1,720,991 research outputs found
Synthesis of glycopeptides for exploration of mucin‐type‐threonine and HexNAc‐tyrosine modifications
Full text linkDie Protein O-Glykosylierung ist eine biologisch sowie strukturell vielseitige Modifikation. Die mucinartige O-Glykosylierung an extrazellulären Mucinproteinen ist z.B. involviert in Zell-Zell- sowie Zell-Matrix- Interaktionen und spielt eine Schlüsselrolle bei Atemwegsinfektionen von COPD-, Mukoviszidose- und Asthmapatienten. Dabei dienen die O-Glykane als Rezeptoren für Virulenzfaktoren von atemwegserkrankungsrelevanten Pathogenen (Bakterien und Viren). Einblicke in die molekularen Details der Bindungsspezifitäten von Virulenzfaktoren wie Adhäsionsproteine (Lektine) oder Sialidasen würde die Entwicklung von glykomimetischen Antiadhäsionsmedikamenten und Enzyminhibitoren zur Infektionsbekämpfung unterstützen. Zudem wurde gezeigt, dass Adenokarzinomzellen (von z.B. Brust-, Darm-, Lungen- und Gebärmutterkrebs) veränderte Mucinglykosylierung sowie -expression aufweisen, was wiederum mit Tumorwachstum und Metastasierung in Verbindung gebracht wird. MUC1-basierte Vakzinkonstrukte gelten als vielversprechend, um eine tumorgerichtete Immunantwort zu induzieren, welche die Tumorlast schließlich beseitigen könnte. Ohne eine Bibliothek bestehend aus MUC1- Gklykopeptiden definierter Struktur jedoch, ist eine Qualitätskontrolle sowie eine präzise Aufklärung der induzierten Antikörper nicht möglich. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Synthese einer wohldefinierten Peptidbibliothek (mit verlängerter Core 2- und Core 4-Glykosylierung) zur Anwendung in Microarrayexperimenten um schließlich Lektin/Glykopeptid- und Antikörper/Glykopeptidspezifitäten aufzuklären. Die so gewonnenen Informationen werden dabei helfen, die oben genannten Herausforderungen bzgl. Atemwegserkrankungs- und Krebsverlauf lösen. Darüber hinaus trug diese Arbeit zu Entwicklung einer neuen oxoniumionenbasierten, massenspektrometrischen Methode zur verbesserten Charakterisierung von Glykopeptidstrukturen bei. O-Glykosyierung wird üblicherweise auf Serin (Ser) oder Threonin (Thr) gefunden, jedoch zeigten jüngste Identifikationen, dass ähnliche Modifikationen auch auf Tyrosin (Tyr) stattfinden können. Diese Modifikationen werden durch Einführung einer HexNAc (GalNAc oder GlcNAc)-Gruppe an die jeweilige Aminosäure initiiert. Eine große Herausforderung war es bei den kürzlich entdeckten HexNAc-Tyrosin- Modifikationen zwischen den strukturell ähnlichen Isomeren αGalNAc-, αGlcNAc- und βGlcNAc-Tyr zu unterscheiden. Eine Zuordnung der Glykanstrukturen war nur möglich durch das generelle Wissen um Biosynthesewege oder beruhend auf bekannten Lektin/Glykan-Bindungspräferenzen zur Lektinaffinitätsanreicherung von Glykopeptidfragmenten. Jedoch sind die Lektinbindungspräferenzen ggü. HexNAc-Tyr bislang unerforscht. Zudem sind Lektine nicht immer in der Lage zwischen verschiedenen Glykanisomeren zu unterscheiden. In bisherigen Studien zum Glykoproteom wurde komplexe Tyr- Glykosylierung als mucinartige αGalNAc-Tyr-Modifikation betrachtet, basierend auf dem Wissen um Lektinspezifitäten ggü. Ser/Thr-Glykopeptiden und der Tatsache, dass mucinartige Glykopeptide generell um weitere Glykane verlängert vorliegen. αGlcNAc-Tyr, eine Modifikation, welche durch intrazelluläre Infektionen verursacht wird, wurde an Host-GTPasen gefunden. Eine Glykanzuordnung fand mittels enzymatischen In-Vitro-Studien sowie NMR-basierten Strukturbestimmungen statt. Weiter wurden im Rahmen einer umfangreichen Glykoproteom-Studie verschiedene HexNAc-Tyr-Modifikationen an mitochondriellen Proteinen gefunden, wobei einige der identifizierten Glykosylierungsstellen gleichzeitig bekannte Phosphorylierungsstellen darstellen. Daher handelt es sich bei diesen HexNAc-Tyr-Modifikationen wahrscheinlich um βGlcNAc-Tyr (obwohl diese Modifikation bis dato nicht verifiziert werden konnte). Um eine Identifikation von HexNAc-Tyr als mögliche Modifikation durch Glykoproteomanalysen zu ermöglichen, wurden Lektine, welche üblicherweise zur Glykopeptidaffinitätsanreicherung verwendet werden, hinsichtlich ihrer Bindungserkennung von HexNAc-Tyr und im Vergleich zu dessen Ser/Thr-Analoga, untersucht. Zu diesem Zweck wurde eine vielseitige Bibliothek bestehend aus HexNAc-Modellglykopeptiden synthetisiert, welche