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Effect of the expression of BRCA2 on spontaneous homologous recombination and DNA damage-induced nuclear foci in Saccharomyces cerevisiae
No full textRAD52 influences the effect of BRCA1/2 missense variants on homologous recombination and gene reversion in Saccharomyces cerevisiae
No full textThe breast and ovarian cancer susceptibility genes, BRCA1 and BRCA2, are key players in the homologous recombination (HR) repair pathway and act as tumor suppressors by maintaining genome stability. The yeast Saccharomyces cerevisiae has no BRCA1/2 homolog; however, a number of HR genes are evolutionary conserved between human and yeast. Among them, RAD52 is involved in DNA double strand break (DSB) repair by HR, and promotes genome stability. We previously reported that the heterologous expression of cancer-associated BRCA1/2 missense variants in growing yeast cultures affects both spontaneous HR and gene reversion (GR) suggesting that yeast could be a reliable system to assess the functional impact of variants. Because inhibition of Rad52p is lethal in BRCA1/2 mutated tumors, and Rad52p is conserved between humans and yeast, we asked if the effect of BRCA1/2 variants on HR and GR could be affected by loss of RAD52. We found that the rad52∆ mutation predominantly suppressed the stimulation of HR in yeast by pathogenic BRCA1 variants but also facilitated increased GR by pathogenic variants. Conversely, the rad52∆ mutation stimulated HR by a pathogenic BRCA2 variant in yeast but had no effect on GR. These results demonstrate a functional interplay between the pathogenic BRCA1/2 variants and Rad52p in budding yeast, supporting the use of budding yeast as a suitable system for evaluating potential chemotherapeutic strategies
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Influenza dei "pathways" di riparazione del DNA sulla instabilita genomica indotta dall'espressione di BRCA1 nel lievito Saccharomyces cerevisiae
No full textI carcinomi della mammella e dell’ovaio rappresentano le prime cause di mortalità per tumore nella donna. Uno dei geni che, se mutato, conferisce il più elevato rischio di sviluppare questa sindrome tumorale ereditaria è BRCA1.
Nei mammiferi BRCA1 è situato sul cromosoma 17, è composto da 24 esoni e codifica per una proteina in grado di interagire con varie proteine come ad esempio BARD1 e con p53, o formare un macrocomplesso proteico, definito BASC, coinvolto nella riparazione del DNA e nella progressione del ciclo cellulare. Il gene BRCA1 è polimorfico, ovvero può presentare diverse mutazioni a singola base lungo la sua sequenza, alcune sono note e associate ad un aumento di instabilità genomica, alcune classificate come neutre e quindi non associate allo sviluppo del tumore, e altre non ancora del tutto conosciute.
L’impiego di S. cerevisiae come sistema di espressione di una proteina umana può risultare un ottimo metodo di analisi in quanto, nonostante nel lievito non sia presente l’omologo di BRCA1, tale organismo conserva gli stessi “pathway” di riparazione del DNA presenti nell’uomo, e inoltre riesce a sintetizzare la proteina BRCA1.
Lavori precedentemente pubblicati dal gruppo di ricerca dove ho svolto la tesi, dimostrano che l'espressione di BRCA1 wild-type e di due varianti missenso neutre non induce aumento di ricombinazione nel ceppo diploide di Saccharomyces cerevisiae RS112, al contrario l’espressione di varianti cancro-correlate determina un significativo aumento della ricombinazione. Poiché, è noto che negli eucarioti superiori BRCA1 è coinvolto nella riparazione del DNA, l’ipotesi è che l’espressione di BRCA1 in ceppi di lievito riparazione-deficienti possa influenzare l’instabilità genomica misurabile come effetto sulla ricombinazione e sulla reversione, e quindi possa dare un contributo per capire se un pathway specifico possa essere coinvolto nella determinazione del tumore.
Abbiamo espresso BRCA1 e diverse varianti missenso in due ceppi aploidi di lievito: RSY6msh2Δ che è difettivo per il processo di riparazione dei disaccoppiamenti di base del DNA (“mismatch repair”); e RSY6rad52Δ che ha un difetto nella riparazione per ricombinazione omologa.
I vettori di espressione per BRCA1wt e per le varianti missenso sono stati trasformati nei due ceppi difettivi e per comparazione nel ceppo RSY6RAD52MSH2.
Dopo aver selezionato i ceppi trasformati e aver dimostrato per Western blot che BRCA1 viene espressa anche nei ceppi difettivi, abbiamo determinato il suo effetto sulla ricombinazione e reversione.
Dai risultati ottenuti si dimostra che nel ceppo RSY6RAD52MSH2 l’espressione di BRCA1 WT non induce aumento di ricombinazione e di reversione; l’espressione di tutte le varianti influenza debolmente la ricombinazione, mentre l’espressione di una variante nel C-terminale aumenta la frequenza di reversione.
Nel ceppo RSY6rad52Δ, l'espressione di BRCA1wt non influenza la frequenza di ricombinazione. In questo ceppo l’evento di reversione aumenta quando vengono espresse due varianti patogenetiche di BRCA1 e BRCA1 WT.
Nel ceppo RSY6msh2Δ, l’espressione della proteina BRCA1wt e di alcune varianti induce un forte aumento sia della ricombinazione che della reversione. L’espressione di due varianti patogenetiche non ha alcun effetto né sulla ricombinazione che sulla reversione. Questo suggerisce che il “mismatch repair” e, soprattutto il gene MSH2 hanno un ruolo nella instabilità genetica e presumibilmente nella cancerogenesi indotta da BRCA1.
