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Understanding the molecular mechanisms and modifiers underlying CRB1-linked retinal degenerations
No full textDie Dissertation ist gesperrt bis zum 01. Juli 2026
Evaluation of Neuroprotective Interventions in Different Pde6a Mutant Animal Models for Retinitis Pigmentosa
Full text linkZiel. Retinitis Pigmentosa (RP) ist eine Gruppe heterogener Krankheiten, die zu Erblindung führt und in der Summe mit einer Häufigkeit von 1 in 4000 Individuen weltweit auftritt. RP ist gekennzeichnet durch eine hohe genetische Diversität, bei der Mutationen desselben Gens zu sehr verschiedenen Phänotypen führen können. Bisher lag der Fokus der Forschung auf Mutationen in Pde6b (Keeler 1924, Chang, Hawes et al. 2002), während Pde6a Mutationen weit weniger untersucht wurden, obwohl sie ebenfalls zu Zelltod der Photorezeptor-Stäbchen führen und RP verursachen.
Methoden. Die Experimente der vorliegenden Arbeit wurden in zwei Schritten durchgeführt: im ersten die Charakterisierung der retinalen Degeneration in vivo und im zweiten die in vitro Behandlung von Gewebe von Pde6a Mutanten. Für die Charakterisierung der retinalen Degeneration in vivo haben wir vier unterschiedliche homozygote Pde6a Mauslinien verwendet, und zwar Pde6aV685M, Pde6aD670G, Pde6aR562W und Pde6aV685M*R562W. Wir haben in den Pde6a Mauslinien mit den folgenden Markern den Fortschritt der Degeneration der Photorezeptoren beschrieben: - TUNEL-Signal, - Caspase-3, - Calpain-Aktivität, - PARP-Aktivität und - PAR-Polymere. 2) Für eine Charakterisierung der Wirkung der Inhibition von PARP in vitro haben wir organotypische Kulturen von Retinas der verschiedenen Mauslinien verwendet. Diese Kulturen wurden mit dem pharmakologischen PARP Inhibitor PJ34 behandelt, um zu bestätitigen, dass PARP-Aktivität eine Ursache des neurodegenerativen Prozesses ist.
Ergebnisse. Unsere Untersuchung zeigt auf, dass das Tempo der retinalen Degeneration in vivo in den vier Pde6a Mutationen unterschiedlich ist und dass der Verlauf der Degeneration der Photorezeptoren immer korreliert ist mit erhöhten Signalen bei der Messung von TUNEL, PARP-Aktivität, PARylierten Proteinen und Calpain-Aktivität. Die Aktivität von Caspase-3 zeigte keine Erhöhung bei der retinalen Degeneration der Pde6a Mutanten. Der Einsatz eines pharmakologischen Inhibitors von PARP in organotypische Kulturen von Retinas von Pde6a Mäusen bestätigte, dass PARP eine Rolle spielt in der retinalen Degeneration von Mäusen der vier Genotypen. Die neuroprotektive Wirkung des PARP Inhibitors wurde in den vier Genotypen zu verschiedenen Zeitpunkten und für verschiedene Expositionszeiten nachgewiesen.
Ausblick. Wir konnten zeigen, dass die Enzyme Calpain und PARP im Verlauf der Degeneration der Photorezeptoren in verschiedenen Pde6a Mutanten eine zentrale Rolle spielen. Unsere Untersuchung unterstreicht, dass das PARP Enzym ein gemeinsames pharmakologisches Ziel sein kann für neuroprotektive Massnahmen in jenen Fällen der RP, denen Pde6a Mutationen zugrunde liegen. Darüber hinaus kann die vorliegende Studie dazu dienen, den Zeitverlauf der retinalen Degeneration bei RP Patienten vorherzusagen, deren RP unterschiedliche Pde6a Mutationen zugrunde liegen, und die Studie kann helfen, den optimalen Zeitpunkt für klinische Intervention festzulegen
Proteomic Analysis Suggests a Role for HtrA Serine Peptidase 1 in Immune Regulation and Thereby in Age-Related Macular Degeneration
Full text linkPurpose. Single-Nucleotide Polymorphisms on chromosome 10 at the region 10q26 that harbors the three genes, PLEKHA1, ARMS2 and HtrA1, show strong association with the pathogenesis of age-related macular degeneration (AMD). In the last decade, evidence was mounted that mutations in the HtrA1 gene are a major causative factor of this disorder in Caucasian populations. The current study was undertaken in order to enhance the understanding the role of this HtrA1 in the pathogenesis of AMD.
