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Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica e Transtornos de Deglutição: revisão de literatura
Full text linkTCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências da Saúde. Fonoaudiologia.Introdução: Pelas projeções dos órgãos de saúde e sociedades científicas da área, nas próximas décadas a DPOC será uma das cinco primeiras causas de morte em todo o mundo sendo que no Brasil já é uma das doenças mais incapacitantes e com elevados índices de mortalidade. A DPOC corresponde a presença de obstrução ou limitação crônica do fluxo aéreo, apresentando progressão lenta e irreversível. A respiração é a parte intrínseca e vital no processo de deglutição, porém, é a função mais afetada na DPOC. Objetivo:Realizar uma revisão de literatura visando encontrar artigos que busquem a relação da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica com transtornos de deglutição.Metodologia:Foi conduzida uma busca em artigos nos idiomas PORTUGUES, INGLES e ESPANHOL sobre a relação da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica com transtornos de deglutição, sem limite de tempo, texto na íntegra, tipo de estudo (sem delimitação), população-alvo (adultos) nas bases de dados MEDLINE-PUBMED, LILACS, SCIELO e SCOPUS. As palavras-chave usadas isoladas e em cruzamentos foram: em português: DPOC; transtornos de deglutição, deglutição, disfagia e disfagia orofaríngea; em inglês: COPD, deglutition disorders, swallowing disorders, dysphagia e em espanhol: EPOC e transtornos de Deglución. Resultados: A pesquisa resultou em 224 artigos, destes apenas 18 preencheram os critérios de inclusão, sendo 12 artigos encontrados na base de dados PUBMED, 3 artigos encontrados na base de dados LILACS e 3 na base SCIELO. Conclusão: Há escassez de trabalhos sobre a correlação entre disfagia no paciente com DPOC, porém, em 15 (quinze) dos 18 (dezoito) artigos estudados, o que corresponde a 79% do total, houve esta relação. Sugerem-se novos estudos, estruturados metodologicamente, abordando este mesmo tema, para a disseminação do conhecimento a cerca dos fatores que podem influenciar a estabilidade do paciente acometido por estas comorbidades.Introduction: According to projections of health agencies and scientific societies of the area in the coming decades COPD is one of the five leading causes of death worldwide and in Brazil is already one of the most disabling diseases and high mortality. COPD accounts for obstruction or chronic airflow limitation, with slow progression and irreversible. Breathing is a vital and intrinsic part of the swallowing process, however, is the most affected function in COPD. Objective:To review the literature in order to find articles that seek the relationship of Chronic Obstructive Pulmonary Disease with swallowing disorders. Methods: We conducted a search for articles in languages PORTUGUESE, ENGLISH and SPANISH on the relationship of Chronic Obstructive Pulmonary Disease with swallowing disorders, no time limit, full text, type of study (without boundary), the target population (adults ) in MEDLINE, PUBMED, LILACS, SCIELO and SCOPUS. The keywords used were isolated and crossings: in Portuguese: COPD; swallowing disorders, swallowing, dysphagia and oropharyngeal dysphagia, in English: COPD, deglutition disorders, swallowing disorders, dysphagia and Spanish: EPOC and disorders Deglución. Results:The search resulted in 224 articles, of which only 18 met the inclusion criteria, 12articles found in PUBMED database, 3 articles found in the database LILACS and SCIELO third base. In SCOPUS database items found were discarded due to the exclusion criteria. Conclusion:There are few studies on the correlation between dysphagia in patients with COPD, however, within fifteen (15) of the eighteen (18) items studied, which corresponds to 79% of the total, there was this relationship. Suggest new studies, methodologically structured, addressing the same subject, for the dissemination of knowledge about the factors that may influence the stability of patients affected by these comorbidities
aspectos parasitológicos de Cavia intermedia (Rodentia: Caviidae) no arquipélago de Moleques do Sul, em Santa Catarina, Brasil
Full text linkTCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Biologia.Cavia intermedia é endêmica da maior ilha do Arquipélago de Moleques do Sul e a estimativa do tamanho médio populacional em 42 indivíduos fundamenta que esta seja uma espécie criticamente ameaçada de extinção de acordo com a IUCN. Em expedições realizadas de 11 à 19 de dezembro de 2009 e de 20 à 23 de fevereiro de 2010, um total de 27 preás foi capturado com auxílio de gaiolas iscadas com rodelas de milho. A coleta de piolhos foi realizada por escovação da pelagem sobre uma bandeja branca, antecipada da passagem de um algodão embebido em éter etílico sobre o corpo do hospedeiro, ao passo que os ácaros foram removidos por raspagem do tecido. Amostras de sangue foram coletadas por punção digital para realização de esfregaços sanguíneos, fixados posteriormente com metanol. A busca por helmintos foi baseada em exames de fezes coletadas das gaiolas e necropsias de cinco espécimes disponíveis em coleção científica. Ácaros trombiculídeos foram observados em todos os hospedeiros capturados. Um total de 1336 piolhos de duas espécies, Gliricola lindolphoi e Trimenopon hispidum (Phthiraptera – Amblycera) foi coletado de 27 preás, sendo 471 exemplares de G. lindolphoi e 865 indivíduos de T. hispidum, proporcionando uma abundância média de 49,5 (± 39,1) piolhos por hospedeiro. A prevalência e a intensidade de infestação por piolhos foram elevados e podem não ter relação com a síndrome insular, uma vez que valores similares ou até maiores foram observados em populações continentais de preás. Cavia intermedia é apresentada como um novo hospedeiro verdadeiro para ambas as espécies de piolhos. Apesar de T. hispidum ser um parasito comum de Cavia spp., a ocorrência de G. lindolphoi é rara, sendo notificada pela sexta vez. No que diz respeito ao achado de ácaros trombiculídeos, sua origem é incerta. A ausência de endoparasitos deve-se possivelmente à alta complexidade de seus ciclos biológicos, o que poderia ser resultado do isolamento no arquipélago. Estes resultados podem fundamentar ações de manejo e a sua associação com informações sobre a ectoparasitofauna de outras espécies do gênero Cavia pode subsidiar investigações taxonômicas e filogenéticas tanto para os parasitos, quanto para os hospedeiros
Investigação do efeito do laser de baixa potência na recuperação de lesões epidérmicas e musculares em roedores
