1,721,008 research outputs found
Investigations of the spectrum of activity and mechanism of antimicrobial dermcidin derived peptides
No full textDermcidin (DCD) ist ein antimikrobielles Peptid, welches konstitutiv in ekkrinen Schweißdrüsen exprimiert und mittels Schweiß auf die Haut sezerniert wird. Durch postsekretorische Prozessierung im menschlichen Schweiß werden aus dem DCD-Protein mehrere DCD-abgeleitete Peptide generiert, die sich voneinander sowohl in der Peptidlänge als auch in ihrer Nettoladung unterscheiden.
Um den antimikrobiellen Wirkmechanismus der prozessierten DCD-abgeleiteten Peptide zu verstehen, wurden das antimikrobielle Wirkspektrum, die Sekundärstrukturen in verschiedenen Lösungsmitteln und die Fähigkeit der Peptide mit Membranen zu interagieren bzw. diese zu permeabilisieren untersucht.
Obwohl alle DCD-abgeleiteten Peptide eine alpha-helikale Konformation einnehmen können, besitzen diese interessanterweise ein unterschiedliches und teilweise überlappendes Wirkspektrum gegen Gram-positive und Gram-negative Bakterien. Dies deutet darauf hin, dass sowohl die Nettoladung als auch die alpha-helikale Sekundärstruktur der Peptide nicht essentiell für die toxische Aktivität zu sein scheinen. Weiterhin wurde mit Hilfe von Carboxyfluorescein-beladenen Liposomen, Membranpermeabilisierungs-Studien und Elektronenmikroskopie die Fähigkeit der Peptide untersucht, Bakterienmembranen zu permeabilisieren. Die Daten zeigen deutlich, dass die verschiedenen DCD-Peptide die Bakterienmembranen nicht permeabilisieren. Allerdings weisen Bakterienmutanten, welchen bestimmte Modifikationen in der Bakterienmembran fehlen, eine erhöhte Sensitivität gegenüber den DCD-Peptiden im Vergleich zum Wildtypstamm auf. Schließlich zeigen Untersuchungen mit Hilfe der Immunelektronenmikroskopie, dass die DCD-Peptide an die Bakterienmembran binden können, diese aber nicht offensichtlich schädigen. Insgesamt zeigen die Untersuchungen, dass die DCD-abgeleiteten Peptide ihre antimikrobiell Aktivität auf Bakterien unabhängig von ihrer Nettoladung und ohne Permeabilisierung der Bakterienmembran ausüben.Dermcidin (DCD) is an antimicrobial peptide, which is constitutively expressed in eccrine sweat glands and transported via sweat to the epidermal surface. By postsecretory proteolytic processing in sweat the dermcidin protein gives rise to several truncated DCD-peptides which differ in length and netcharge.
In order to understand the mechanism of antimicrobial activity the spectrum of activity of several naturally processed dermcidin-derived peptides, the secondary structure in different solvents and the ability of these peptides to interact with or permeabilize the bacterial membrane were analysed.
Interestingly, although all processed DCD-peptides can adopt an alpha-helical conformation, they have a diverse and partially overlapping spectrum of activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria. This indicates that the netcharge and the alpha-helical secondary structure of the peptides seem not to be important for the toxic activity. Furthermore, using carboxyfluorescein-loaded liposomes, membrane permeability studies and electron microscopy the ability of DCD-peptides to permeabilize bacterial membranes was investigated. The data convincingly show that the different DCD-peptides are not able to permeabilize bacterial membranes. However, bacterial mutants lacking specific membrane components exhibited different susceptibilities to killing by DCD-peptides than wildtype bacterial strains. Finally, immune-electrone microscopy studies indicated that DCD-peptides are capable to bind to the bacterial membrane, however, signs of membrane perturbation were not observed. These studies indicate that irrespective of their netcharge DCD-peptides do not exert their activity by permeabilizing bacterial membranes
Crosstalk of Keratinocytes with Neutrophils and Neutrophil Extracellular Traps Promotes Staphylococcus aureus Skin Colonization
Get PDFIn the skin, a highly regulated interplay between keratinocytes, immune cells, and the skin microbiome provides a protective barrier against skin infections with Staphylococcus aureus (S. aureus). A disturbance of this balance can lead to increased S. aureus colonization of the skin, which is particularly evident in atopic dermatitis (AD), an inflammatory skin disorder with an impaired barrier function of the skin. The abundant presence of S. aureus on AD skin exacerbates inflammation and barrier defects in the skin. In order to develop effective treatments, it is crucial to understand how the immune system interacts in this scenario. Neutrophils, while essential for fighting S. aureus, may paradoxically create a favorable environment for its colonization in inflammatory skin conditions, particularly through interactions with keratinocytes and NET formation. However, the underlying mechanisms of this phenomenon remain unknown.