die Grundlage für Lektinbindungsstudien bildet. Der Beitrag von Glykopeptidstrukturelementen zur Erkennung durch üblicherweise zur Glykopeptidanreicherung verwendete Lektine (Vicia Villosa Agglutinin - VVA, Wheat Germ Agglutinin – WGA und Griffonia Simplicifolia Lectin II – GSL II) wurde durch Einsatz von Glykopeptidmicroarrays getestet. Dabei wurde der Einfluss von Glykan (αGalNAc/αGlcNAc/βGlcNAc), Akzeptoraminosäure (Tyr/Ser/Thr) sowie die Art der Glykanpräsentation (mono- vs divalent) untersucht. WGA und GSL II zeigten eine deutlichen Präferenz für Tyr-Glykopeptide ggü. Ser/Thr. Demgegenüber wurde keine solche Tyr-Präferenz für VVA gefunden. Das WGA-Lektin zeigte eine starke Bindung sowohl an GlcNAc-Tyr- als auch an GalNAc-Tyr-Glykopeptide und kommt somit für eine Strukturzuordnung von HexNAc-Tyr nicht in Betracht. Im Gegensatz dazu wurde für VVA eine hohe Spezifität für ausschließlich αGalNAc-Glykopeptide gefunden. GSL II erkannte sowohl αGlcNAc- als auch βGlcNAc-modifizierte Peptide. Für WGA wurde der Einfluss von divalenter Glykanpräsentation untersucht, wobei sich eine Abhängigkeit von der Peptidlänge zwischen den beiden Glykanen ergab. Generell resultierte eine Distanz von 2-5 Aminosäuren in erhöhter Glykopeptiderkennung. Zusammengenommen ermöglichen diese Ergebnisse eine verlässlichere Verwendung von Lektinen zum Zwecke der HexNAc-Tyr-Glykopeptidanreicherung. Des weiteren wurde die massenspektrometrische Oxoniumionenfragmentierung hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit zur HexNAc-Tyr-Glykopeptididentifikation untersucht. Es zeigte sich, dass die Methode voll Anwendbar ist zur Unterscheidung von GalNAc vs GlcNAc, jedoch nicht zur Zuordnung der jeweiligen anomerischen Konfiguration. Das hier generierte Wissen über Lektinaffinitäten in Kombination mit der oxoniumionenbasierten Glykanidentifikation wird großangelegte Glykoproteomstudien ermöglichen, in welchen die Tyr-O-Glykosylierung mit in Betracht gezogen wird. Dies könnte schließlich zur Klärung der Frage beitragen, ob βGlcNAc-Tyr eine tatsächlich existierende Modifikation ist. Der ultimative Beweis für dessen Existenz wäre jedoch die Beobachtung einer Tyr-Spezifität ausgehend von den βGlcNAc-Biosyntheseenzymen O-GlcNAc-Transferase (OGT) und O-GlcNAcase (OGA). Entsprechende, in dieser Arbeit durchgeführte Inkubationen von Glykopeptid-Substratkandidaten mit OGA ergaben eine deutliche OGA-Präferenz ggü. βGlcNAc-Tyr-Substraten im Vergleich zu Ser/Thr-Analoga. Entsprechende Inkubationen mit OGT verliefen bislang ergebnislos und benötigen weitere Untersuchungen.Protein O-glycosylation is a structurally and biologically versatile modification. The mucin-type O- glycosylation on extracellular mucin proteins is for instance involved in cell-cell and cell-matrix interactions, and play key roles in airway inflammations of COPD, asthma and cystic fibrosis patients by serving as binding receptors for virulence factors of airway disease-related pathogens (bacteria and viruses). Insights into molecular details in the binding specificities of virulence factors like adhesion proteins (lectins) or sialidases would support the development of glycomimetic antiadhesive drugs or enzyme inhibitors to suppress infections. Moreover, adenocarcinoma cells (from for instance breast, colon, lung and ovary cancer) have been found to exhibit altered mucin glycosylation and expression levels, which has been related to tumor progression and metastasis. MUC1-based vaccine constructs have been identified as promising for induction of a tumor-directed immune response, which in consequence might eradicate the tumor burden. However, without a structurally defined MUC1 glycopeptide library, a quality control and a precise epitope mapping of the induced antibodies is not possible. This work focuses on the synthesis of a well-defined peptide library (including extended core 2 and core 4 glycosylation) for application in microarray experiments to map lectin/glycopeptide and antibody/glycopeptide binding specificities. The gained information will aid to tackle the above- described challenges in airway disease and cancer progression. Further, this work contributed in the development of a new oxonium ion-based mass-spectrometric methodology for improved structural characterization of glycopeptides. O-glycosylation is