Full text linkTese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2013Estudos nos últimos anos tem demonstrado que a terapia com laser de baixa potência (LBP) modula vários processos bioquímicos, principalmente aqueles relacionados ao aumento da respiração mitocondrial e síntese de ATP, com consequente redução de lesões musculares e dérmicas, bem como acelerando o processo de cicatrização. O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a influência da terapia com LBP sobre o processo de cicatrização de feridas dérmicas e também em um modelo de lesão muscular traumática. Além disso, foram avaliados os efeitos da irradiação com LBP sobre atividade da cadeia respiratória em mitocôndrias isoladas de músculo esquelético e em parâmetros relacionados com a respiração celular em células musculares da linhagem L6. Primeiramente nossos resultados demonstram que o LBP Hélio Neônio (HeNe) e Arsêneto de Gálio (AsGa) com comprimentos de onda de 632 e 904 nm, respectivamente, e doses de 1 e 3 J/cm2 induziram um maior fechamento da ferida estimulou a produção de colágeno, aumentando o conteúdo de hidroxiprolina e diminuiu os danos oxidativos a lipídeos e proteínas e as atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) em um modelo de lesão epidérmica, quando comparado com o grupo lesão sem laser. No segundo experimento, demonstramos que o laser AsGa com doses de 3 J/cm2 com início de irradiação 2 horas após a lesão muscular traumática induziu uma diminuição em todos os parâmetros de estresse oxidativo analisados, tais como os conteúdos de oxidação de lipídeos e proteínas, atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPX), SOD e CAT e na concentração de nitritos no plasma e no músculo induziu uma diminuição na expressão gênica de IL-6, VEGF e BDNF como também um aumento na IL-10 no tecido muscular traumatizado e irradiado até 5 dias após a lesão. Os resultados relacionados a parâmetros comportamentais de déficit motor (campo aberto) também comprovaram que os animais com lesão muscular e tratados com a dose de 3 J/cm2 tiveram um aumento na distância percorrida e no número de levantamentos comparados com o grupo lesão muscular, demonstrando uma melhora no déficit motor induzido pela lesão muscular. Os resultados com mitocôndrias musculares saudáveis demonstraram que a irradiação com LBP HeNe com doses de 30 e 60 J/cm2 induziu um aumento significativo nas atividades do complexo I e IV 5 minutos após a irradiação. Além disso, o LBP com doses de 10, 30 e 60 J/cm2 também aumentou a atividade do complexo IV 1 hora após a irradiação. Estudos in vitro com células saudáveis L6 demonstraram que a irradiação com LBP HeNe e dose de 10 J/cm2 teve uma contribuição maior da ATP sintase ao consumo de oxigênio basal e uma concentração maior de FCCP foi usada para induzir a capacidade máxima respiratória. Neste contexto, o presente estudo evidencia que o LBP pode induzir um aumento na velocidade de cicatrização de feridas e acelerar o processo inflamatório agudo da lesão muscular traumática, provavelmente devido a sua capacidade de aumentar o estado energético da mitocôndria e diminuir parâmetros de inflamação e de estresse oxidativo.Abstract: Many studies performed in the past 40 years have proposed that lowpower laser (LPB) therapy reduces dermal and muscle injuries and accelerates the healing process, by modulating several biochemical processes, including those associated with increased mitochondrial respiration and ATP synthesis. The present study aimed to evaluate the influence of LPB therapy on dermal wound healing and on the recovering from muscle injury. In addition, the effects of LPB irradiation on mitochondrial respiratory chain activity and oxygen consumption in skeletal muscle and muscle L6 cell line, were also evaluated. Irradiation with LPB Helium Neon (HeNe) and Galeo arsenide (GaAs) at wavelengths of 632 and 904 nm, and doses of 1 and 3 J/cm2, respectively, accelerated the wound repair, stimulated the collagen production, by increasing the hydroxyproline content and also by decreasing the concentration of oxidized lipids and proteins. The activities of the antioxidants enzymes, including superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were also decreased after the LPB treatment. The second set of experiments demonstrated that the application of the AsGa laser with 3 J/cm2, 2 hours after the traumatic-induced muscle lesion decreased the oxidative stress parameters, including the activity of antioxidant enzymes, oxidative damage markers and nitrite levels in plasma and muscle tissue. In addition, the irradiation decreased the gene expression of IL-6, VEGF e BDNF, and increased the IL-10 content on injured muscle after 5 days of irradiation. Rat spontaneous locomotor activity, measured in the open field arena, was reduced in traumareceiving animals. The LPB irradiation (3 J/cm2) reverted this effect by increasing the distance traveled and the number of withdrawals of the animals. The third group of experiments showed that healthy muscle mitochondria irradiated with LPB HeNe, with doses of 30 and 60 J/cm2, induced a significant increment in the activity of complexes I and IV 5 minutes after the irradiation. Additionally, LPB, with doses of 10, 30 60 J/cm2, also increased complex IV activity one hour after irradiation. In agreement, studies performed in irradiated (LPB HeNe) healthy L6 cells, with dose and 10 J/cm2, provoked increased of ATP synthaselinked oxygen consumption and required higher concentration of FCCP for inducing the maximal mitochondrial respiratory capacity. In this context, the present study demonstrates that LPB induces wound healing process and accelerates the inflammatory phase during acute traumatic muscle injury, probably by increasing the energy state of mitochondria
A geografia das feiras de negócios em Santa Catarina: origem, evolução e dinâmica das transformações
Full text linkTese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Filosofia e Ciências Humanas, Programa de Pós-Graduação em Geografia, Florianópolis, 2014.Este trabalho propõe a tese que a formação espacial catarinense possibilitou um dinamismo econômico que torna regiões catarinenses competitivas em diversos setores - como em eventos - haja vista o posicionamento no ranking ICCA e a frequência de centenas de eventos nacionais e internacionais - e especificamente nas feiras de negócios, com a presença constante entre os cinco Estados que mais sediam eventos promovidos por associados à UBRAFE - União Brasileira de Promotores de Feiras. Para se chegar à comprovação da tese, foram pesquisados daods e informações sobre a indústria de eventos em Santa Catarina - mais especificamente as feiras de negócios. O trabalho utilizou como método de análise o paradigma de formação sócio-espacial que propõe o uso do conceito de formação social como base para o estudo da sociedade. O estudo permitiu compreender as origens da indústria de eventos em Santa Catarina, as relações das feiras com a formação sócio-regionais de Santa Catarina, as relações de produção no setor de eventos, o papel do Estado no segmento, as origens e fluxos do capital investido na construção de espaços para eventos e das empresas promotoras, organizadoras e prestadoras de serviços para feiras de negócios, que possibilitaram traçar a geografia das feiras de negócios no Estado. Os principais resultados encontrados foram: o segmento de feiras de negócios cresce em todo o mundo. Três países são os principais concorrentes mundiais no setor: Estados Unidos, Alemanha e China. Sobretudo as empresas européias avançam nos principais mercados em expansão - como o asiático e o brasileiro a partir de aquisições e joint ventures. O Brasil passa por um processo de internacionalização de seus espaços e de suas feiras de negócios, principalmente as feiras e espaços localizados no Rio de Janeiro e em São Paulo. A formação sócio-espacial de Santa Catarina possibilitou que alguns municípios se sobressaíssem em determinadas atividades - e a relação com as atividades econômicas locais que são referências nacionais, como em Joinville, Lages, Criciúma, Chapecó, Itajaí e Blumenau determinam as feiras lá realizadas. Muitas empresas catarinenses do setor - organizadoras e fornecedores em geral - atuam frequentemente no mercado nacional, em ações próprias ou em alianças com promotores e organizadores de outras regiões. A construção do Centro de Eventos em Balneário Camboriu deverá fomentar a atividade em todo o