Therefore, this work aimed to provide a detailed mechanistic understanding of how S. aureus colonization is enhanced in inflamed skin through the actions of neutrophils and NETs. We have demonstrated that disruption of the skin barrier by tape-stripping enhances S. aureus colonization of the skin and the presence of neutrophils in the skin in an in vivo epicutaneous colonization model. Neutrophil depletion reduced this enhanced S. aureus colonization revealing a functional role for them in this scenario. Further in vitro investigations using a human co-culture system of primary human keratinocytes and neutrophils showed that neutrophils co-incubated with keratinocytes are primed for NET formation in response to S. aureus infection. We show that the increased presence of neutrophils and NETs causes oxidative stress in the skin, which triggers the secretion of HMGB1. Extracellular HMGB1 induces further oxidative stress in the skin and NET formation in infiltrating neutrophils, leading to the decreased expression of epidermal barrier proteins and increased S. aureus colonization of the skin. The clinical evidence of our study is supported by analyses showing increased levels of HMGB1, neutrophils and NETs in the skin of AD patients.
Since neutrophils possess immunomodulatory functions and are associated with the exacerbation of skin inflammation in a variety of skin diseases, we investigated how the interaction between keratinocytes and neutrophils in the skin affects the immune response to S. aureus skin infections. Using our in vitro co-culture model, we showed that co-culturing neutrophils with keratinocytes leads to a significant prolongation of neutrophil lifespan, mediated by secreted IL-8, which was associated with an increased activity of neutrophils against S. aureus. Furthermore, prolonged co-culture with neutrophils induced inflammation in keratinocytes, which was exacerbated by S. aureus infection. Notably, the skin commensal S. epidermidis reduced neutrophil-mediated skin inflammation in keratinocytes and induced apoptosis in activated neutrophils, suggesting a beneficial role of the skin microbiome in preventing excessive skin inflammation.
In conclusion, this work provides the intriguing finding that the interaction between neutrophils and keratinocytes plays a critical role in S. aureus skin infections in inflamed skin. First, a crosstalk between keratinocytes and neutrophils primes neutrophils for NET formation, which promotes S. aureus colonization of the skin by causing skin barrier defects in a ROS-dependent manner. Second, the interplay between neutrophils and keratinocytes exacerbates skin inflammation induced by S. aureus infection. Therefore, we propose that the blockade of the interaction between neutrophils, NETs, and keratinocytes could serve as a potential treatment approach for skin disorders associated with S. aureus colonization, such as AD
Hochdosiertes Ascorbat zur Intervention bei Sepsis – eine in vitro Evaluation –
Get PDFBei der Sepsis kommt es komplikativ regelhaft zu einer überschießenden Freisetzung von Zytokinen, was in einer Schädigung der Gewebe und der Organe betroffener Patienten resultiert. Ein möglicher Ansatz zur gezielten pharmakologischen Intervention ergibt sich aus der Beobachtung, dass sich bei vielen Sepsis-Patienten ein ausgeprägter Vitamin C-Mangel findet, der wiederum mit einem höheren Bedarf an Vasopressoren, höheren SOFA-Scores und einer erhöhten Sterblichkeit korreliert.