commonly found on serine (Ser) or threonine (Thr), but recent identifications suggest that similar modifications also occur on tyrosine (Tyr). These modifications are initiated by addition of a HexNAc (GalNAc or GlcNAc) monosaccharide residue to the respective amino acid. A major challenge for identification of the recently discovered HexNAc-Tyr modifications was to distinguish the structural similar isomers αGalNAc-, αGlcNAc- and βGlcNAc-Tyr. Assignments of the glycan structures were only possible by general knowledge of biosynthetic pathways or being based on lectin glycan-binding preferences when applied in lectin-affinity enrichment of protein-digested peptide fragments. However, lectin binding-preferences of HexNAc-Tyr have not been explored and lectins are not always capable to discriminate between different glycan isomers. In previous glycoproteomic studies complex Tyr glycosylation was assumed as mucin type αGalNAc-Tyr modification, based on knowledge of lectin specificity to Ser/Thr glycopeptides and the fact that mucin-type glycopeptides are generally extended with additional glycans. The αGlcNAc-Tyr was found on host GTPases, a modification caused by intracellular infections and was assigned by enzymatic in vitro studies and NMR structural characterization. Further, in an extensive glycoproteomic study several HexNAc-Tyr modifications were found on mitochondrial proteins and some of the identified sites are also known phosphorylation sites. Therefore, the identified HexNAc-Tyr modifications were likely to be βGlcNAc-Tyr (although to date this modification is still not verified). In order to enable identification of HexNAc-Tyr as a possible modification by glycoproteomic analysis, lectins commonly used for glycopeptide affinity enrichment were evaluated towards binding recognition of HexNAc-Tyr glycopeptides compared to Ser/Thr analogs. To this extent, a versatile library of HexNAc model glycopeptides was synthesized, providing the basis for the lectin binding studies. The contribution of structural elements towards recognition by lectins commonly used for glycopeptide enrichment (Vicia villosa agglutinin - VVA, Wheat germ agglutinin - WGA and Griffonia simplicifolia lectin II - GSL II) was tested by using glycopeptide microarrays. The binding recognition influence of glycan (αGalNAc/αGlcNAc/βGlcNAc), acceptor amino acid (Tyr/Ser/Thr) and mono vs divalent glycan presentation was evaluated. The WGA and GSL II lectins showed a clear preference for Tyr glycopeptides over Ser/Thr. In contrast no clear Tyr preference was found for VVA. The WGA lectin showed strong binding to both GlcNAc- and GalNAc-Tyr glycopeptides and could not be considered for structural assignment of HexNAc-Tyr glycopeptides. In contrast VVA was highly specific for αGalNAc-containing glycopeptides and GSL II recognized both αGlcNAc- and βGlcNAc modified peptides. In analysis of WGA the impact of divalent glycan presentation was evaluated and found to be dependent on the peptide spacing between the glycans. A distance of 2-5 amino acids resulted in a generally enhanced recognition. Taken together, these results will enable a more reliable application of lectins for HexNAc-Tyr glycopeptide enrichment. Further, mass spectrometric oxonium ion fragmentation was elucidated for applicability towards HexNAc-Tyr glycopeptide identification. The methodology was found to be fully applicable for discrimination of GalNAc vs GlcNAc epimers, but not for assignment of the anomeric configuration. The knowledge about lectin affinities in combination with the oxonium-based glycan identification will enable large-scale glycoproteomic studies taking account of Tyr O-glycosylation, which eventually might help to clarify, whether βGlcNAc-Tyr is actually an existing modification. However, the ultimate proof of existence of the modification would be the observation of Tyr-specificity by the βGlcNAc biosynthetic enzymes O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA). Accordingly, selected peptides and glycopeptides were used as substrate candidates for OGT and OGA. Thereby, OGA showed a clear preference for βGlcNAc-Tyr substrates over Ser/Thr analogs. The OGT substrate studies were inconclusive and needs further evaluation
Chemical tools for protein analysis: development of an MS-cleavable cross-linker and a new approach for glycopeptide enrichment