Estado. Com os investimentos da União, Estado, Municípios e empresários, em rodovias, aeroportos, espaços para eventos e na qualificação profissional e em novos hotéis e com a sinergia existente no trade turístico e deeventos e com capacitação na gestão de espaços de eventos e de prestadores de serviços e na captação de eventos e de recursos, a tendência nos próximos anos é de que Santa Catarina e seus empresários e trabalhadores continuem se destacando no cenário nacional de eventos - em especial nas feiras de pequeno e médio porte.Abstract : This paper presents results of research on the events industry in Santa Catarina ? Brazil, specifically business fairs. The study used as a method of analyzing the paradigm of socio- spatial formation that proposes the use of the concept of social formation as a basis for the study of society. The study allowed us to understand the origins of the events industry in Santa Catarina, the relations of trade with the socio- regional training of Santa Catarina, the relations of production in the field events, the role of the state in the segment, the sources and flows of capital invested in the construction of spaces for events and companies promoting, organizing and providing services for tradeshows, that made possible to the geography of trade fairs in the state. The main findings were: the segment of trade fairs grows worldwide. Three countries are the world's major competitors in the industry: United States, Germany and China . Mainly European companies advance in key markets booming - as the Asian and Brazilian from acquisitions and joint ventures. Brazil is going through a process of internationalization of its spaces and its trade shows, fairs and especially spaces located in Rio de Janeiro and Sao Paulo. The socio-spatial formation of Santa Catarina possible that some municipalities to excel in certain activities - and the relationship with local economic activities that are national references, as in Joinville, Lages, Criciúma, Chapecó, Itajaí and Blumenau determine the fairs held there. Many companies in the sector - organizing and general contractors - often operating in the domestic market, own shares in or alliances with promoters and organizers from other regions. The construction of the Events Center in Camboriu should encourage activity throughout the state. With the investment of Federal, State, municipalities and entrepreneurs, highways, airports, event spaces and vocational qualifications and new hotels and the synergy in trade and tourism and event management training event spaces and service providers and the capture of events and resources, the trend in the coming years is that Santa Catarina and its entrepreneurs and workers continue excelling on the national scene of events - particularly in the markets of small and medium size
Artes de canto (1492-1626) y mujeres en la cultura musical del mundo ibérico renacentista
Full text link[spa] Esta Tesis Doctoral explora la cultura musical del mundo ibérico renacentista a través del estudio de artes de canto en lengua vernácula impresas entre 1492 y 1626 y de su relación con las mujeres de la época. La Tesis consta de siete capítulos, estructurados en dos partes (Vol. I), y de veinte apéndices (Vol. II). La primera parte (Capítulos I al IV) muestra que las características por las que estos libros que contenían los rudimentos de la música han sido infravalorados hasta ahora por la historiografía musical son precisamente las mismas que demuestran que respondían a una necesidad pedagógica y a la demanda de manuales asequibles, breves y prácticos por parte de un amplio mercado. Las artes de canto se imprimieron en tiradas de miles de ejemplares y eran vendidas a bajo precio, tuvieron una enorme circulación en la Península Ibérica y el Nuevo Mundo, y contribuyeron al incremento y la difusión de la educación musical en contextos educativos diferenciados (la iglesia, la universidad y el ámbito privado), así como entre grupos sociales hasta entonces excluidos del aprendizaje de los fundamentos de la música. El Arte de canto llano (Sevilla, 1530) de Juan Martínez emerge como el tratado de música del mundo hispánico más difundido geográfica y cronológicamente en el siglo XVI e inicios del XVII, pero del que casi nada se sabía. En la segunda parte (Capítulos V al VII), las conexiones entre estos libros de música y mujeres muestran que las áreas de superposición entre lo privado y lo público y entre lo oral y lo escrito permiten desafiar la invisibilidad de las mujeres en documentos históricos y vislumbrar trazas no sólo de la cultura musical de las mujeres de la época, sino también de la importancia de la música en la vida cotidiana. Se utiliza una diversidad de fuentes (artes de canto, libros de conducta, documentos inquisitoriales, literatura, correspondencia e inventarios de bienes, entre otras), a través de las cuales se ha podido documentar la relación con la música de, entre otras, Catalina de Zúñiga, VI Condesa de Lemos, Isabel de Plazaola, e Isabel de Aragón, IV Duquesa del Infantado. Empleando metodologías de la musicología tradicional junto a otras tomadas de los historiadores del libro y de la cultura popular, esta Tesis Doctoral presenta una panorámica de la vida musical de la época a través del prisma de doble alteridad que supone el estudio de las artes de canto, generalmente consideradas carentes de interés, y de su relación con las mujeres, insuficientemente representadas en la historiografía musical.[eng] This dissertation explores the musical culture of the Renaissance Iberian world through both the study of small-format treatises in the vernacular containing the rudiments of music –known as artes de canto– printed between 1492 and 1626, and the nexuses between them and women. The dissertation consists of seven chapters, structured into two parts (Volume I), and twenty appendixes (Volume II). Part I (Chapters I to IV) shows that the arte de canto, until now generally overlooked or undervalued in music historiography, was produced in print runs of thousands of copies and sold for a low price; it had a broad circulation in the Iberian Peninsula and the New World, contributing to the spread of musical literacy in distinct didactic contexts (churches, universities, private settings) and among social groups until then excluded from learning the rudiments of music. The little known Juan Martínez’s Arte de canto llano (Seville, 1530) emerges as the most circulated music book in the Hispanic world during the sixteenth and seventeenth centuries. The aim of Part II (Chapters V to VII) is to approach the musical life of the sixteenth-century Iberian world through the exploration of women’s contributions, thus broadening the field of historical research. The study of some connections between music books and women shows that the points of overlap between the private and the public spheres, on the one hand, and the written and the oral music transmission, on the other hand, not only make women’s musical practices visible, but also offer new vistas on the popular culture of the age. Through a variety of source materials (artes de canto, conduct manuals, Inquisition records, literature, letters and inventories of goods, among others) it has been possible to document the musical activities of women such as Catalina de Zúñiga, VI Countess of Lemos, Isabel de Plazaola, and Isabel de Aragón, IV Duchess of the Infantado. Combining methodologies from traditional musicology with those borrowed from book history and popular culture, this dissertation analyzes music in the culture of the Renaissance Iberian world through the prism of double Otherness involved in studying the ‘other’ music books –that is the undervalued artes de canto– and their connections to women of that period