Das Ziel der hier vorliegenden in vitro Studie war es, die Auswirkungen von hochdosiertem Vitamin C allein und in einer Dreifachkombination mit Vitamin B1 (Thiamin) und Hydrocortison auf die durch Lipopolysaccharid (LPS) ausgelöste Zytokinreaktion in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von gesunden menschlichen Spendern zu untersuchen.
Die Ergebnisse der hier vorliegenden in vitro Studie zeigen, dass pharmakologische Dosierungen von Vitamin C bis zu 2 mM die Viabilität von menschlichen PBMCs gesunder Spender nicht beeinflussen. Wie eingangs bereits vermutet, verringert Vitamin C allerdings die LPS-induzierte Freisetzung von Zytokinen, was die therapeutische Wertigkeit einer solchen Intervention bei Sepsis-Patienten unterstreicht.
Bei den untersuchten Zytokinen zeigte sich die Sekretion von MCP-1, IL-10 und IL-23 bei gleichzeitiger Vitamin C-Behandlung signifikant verringert. Die derartig nachgewiesene immunmodulatorische Wirkung von Vitamin C auf MCP-1, IL-10 und IL-23 ist von besonderem Interesse, da der septische Schock häufig mit einer übersteigerten Immunantwort und einer oft tödlichen Hyperzytokinämie verbunden ist.
Unsere Daten bestätigen auch eine dominante Wirksamkeit des Cortikosteroids Hydrocortison in den Kombinationsversuchen mit Vitamin B1 und Vitamin C. In diesem Zusammenhang ist es bemerkenswert, dass die Wirkung von Vitamin C auf die IL-10 Sekretion der Wirkung von Hydrocortison gleichkommt. Allerdings zeigte die Kombination von Vitamin C und Hydrocortison im Vergleich zu Hydrocortison keine zusätzliche Wirkung in Form einer verringerten Zytokinfreisetzung im Vergleich zu Hydrocortison allein; dies trifft für alle hier untersuchten Zytokine zu. Interessanterweise hatte Vitamin B1 keinen Einfluss auf die Zytokinfreisetzung.
In dieser Promotionsarbeit konnte somit gezeigt werden, dass Vitamin C eine modulierende Wirkung auf bestimmte entzündliche Zytokine ausübt. Allerdings sind Untersuchungen in weiteren Sepsis-Modellen erforderlich, um die Auswirkungen von Vitamin C auf die Abschwächung eines Zytokinsturms und damit den Erfolg einer dezidierten Sepsistherapie zu bewerten.
Trotz der interessanten Aspekte, die für Vitamin C erbracht wurden, zeigte sich in diesem in vitro PBMC-Sepsismodell eine dominante Wirkung von Hydrocortison in Bezug auf die Zytokinfreisetzung. Angesichts der Tatsache, dass Vitamin B1 keinen Einfluss auf die Zytokinfreisetzung hatte, könnte das Protokoll von Marik (Marik et al., 2017) zur Sepsis-Behandlung dahingehend modifiziert werden, dass Vitamin B1 zum Beispiel durch Vitamin D ersetzt wird.
Da Vitamin C einen lebenswichtigen Mikronährstoff darstellt, sollte die Wiederherstellung physiologisch angemessener Serum-Konzentrationen an Vitamin C ein zentraler Bestandteil eines jeden therapeutischen Ansatzes sein. Inwiefern supraphysiologische Serum-Konzentrationen von Vitamin C mit zusätzlichen therapeutischen Vorteilen bei Sepsis-Patienten verbunden sind, muss in weiteren klinischen Studien überprüft werden
Establishment of an in vitro model for melanoma cell dormancy through short-term chemotherapy
Get PDFIntroduction
Many years after removal of the primary tumor, melanoma patients can face a severe recurrence of the malignancy. The appearing metastases at different organ sites most likely arise by reawakening of “dormant” tumor cells. The survival of the latter is attributed to an induced reversible cell cycle arrest. Although cellular dormancy in tumor cells is already known for decades, in vitro models to investigate the cellular mechanisms of dormancy and late recurrence in melanoma remain to be established. This study aimed to elaborate an in vitro model for cellular dormancy in cutaneous melanoma, recapitulating the latency of recurrence. We hypothesized that Cisplatin induces a stable cell cycle arrest in a subgroup of cells in different melanoma cell lines and further assumed this cell cycle arrest as being reliably reversible upon the addition of a specific stimulus.
