
示され，DNA メチル化に依存しない抑制機構が存在することが示唆された。そこで新生仔
卵母細胞における抑制型ヒストン修飾に着目して解析を行った。その結果，野生型の新生仔
卵母細胞では，IAP-Fancd2 の転写開始点付近に抑制型ヒストン修飾の１つである
H3K9me2 の蓄積が確認された。この蓄積は胎齢 13.5 日の生殖細胞ですでに確認されたこ
とから，初期の生殖細胞と卵母細胞において異常な融合トランスクリプトはヒストン修飾依
存的に抑制されていることが示唆された。 
 
【考察】 
 piRNA 経路の欠失によるレトロトランスポゾンの活性化が初期の雄性生殖細胞である前
精原細胞そのものに与える影響については不明であったが，本研究により，レトロトランス
ポゾンの活性化は前精原細胞においてレトロトランスポゾン由来の異常な融合トランスク
リプトの転写を引き起こすことが明らかとなった。Asz1 欠損前精原細胞において観察され
たこの現象は，piRNA をガイドにレトロトランスポゾンへの DNA のメチル化導入を担う
MIWI2 が機能不全となり，DNA メチル化を失って活性化したレトロトランスポゾンのプ
ロモーター活性により引き起こされたことが示唆された。実際，異常な融合トランスクリプ
トの転写への関与が疑われるレトロトランスポゾンはAsz1欠損前精原細胞において低メチ
ル化傾向を示した。前精原細胞において DNA メチル化はレトロトランスポゾンの制御に重
- 5 - 
 
要ではなく，このような異常な融合トランスクリプトは存在しないと考えられてきた。しか
しながら本研究により前精原細胞の時点でレトロトランスポゾンの活性化は異常な融合ト
ランスクリプトの発現を誘起することで前精原細胞の遺伝子発現の完全性を乱すことが明
らかとなり，piRNA 経路は前精原細胞においてこれらの抑制に重要な役割を担っているこ
とが明らかとなった。さらに piRNA 経路は雄性生殖系列が不均一な遺伝子発現動態を示す
集団になることを抑制する潜在的な機能があることが明らかとなった。 
 一方で，前精原細胞とは異なり，初期卵母細胞では DNA メチル化酵素が発現しないこと
が知られているが，Fancd2 の異常な融合トランスクリプト（IAP-Fancd2）は初期卵母細
胞で抑制されており，これには抑制型ヒストン修飾の１つである H3K9me2 の関与が示唆
された。これらのことから，雌性生殖細胞ではレトロトランスポゾンの活性は piRNA 経路
を介した DNA メチル化に非依存的な機構で抑制されており，レトロトランスポゾンによる
トランスクリプトームへの影響は限定的であった。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
レトロトランスポゾンは生物に進化をもたらす一方，ゲノムの不安定性を招き種の存続を
危うくする要因にもなりうる。そのため，レトロトランスポゾンは通常 piRNA，DNA メチ
ル化あるいは抑制型ヒストン修飾などにより抑制されているが，レトロトランスポゾン抑制
に必要かつ十分な条件の全容は不明である。池田晋也氏は，piRNA 機構欠如によるレトロ
トランスポゾンの脱抑制が雌雄生殖細胞に及ぼす影響が明らかにした。piRNA 機構の主要
因子である Asz1 を欠損したマウスの前精原細胞においては，レトロトランスポゾンが活性
化すること，またその領域の DNA メチル化が欠如していること，それによってレトロトラ
ンスポゾンからの転写産物とタンパク質をコードする遺伝子のエクソンが融合したキメラ
転写産物が生じることを見出した。前精原細胞のレトロトランスポゾン抑制に DNA メチル
化は重要でないと考えられてきたが，本研究により，piRNA 経路を介した DNA メチル化が
不可欠であることが明らかとなった。一方，雌性生殖系列の非成長期卵母細胞においては，
piRNA 経路の主要因子である MIWI2 や DNA メチル化酵素が発現していないが，H3K9me2
などのヒストン修飾によりレトロトランスポゾンが抑制されている可能性が示唆された。こ
れらの研究成果等を詳細に検討した結果，審査員一同は池田晋也氏に博士（バイオサイエン
ス）の学位を授与するに相応しいと判断した。 