Efeitos comportamentais e sobre a expressão da proteina Fos em neurônios serotonérgicos após injeções intracerebroventriculares de serotonina em pombos (Columba livia)
Full text linkDissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2010Em mamíferos, os circuitos serotonérgicos têm sido relacionados à modulação de comportamentos ingestivos e dos estados de sono e vigília. No presente trabalho, foram examinadas as respostas comportamentais e ingestivas e também o padrão de expressão da proteína Fos no tronco encefálico, após injeção intracerebroventricular de serotonina (5-HT, 50, 150 ou 300 nmol/2µl) em pombos (Columba lívia) com livre acesso à água e alimento. As injeções de 5-HT provocaram marcante sequência comportamental que consistiu em veemente ingestão de água dentro dos primeiros 15 minutos após os tratamentos, seguida por comportamentos de manutenção e então por prolongados períodos de comportamentos típicos de sono. Estes efeitos foram de curto-prazo: os padrões de ingestão de água foram similares entre animais tratados com 5-HT ou veículo 2, 3 e 24 h após as injeções. Nenhum efeito consistente foi observado sobre a ingestão de alimento. A densidade de células imunorreativas à Fos (Fos+) ou tanto à Fos e a triptofano hidroxilase (Fos+/TPH+) foram examinadas em seis áreas do tronco encefálico rostral em pombos com livre acesso à água e alimento que foram tratados com 5-HT (5-HTW) ou veículo. Um grupo controle adicional foi tratado com 5-HT, mas não teve acesso à água nas duas horas seguintes à injeção (5-HTØ). Na rafe pontina, a densidade Fos+ foi positivamente correlacionada com índices de comportamentos típicos de sono e aumentou tanto nos animais 5-HTW como nos animais 5-HTØ. No núcleo da linha média pontomesencefálica, o linearis caudalis, as marcações Fos+ e Fos+/TPH+ foram negativamente correlacionadas com os comportamentos típicos de sono e foram reduzidas nos animais 5-HTØ. Na área de A8, a densidade de Fos+/TPH+ foi reduzida VII em ambos os grupos tratados com 5-HT e foi positivamente correlacionada com a ingestão de alimento e negativamente correlacionada com o sono. Estes dados indicam que efeitos hiperdípsicos e hipnóticos de injeções ICV de 5-HT em pombos com livre acesso à água e alimento resultam da inibição da atividade tônica de neurônios serotonérgicos no tronco encefálico. Além disso, indicam que pode existir em aves, semelhante a mamíferos, uma influência inibitória de neurônios serotonérgicos sobre o comer, o beber e sobre o sono, possivelmente relacionados à sequência de saciedade pós-prandial e que a coordenação deste cenário fisiológico por circuitos serotonérgicos pode representar um atributo altamente preservado no encéfalo de amniótas.In mammals, serotonergic circuits have been shown to play important roles in the control of ingestive behaviors and sleep-waking states. In the present work, the behavioral and ingestive responses as well as the pattern of Fos-like activity in the brainstem following intracerebroventricular (ICV) injections of serotonin (5-HT at 50, 150 or 300 nmol/2 µl) were examined in free-feeding/free-drinking pigeons (Columba livia). 5-HT injections evoked a remarkable behavioral sequence that consists of vehement drinking behavior within the first 15 min after injections, followed by preening and then by prolonged periods of sleep-like behavior. These effects are short-lived: the patterns of ingestive behavior are similar in 5-HT- and vehicle-treated animals at 2, 3 and 24 h after treatments. No consistent effect on feeding behavior was observed. The density of cells immunoreactive to Fos (Fos+) or to both Fos and tryptophan hydroxylase (Fos+/TPH+) were examined in six areas of the rostral brainstem of ree-feeding/freedrinking birds treated with 5-HT (5-HTW) or vehicle. An additional control group was treated with 5-HT without access to water during the 2 hours after the treatment (5-HTØ). In the pontine raphe, Fos+ density positively correlated to sleep behavioral indexes and increased in both 5-HTW and 5-HTØ animals. In the midline nucleus linearis caudalis, Fos+ and Fos+/TPH+ labeling negatively correlated to sleep-like behaviors and were reduced in 5-HTØ animals. In the A8 area, Fos+/TPH+ cell density was reduced in both 5-HTW and 5-HTØ animals and was positively correlated to food intake whereas negatively correlated to sleep. These data indicate that hyperdipsic and hypnotic effects of ICV 5-HT in free-feeding pigeons results from inhibition of the tonic activity of serotonergic neurons in brainstem. Moreover, it indicates that it may exist in IX birds, as in mammals, an inhibitory influence of serotonergic neurons on feeding, drinking and sleep behaviors, possibly related to the postprandial Behavioral Satiety Sequence and that the coordination of this physiological set by central 5-HT circuits may represent a highly conserved attribute of the amniote brain
2022 : position of Brazilian Diabetes Society on exercise recommendations for people with type 1 and type 2 diabetes
Full text linkIntroduction: For individuals diagnosed with diabetes mellitus, the practice of properly oriented physical exercises brings signifcant benefts to the individual’s health and is considered an indispensable tool for metabolic management. The individualization of exercise routines is an essential aspect for therapeutic success, despite the need to consider some general recommendations. This review is an authorized literal translation of the Brazilian Society of Diabetes (SBD) Guidelines 2021–2022, which is based on scientifc evidence and provides guidance on physical activities and exercises aimed at individuals with type 1 and 2 diabetes. Methods: SBD designated 9 specialists from its “Department of Diabetes, Exercise & Sports” to author chapters on physical activities and exercises directed to individuals with type 1 and 2 diabetes. The aim of these chapters was to highlight recommendations in accordance with Evidence Levels, based on what is described in the literature. These chapters were analyzed by the SBD Central Committee, which is also responsible for the SBD 2021–2022 guidelines. Main clinical inquiries were selected to perform a narrated review by using MEDLINE via PubMed. Top available evidence, such as high-quality clinical trials, large observational studies and meta-analyses related to physical activity and exercise advisory, were analyzed. The adopted MeSh terms were [diabetes], [type 1 diabetes], [type 2 diabetes], [physical activity] [physical exercise]. Results 17 recommendations were defined by the members. For this review, it was considered different Evidence Levels, as well as different Classes of Recommendations. As to Evidence Levels, the following levels were contemplated: Level A) More than one randomized clinical trial or a randomized clinical trial meta-analysis with low heterogeneity. Level B) Meta analysis with observational studies, one randomized clinical trial, sizeable observational studies and sub-groups analysis. Level C) Small non-randomized studies, cross-sectional studies, case control studies, guidelines or experts’ opinions. In respect to Recommendation Classes, the following criteria were adopted: I. “Recommended”: Meaning there was a consent of more than 90% of the panel; IIa. “Must be considered”: meaning there is a general preference of the panel which 70–90% agrees; IIb. “Can be considered”. 50–70% agrees; III Not recommended: There is a consensus that the intervention should not be performed. Conclusion Physical exercise aids on the glycemic control of type 2 diabetes individuals while also decreasing cardiovascular risk in individuals with type 1 and 2 diabetes. Individuals diagnosed with diabetes should perform combined aerobic and resistance exercises in order to manage the disease. In addition, exercises focusing on flexibility and balance should be specially addressed on elderly individuals. Diabetes individuals using insulin as therapeutic treatment should properly monitor glycemia levels before, during and after exercise sessions to minimize health incidents, such as hypoglycemia