Methods
The establishment of our in vitro model included the optimization of the experimental setting and scheme, the analysis for different cell cycle arrest associated characteristics in the surviving cells and exposure of the latter to putatively pro-proliferative stimuli such as conditioned media of proliferating melanoma cells, specific growth factors or components of the extracellular matrix.
Results
A cell cycle arrest was induced by treatment with Cisplatin in combination with the reduction of fetal calf serum in the medium in three different melanoma cell lines but stability, homogeneity, and reproducibility in the arrest accounted only for SBCL2 cells, treated under specific conditions. One week after therapy removal, all three cell lines showed a G2/M-arrest in the majority of cells in cell cycle analysis by flow cytometry. In surviving SBCL2 cells, this arrest was largely maintained until day 17 of the scheme for short-term chemotherapy. Whereas PCNA expression analysis by immunofluorescence reaction supports the idea of a G2/M-arrest, β-galactosidase staining and morphological characteristics of surviving SBCL2 cells on day 18 of the scheme suggests a senescent phenotype which is commonly associated with a G1-arrest. Neither the application of putatively pro-proliferative stimuli nor the seeding on different components of the extracellular matrix triggered cell cycle-arrested SBCL2 cells into ready re-proliferation.
Discussion and Conclusion
The established in vitro model enables for multifactorial investigation on cellular dormancy over several weeks, reflecting more closely than others the clinical reality of late recurrence. A potent pro-proliferative stimulus reversing Cisplatin-induced cell cycle arrest in our in vitro model remains to be found. Still, the diverse results of this study already encourage widening commonly accepted theories of cellular dormancy in cutaneous melanoma.Einleitung
Jahre nach der Entfernung des Primärtumors können Melanompatienten einen schweren Rückfall der Erkrankung erleiden. Die sich bildenden Metastasen gehen vermutlich auf wiedererweckte Schläferzellen zurück. Das Überleben dieser wird auf einen induzierten reversiblen Zellzyklusarrest zurückgeführt. Obwohl die Existenz von Schläferzellen seit Jahrzenten bekannt ist, gibt es bisher keine in vitro Modelle, um die zellulären Mechanismen der Schläferzellen im Melanom und ihre Reaktivierung zu untersuchen.
Das Ziel dieser Studie war es, ein solches in vitro Modell für Zellschlaf beim kutanen Melanom zu entwickeln, welches zudem die klinische Latenz widerspiegelt. Wir vermuteten, dass Cisplatin in einer Untergruppe von verschiedenen Zelllinien des Melanoms einen stabilen Zellzyklusarrest induziert und gingen weiter davon aus, dass dieser Arrest reversibler Natur ist und bei Zugabe spezifischer Stimuli zuverlässig aufgehoben werden kann.
Methoden
Die Etablierung unseres in vitro Models beinhaltete die Optimierung des experimentellen Versuchsaufbaus und -ablaufs, die Analyse verschiedener Zellzyklus assoziierter Eigenschaften der überlebenden Zellen und die Stimulation letzterer mit mutmaßlich pro-proliferativen Faktoren wie beispielsweise konditionierten Medien proliferierender Melanomzellen, spezifischer Wachstumsfaktoren und Komponenten der extrazellulären Matrix.