レトロトランスポゾンが雌雄生殖細胞の機能に及ぼす影響

柴田, 武彦

4582

SHIBATA, Takehiko

4583

- 1 - 
 
氏 名   柴 田 武 彦 
学位（専攻分野の名称）   博 士（農学） 
学 位 記 番 号   甲 第 867号 
学位授与の日付   令和 4年 3月 21日 
学 位 論 文 題 目   ムラサキセンダイハギの開花調節に関する研究
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（農学） 雨 木 若 慶 
               教 授・博士（農学） 馬 場   正 
               教 授・農 学 博 士 河 合 義 隆 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
ムラサキセンダイハギ（Baptisia australis (L.) R.Br.）は北アメリカ原産のマメ科宿根草
である。小花は青紫色の蝶形花冠で総状花序を形成し，神奈川県で露地栽培すると通常 5
月上中旬に開花する。初夏に咲く花としては非常に魅力的な花色をもつ。本植物は，冬の低
温を受けることで地上部が一旦枯死するが，翌春の温度上昇とともにシュートが伸長し開花
するサイクルを繰り返す。シュートはそれぞれ 1 度しか開花しない特性のため，切り花とし
ての収量が限られ，採花期間が短い。またこれまで開花習性に関する学術的研究はなかった。 
本研究では，まず第 1 章においてムラサキセンダイハギの花芽形成過程を詳細に観察した。
さらに通常の地植え露地栽培における花穂長，小花数を測定し，ホームユースを前提とした
切り花としての採花基準を定めた。次に第 2 章では本植物の採花期拡大を探るため，開花誘
導に必要な低温要求量を明らかにし，開花期を早める促成栽培のための低温処理条件を検討
した。次いで第 3 章では低温貯蔵による抑制栽培を試み，開花期を遅らせる貯蔵条件を探っ
た。さらに第 4 章において，切り花品質の向上を目指して，発光ダイオード（LED）光源
による補光栽培の可能性を検討した。 
 
第 1章 ムラサキセンダイハギの花芽形成過程と切り花としての採花基準 
 ムラサキセンダイハギの採花期間の拡大に向けた基礎データを得るために，花芽形成過程
を調査した。北海道札幌市の苗生産者から入手したムラサキセンダイハギの実生 4 年生株を，
直径 18 cm のプラスチックポットに定植，供試した。2016 年 10 月に 8℃のプレハブ冷蔵
庫に 12 週間入れ低温処理した後，最低 15℃を維持したガラス温室へ移動し栽培した。低温
処理中は 0，4，8，12 週の 4 回，加温中は 1 週間ごとに 7 回，1 回 4 株ずつを掘りあげ，
頂芽の状態を実体顕微鏡にて観察した。花芽形成過程を観察したところ，Ⅰ：分化初期，Ⅱ：
花房分化期，Ⅲ：がく形成期，Ⅳ：花弁・雄ずい・雌ずい原基形成期，Ⅴ：葯形成期，Ⅵ：
- 2 - 
 
小花完成期に分けられ，この過程は他のマメ科植物と類似していた。また 8℃低温処理開始
から 4 週で小花の分化が確認でき，低温遭遇後早い段階で花芽となるシュートが決定してい
ることが明らかとなった。 
次に家庭用切り花としての採花基準を定めるために，地植え露地栽培した場合の花穂長と
小花数を観察した。同じ苗生産者から入手した実生 2，3 年生株 20 株を 2015 年 11 月に東
京農業大学厚木キャンパス内で露地植えした。翌年 5 月に開花がみられたが開花シュートは
少なかったため，露地栽培を継続した。翌々年 5 月に 239 本の切り花が得られたので，花
穂長と小花数を測定した。その結果，花穂長 30.4cm，小花数 21.7 個が平均であった。小花
のほとんどが開花に至ることを考慮して，ムラサキセンダイハギでは花穂長 30～40cm，開
花小花数 20 個以上を採花基準とした。 
 