Questi risultati indicano che la proteina BRCA1 influenza i “pathway” di riparazione del DNA in lievito. Poiché l’espressione di varianti missenso induce effetti diversi nei ceppi deficienti per la riparazione del DNA indica che presumibilmente questi pathway potrebbero essere fondamentali per la determinazione del rischio di tumore.
In conclusione il nostro studio dimostra che la genetica del lievito può dare un contributo per comprendere le basi genetiche della tumorigenicità dovuta a mutazioni di BRCA1
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Full text linkWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
Geni che regolano la rigenerazione dell'osso: analisi dell'espressione di Otx1 nell'osteogenesi
No full textMolti studi avvalorano l’ipotesi che processi di differenziazione di diversi tessuti siano orchestrati da meccanismi molecolari comuni. I geni contenenti omeobox codificano fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione dello sviluppo embrionale e nel controllo di processi differenziativi adulti. Un esempio significativo è rappresentato dai geni Otx, omologhi nei Vertebrati del gene Orthodenticle di Drosophila, che svolgono un ruolo di notevole rilievo sia nella neurogenesi che nell’ematopoiesi. Otx2 è il primo a essere attivato durante l’embriogenesi ed è indispensabile per la specificazione precoce della piastra neurale. Otx1 mostra un’espressione più tardiva necessaria per l’organizzazione dell’area temporale della corteccia cerebrale ed è coinvolto anche nello sviluppo di occhio e orecchio e nella funzionalità della ghiandola pituitaria. Topi Otx1 -/- sono affetti da epilessia e mostrano varie anormalità neurologiche e difetti al sistema acustico e visivo; i topi Otx2 -/- sono invece non vitali in quanto viene completamente a mancare la formazione delle strutture anteriori del cervello.
Studi effettuati nel nostro laboratorio hanno dimostrato che Otx1 ha un’importante funzione anche nella produzione di cellule del sangue. Infatti è espresso nei precursori ematopoietici e, ad alti livelli, nei precursori eritroidi. L’ablazione di Otx1 provoca un difetto intrinseco nelle cellule staminali ematopoietiche (Hematopoietic Stem Cells - HSC) che ha come conseguenza una produzione insufficiente di cellule eritroidi. Otx1 contribuisce al controllo dell’eritropoiesi attraverso l’azione diretta su un fattore di trascrizione, SCL, fondamentale per l’ematopoiesi e in particolare per la filiera eritroide.
Nel midollo osseo, insieme alle HSC e ai progenitori ematopoietici, sono presenti cellule staminali e progenitori mesenchimali (Mesenchymal Stem Cells o Marrow Stromal Cells - MSC) responsabili della formazione di osso, cartilagine, tessuto adiposo e tessuto muscolare.
Il nostro interesse è attualmente diretto, per diversi motivi, a comprendere se i geni Otx contribuiscano anche alla regolazione delle cellule mesenchimali:
a) le MSC rappresentano un altro tipo di cellule staminali nel quale verificare l’ipotesi per cui i geni Otx controllano proprietà comuni a tutte le cellule staminali
b) insieme agli osteoblasti maturi e alle cellule endoteliali, le MSC costituiscono la nicchia delle HSC ovvero il microambiente necessario a mantenere le loro caratteristiche staminali
c) cellule ematopoietiche e osteoblasti sembrano derivare da un precursore comune
d) i meccanismi molecolari che regolano il differenziamento e la maturazione delle MSC sono ancora poco conosciuti.
Scopo della mia tesi è determinare l’espressione dei geni Otx in cellule mesenchimali durante la loro differenziazione in senso osteogenico. Un buon modello sperimentale per questo processo è costituito dalla linea cellulare murina MC3T3-E1, ottenuta dalle ossa del cranio di embrione di topo, che riproduce il processo di differenziamento degli osteoblasti durante la formazione di osso in vivo.
Pertanto ho analizzato l’espressione dei geni Otx in cellule MC3T3-E1 mantenute in coltura, sia allo stato indifferenziato sia a tempi diversi durante la differenziazione in senso osteogenico. Ho verificato lo stadio differenziativo attraverso una colorazione istochimica (Alizarin Red) che mette in evidenza la formazione di matrice di fosfati di calcio tipica degli osteoblasti maturi e ho valutato l’espressione di geni regolatori e di marcatori osteogenici tramite PCR semiquantitativa e quantitativa (Real Time qPCR). I risultati ottenuti dimostrano che Otx1 è espresso in cellule MC3T3-E1 mentre Otx2 è inattivo. Inoltre l’espressione di Otx1 è modulata nel corso della differenziazione osteogenica. Un’analisi iniziale dei possibli targets ha evidenziato che, al contrario di quanto avviene nel sistema ematopoietico, Scl non interviene nel pathway trascrizionale di Otx1 nel sistema mesenchimale. Al fine di verificare se OTX1 potesse essere coinvolto anche nell’osteogenesi umana, ho effettuato una analisi di espressione in cellule staminali mesenchimali umane sia allo stato indifferenziato che dopo induzione in senso osteogenico. I risultati ottenuti confermano il profilo di espressione riscontrato nel modello murino. Queste osservazioni suggeriscono che Otx1 sia implicato nel controllo della rigenerazione ossea confermando l’ipotesi di una sua funzione regolatrice in diversi processi differenziativi
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