Fatal outcome of chikungunya virus infection in Brazil
No full textFederal University of Ceará. Fortaleza, CE, Brazil / Central Public Health Laboratory of Ceará State. Fortaleza, CE, Brazil.University of São Paulo. Virology Research Center. Ribeirão Preto, SP, Brazil.Federal University of Ceará. Fortaleza, CE, Brazil.University of Oxford. Department of Zoology. oxford, United Kingdom.University of São Paulo. Virology Research Center. Ribeirão Preto, SP, Brazil.University of Oxford. Department of Zoology. oxford, United Kingdom / Gorgas Memorial Institute of Health Studies. Department of Research in Virology and Biotechnology. Panama City, Panama.Central Public Health Laboratory of Ceará State. Fortaleza, CE, Brazil.Central Public Health Laboratory of Ceará State. Fortaleza, CE, Brazil / Centro Universitário Christus. Faculdade de Medicina. Fortaleza, CE, Brazil.Central Public Health Laboratory of Ceará State. Fortaleza, CE, Brazil.Federal University of Ceará. Fortaleza, CE, Brazil.State Health Secretariat of Ceará. Death Verification Service Dr Rocha Furtado. Fortaleza, CE, Brazil.Federal University of Ceará. Fortaleza, CE, Brazil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Federal University of Ceará. Fortaleza, CE, Brazil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Centro Universitário Christus. Faculdade de Medicina. Fortaleza, CE, Brazil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Centro Universitário Christus. Faculdade de Medicina. Fortaleza, CE, Brazil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Centro Universitário Christus. Faculdade de Medicina. Fortaleza, CE, Brazil.Centro Universitário Christus. Faculdade de Medicina. Fortaleza, CE, Brazil.Centro Universitário Christus. Faculdade de Medicina. Fortaleza, CE, Brazil.Federal University of Ceará. Fortaleza, CE, Brazil.Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, MG, Brazil.Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, MG, Brazil / Ministry of Health. Brasilia, DF, Brazil.Ministry of Health. Brasilia, DF, Brazil.Ministry of Health. Brasilia, DF, Brazil.Ministry of Health. Brasilia, DF, Brazil.Faculdade de Medicina São Leopoldo Mandic. Campinas, SP, Brazil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.University of Oxford. Department of Zoology. Oxford, United Kingdom.University of São Paulo. Virology Research Center. Ribeirão Preto, SP, Brazil.University of Oxford. Department of Zoology. Oxford, United Kingdom / Imperial College London. Department of Infectious Disease Epidemiology. London, United Kingdom.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Federal University of Ceará. Fortaleza, CE, Brazil.Federal University of Ceará. Fortaleza, CE, Brazil / Oswaldo Cruz Foundation - Branch Ceará. Fortaleza, CE, Brazil.BACKGROUND: Chikungunya virus (CHIKV) emerged in the Americas in 2013 and has caused approximately 2.1 million cases and >600 deaths. A retrospective investigation was undertaken to describe clinical, epidemiological, and viral genomic features associated with deaths caused by CHIKV in Ceará state, northeast Brazil. METHODS: Sera, cerebrospinal fluid (CSF), and tissue samples from 100 fatal cases with suspected arbovirus infection were tested for CHIKV, dengue virus (DENV), and Zika virus (ZIKV). Clinical, epidemiological, and death reports were obtained for patients with confirmed CHIKV infection. Logistic regression analysis was undertaken to identify independent factors associated with risk of death during CHIKV infection. Phylogenetic analysis was conducted using whole genomes from a subset of cases. RESULTS: Sixty-eight fatal cases had CHIKV infection confirmed by reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction (52.9%), viral antigen (41.1%), and/or specific immunoglobulin M (63.2%). Co-detection of CHIKV with DENV was found in 22% of fatal cases, ZIKV in 2.9%, and DENV and ZIKV in 1.5%. A total of 39 CHIKV deaths presented with neurological signs and symptoms, and CHIKV-RNA was found in the CSF of 92.3% of these patients. Fatal outcomes were associated with irreversible multiple organ dysfunction syndrome. Patients with diabetes appear to die at a higher frequency during the subacute phase. Genetic analysis showed circulation of 2 CHIKV East-Central-South African (ECSA) lineages in Ceará and revealed no unique virus genomic mutation associated with fatal outcome. CONCLUSIONS: The investigation of the largest cross-sectional cohort of CHIKV deaths to date reveals that CHIKV-ECSA strains can cause death in individuals from both risk and nonrisk groups, including young adults. © The Author(s) 2020. Published by Oxford University Press for the Infectious Diseases Society of America
Morphological and molecular study in a model of zika infection during embryonic neurogenesis
No full textilustraciones fotografías, gráficas, tablasLa enfermedad del virus Zika (ZIKV) ha generado graves problemas en la salud pública desde su aparición en los brotes de las Américas del 2015-2016. Esta enfermedad puede causar trastornos en el neurodesarrollo como microcefalia; una condición que genera, entre otras, disfunciones motoras, visuales, auditivas y cognitivas. A pesar de un gran número de publicaciones sobre la patogénesis del ZIKV aún se desconocen los mecanismos asociados a la infección de las células del sistema nervioso, por ello, el objetivo de este trabajo consistió en evaluar los cambios morfológicos y la participación de marcadores del neurodesarrollo en la infección por virus del Zika durante la neurogénesis embrionaria en un modelo murino. Para cumplir este objetivo se inocularon cinco ratones hembra BALB/c en el estadío temprano de gestación E6,5 por la vía intraperitoneal, con una dosis de interferón y al siguiente día (E7,5) con una dosis de 9,4 x 105 PFU del ZIKV. Se llevó a cabo la eutanasia de las hembras en el estadío embrionario E14,5; momento en donde se da la convergencia para la corticogénesis y cerebelogénesis en el ratón. A continuación, se realizó la extracción de los encéfalos de los embriones para evaluar la expresión de los marcadores del neurodesarrollo (DCX, MCPH1, NES, TBR2, GFAP, CEP-152 y RELN) y para ensayos histológicos e inmunohistoquímicos únicamente en el tejido cerebral. En la evaluación de expresión de los marcadores de neurodesarrollo evaluados se encontró que la infección por ZIKV altera significativamente la expresión de DCX, CEP-152, TBR2 y RELN proteínas cruciales para el desarrollo cortical y cerebelar. Además, en los resultados obtenidos de inmunohistoquímica e hibridación in situ observamos que las regiones con más antígeno y ARN de replicación del ZIKV fueron el mesencéfalo, rombencéfalo y médula espinal, regiones donde también encontramos un mayor número de alteraciones asociadas a procesos morfológicos