第 2章 ムラサキセンダイハギの低温処理による促成栽培 
 採花期間の前進化を目指して，低温の処理期間と温度を変えて開花反応を観察した。同じ
苗生産者から入手した実生 3 年生株を定植して供試した。2015 年 10 月に 8℃のプレハブ冷
蔵庫に入れ，低温処理期間を 0，8，12，16 週と変え，その後最低 15℃を維持したガラス
温室に移動して栽培した。対照区として，戸外の自然低温に置く区を設けた。その結果，低
温無処理では発蕾はしたものの開花には至らなかった。一方，12 週間の低温処理を行った
場合，自然低温区と比べて開花が 50 日以上早まり，3 月中旬まで前進した。この時の花穂
長，開花小花数はそれぞれ 24.0cm，18.5 個であった。 
次に低温処理温度を変えて開花反応を観察した。同じ苗生産者から入手した実生 4 年生株
を定植して供試した。2016 年 10 月に 1，5，8，15℃の定温庫に入れ 12 週間置いた。その
後最低 15℃を維持したガラス温室に移動して栽培した。その結果，15℃処理区は発蕾した
がすべて開花に至らずアボートした。一方，8℃以下の処理区ではすべて開花が 3 月中旬と
早まり，花穂長，開花小花数の平均値は 10.5cm，6.9 個であった。 
以上のような促成栽培法は低温貯蔵庫を利用したもので，生産現場での利用は限られる。
より汎用性が高い方法として，自然低温を利用した方法を試みた。同じ苗生産者から入手し
た実生 4 年生株を定植して供試した。2016 年 11 月に東京農業大学厚木キャンパス内の戸
外に搬出し，8，12 週自然低温に遭遇させてから最低 15℃を維持したガラス温室に移動す
る区と，そのまま戸外に置く区を設けた。その結果，自然低温遭遇 12 週区で開花が 30 日
程度早まった。このように自然低温を利用した方法でも露地栽培と比べて約 1 か月早い 4
月上旬の開花が可能であった。この時の花穂長，開花小花数はそれぞれ 16.1cm，8.9 個で
あった。 
以上より，ムラサキセンダイハギの低温遭遇による開花は，低温貯蔵庫利用の場合は 8℃
12 週間，自然低温利用の場合は戸外に 12 週間置いてから，それぞれ最低 15℃を維持した
- 3 - 
 
ガラス温室で栽培することで，それぞれ3月中旬，4月上旬まで開花を早めることができた。 
 
第 3章 ムラサキセンダイハギの長期低温貯蔵による抑制栽培 
 次に長期低温貯蔵による抑制栽培の可能性を調査した。8℃貯蔵した場合 4 月上旬には貯
蔵庫内でシュートの伸長開始がみられたので，8℃よりも低い温度での貯蔵による開花の遅
延を目指した。同じ苗生産者から入手した実生 4，5 年生株を 2019 年 3 月に 1，3℃のイン
キュベータに入れ，同年 5 月と 6 月に搬出し，定植後戸外で栽培した。その結果，開花日
は貯蔵温度によらず，5 月搬出で 6 月上旬，6 月搬出で 7 月上旬となった。なお，1℃貯蔵
では 6 月搬出時までシュートの伸長はみられなかった。一方，3℃貯蔵では 5 月搬出時に
2.0cm 以上の伸長がみられたため，抑制栽培時の貯蔵推奨温度を 1℃とした。この時の花穂
長，開花小花数はそれぞれ 9.8cm，6.2 個であった。このように苗を 1℃で貯蔵することで
7 月上旬まで継続的に開花可能であることがわかった。 
 