Ergebnisse
Durch Behandlung mit Cisplatin in Kombination mit einer Reduktion des Fetalen Kälberserums im Nährmedium konnte in drei verschiedenen Melanomzelllinien ein Zellzyklusarrest induziert werden, jedoch war dieser lediglich bei der SBCL2 Zelllinie und unter spezifischen Bedingungen stabil, homogen und reproduzierbar. Eine Woche nach Beendigung der Therapie zeigte die Zellzyklusanalyse in der Durchflusszytometrie einen Arrest in der G2/M-Phase bei der Mehrzahl der Zellen aller drei Zelllinien. In den überlebenden SBCL2 Zellen wurde dieser Arrest größtenteils bis Tag 17 des Schemas für „short-term chemotherapy“ aufrechterhalten. Während die PCNA-Expressions-analyse durch Immunfluoreszenz die Idee eines G2/M-Arrests unterstützt, deutet die β-Galactosidasefärbung der an Tag 18 des Schemas überlebenden SBCL2 Zellen in Richtung des seneszenten Phänotyps, welcher eher mit einem G1-Arrest assoziiert wird. Weder die Applikation mutmaßlich pro-proliferativer Stimuli noch die Aussaat auf verschiedenen Bestandteilen der extrazellulären Matrix konnten zellzyklusarretierte SBCL2 Zellen zur Re-Proliferation anstoßen.
Diskussion und Schlussfolgerung
Das etablierte in vitro Model ermöglicht eine vielseitige Untersuchung von Schläferzellen über mehrere Wochen. Mehr als andere Modelle kann dies die klinische Realität später Rückfälle abbilden. Ein wirksamer Stimulus zur Reaktivierung des Cisplatin-induzierten Zellzyklusarrests bleibt zu entdecken. Dennoch regen die vielfältigen Ergebnisse dieser Arbeit bereits dazu an, die weithin akzeptierten Theorien zu Schläferzellen im kutanen Melanom zu überdenken
Importance of the TP53 Family and the DNA Damage Repair Machinery in Overcoming Targeted Therapy Resistance in Malignant Melanoma
Get PDFThe skin cancer melanoma is known for its aggressive nature and high mortality rate when metastasized. While there has been significant advancement in using mitogen-activated protein kinase (MAPK) inhibitors (MAPKi) to target melanoma cells and combat metastasis, most patients ultimately experience relapse due to different resistance mechanisms. Despite the positive impact of immunotherapy on the prognosis of melanoma patients, some individuals show no response to these therapeutic drugs. Consequently, it becomes crucial to unravel the molecular mechanisms behind acquired resistance to targeted treatments and explore innovative therapeutic approaches for these patients.
In the first part of our study, we aimed to uncover the role of the p53 target gene CDKN1A/p21 in the response of melanoma cells to v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 (BRAF) inhibitors (BRAFi). Our findings reveal that activation of p53 enhances the sensitivity of melanoma cells to BRAFi in a synergistic manner, exclusively in cells exhibiting high expression levels of CDKN1A/p21. Similarly, high expression of CDKN1A/p21 correlates with a more favorable response to the mouse double minute 2 (MDM2) inhibitor (MDM2i) Nutlin-3 compared to cells with low CDKN1A/p21 expression. These results suggest that the effectiveness of targeted therapies (such as BRAFi and MDM2i) in melanoma cells correlates with the expression levels of the p21 protein in the cells. Furthermore, our study uncovers that p53 negatively regulates the expression of the p53 family member p73, however p73 does not appear to influence p53 expression. These discoveries offer new potential strategies for improving the treatment of melanoma patients with elevated basal p21 levels. Specifically, combination therapies utilizing p53 activators, which further increase p21 expression levels, can enhance the efficacy of BRAFi. Additionally, the data suggest that the expression and induction level of p21 could serve as a predictive biomarker in melanoma patients, enabling the prognosis of treatment outcomes with p53 activators and BRAFi.
In the second part of the project, the focus shifted towards targeting the DNA repair pathway as a potential therapy against melanoma, particularly in the case of melanoma cells resistant to MAPKi. We explored the use of poly adenosine diphosphate (ADP) ribose polymerase (PARP) inhibitors (PARPi) for this purpose. Our findings indicate that melanoma cells resistant to MAPKi exhibit increased sensitivity to PARPi treatment, facilitated by decreased ataxia-telangiectasia mutated (ATM) basal expression, an important DNA damage sensor. As a result, these resistant melanoma cells demonstrate an impaired ability to detect and repair DNA double strand breaks through the homologous recombination repair (HRR) pathway, which can be induced by PARPi. Additionally, we discovered that inhibiting the MAPK pathway induces a state of HRR deficiency (HRD) in melanoma cells, regardless of their sensitivity to MAPKi. This led to a synthetic lethal interaction when combining MAPK inhibition with PARPi, resulting in a significant reduction in melanoma cell growth both in vitro and in vivo.