Methods. A HtrA1 gene trap mouse model was employed to compare the differences in protein expression between the gene trap mouse and a wild type mouse. ARPE19 and HeLa cells were transfected with a plasmid coding for triple-tagged, proteolytically inactive HtrA1. Next, a Co-IP assay was used to isolate HtrA1 interacting proteins. Selected candidates were validated with Western blot. Potential substrates of HtrA1 were tested by an in vitro digestion assay.
Results. Our study indicated that HtrA1 as a secreted protein binds to various complement components, e.g. CFP, CFD, CFI, C1r, C1s, C2, C3 and C5 in the classical pathway, as well as to components of the lectin-mediated pathway and, in particular, to components of the alternative pathway. Several of these components have been implicated in the pathological process of age-related macular degeneration. Notably, a regulatory component of the innate immune activity, Ubiquitin-like protein ISG15 directly interacts with HtrA1 in our Co-IP. Furthermore, our in vitro digestion assay showed that Ubiquitin-like protein ISG15 is a substrate of HtrA1 protease.
Conclusion. The aberrant activation of the complement system by HtrA1 found in our assays underlies the importance of the immune system in the pathogenesis of AMD. Our results suggest that HtrA1 may exert its biological function through the regulation of the immune system.ZIEL: Einzelnukleotid-Polymorphismen (englisch: Single-Nucleotide Polymorphisms, SNP) in dem chromosomalen Bereich 10q26, der die drei Gene PLEKHA1, ARMS2 und HtrA1 enthält, zeigen eine starke Assoziation mit der Pathogenese der Altersbedingten Makuladegeneration (AMD). In den letzten zehn Jahren haben sich zahlreiche Anzeichen dafür gehäuft, dass eine Hauptursache der Erkrankung in einer Mutation des HtrA1 Gens liegen könnte. Mit dieser Studie sollte daher die pathologische Rolle des Gens bzw. Proteins weiter aufgeklärt werden.
METHODEN: Ein HtrA1 "gene trap" Mausmodell wurde verwendet, um die Proteinexpression zwischen der gene trap Maus und der Wildtyp Maus zu vergleichen. Des Weiteren wurden ARPE19 Zellen und HeLa Zellen mit einem HtrA1-Plasmid transfiziert, das einen dreifach Tag trägt und für proteolytisch inaktives HtrA1 kodiert. Mittels Co-Immunopräzipitation wurden dann die Proteine präzipitiert, die mit HtrA1 interagieren. Interessante Kandidaten wurden mit Western Blot überprüft. Potentielle HtrA1 Substrats, wurden mittels in vitro Verdau getestet.
ERGEBNISSE: Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass HtrA1 als ein sekretiertes Protein an verschiedene Komponenten des Komplementsystems binden kann, und zwar an die Komponenten CFP, CFD, CFI, C1r, C1s, C2, C3 und C5 aus dem klassischen Weg, sowie an Komponenten des Lektin-Weges und besonders an Komponenten des alternativen Weges. Einige dieser Proteine stehen im Zusammenhang mit der Pathogenese der Altersbedingten Makuladegeneration. Insbesondere konnten wir zeigen, dass das Ubiquitin-like protein ISG15 bei Co-Immunopräzipitation direkt mit HtrA1 interagiert. Bei einem in vitro Verdau war Ubiquitin-like protein ISG15 auch ein Substrat für HtrA1.