第 4章 ムラサキセンダイハギの切り花品質の向上に向けた発光ダイオード（LED）補光 
 第 2，3 章の促成・抑制栽培は鉢植えで行ったが，地植え露地栽培と比べると花穂長が短
く開花小花数も少なかった。切り花の品質改善法の一つに LED 補光技術の導入がある。そ
こで，LED 単色光補光によるムラサキセンダイハギの切り花品質の改善を目指した。同じ
苗生産者から入手した実生 4，5 年生株を定植して供試した。定植後すぐの 2019 年 3 月に
最低 15℃を維持したガラス温室に移動して栽培した。初年度は生長・開花が不揃いであっ
たため，ガラス温室内で栽培を継続し，10 月に戸外に移動し低温遭遇させた。翌年 4 月 26
日にガラス温室に戻すと同時に LED 照射を開始した。LED 照射区は，青 LED（ピーク波
長 470 nm）区，緑 LED（同 530 nm）区，赤 LED（同 630 nm）区の 3 区と，対照区とし
て無補光の計 4 区とした。補光時間は，6：00～18：00 の 12 時間とし，鉢用土表面で 80µmol･
m-2･s-1PPFD に調整した。その結果，補光しなかった対照区の花穂長，開花小花数が 25.4cm，
11.9 個であったのに対し，赤 LED の補光により 40.0cm，17.4 個まで改善され，目安とし
た切り花の採花基準に近づくことができた。 
 
以上のように本研究は，ムラサキセンダイハギの採花期間の延長を目指して，低温処理と
加温ガラス温室による促成栽培，さらに長期低温貯蔵による抑制栽培の条件を明らかにした。
その結果，5 月上中旬に限られていた開花期間を 3 月中旬から 7 月上旬までの約 4 か月間に
延長することができた。また，赤 LED 補光を組み合わせることで，花穂長 30～40cm，開
花小花数 20 個程度の採花基準に近づくことができた。これらの研究成果は，すぐれた切り
花品質をもつムラサキセンダイハギの長期安定供給に貢献するものである。 
 
- 4 - 
 
審 査 報 告 概 要 
 
ムラサキセンダイハギは魅力的な花色をもつマメ科宿根草であるが，採花期間が 5月上中
旬の 2週間程度と短いのが欠点である。申請者は，採花期間の延長を目指して，促成栽培の
ための低温処理条件と抑制栽培のための低温貯蔵条件を検討した。まず花芽形成過程を観察
したところ，8℃の低温処理開始後 4 週で小花の分化が確認できた。そこで低温処理期間と
温度を変えて生育・開花反応を検討し，8℃12週の低温処理後に最低 15℃を維持したガラス
温室で栽培することで，開花が 3 月中旬と 50 日以上早まることを明らかにした。次に苗の
長期低温貯蔵による抑制栽培を試みたところ，苗を 1℃低温下に 6月まで置いた後に戸外で
栽培することで，開花が 7 月上旬と 60 日程度遅れた。このようにムラサキセンダイハギの
低温反応性を利用して，開花期間を 4か月まで延長できた。以上の促成・抑制栽培はすべて
鉢植えで行っており，地植え露地栽培と比べると，花穂長が短く開花小花数も少なかった。
そこでLED補光による切り花品質の改善を試みた。その結果，開花前の赤LED補光によって，
露地栽培に劣らない花穂長，開花小花数を持つ切り花が採花できた。 
これらの研究成果等を詳細に検討した結果，審査委員一同は博士（農学）の学位を授与す
る価値があると判断した。 


ムラサキセンダイハギの開花調節に関する研究

森本, 洋武

4527

MORIMOTO, Hiromu

4528

- 1 - 
 
氏 名   森 本 洋 武 
学位（専攻分野の名称）   博 士（バイオサイエンス） 
学 位 記 番 号   甲 第 840号 
学 位 授 与 の 日 付   令和 3年 9月 30日 
学 位 論 文 題 目   マウス栄養膜巨細胞におけるラミン B1 の発現と機能に関する 
研究 
論 文 審 査 委 員   主査 教 授・博士（畜産学） 尾 畑 やよい 
               教 授・博士（農学） 小 川 英 彦 
               教 授・農 学 博 士  千葉櫻   拓 
                    理 学 博 士 田 辺 秀 之＊ 
 