In the third part of the project, we were interested in the role of PARP1 as a predictive biomarker to forecast PARPi therapy response as well as progression and metastatic potential of melanomas. We could show that high PARP1 expressing melanoma cells are extremely sensitive to PARPi treatment due to a higher PARP trapping effect, and thereby increased cell death. Moreover, we found that PARP1 expression positively correlates with the invasiveness and metastatic potential of melanoma cells, and that PARP1 is low expressed in non-malignant skin cells. Most strikingly, we found that high PARP1 expression goes along with significantly decreased overall survival probability of metastasized late-stage melanoma patients. With this, we propose that PARP1 might be used as a potential biomarker to predict PARPi therapy response and that especially the late-stage melanoma patients would benefit from the therapy with PARPi.Das maligne Melanom ist eine sehr aggressive Form von Hautkrebs mit einer hohen Sterblichkeitsrate bei Patienten, die an Metastasen leiden. Trotz der großen Fortschritte, die bei der Bekämpfung des metastasierten Melanoms mit Hilfe von MAPK Inhibitoren (MAPKi) erzielt wurden, kommt es bei den meisten Patienten aufgrund verschiedener Resistenzmechanismen zu einem Rezidiv. Auch wenn der Einsatz der Immuntherapie die Prognose von metastasierten Melanompatienten verbessert hat, sprechen einige Patienten überhaupt nicht auf immuntherapeutische Medikamente an. Daher ist es von größter Bedeutung, die molekularen Mechanismen der erworbenen Resistenz gegen zielgerichtete Therapien zu entschlüsseln und neue therapeutische Strategien für diese Patienten zu finden.
Im ersten Teil dieser Studie haben wir versucht, die Rolle des p53 assoziierten Gens CDKN1A/p21 in der Sensitivität von Melanomzellen auf BRAF Inhibitoren (BRAFi) zu entschlüsseln. Wir zeigen, dass die Aktivierung von p53 die Sensitivität gegenüber BRAFi auf synergistische Weise ausschließlich in Zellen mit einer hohen Expression von CDKN1A/p21 erhöht. In ähnlicher Weise geht eine hohe Expression von p21 mit einer besseren Reaktion auf MDM2-Inhibitoren einher. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Sensitivität von Melanomzellen gegenüber zielgerichteten Therapien mit der Proteinexpression von p21 in den Zellen korreliert ist. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass p53 die Expression des p53 Familienmitglieds p73 negativ reguliert, p73 scheint jedoch keinen Einfluss auf die p53 Expression zu haben. Diese Ergebnisse bieten neue potenzielle Strategien für die Verbesserung der Behandlung von Melanompatienten mit hoher basaler p21 Expression mit BRAFi, indem die Wirksamkeit der Behandlung durch Kombinationstherapien mit p53 aktivierenden Substanzen erhöht wird, die in der Lage sind, die p21 Expression weiter zu steigern. Darüber hinaus deuten die Daten darauf hin, dass die Expressions- und Induktionswerte von p21 als prädiktiver Biomarker bei Melanompatienten verwendet werden könnten, um das Ergebnis einer Behandlung mit p53-aktivierenden Substanzen und BRAFi vorherzusagen.
Im zweiten Teil des Projekts konzentrierten wir uns auf die Regulation des DNA-Reparaturweg als Melanomtherapie, insbesondere bei MAPKi resistenten Melanomzellen, durch den Einsatz von PARP Inhibitoren (PARPi). Wir fanden heraus, dass MAPKi resistente Melanomzellen besonders empfindlich auf die Behandlung mit PARPi reagieren, da sie eine geringere basale Expression des DNA-Schadenssensors ATM aufweisen. Folglich haben MAPKi resistente Melanomzellen eine verringerte Erkennung von DNA-Doppelstrangbrüchen, die durch PARPi verursacht werden. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Hemmung des MAPK-Signalwegs in Melanomzellen unabhängig von ihrem Resistenzstatus gegenüber MAPKi einen homologen Rekombinationsreparatur defizienten (HRD) Phänotyp hervorruft. Die MAPK Inhibition in Kombination mit PARPi führt zu einer synthetisch letalen Interaktion, die das Wachstum von Melanomzellen in vitro und in vivo deutlich reduziert.