relacionados a procesos de degeneración celular y marcación positiva para caspasa. Por otro lado, se realizaron ensayos de acoplamiento molecular entre las proteínas seleccionadas para el proyecto (DCX, MCPH1, CEP152, RELN, TBR2, GFAP y NES) con las proteínas de replicación NS4A y NS5 del ZIKV y se encontraron energías de interacción favorables para MCPH1, RELN, DCX y TBR2 con NS4A del ZIKV. Con este trabajo se concluye que el virus zika genera alteraciones morfológicas como la aparición de núcleos picnóticos altamente asociadas a la presencia y replicación viral del mismo. Se reporta por primera vez cambios en la expresión de marcadores del neurodesarrollo cortical y cerebelar asociados a la infección por el ZIKV como MCPH1, CEP-152, RELN, TBR2, además, este estudio es el primer reporte en donde se evidencia interacción molecular entre las proteínas del neurodesarrollo MCPH1, DCX, RELN y TBR2 con la proteína de replicación viral NS4A. Estos resultados postulan a los genes evaluados como posibles blancos de unión al ZIKV y permiten plantear futuros mecanismos de infección por el ZIKV. (Texto tomado de la fuente).Zika virus disease (ZIKV) has generated serious public health problems since its appearance between 2015–2016 years of outbreaks in the Americas. This disease can cause neurodevelopmental disorders such as microcephaly; a condition that generates, among others, motor, visual, auditory and cognitive dysfunctions. Despite numerous publications on the pathogenesis of ZIKV, the mechanisms associated with the infection of nervous system cells are still unknown. Therefore, this study evaluated the morphological changes and the participation of neurodevelopmental markers in ZIKV infection during embryonic neurogenesis in a murine model. To accomplish this objective, five female BALB/c mice at early gestational stage E6.5 were inoculated intraperitoneally with a dose of interferon and the following day (E7.5) with a 9.4 x 105 PFU dose of ZIKV. The females were euthanized at the E14.5 embryonic stage, when the convergence for corticogenesis and cerebellogenesis occurs in the mouse. Then, the embryos' brains were extracted to evaluate the expression of neurodevelopmental markers (DCX, MCPH1, NES, TBR2, GFAP, CEP-152 and RELN) and for histological and immunohistochemical assays only in brain tissue. In the evaluation of expression of the neurodevelopmental markers evaluated, it was found that ZIKV infection significantly alters the expression of DCX, CEP-152, TBR2 and RELN proteins crucial for cortical and cerebellar development. Additionally, in the results obtained from immunohistochemistry and in situ hybridization, we observed that the regions with more antigen and replication RNA of ZIKV were the midbrain, hindbrain and spinal cord, regions where we also found a greater number of alterations associated with morphological processes related to processes of cell degeneration and positive labeling for caspase. By the other hand, molecular docking assays were performed between the proteins selected for the project (DCX, MCPH1, CEP152, RELN, TBR2, GFAP and NES) with the replication proteins NS4A and NS5 of ZIKV and favorable interaction energies were found for MCPH1, RELN, DCX, and TBR2 with NS4A of ZIKV. This work concludes that the Zika virus generates morphological alterations such as the appearance of pyknotic nuclei, highly associated with the presence and viral replication of the virus. We report for the first time changes in the expression of cortical and cerebellar neurodevelopmental markers associated with ZIKV infection such as MCPH1, CEP-152, RELN, TBR2, in addition, this study is the first report where the molecular interaction between the neurodevelopmental proteins MCPH1, DCX, RELN, and TBR2 with the viral replication protein NS4A is evidenced. These results postulate the genes evaluated as possible binding targets for ZIKV and allow us to consider future mechanisms of ZIKV infection.MaestríaMagíster en Neurociencias5.1 Consideraciones éticas para el uso de animales de laboratorio
Para el adecuado uso de animales y el manejo de muestras de tejido animal se siguieron las
normas técnicas y éticas vigentes de Colombia y las guías internacionales en cuidado y uso
de animales de laboratorio que se acogen en el país (145) y de la directiva Europea (146), así
como en Bioseguridad el BMBL del CDC-NIH, (147) y el Manual OMS 3ª edición (148).
Se tuvieron en cuenta las disposiciones y recomendaciones consignadas en la Resolución
8430 de 1993 del Ministerio de Salud por la cual se establecen las normas científicas, técnicas
y administrativas para la investigación en salud y en su Título V la investigación biomédica
en animales; normatividad jurídica que regula la experimentación animal en Colombia
incluida en la ley 84 de 1989 por la cual se adopta el “Estatuto Nacional de Protección de los
Animales y las disposiciones sobre métodos de manejo y cuidado de animales de laboratorio
usados en Latinoamérica que a la vez consideran los lineamientos internacionales (149).
Adicional a lo anterior este trabajo acogió a todas las recomendaciones dictadas por el
Instituto Nacional de Salud (INS) (lugar en donde se desarrolló el trabajo de investigación).
Este trabajo forma parte de los compromisos adquiridos en el marco del proyecto “Estudio
del efecto de la infección por virus ZIKA sobre la citomorfología, la neurobioquímica, y el
neurodesarrollo en modelos in vivo e in vitro” Financiado por Colciencias (Minciencias) y el
INS para lo cual los procedimientos aquí descritos fueron avalados por el Comité de Ética en
Investigación (CEIN) del INS (Acta No. 13 de 2016). Adicionalmente, este proyecto de tesis
fue avalado por el Comité de Ética de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional.
5.2 Establecimiento del modelo de infección prenatal
Se inocularon cinco ratones hembra BALB/c en el estadío temprano de gestación E6,5 por la
vía intraperitoneal, con una dosis de interferón de 125 mg ref: I-401 (Leinco techologies, Inc)
y al siguiente día (E7,5) con una dosis de 9,4 x 105 PFU de ZIKV de una cepa circulante en
las Américas capaz de infectar el tejido cerebral y generar signos neurológicos; cepa aislada
y caracterizada por nuestro grupo de trabajo en el INS (123). También se inoculó el mismo
número de hembras con solución vehículo desprovista del virus, para tener un grupo control.
Todas las inoculaciones se realizaron previo al proceso de neurulación (E8-E9,5) y los
sacrificios de las hembras se realizaron en el estadío embrionario E14,5 debido a los
importantes eventos de convergencia del neurodesarrollo cortical y cerebelar que se
presentan en dicha etapa (24). Para determinar los estadios de inoculación, se realizó el
apareamiento de las ratonas BALB/c en el ciclo estral de diestro (establecido citología
vaginal), a partir de este momento se contaron días y horas de preñez. Además, se realizaron
mediciones diarias del peso de las hembras y las ratonas que presentaban un aumento del
peso eran seleccionadas para los ensayos de inoculación. En total se inocularon 10 hembras
gestantes, cinco con virus y cinco controles, este número de ensayos se llevó a cabo teniendo
en cuenta la cantidad mínima de ensayos requeridos para obtener una preñez efectiva de acuerdo con la experiencia previa del grupo de trabajo en este tipo de ensayos, basados en el
principio de las tres R de Russel: reducción, refinamiento y reemplazo (150). Con estas
inoculaciones se logró obtener un grupo mínimo de tres hembras preñadas infectadas con sus
respectivos controles.