AUSWERUNG: Die Aktivierung des Komplementsystems durch HtrA1, die wir unseren Assays gefunden haben, unterstützt die Vermutung, dass das Immunsystem eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von AMD spielt. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen vermuten, dass HtrA1 die Aktivität des Immunsystems reguliert
The non-canonical impact of Complement factor H on mTOR signaling and cellular metabolism in retinal pigment epithelium (RPE) cells
Full text linkThe following summary has been published in (58). Age-related macular
degeneration (AMD) is a complex degenerative disease of the retina with multiple
risk-modifying factors, including aging, genetics, and lifestyle choices. The
combination of these factors leads to oxidative stress, inflammation, and metabolic
failure in the retinal pigment epithelium (RPE) with subsequent degeneration of
photoreceptors in the retina. The alternative complement pathway is tightly linked to
AMD. In particular, the genetic variant in the complement factor H gene (CFH), which
leads to the Y402H polymorphism in the factor H protein (FH), confers the second
highest risk for the development and progression of AMD. Although the association
between the FH Y402H variant and increased complement system activation is
known, recent studies have uncovered novel FH functions not tied to this activity and
highlighted functional relevance for intracellular FH. In our previous studies, we show
that loss of CFH expression in RPE cells causes profound disturbances in cellular
metabolism, increases the vulnerability towards oxidative stress, and modulates the
activation of pro-inflammatory signaling pathways, most importantly the NF-kB
pathway. Here, we silenced CFH in hTERT-RPE1 cells to investigate the mechanism
by which intracellular FH regulates RPE cell homeostasis. We found that silencing
of CFH results in hyperactivation of mTOR signaling along with decreased
mitochondrial respiration and that mTOR inhibition via rapamycin can partially
rescue these metabolic defects. To obtain mechanistic insight into the function of
intracellular FH in hTERT-RPE1 cells, we analyzed the interactome of FH via
immunoprecipitation followed by mass spectrometry-based analysis. We found that
FH interacts with essential components of the ubiquitin-proteasomal pathway (UPS)
as well as with factors associated with RB1/E2F signalling in a complement-pathway
independent manner. Moreover, we found that CFH silencing affects mRNA levels
of the E3 Ubiquitin-Protein Ligase Parkin and PTEN induced putative kinase (Pink1),
both of which are associated with UPS. As inhibition of mTORC1 was previously
shown to result in increased overall protein degradation via UPS and as FH mRNA
and protein levels were shown to be affected by inhibition of UPS, our data stress a
potential regulatory link between endogenous FH activity and the UPS
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Unraveling the specificities of the different human methionine sulfoxide reductases
No full textThe oxidation of free and protein-bound methionine into methionine sulfoxide is a frequently occurring modification caused by ROS. Most organisms express methionine sulfoxide reductases (MSR enzymes) to repair this potentially damaging modification. Humans express three different MSRB enzymes which reside in different cellular compartments. In this study, we have explored the specificity of the human MSRB enzymes both by in silico modeling and by experiments on oxidized peptides. We found that MSRB1 is the least specific MSRB enzyme, which is in agreement with the observation that MSRB1 is the only MSRB enzyme found in the cytosol and the nucleus, and therefore requires a broad specificity to reduce all possible substrates. MSRB2 and MSRB3, which are both found in mitochondria, are more specific but because of their co-occurrence they can likely repair all possible substrates
Immunprivileg des Auges: Ca2+ -Signaling der äußeren Blut-Retina-Schranke
Full text linkCa2+ fungiert als elementares Signalmolekül der Zelle. Der zeitliche und räumliche Verlauf eines Ca2+-Signals bestimmt seine Wirkung auf die Zellfunktion. Wesentliche, durch Ca2+ gesteuerte Funktionen des RPE sind Ionentransport, Phagozytose von Photorezeptoraußensegmenten und Sekretion.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Verständnis der komplexen Vorgänge des Ca2+-Signaling im RPE wesentlich verbessert. Die Modulation von 2 Ionenkanälen, die den Ca2+-Spiegel in RPE Zellen erhöhen, TRPV2 und CaV1.3, wurde beleuchtet. Hier kam es zu erhöhter Membranoberflächenexpression sowie Veränderungen wesentlicher elektrophysiologischer Parameter wie Stromdichte und Aktivierungspotential. Zudem wurden mit Ano2 und Ano4 molekulare Korrelate für den Ca2+-abhängigen Cl--Kanal bzw. Ca2+-abhängigen Kationenkanal in der basolateralen Membran des RPE identifiziert. Als Ca2+-abhängige Mechanismen wurde neben dem Ionentransport ein Fokus auf die Sekretion von pro-angiogenen und pro-inflammatorischen Komponenten VEGF-A und PGF gelegt.
Somit konnte eine Brücke geschlagen werden von der Analyse zellphysiologischer Mechanismen zu Pathomechanismen bei verschiedenen retinalen Erkrankungen mit inflammatorischer und angiogener Komponente wie zum Beispiel diabetischer Retinopathie (DR) und Altersabhängiger Makuladegeneration (AMD).
Das RPE fungiert hier als „educational barrier“: bei Inflammation kommt es nicht zum Versagen der Barriere, sondern vielmehr zu einer orchestrierten Reaktion, bestehend aus ionalen und zellulären Mechanismen. Autokrine und endokrine Sekretion von proinflammatorischen und pro-angiogenen Faktoren spielt hier ebenso eine Rolle wie die Interaktion mit zellulären Komponenten der angeborenen und adaptiven Immunantwort. Hieraus leitet sich die Notwendigkeit ab zukünftige Therapiestrategien für DR und AMD nicht primär auf die Effektoren wie Endothelzellen oder Entzündungszellen zu konzentrieren, sondern die pathophysiologischen Prozesse im Zentrum, dem RPE zu adressieren/modulieren
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
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