Im dritten Teil des Projekts interessierten wir uns für die Rolle von PARP1 als prädiktiver Biomarker zur Vorhersage des Ansprechens auf eine PARPi-Therapie sowie des Fortschreitens und des Metastasierungspotenzials von Melanomen. Wir konnten zeigen, dass Melanomzellen mit hoher PARP1 Expression sehr gut auf eine PARPi-Behandlung reagieren, da die Behandlung zu einem höheren PARP-Trapping-Effekt und damit einem erhöhten Zelltod führt. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die PARP1 Expression positiv mit der Invasivität und dem metastatischen Potenzial von Melanomzellen korreliert, und dass PARP1 in nicht-malignen Hautzellen nur gering exprimiert wird. Besonders auffallend ist, dass eine hohe PARP1 Expression mit einer deutlich geringeren Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten mit metastasiertem Melanom im Spätstadium einhergeht. Damit schlagen wir vor, dass PARP1 als potenzieller Biomarker für die Ansprechrate auf eine PARPi-Therapie verwendet werden könnte und dass insbesondere Melanompatienten im Spätstadium möglicherweise von einer PARPi-Therapie profitieren
Influence of Neutrophils and Extracellular Matrix on the Reactivation of Dormant Melanoma Cells
Get PDFDespite new therapeutic strategies, melanoma patients suffer from recurrence decades after successful treatment. The underlying mechanism is thought to be tumor dormancy, a state of reversible growth arrest in which tumor cells persist in niches. Upon an adequate stimulus, such as sustained inflammation through smoking, metastatic outgrowth may occur. As proven in breast cancer, this may be mediated by neutrophil extracellular traps (NETs), which in turn alter the extracellular matrix (ECM) of the tumor niche. In this study, we aimed to validate the previously established in vitro model of melanoma dormancy. We further hypothesized that stimulated neutrophils release NETs, which reawaken dormant tumor cells in an ECM-dependent manner.
Dormancy was induced in SbCl2 and A375 melanoma cells by a 72 h treatment with cisplatin, which lasted for at least 15 days. Regrowth was assessed for up to 6 weeks by light microscopy, cell or colony count and by using the fluorescence ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system in melanoma cells. Stable G0/G1 arrest was only achieved in SbCl2 but not in A375 cells. Expression analysis by qPCR and western blot characterized dormant melanoma cells on the molecular level. While p53 and p21 stabilized the cell cycle arrest for 20 days, ERK activation (MAPK) may contribute to cell survival. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers further indicated a shift towards a differentiated epithelial phenotype shortly after dormancy induction, contrary to our expectations. Findings of the senescence-associated β-galactosidase assay allow coexistence of a dormant and senescent (irreversible arrest) state.
The proliferative capacity of melanoma cells was assessed during cocultivation of melanoma cells with neutrophils or NETs and/or the ECM components Matrigel or a fibroblast matrix. Fibroblast derived ECM (FF-ECM) and Matrigel restricted growth in proliferating cells, while solubilized FF-ECM promoted proliferation. Cocultivation (6-18 h) of PMN or NETs with dormant SbCl2 cells did not induce reawakening when seeded in 2 % Matrigel. NETs induced massive cell death, which may explain why melanoma cells act suppressive on NET formation.