 
 
論 文 内 容 の 要 旨 
 
【背景・目的】 
 哺乳類の母体内における正常な発生の進行には胎仔のみならずその発育を支える胎盤の
形成が不可欠である。マウスの胎盤は大きく分けて迷路層栄養膜細胞，海綿状栄養膜細胞，
栄養膜巨細胞の 3種類の細胞から構成されている。このうち最も母体に近い位置に層を成す
栄養膜巨細胞はげっ歯類に特有の細胞であり，子宮への浸潤や，妊娠成立，維持に必須なホ
ルモンの合成，分泌などの役割を担っている。栄養膜巨細胞は“endoreduplication”と呼
ばれる細胞分裂を伴わない特殊な細胞周期を繰り返すことで，染色体の倍加を行い間期核の
状態を維持したまま巨核化することが知られている。これまでにマウス胎盤の幹細胞である
栄養膜幹細胞を用いることで，胎盤の各細胞の機能や分化に伴う遺伝子発現の変化などが明
らかにされてきた。しかしながら栄養膜巨細胞の核内構造については未だ明らかになってい
ない点が多い。そこで本研究では栄養膜巨細胞の巨核化に伴う核内構造の変化を明らかにす
るとともに，その構造変化が細胞に与える影響を明らかにすることを目的とした。 
 
【方法・結果】 
1. 栄養膜巨細胞の巨核化に伴う核内構造変化の解明 
 間期核において染色体は個々のテリトリーを維持し互いに交じり合わない事が知られて
いる。しかしながら栄養膜巨細胞において染色体テリトリーはコンパクトに維持されず，核
内に大きく拡張，分散することを我々は明らかにしている。そこで本研究では核内構造の詳
細な解析を進めるために栄養膜幹細胞と分化誘導後 9 日目の栄養膜巨細胞を用いて電子顕
微鏡観察を行った。その結果，栄養膜幹細胞においては核膜近傍部にヘテロクロマチンが局
在するのに対して，栄養膜巨細胞では核膜近傍にヘテロクロマチンが局在していなかった。
 ＊総合研究大学院大学 先導科学研究科 准教授 
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核膜近傍部に局在するヘテロクロマチンは H3K9me2 修飾を受けていることが知られてい
る。そこで，栄養膜幹細胞と分化誘導後 9 日目の栄養膜巨細胞における H3K9me2 の局在
を免疫染色により解析した。栄養膜幹細胞のほとんど全ての間期核において，核膜近傍部に
H3K9me2 のシグナルが認められた。一方で栄養膜巨細胞では栄養膜幹細胞同様のシグナル
を示した細胞は全体の 53％にとどまり，12％の細胞においては H3K9me2 のシグナルは完
全に消失していた。以上の結果から，栄養膜巨細胞の巨核化に伴いヘテロクロマチンの核膜
近傍部への局在が消失すると示された。 
 
2. 栄養膜巨細胞の巨核化に伴う核膜近傍部の構造変化の解析 
 栄養膜巨細胞において染色体テリトリーが維持されないこと，ヘテロクロマチンの核膜近
傍部への局在が消失することから，染色体の足場構造となる核ラミナ構造に着目をした。核
ラミナ構造は間期核の核内膜直下に存在する構造であり，複数のタンパク質から構築された
核内構造である。この内，LMNB1 はマウス ES 細胞において H3K9me2 修飾されたヘテロ
クロマチンと相関があること，ヒト DLD-1 細胞においてノックダウンすることにより染色
体テリトリーが拡張することなどが報告されている。そこで栄養膜幹細胞の分化に伴う
LMNB1 のタンパク質量をウエスタンブロットにより解析をした。その結果，分化誘導後日
数の経過とともに核の表面積が大きな栄養膜巨細胞の数が増加するのに対して，LMNB1 の
タンパク質量は分化誘導後 3 日目にピークを迎えた後，徐々に減少していく事が明らかとな
った。そこで個々の細胞における LMNB1 の局在を免疫染色法によって解析した。栄養膜
幹細胞では，ほとんど全ての細胞の核膜近傍部に LMNB1 のシグナルが認められた。一方
で，分化誘導後 6 日目より LMNB1 のシグナルが減退，消失した細胞が出現し，分化誘導
後 9 日目には 50％の細胞の核において LMNB1 のシグナルは減退し，20％の核においては
消失していた。また，栄養膜巨細胞における LMNB1 の消失は核のサイズに依存しないこ
とがわかった。さらに，LMNB1 を維持した栄養膜巨細胞に対して，減退，消失した栄養膜
巨細胞では核膜近傍部への H3K9me2 修飾されたクロマチンの局在が有意に失われている
ことが明らかとなった。以上の結果から，栄養膜巨細胞では分化誘導後日数の経過とともに
LMNB1 の消失を生じることで核膜近傍部へのヘテロクロマチンの局在が消失することが
示唆された。 
 