Full text linkThe technological development in analytical methods, especially in chromatography and mass spectrometry, has allowed a deeper understanding of biological systems at a molecular level. Characterization and quantification of biomolecules and its modifications are crucial for comprehension of the entire biological machinery. However, additional bioanalytical methods are needed to gain more detailed information about protein structure, dynamic protein complexes and low abundant protein modifications. Herein chemical tools are used in addition to well-established shotgun proteomic approaches in order to enhance the knowledge of protein structure and information about glycosylation as a protein modification.
Cross-linkers are used as molecular rulers or molecular bridges to connect two amino acid residues at a specific distance via covalent bonds. These tools assist in the characterization of the three-dimensional structure of a protein or of protein complexes. In the first part of this work a new MS-cleavable phosphonate cross-linker was proposed, with the aim to perform a neutral elimination reaction during the tandem MS fragmentation. The new phosphonate cross-linker PXL 14 was synthesized in 3 steps from commercial sources. This linker was evaluated using synthetic peptides. The linkage reaction was optimized by adjusting the buffer system and pH value in order to avoid in-situ chemical cleavage. Distinct fragmentation techniques were applied to observe the linker fragmentation in tandem mass spectrometric experiments. Low-energy HCD fragmentation showed favorable cleavage of the cross-linker bonds instead of the peptide backbone fragmentation. The acryloyl fragment of the Ac-IEAEKGR peptide is the second most intense ion in HCD with 18% NCE. Bovine serum albumin was used as model protein to evaluate PXL in a more complex system. The cross-linker reaction with BSA was monitored using SDS-PAGE. After optimization of conditions for cross-linker reaction and proteolytic digestion, cross-linked peptides were analyzed using LC-MS/MS methods. Manual data analysis allowed the identification of 7 intra-linked peptides, including 2 non-previously reported; 3 loop linked peptides and 8 peptides derived from chemical cleavage.
Chemical tools were also developed in this work to improve glycopeptide enrichment in studies of glycan protein modifications. Glycosylation is one of the most common post-translational protein modifications and one of the most complex modifications due to the diversity in the monosaccharides building blocks, the linkage types among those monosaccharides and their extension. Besides micro- and macroheterogeneity, the low abundance of modified peptides after proteolytic protein degradation is a major obstacle for analysis of glycopeptides using the standard proteomic workflows. Therefore, an efficient glycopeptide enrichment strategy is required prior to LC-MS/MS analysis. In this work an improved enrichment methodology is proposed based on the chemical properties of glycopeptides/glycoproteins. A smart cleavable disulfide linker containing hydroxylamine groups was attached on the surface of beads. The linker 40 was synthesized in 6 steps from commercial source prior to the bead surface modification. The hydroxylamine group reacts with aldehydes leading to a covalent oxime bond. Reactive aldehyde groups were introduced on terminal glycan residues, e.g. via selective oxidation of sialic acid using sodium periodate or via enzymatic oxidation of terminal galactose by galactose oxidase. In this approach both, neutral and negatively charged, synthetic glycopeptides were enriched and released under reductive conditions by disulfide bond cleavage. This strategy allowed glycopeptide release independently of glycan nature and peptide backbone. The released glycopeptides presented only a minor modification of the chemical structure in the terminal glycan residue. Moreover, we demonstrated that this approach is compatible with tandem mass tag labeling, which would enable quantification with current available TMT methodologies. Amino acid analysis demonstrated that the enrichment of synthetic sialylated glycopeptide had a yield of 32% and a yield of 40% for a synthetic galactosylated peptide.