5.3 Eutanasia y manejo de muestras
La eutanasia de las hembras gestantes se llevó a cabo en cámara de CO2, se y para los
embriones se realizó mediante la exposición a un caudal mayor de CO2. La mayor exposición
a los gases se realizó debido a que en etapas tempranas del desarrollo embrionario o posnatal
temprano la rata y el ratón resisten altamente las condiciones de hipoxia (151). Cada embrión
fue extraído dentro de su saco embrionario en donde contenían la placenta de cada embrión.
Los procedimientos que involucraron intervenciones madre-cría fueron coordinados por un
médico/a veterinario (en el Bioterio del INS) entrenado en este tipo de procedimientos que
aseguró el manejo adecuado de los animales.
A continuación, se realizó la extracción de los encéfalos de los embriones para evaluar la
expresión de los marcadores y los daños histopatológicos únicamente en el tejido cerebral.
Los embriones control e infectados fueron separados en dos grupos como se explica más
adelante, la mitad de los embriones obtenidos de cada madre inoculada se ubicó en un vial
de 1,5 ml con 500 uL de RNAlater® (Qiagen Inc, USA) y las muestras se almacenaron a -
80°C, hasta su posterior procesamiento. La otra mitad de los embriones se fijó en una
solución de paraformaldehído al 4%, para ensayos histológicos e inmunohistoquímicos.
5.4 Metodología por objetivo
5.4.1. Coloraciones de Hematoxilina-Eosina (H&E) (Objetivo 1)
Se realizaron coloraciones de H&E en los tejidos cerebrales para evaluar cambios
neurohistológicos o citopáticos convencionales previamente mencionados en ensayos de
infección por ZIKV tales como calcificaciones, necrosis, cuerpos picnóticos y otras formas
de muerte celular. Las interpretaciones de los ensayos histológicos se realizaron mediante la
asesoría del grupo de patología del Instituto Nacional de Salud, aquí, se construyó una matriz
de las diferentes áreas cerebrales evaluadas para establecer asociaciones entre el tipo de daño
celular y la cantidad de antígeno viral expresado en unidades de densidad óptica (tabla 5).
5.4.2. Ensayos de relación entre porcentaje de células infectadas y alteraciones
morfológicas
En los estudios histológicos se llevaron a cabo ensayos de hibridación in situ en cortes
seriados con el fin de evaluar las diferencias entre el porcentaje de células infectadas por cada
técnica y establecer relaciones con el grado de daño o alteraciones morfológicas observadas
en los encéfalos de embriones analizados.
5.4.3. Ensayos histológicos e inmunohistoquímicos (IHQ) (Objetivo 1)
Para el análisis de los cambios histológicos de ratones BalB/c infectados con Zika, los
encéfalos de los embriones fijados en paraformaldehído 4% -DEPC (diethilpirocarbonato),
se incluyeron en parafina y se realizaron cortes de 4 micras en sentido sagital. Estos cortes
fueron recogidos sobre láminas cargadas y se llevaron a cabo tinciones H&E así como
ensayos inmunohistoquímicos para detectar antígeno viral de Zika mediante el kit MACH4
AP polymer marca Biocare Medical y un anticuerpo policlonal contra Zika donado por el
CDC. El protocolo de inmunohistoquímica en lámina se realizó de acuerdo con ensayos
previamente estandarizados en el grupo de Morfología Celular del INS (152-154) o por el
protocolo del kit MACH4 (Rochem Biocare).
5.4.4. Ensayos de hibridación in situ (ISH) (Objetivo 1)
Las muestras fueron fijadas en paraformaldehído (PFA) 4% -DEPC para evitar la presencia
de RNasas que pueden alterar la integridad de las sondas, por esta razón, todos los procesos
de deshidratación se realizaron con etanol grado molecular y diluidos con H2O-DEPC. Cada
ensayo contó con tejidos control tanto positivos como negativos.
Para los ensayos de ISH se utilizaron sondas previamente diseñadas por nuestro equipo de
trabajo (155) y sintetizadas con los primers forward y reverse respectivamente; las sondas
fueron detectadas con el conjugado de digoxigenina (DIG). Los tejidos pasaron por un
proceso de desparafinación y rehidratación usando un coplin de vidrio de 60ml estéril. Los
cortes de los tejidos se ubicaron sobre láminas cargadas de manera electrostática, se
incubaron con aproximadamente 400 µl de H20-DEPC y se procedió a realizar la digestión
enzimática con 1µL de proteinasa K por 15 minutos a 37°C en cámara húmeda.
Los tejidos pasaron por una post-fijación con PFA 4%-DEPC por 20 minutos a temperatura
ambiente en cámara húmeda. Después de unos lavados con PBS 1X-DEPC se realizó la prehibridación en la cual los tejidos se incubaron a 70°C por 5 minutos en la solución de
hibridación compuesta de (10ml total): Formamida 100% (5ml), SSC 20X (2.5 ml), Tween
100% (0.01ml), Heparina 100mg/ml (0.01ml), SDS 100% (1ml), Denhart´s solution 50X
(0.2ml), tRNA 10mg/ml (2.5ml) y H2O-DEPC (1.03ml). Las muestras y las sondas pasaron
por un proceso de desnaturalización con la solución de hibridación a 70°C por 5 minutos y
se incubaron con 400 µL de sonda a 65°C por toda la noche en cámara húmeda. Se utilizaron
sondas conjugadas con digoxigenina (DIG). Las sondas sintetizadas con el primer forward
acoplado al promotor SP6 para hibridación con el ARN de replicación del ZIKV (hebra
antisentido) y las sondas sintetizadas con el primer reverse acoplado con el promotor T7 para
hibridación con el ARN genómico del virus Zika (hebra sentido). Pasado el tiempo de
incubación, se procedió a realizar lavados con la solución de hibridación sin sondas a 75, 50
y 25 %, a una temperatura de 65°C por 10 minutos cada una. El revelado se llevó a cabo con
NBT/BCIP (SIGMA) en cámara húmeda cubierta de la luz; el tiempo de exposición fue
definido dependiendo de la coloración deseada con revisiones periódicas cada 30 minutos.