All in all, PMN/NETs did not reawaken SbCl2 cells of our in vitro dormancy model under the selected test conditions. Future studies may focus on the effect of sustained neutrophil inflammation in melanoma
Strukturelle Untersuchungen zum Wirkmechanismus von DCD-1L, einem anionischen antimikrobiellen Peptid
Get PDFDermcidin-abgeleitete Peptide werden in den ekkrinen Schweißdrüsen konstitutiv exprimiert und in den Schweiß sezerniert. Diese Peptide unterscheiden sich in Länge, Nettoladung und einigen konnte eine antimikrobielle Aktivität gegen pathogene Bakterien nachgewiesen werden. Mit Hilfe des anionischen DCD-1L sollte der antimikrobielle Wirkmechanismus, der zum bakteriellen Zelltod führt, genauer untersucht werden.
Im Rahmen dieser Arbeit sowie in vorhergehenden Arbeiten konnte eine Interaktion des Peptids mit der bakteriellen Zelloberfläche beobachtet werden, wobei die Oberflächenstruktur gestört wird. Die Interaktion zwischen DCD-1L und bakteriellen Phospholipiden oder DCD-1L in membranimitierenden Umgebungen (TFE, Detergenzien) führten zu einer strukturellen Veränderung des Peptids. DCD-1L bildete dabei eine amphipathische alpha-helikale Struktur aus und orientierte sich parallel zur Membrannormalen in Lipidsystemen aus POPG oder DMPC/DMPG (1:1). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass DCD-1L oligomere Strukturen in membranimitierenden Umgebungen sowie in Anwesenheit von Phospholipiden ausbildet, welche durch Zn2+ stabilisiert wurden. Auch eine Steigerung der antimikrobiellen Aktivität von DCD-1L gegen S. aureus 113 WT konnte in vitro durch die Zugabe von divalenten Kationen erzielt werden. Des Weiteren konnte in elektrophysiologischen Messungen DCD-1L eine spannungsabhängige porenbildende Aktivität in DPhPC-Phospholipidlayern nachgewiesen werden. Die Leitfähigkeit verhielt sich sigmoidal und wurde durch den pH-Wert beeinflusst, wobei keine Ionenselektivität gemessen werden konnte.
Anhand der erzielten Ergebnisse kann ein Modell zur Wirkungsweise von DCD-1L erstellt werden. Die initiale Interaktion zwischen DCD-1L und den Phospholipiden der bakteriellen Membran erfolgt wahrscheinlich über elektrostatische Kräfte oder über Salzbrücken. Dabei führt der Kontakt von DCD-1L mit der Zielmembran zur Ausbildung einer amphipathischen alpha-Helix, welche sich parallel zur Membran orientiert. Beim Erreichen einer Schwellenkonzentration kommt es zur Oligomerisierung der Peptide und zur Permeabilisierung der Membran.Dermcidin-derived peptides are constitutively expressed in human eccrine sweat glands and secreted into the sweat. These peptides differ in length, net charge and some of them have an antimicrobial activity against pathogens. The antimicrobial activity of DCD-1L, which leads to bacterial cell death, was investigated in detail.
In this study as well as in previous work we observed an interaction of the peptide with the bacterial surface, whereby the surface structure was disturbed. The interaction between DCD-1L and bacterial phospholipids or DCD-1L in membrane-imitating environments (TFE, detergents) induced a structural change of the peptide. DCD-1L changed its disordered conformation to an amphipathic alpha-helical structure and was aligned in plane of the lipid bilayer consisting of POPG or DMPC/DMPG (1:1). In addition, DCD-1L formed oligomeric structures which are stabilized by Zn2+ in membrane-imitating environments as well as in the presence of phospholipids. The antimicrobial activity of DCD-1L against S. aureus 113 WT was increased by divalent cations. In single channel conductance measurements it was shown, that DCD-1L was able to form voltage-dependent ion channels in DPhPC bilayers, which were pH-dependent without an ion selectivity.
With these data it is possible to develop a model for the mode of action of DCD-1L. The initial interaction between DCD-1L and the phospholipids of the bacterial membrane take place by electrostatic interactions or by salt bridges. The interaction induces an amphipathic alpha-helical structure and the peptide is aligned in plane of the membrane. After reaching a concentration dependent threshold the peptide will oligomerize and permeabilize the membrane
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Get PDF“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
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