The enrichment method was also evaluated using model proteins. In this case, fetuin and asialofetuin were applied using different oxidation methods: sodium periodate and GOase oxidation, respectively. For the fetuin sample, a total of 28 unique glycopeptides were identified. Among them, 7 were unique O-glycopeptides and 21 were unique N-glycopeptides. These peptides covered 2 O- and 2 N-glycosylation sites from fetuin A, and 2 O-glycosylation sites from fetuin B. On the other hand, 98 unique glycopeptides were identified for asialofetuin. Herein, 11 unique O-glycopeptides covered 1 fetuin A glycosylation site and 2 fetuin B glycosylation sites. For the N-glycopeptides 87 unique peptides were covered on 2 glycosylation sites from each fetuin A and B. Serum and CSF were used to expand the sample complexity scope of the improved enrichment methodology. In serum a total of 34 proteins and 162 unique sialylated glycopeptides were identified by our methodology. In a CSF sample 32 proteins and 129 unique sialylated glycopeptides were further identified.
The N-glycopeptide enrichment method using hydrazine beads is typically used for determination of N-glycosylation sites after removal of the glycans during enzymatic bead release. Clinical CSF samples were here also used for the comparison of N-glycopeptide enrichment, by using this method employing hydrazine beads and enzymatic release with PNGase F and the new method containing a cleavable linker on hydroxylamine beads with chemical and/or enzymatic PNGase F release. A total of 2 963 peptides were identified by samples enriched with hydrazine and hydroxylamine beads together and enzymatic peptide release. While 350 unique glycopeptides were identified from 80 different proteins in the samples enriched by hydroxylamine beads and mild chemical cleavage. Among these identifications, 251 were O-glycopeptide structures and 222 were N-glycopeptide structures. As a conclusion, the new enrichment method allows parallel analysis of O- and N-glycopeptides from both galactosylated and sialylated peptide classes under mild chemical bead release conditions. Besides leaving the glycan structure intact, the method enables labeling with a TMT for quantitative MS detection and is also suitable to be explored in further large scale glycoproteomic studies.Die technische Entwicklung analytischer Methoden, speziell der Chromatographie und Massenspektrometrie erlaubt ein tieferes Verständnis biologischer Systeme auf molekularer Ebene. Charakterisierung und Quantifizierung von Biomolekülen und ihrer Modifikationen sind entscheidend für das Verständnis biologischer Mechanismen. Zusätzliche bioanalytische Methoden sind notwendig um detaillierte Informationen über Proteinstrukturen, dynamische Proteinkomplexe oder Proteinmodifikationen mit geringer Häufigkeit zu erhalten. Hierfür werden chemische Werkzeuge zusammen mit bereits etablierten Shotgun-Ansätzen genutzt, um Erkenntnisse über Proteinstrukturen und Glykosylierungen zu erweitern.
Cross-Linker dienen als molekulare Lineale, die zwei Aminosäureseitenketten in einem definierten Abstand kovalent miteinander verknüpfen. Sie sind hilfreich bei der Charakterisierung dreidimensionaler Protein- bzw. Proteinkomplex-Strukturen. Im ersten Teil dieser Arbeit wird ein MS-spaltbarer Phosphonat-Cross-Linker (PXL) vorgestellt, der eine neutrale Eliminierung während der Tandem-MS-Fragmentierung ermöglichen soll. Der neue Phosphonat-Cross-Linker PXL 14 konnte ausgehend von kommerziell erhältlichen Edukten in drei Stufen dargestellt werden. Die Evaluierung wurde an synthetischen Peptiden vorgenommen. Die Optimierung der Reaktionsbedingungen der Verknüpfung erfolgte hinsichtlich des Puffer-Systems und pH-Werts, um eine in-situ-Freisetzung des Cross-Linkers zu vermeiden. Verschiedene Fragmentierungstechniken wurden zur Erforschung der Linker-Fragmentierung in Tandem-Massenspektrometrieexperimenten untersucht. Die gewünschte Abspaltung des Linkers konnte mittels Low-energy-HCD-Fragmentierung realisiert werden ohne dabei das Peptidrückgrat zu beschädigen. Das Acryloyl-Fragment des Ac-IEAEKGR-Peptids ist das zweitintensivste Ion nach HCD-Fragmentierung bei 18% NCE. Als Modellprotein zur Evaluierung der PXL in komplexeren Systemen fungierte Bovines Serumalbumin (BSA). Die Verknüpfung des Cross-Linkers mit BSA wurde mittels SDS-PAGE verfolgt. Nach Optimierung der Bedingungen der Cross-Linker-Kupplung und der proteolytischen Verdauung dienten LC-MS/MS-Methoden zur Analyse der cross-linker-verknüpften Peptide. Die manuelle Datenanalyse erlaubte die Identifizierung von sieben intramolekular verknüpften Peptiden, inklusive zweier bisher nicht dokumentierten; drei schleifen-verknüpften Peptiden und acht Peptiden als Resultat einer chemischen Spaltung.