3. LMNB1 消失が遺伝子発現に与える影響の解析 
 栄養膜幹細胞は分化を誘導すると胎盤を構成するそれぞれの細胞への分化を促す遺伝子
の劇的な発現上昇を生じる。そこで LMNB1 が栄養膜幹細胞の分化に与える影響を明らか
にするために，siRNA を用いて Lmnb1 のノックダウンを行い，3 日間分化を誘導した細胞
を用いて胎盤を構成する各細胞の遺伝子発現を定量的に解析した。その結果，ノックダウン
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区とコントロール区においてどの細胞のマーカー遺伝子も劇的な遺伝子発現量の差はなか
った。以上の結果から，LMNB1 は栄養膜細胞特異的な遺伝子発現や栄養膜幹細胞の分化に
影響を与えないと考えられた。 
 
4. 妊娠の進行に伴う胎盤内栄養膜巨細胞の LMNB1 局在変化の解析 
 胎盤中の栄養膜巨細胞において LMNB1 の消失が生じているかを明らかにするために，
妊娠 14.5, 16.5, 19.5 日目の雌マウスより摘出した胎盤を用いて凍結切片の免疫染色を行っ
た。その結果，14.5 日目の胎盤では LMNB1 の消失を生じた栄養膜巨細胞はなかったが，
16.5 日目の胎盤では 8.6％の栄養膜巨細胞が，19.5 日目の胎盤では 19.5％の栄養膜巨細胞
が LMNB1 の消失を生じていた。このことから胎盤中の栄養膜巨細胞は分娩に向けて
LMNB1 の消失を生じていると考えられた。 
 
5. 栄養膜巨細胞の生存性の解析 
 一般に LMNB1 の消失がみられる現象は細胞分裂，細胞老化，そして細胞死の過程であ
る。このうち栄養膜巨細胞は細胞分裂をせず，細胞老化でみられる核内構造の特徴とは大き
く異なる。また，妊娠末期の栄養膜巨細胞は分娩に向けて細胞死を生じる事が報告されてい
る。以上の事から，栄養膜巨細胞における LMNB1 の消失は細胞死の過程で生じている可
能性が考えられた。そこで，LMNB1 の消失がみられた分化誘導後 6 - 9 日目にかけてタイ
ムラプス観察，並びに Calcein AM，Ethidium homodimer Ⅲを用いた Live/Dead 染色を
行った。その結果，分化誘導後 6 - 9 日目にかけて栄養膜巨細胞は細胞死を生じている事が
明らかとなった。また，分化誘導後 6 日目，9 日目の栄養膜巨細胞の死細胞率はそれぞれ
2.5％と 17.6％であり，LMNB1 消失の割合と同様に分化誘導後 6 - 9 日目にかけて死細胞の
出現率が上昇した。 
妊娠の維持にはプロジェステロンが必須であり，母体血中におけるプロジェステロン量は
妊娠 17 日頃を機に減少し分娩に至るまで再び増加することはないとされている。そこで，
プロジェステロンが栄養膜巨細胞の生存性に与える影響を明らかにするために，栄養膜幹細
胞から分化した栄養膜巨細胞にプロジェステロンを最終濃度 10-8, 10-7, 10-6Mで添加し分化
誘導後 9 日目に Live/Dead 染色を行った。その結果，コントロールとしたエタノール添加
区が 12％の死細胞率を示したのに対して，プロジェステロン添加区では 10-8, 10-7, 10-6区そ
れぞれ 5.2, 3.5,2.4％の死細胞率となり，プロジェステロン濃度依存的に死細胞率が減少し
た。以上の結果から，栄養膜巨細胞の生存性はプロジェステロン濃度に依存しており，in 
vitro における栄養膜巨細胞の細胞死はプロジェステロン量が不足することにより生じてい
ると明らかになった。 
 
