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Funktionelle Charakterisierung der gamma-Sekretasekomponente PEN-2
Full text linkDie gamma-Sekretase ist ein Proteasekomplex, der aus vier Komponenten, Presenilin
(PS), Nicastrin (NCT), APH-1 und PEN-2, besteht und der die intramembranöse Prozessierung verschiedener Typ I Transmembranproteine, einschliesslich
des Alzheimer-assoziierten beta-Amyloid Vorläuferproteins, katalysiert. In der vorliegenden Arbeit wurden stabile PEN-2 RNAi-Knockdown Zellen (PEN-2KD) dazu
verwendet, um Hinweise auf die Funktion von PEN-2 bei der Assemblierung und
Reifung des gamma-Sekretasekomplexes, die Rolle von PEN-2 im aktiven Komplex und
für die gamma-Sekretaseaktivität zu erhalten. Zusätzlich wurden, vor dem Hintergrund
des PEN-2KD, RNAi-resistente PEN-2 Varianten analysiert, die in einer Struktur-
/Funktionsanalyse auf ihre Fähigkeit hin untersucht wurden, den Defekt des PEN-
2KD aufzuheben, um damit funktionell wichtige Domänen im PEN-2 Protein zu
identifizieren.
Der Knockdown von PEN-2 war mit gestörter Reifung von NCT und blockierter
PS Endoproteolyse assoziiert. PS akkumulierte als Vollängenprotein (PSholo), das
durch Komplexbildung mit NCT und APH-1 stabilisiert wurde. In Abwesenheit von
PEN-2 können PS, NCT und APH-1 zu einem trimeren Komplex assemblieren, PEN-
2 ist danach allerdings notwendig, um die Reifung des gamma-Sekretasekomplexes durch Initialisierung der PS Endoproteolyse einzuleiten.
Interessanterweise bewirkte der Knockdown von PEN-2 auch in Endoproteolyse defizienten SwAPP/PS1 deltaExon9 Zellen einen Defekt in der Reifung von NCT. Dies
schlägt eine generelle Rolle von PEN-2 bei der Reifung und für die Aktivität der
gamma-Sekretase vor, die unabhängig von der PS Endoproteolyse ist.
Die Defekte des PEN-2KD konnten effektiv durch RNAi-resistentes wt-PEN-2
revertiert werden. In der folgenden Struktur-/Funktionsanalyse erwies sich am N-Terminus mit einem Epitop-tag verlängertes PEN-2 als voll funktionell, wohingegen
sowohl die Verlängerung des C-Terminus mit einem tag, als auch eine Trunkierung
des C-Terminus (PEN-2 deltaC) defekte PEN-2 Varianten hervorrief. Diese konnten zwar die Akkumulation von PSholo, die mit dem Knockdown von PEN-2 assoziiert war ausgleichen, konnten aber weder normale Spiegel an PS-NTF und -CTF herstellen, noch für eine Reifung von NCT sorgen. PEN-2 deltaC war sehr instabil und wurde schnell vom Proteasom abgebaut, was mit der Unfähigkeit einen stabilen gamma-Sekretasekomplex zu bilden konsistent war. Zusätzlich verursachte die Expression von PEN-2 deltaC eine selektive Instabilität des PS-NTF/-CTF Heterodimers, das ebenfalls vom Proteasom abgebaut wurde, wohingegen NCT und APH-1 stabil blieben. Der C-Terminus von PEN-2 ist nicht für die Einleitung der PS Endoproteolyse notwendig. Danach wird er allerdings benötigt um die entstandenen PS Fragmente und PEN-2 selbst im Komplexzu stabilisieren.
Um den PEN-2 C-Terminus genauer zu untersuchen, wurden unterschiedliche Deletionen und Mutationen mehrerer konservierter Aminosäuren, im PEN-2KD auf
funktionelle Aktivität hin analysiert. Progressive Verkürzung des C-Terminus bewirkte
einen zunehmenden Funktionsverlust. Dieser wurde auch bei einer internen
Deletion oder der groben Verdopplung der Länge durch einen Epitop-tag beobachtet.
Interessanterweise störte nur die kombinierte, nicht aber die einzelne Mutation der
konservierten Aminosäuren D90, F94, P97 und G99 die Funktion von PEN-2. Alle
funktionslosen Mutanten erlaubten zwar die PS Endoproteolyse, die PS Fragmente
und PEN-2 selbst waren aber instabil und wurden durch das Proteasom abgebaut.
Länge und gesamter Sequenzkontext des PEN-2 C-Terminus sind also, in der engen
räumlichen Anordnung der Komplexpartner, für die Stabilisierung des PS-NTF/-
CTF Heterodimers und von PEN-2 selbst im gamma-Sekretasekomplex notwendig.
Die Interaktion der C-terminalen PEN-2 Mutanten mit den PS Fragmenten und
den anderen beiden Komplexpartnern konnte allerdings unter Bedingungen, wo der
proteasomale Abbau blockiert war, wiederhergestellt werden. Somit wurde ein Komplex
aus allen vier essentiellen gamma-Sekretasekomponenten stabilisiert und isoliert, der
zwar vollständig assembliert, aber noch nicht komplett gereift war. Dieser prämature
Komplex zeigte noch keine gamma-Sekretaseaktivität, für welche sowohl die vollständige Assemblierung der Komponenten, als auch deren komplette Reifung essentiell sind.
Zusammenfassend schlagen die vorliegenden Daten folgende Funktionen für PEN-
2 im gamma-Sekretasekomplex vor: PEN-2 wird für die Reifung des gamma-Sekretasekomplexes und die Einleitung der PS Endoproteolyse benötigt. Darüber hinaus stabilisiert PEN-2 die, durch die Endoproteolyse entstandenen PS Fragmente im Komplex. Für letztere Funktion ist ein in Länge und Gesamtsequenzkontext intakter C-Terminus wichtig, der allerdings für die Einleitung der PS Endoproteolyse nicht benötigt wird. Unabhängig von der Rolle bei der PS Endoproteolyse ist PEN-2 aber generell für die Reifung und Aktivität des gamma-Sekretasekomplexes wichtig
A Study of "Yu-lan-pen"
Full text linkapplication/pdfThis paper intends to give one interpretation of the origin of the word `Yu-lan-pen (孟蘭盆) '. There are varying opinions about this problem. One is that `Yu-lan-pen (孟蘭盆)' is a copied sound from `ullambana' (a word in Sanskrit, which means "hung topsy-turvy" ) into Chinese characters. Another is `Yu-lan-pen (孟蘭盆)' means "a vessel" , or "a tray" . I support the latter, and I present some bases from Vinaya-pitaka, Buddhist religious commandements
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