Des Weiteren wurden chemische Methoden zur Verbesserung der Anreicherung von Glykopeptiden zur Untersuchung von Glykosylierungsmodifikationen entwickelt. Die Glykosylierung stellt eine der am häufigsten vorkommenden und auf Grund der hohen Diversität an Monosacchariden und an Möglichkeiten derer Verknüpfung auch komplexesten posttranslationalen Modifikationen von Peptiden dar. Neben der Mikro- und Makroheterogenität stellt einem vor allem die geringe Menge an modifizierten Peptiden nach erfolgtem proteolytischen Abbau in der Analytik von Glykopeptiden mit Hilfe von Standard-Proteomic-Verfahren vor Herausforderungen. Aus diesem Grund ist eine effiziente Strategie zur Anreicherung von Glykopeptiden für LC-MS/MS-Analysen erforderlich. In dieser Arbeit wird eine verbesserte Anreicherungsmethode basierend auf den chemischen Eigenschaften von Glykopeptiden/-proteinen vorgestellt. Ein abspaltbarer Disulfid-Linker mit Hydroxylamin-Funktionen wurde auf der Oberfläche von Beads angebracht. Linker 40 konnte in sechs Stufen ausgehend von kommerziell erhältlichen Edukten dargestellt werden. Über die Hydroxylamin-Gruppen des Linkers können kovalente Verknüpfungen mit den Aldehyd-Funktionen der terminalen Monosacchariden der Glykosylierungsmodifikation unter Ausbildung von Oxim-Bindungen geschlossen werden. Die Einführung dieser Aldehyd-Funktionen kann z.B. mittels selektiver Oxidation von Sialinsäuren mit Natriumperiodat oder enzymatischer Oxidation von terminaler Galactose mit Galactose-Oxidase erreicht werden. Bei diesem Ansatz werden sowohl neutrale als auch negativ geladene, synthetische Glykopeptide angereichert und über die Spaltung der Disulfid-Bindung unter reduktiven Bedingungen freigesetzt. Diese Art der Freisetzung ist unabhängig von der Natur der Glykanstruktur und des Peptidrückgrates. Die freigesetzten Glykopeptide weisen dabei nur eine geringfügige chemische Modifikation in terminaler Position auf. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass dieser Ansatz für Tandem Mass Tag (TMT) Labeling geeignet ist. Dies würde eine Quantifizierung mit derzeitigen TMT-Methoden ermöglichen. Aminosäureuntersuchungen konnten aufzeigen, dass die Ausbeute der Anreicherung von synthetischen sialylierten Glykopeptiden bei 32% und von synthetischen galactosylierten Glykopeptiden bei 40% liegt.
Die Anreicherungsmethode wurde ebenso mit Hilfe von Fetuin und Asialofetuin als Model-Proteinen evaluiert. Für die Oxidation wurde entsprechend Natriumperiodat bzw. Galactose-Oxidase eingesetzt. In der Fetuin-Probe konnten 28 einzigartige Glykopeptide identifiziert werden; darunter sieben O-Glykopeptide und 21 N-Glykopeptide. Diese korrespondieren mit zwei O- und zwei N-Glykosylierungsseiten des Fetuin A und zwei O-Glykosylierungsseiten des Fetuin B. In der Asialofetuin-Probe wurden 98 einzigartige Glykopeptide identifiziert. Die elf O-Glykopeptide korrespondieren mit einer O-Glykosylierungsposition des Fetuin A und zwei O-Glykosylierungsseiten des Fetuin B. Die 87 N-Glykopeptide korrespondieren jeweils mit zwei N-Glykosylierungspositionen des Fetuin A bzw. Fetuin B. Um die Anreicherungsmethode für die Anwendung auf komplexere Systeme untersuchen zu können, wurden Blutserum und CSF als Proben gewählt. Unsere Methode ermöglichte im Blutserum 34 Proteine und 162 einzigartige sialylierte Glykopeptide zu identifizieren. In der CSF-Probe wurden 32 Proteine und 129 einzigartige sialylierte Glykopeptide identifiziert.