5.4.3. Ensayos histológicos e inmunohistoquímicos (IHQ) (Objetivo 1)
Para el análisis de los cambios histológicos de ratones BalB/c infectados con Zika, los
encéfalos de los embriones fijados en paraformaldehído 4% -DEPC (diethilpirocarbonato),
se incluyeron en parafina y se realizaron cortes de 4 micras en sentido sagital. Estos cortes
fueron recogidos sobre láminas cargadas y se llevaron a cabo tinciones H&E así como
ensayos inmunohistoquímicos para detectar antígeno viral de Zika mediante el kit MACH4
AP polymer marca Biocare Medical y un anticuerpo policlonal contra Zika donado por el
CDC. El protocolo de inmunohistoquímica en lámina se realizó de acuerdo con ensayos
previamente estandarizados en el grupo de Morfología Celular del INS (152-154) o por el
protocolo del kit MACH4 (Rochem Biocare).
5.4.4. Ensayos de hibridación in situ (ISH) (Objetivo 1)
Las muestras fueron fijadas en paraformaldehído (PFA) 4% -DEPC para evitar la presencia
de RNasas que pueden alterar la integridad de las sondas, por esta razón, todos los procesos
de deshidratación se realizaron con etanol grado molecular y diluidos con H2O-DEPC. Cada
ensayo contó con tejidos control tanto positivos como negativos.
Para los ensayos de ISH se utilizaron sondas previamente diseñadas por nuestro equipo de
trabajo (155) y sintetizadas con los primers forward y reverse respectivamente; las sondas
fueron detectadas con el conjugado de digoxigenina (DIG). Los tejidos pasaron por un
proceso de desparafinación y rehidratación usando un coplin de vidrio de 60ml estéril. Los
cortes de los tejidos se ubicaron sobre láminas cargadas de manera electrostática, se
incubaron con aproximadamente 400 µl de H20-DEPC y se procedió a realizar la digestión
enzimática con 1µL de proteinasa K por 15 minutos a 37°C en cámara húmeda.
Los tejidos pasaron por una post-fijación con PFA 4%-DEPC por 20 minutos a temperatura
ambiente en cámara húmeda. Después de unos lavados con PBS 1X-DEPC se realizó la prehibridación en la cual los tejidos se incubaron a 70°C por 5 minutos en la solución de
hibridación compuesta de (10ml total): Formamida 100% (5ml), SSC 20X (2.5 ml), Tween
100% (0.01ml), Heparina 100mg/ml (0.01ml), SDS 100% (1ml), Denhart´s solution 50X
(0.2ml), tRNA 10mg/ml (2.5ml) y H2O-DEPC (1.03ml). Las muestras y las sondas pasaron
por un proceso de desnaturalización con la solución de hibridación a 70°C por 5 minutos y
se incubaron con 400 µL de sonda a 65°C por toda la noche en cámara húmeda. Se utilizaron
sondas conjugadas con digoxigenina (DIG). Las sondas sintetizadas con el primer forward
acoplado al promotor SP6 para hibridación con el ARN de replicación del ZIKV (hebra
antisentido) y las sondas sintetizadas con el primer reverse acoplado con el promotor T7 para
hibridación con el ARN genómico del virus Zika (hebra sentido). Pasado el tiempo de
incubación, se procedió a realizar lavados con la solución de hibridación sin sondas a 75, 50
y 25 %, a una temperatura de 65°C por 10 minutos cada una. El revelado se llevó a cabo con
NBT/BCIP (SIGMA) en cámara húmeda cubierta de la luz; el tiempo de exposición fue
definido dependiendo de la coloración deseada con revisiones periódicas cada 30 minutos.
Evaluación de la expresión diferencial de marcadores de neurodesarrollo
(Objetivo 2)
5.5.1.1 Extracción de ARN viral total a partir de lisados de tejidos animales
Para la cuantificación de la expresión de los marcadores en tejidos se realizó la extracción
del ARN total mediante la utilización del estuche comercial RNeasy mini kit® (Qiagen Inc,
USA), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se adicionaron 600 uL de buffer RLT
y se realizó la homogenización del tejido mediante la utilización de una jeringa estéril.
Posteriormente se centrifugó el lisado a 13.000 rpm y el sobrenadante fue transferido a un
nuevo vial, al cual se le adicionó un volumen de etanol al 70%. La mezcla fue transferida a
una columna RNeasy spin y se centrifugó a 13.000 rpm durante 15 segundos. A continuación,
se realizó un lavado con 700 uL de buffer RW1 y dos lavados con buffer RPE. Finalmente,
para la elusión, la columna se ubicó en un nuevo vial de 1.5 mL y sobre la membrana se
adicionaron 50 uL de agua libre de Rnasas; luego se procedió a centrifugar a 13.000 rpm.
Los extractos de ARN fueron almacenados a -80°C hasta su posterior manejo.
5.5.1.2 Diseño de primers para la evaluación de la expresión diferencial de marcadores
Los primers utilizados en este estudio fueron previamente diseñados con el grupo de trabajo
(Anexo 1B). El diseño de los primers se llevó a cabo utilizando los parámetros descritos en
el anexo 1, a través del módulo PrimerSelect de la suite LaserGene® versión 8.1 (DNASTAR
Inc., Madison, WI, EE. UU.) y el software de bioinformática Unipro UGENE v. 34. Se
seleccionaron los primers de tal manera que el producto amplificado fuera entre 80 a 150pb.
Las secuencias de referencia utilizadas para el diseño de los primers se obtuvieron de la base
de datos de NCBI. A continuación, se realizó un alineamiento entre las secuencias de los
marcadores de neurodesarrollo a evaluar expresados en ratón y los primers seleccionados,
con el fin de identificar si estos primers reconocían los genes a evaluar mencionados en la
tabla1.
Una vez diseñados los primers se analizaron con el software Beacon Designer de PREMIER
Biosoft para seleccionar aquellos que presentaron mejor estabilidad energética y menor
probabilidad de generar “harpings” y regiones homólogas, es decir que se seleccionaron los
primers que tuvieron energías de estabilidad bajas con el fin de minimizar efectos secundarios
sobre la eficiencia de la PCR (anexo 2).
5.5.1.3 RT-qPCR en tiempo real para la cuantificación de marcadores de
neurodesarrollo
A partir de las extracciones de ARN en fase prenatal se evaluaron los siguientes genes DCX,
MCPH1, CEP152, Reelin, TBR2, GFAP y NES, estos genes fueron seleccionados por su
importancia en el neurodesarrollo y posibles implicaciones en la patogénesis de la
microcefalia y porque además se encuentran presentes en humano y ratón. Como gen de
referencia para la cuantificación relativa de la expresión de los transcriptos antes mencionados se utilizó GAPDH. Los datos se recolectaron del análisis de 7 embriones de
madres control o Mock y 6 embriones de madres infectadas con tres réplicas técnicas para
cada grupo, todos los embriones seleccionados como infectados presentaron prueba de RT
Evaluating the Ecological Impacts of Cultivating Genetically Modified Herbicide Tolerant (GMHT) Oilseed Rape and Maize: (2007-B-DS-1-S1) STRIVE Report
No full textThis report is published as part of the Science, Technology, Research and Innovation for the
Environment (STRIVE) Programme 2007–2013.Author has checked copyrigh