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6. プロジェステロンが栄養膜巨細胞における LMNB1 の局在に与える影響 
 栄養膜巨細胞の生存性と同様に LMNB1 の局在がプロジェステロン濃度に影響を受ける
かを同一の培養条件で栄養膜巨細胞を培養し，LMNB1 の免疫染色により解析した。その結
果，細胞の生存性と同様にプロジェステロン濃度依存的に LMNB1 の局在を維持した栄養
膜巨細胞の出現率が上昇し，10-6区では 90％以上の栄養膜巨細胞で LMNB1 の核膜近傍部
での局在が維持されていた。以上の結果から，栄養膜巨細胞において分化誘導後日数経過と
ともに生じる LMNB1 の消失はプロジェステロン量の不足により引き起こされると考えら
れた。 
 
7. 栄養膜巨細胞における LMNB1 消失を担う因子の探索 
 能動的な細胞死の代表例であるアポトーシスの過程において生じる LMNB1 の消失は 
カスパーゼ依存的に生じる事が報告されている。そこで栄養膜巨細胞において生じる
LMNB1 の消失はカスパーゼ依存的な現象かを明らかにするために，LMNB1 と Cleaved 
Caspase-3 の共免疫染色を行った。その結果，分化誘導後 9 日目の LMNB1 を消失した栄
養膜巨細胞において Cleaved Caspase-3 が局在することはなかった。このことから栄養膜
巨細胞において生じる LMNB1 の消失はアポトーシスの過程においてみられる現象とは異
なると考えられた。ショウジョウバエのナース細胞において生じる非アポトーシス型プログ
ラム細胞死の過程において，核ラミナの消失がカテプシン L (CTSL) によって促進されるこ
とが近年報告された。この CTSL はマウスにおいても保存されていることから，栄養膜巨
細胞において生じる LMNB1 の消失に寄与している可能性が考えられた。そこで栄養膜幹
細胞から分化させた栄養膜巨細胞を用いてウエスタンブロットにより CTSL のタンパク質
量を定量した。その結果，分化誘導後 0 日目から 3 日目にかけて CTSL タンパク質は認め
られなかったが，分化誘導後 6 日目から活性型の CTSL が劇的に増加し，その発現は 9 日
目まで維持されていた。次に分化誘導後 9 日目の栄養膜巨細胞において CTSL タンパク質
が局在するかを免疫染色により検証した。その結果 CTSL タンパク質は分化誘導後 9 日目
の栄養膜巨細胞に局在することが明らかとなった。また，胎盤の凍結切片を用いた免疫染色
の結果から，妊娠 19.5 日目の栄養膜巨細胞においても CTSL タンパク質が局在することが
明らかとなった。CTSL が栄養膜巨細胞における LMNB1 の消失を促進させているかを明
らかにする為にはさらなる解析が必要であるが，ウエスタンブロット，免疫染色の結果から
一つの候補因子であることが考えられた。 
 