Die Methode zur Anreicherung von N-Glykopeptiden mittels Hydrazin-Beads wird typischerweise zur Bestimmung von N-Glykosylierungsseiten nach enzymatischer Freisetzung der Oligosaccharide genutzt. Klinische CSF Proben wurden zum Vergleich der N-Glykopeptid-Anreicherung herangezogen; wobei Hydrazin-Beads für enzymatische Freisetzung mittels PNGase F unserer Methode mit abspaltbarem Linker auf Hydroxylamin-Beads für chemische oder enzymatische Abspaltung mit PNGase F gegenübergestellt werden sollten. 2 963 Peptide wurden mit Hilfe der Anreicherung sowohl von Hydrazin- als auch Hydroxylamin-Beads mit enzymatischer Freisetzung identifiziert. Bei Verwendung der Hydroxylamin-Beads in Kombination mit milder, chemischer Freisetzung war eine Identifikation von 350 einzigartigen Glykopeptiden der 80 verschiedenen Proteinen möglich. Unter diesen waren 251 O-Glykopeptidstrukturen und 222 N-Glykopeptidstrukturen zu beobachten. Zusammenfassend ermöglicht die neue Methode, basierend auf der chemischen Freisetzung der Beads unter milden Bedingungen, eine parallele Untersuchung von galactosylierten und/oder sialylierten O- und N-Glykopeptiden. Da die chemische Glykanstruktur nahezu unverändert bleibt, sind TMT Markierungen für quantitative Massenspektrometrie und weiterführende Studien auf dem Gebiet der Glykoproteomics im größeren Maßstab möglich
Chemical synthesis of charbohydrates and glycopeptides for biological application
Full text linkThis thesis describes chemical synthesis of carbohydrates and glycopeptides useful in studies of biologically interesting systems. The following topics are addressed: [Papers I-IV and supporting information]: [I] The non-reducing end di- and trisaccharide structures of an erythrocyte glycolipid responsible for the rare NOR polyagglutination were chemically synthesized. The syntheses were based on a α-D-Galp-(1→4)-β-D-GalpNAc-(1→) structural element found only recently in Nature, and derivatives thereof have not been synthesized before. Both the synthesized oligosaccharides specifically inhibited human anti-NOR antibodies, with the trisaccharide being 300 times more active than the disaccharide. [II] Derivatives of lactose with the galactose ring substituents replaced by 2´, 3´, 4´ and 6´ deoxy and 3´ acylamino functions were prepared. The lactosyl derivatives were tested as acceptors for the Neisseria menigitidis N-acetylglucosaminyltransferase catalyzed β-(1→3) glycosylation reaction, using UDP-GlcNAc as donor. The 6´-deoxy compound showed nearly a threefold increase in activity compared with the reference substance phenyl β-lactoside, whereas the 2´ and 4´-deoxy derivatives were less active. The 3´-deoxy and 3´-acylamino derivatives will be used in studies of the inhibitory capacity. [III] In order to develop the non-viral Bioplex vector system for non-viral gene delivery to hepatocytes, biotinylated ligands were synthesised to study the structure-function relationship of specific binding and uptake to the asialoglycoprotein receptor ASGPr. Cluster glycosides containing two, three and six β-D-GalpNAc residues were synthesized and tested for binding and uptake to liver cells. The derivative displaying six GalNAc units showed the highest uptake efficacy. However, the number of GalNAc units above three seems only to have a minor contribution to the overall affinity, while using longer spacer between the GalNAc ligands markedly influenced the uptake efficacy. [IV] An analgetically active glycopeptide from the cone snail Conus geographus, contulakin G, has recently been analyzed and synthesized. Contulakin-G has been found to be a neurotensin agonist and have entered pre-clinical trials for short-term management of post-operative pain. The glycan part of contulakin-G has been found to be important for the biological in vivo activity. In order to further investigate the importance of the glycan part, three analogues of contulakin-G have been synthesized, were the α/β conformation of the anomeric centers as well as the glycosidic bond pattern of the disaccharide have been altered. In addition to the contulakin G analogues, a heavily posttranslational modified glycopeptide from Conus textile, tx5a, has been synthesized
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Full text linkWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
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