【総括・考察】 
 本研究ではマウス栄養膜巨細胞の巨核化に伴う核内構造の変化を明らかにすることを第
一の目的として研究を進めた。電子顕微鏡観察，免疫染色の結果から，栄養膜巨細胞の核膜
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近傍部にはヘテロクロマチンが局在していないことが明らかとなった。この結果と合わせ，
栄養膜巨細胞における染色体テリトリーを解析した過去の報告から，栄養膜巨細胞では巨核
化に伴って染色体の足場構造である核ラミナ構造に変化が生じていることが考えられた。そ
こで，核ラミナ構造を構成する成分の 1 種である LMNB1 の発現量ならびに局在性を解析
したところ，栄養膜巨細胞は培養日数の進行とともに LMNB1 の消失を生じていることが
明らかとなった。また，LMNB1 の消失を生じた栄養膜巨細胞では核膜近傍部にヘテロクロ
マチンが局在していないことが明らかとなった。さらに LMNB1 の消失は妊娠末期の胎盤
中に存在する栄養膜巨細胞においても生じていた。このことから妊娠末期にみられるプロジ
ェステロンの減少が LMNB1 の消失を促しているのではないかと考えられた。栄養膜巨細
胞にプロジェステロンを添加し培養した結果，プロジェステロン濃度依存的に LMNB1 を
維持した細胞が増加した。以上の結果から，栄養膜巨細胞における LMNB1 の消失はプロ
ジェステロンの欠乏により引き起こされていることが示唆された。 
 また，栄養膜幹細胞から分化した栄養膜巨細胞が LMNB1 の消失を生じる時期と同時期
に細胞死を生じていることが明らかになった。栄養膜巨細胞の死細胞率は培養日数の進行と
ともに上昇した。胎盤中の栄養膜巨細胞はプロジェステロン量の減少が始まる時期と同時期
に死細胞が増加し始めることが報告されている。このことから栄養膜巨細胞の生存性も
LMNB1 と同様にプロジェステロンに依存している可能性が考えられた。プロジェステロン
添加培養を行い Live/Dead 染色を行った結果，栄養膜巨細胞の死細胞率は濃度依存的に低
下した。以上の結果から，栄養膜巨細胞の生存性はプロジェステロンに依存することが明ら
かとなった。 
 LMNB1 は多くの脊椎動物において主要な核ラミナ構成成分であり，間期核において維持
される構造である。そのため間期核を維持する栄養膜巨細胞においてみられた LMNB1 の
消失は極めて珍しい現象であると考えられる。細胞分裂，細胞老化，細胞死といった LMNB1
の消失がみられる現象の内，本研究の結果から栄養膜巨細胞におけるプロジェステロン濃度
依存的な LMNB1 の消失は細胞死の過程において生じている可能性が考えられた。しかし
ながら本研究においては LMNB1 の消失と細胞死の直接的な関係や LMNB1 消失の分子機
構を明らかにすることは出来なかった。今後これらが明らかにされていくことで妊娠維持と
いう役目を終えた栄養膜巨細胞が分娩に向けて死を迎えるメカニズムやその意義が解明さ
れる事を期待する。 
 
 
審 査 報 告 概 要 
 
マウスの胎盤を構成する細胞の一つである栄養膜巨細胞は，有糸分裂とは異なる細胞周期，
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核内倍加により巨核化し，妊娠維持に必要な生理活性物質を合成・分泌する。本研究では，
栄養膜巨細胞の巨核化に伴う核内構造の変化を明らかにするとともに，その構造変化が細胞
に与える影響を明らかにすることを目的とした。核内構造解析の結果，栄養膜巨細胞は巨核
化に伴いヘテロクロマチンの核膜近傍部への局在が消失すること，また染色体の足場構造と
なる核ラミナを構成するラミン B1も消失することが明らかとなった。さらに，栄養膜巨細
胞は巨核化に伴い死細胞の割合が増加した。これらラミン B1の消失と死細胞の増加は，妊
娠維持に必須であるプロゲステロンにより抑制された。さらに，栄養膜巨細胞におけるプロ
ゲステロン依存的なラミン B1の消失は，細胞死の過程で生じていることが示唆された。こ
れらの研究成果等を詳細に検討した結果，審査委員一同は，博士（バイオサイエンス）の学
位を授与する価値があると判断した。 


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