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Study of communication between embryo and endosperm in the maize seed using CRISPR-Cas9 technology
No full textLe maïs est un pilier de l’agriculture moderne principalement utilisé pour l’alimentation animale et humaine et dont la graine est convoitée pour ses valeurs nutritionnelles. Le grain de maïs comporte deux compartiments filiaux : l’embryon (future plante) et l’albumen (compartiment de réserve) qui doivent croître de manière coordonnée via une communication active à leur interface. Les couches cellulaires de l’albumen amylacée au contact de l’embryon constituent un sous-domaine de l’albumen appelé EAS (Endosperm Adjacent to Scutellum). Pour élucider le rôle de ce sous-domaine, des transporteurs de sucres (Sugars Will Eventually be Exported Transporters - SWEETs) et d’acides aminés (Usually Multiple Acids Move In and out Transporters - UMAMITs), préférentiellement exprimés dans l’EAS, ont été mutés par la technologie CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9). Les mutants montrent des perturbations dans les teneurs en sucres et acides aminés de l’embryon, l’EAS et l’albumen. Par ailleurs, chez les plantes sauvages, l’EAS possède une identité métabolique propre (teneur en sucres). La dynamique de l’EAS a été abordée grâce à des méthodes génétiques et cytologiques. La zone EAS s'agrandit en accompagnant le développement de l’embryon, comme illustré par l’expression d’un gène marqueur de l’EAS au cours du temps grâce au gène rapporteur GUS. La mort des cellules les plus proches de l'embryon provoque une accumulation de parois cellulaires dans l’EAS, qui a été documentée par marquage des parois au calcofluor et des observations en microscopie électronique. Enfin, pour faciliter les travaux en génomique fonctionnelle, un système de validation des constructions CRISPR/Cas9 en protoplastes (cellules isolées) de maïs a été mis au point.Maize is a pillar of modern agriculture primarily used for food and feed due to the nutritional value of its seed. The maize seed bears two filial compartments: the embryo (future plant) and the endosperm (nutritive tissue) that grow in a coordinated fashion through active communication at their interface. The starchy endosperm cell layers in contact with the embryo form an endosperm sub-domain called EAS (Endosperm Adjacent to Scutellum). To uncover the role of this sub-domain, sugar (Sugars Will Eventually be Exported Transporters - SWEETs) and amino acid (Usually Multiple Acids Move In and out Transporters - UMAMITs) transporters, preferentially expressed in the EAS, were mutated with CRISPR/Cas9 technology (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9). Mutants exhibit disturbed sugar and amino acid contents in the embryo, EAS and endosperm. Furthermore, in wild type plants, the EAS has a distinct metabolic identity (sugar contents). The dynamics of the EAS have been addressed with genetic and cytologic tools. The EAS grows in the same proportions as the embryo as shown by the expression of an EAS marker gene over time using the GUS reporter gene. The death of the cells closest to the embryo generates an accumulation of cell wall material in the EAS which has been documented by calcofluor staining and electron microscopy. Finally, in order to facilitate functional genomics work, a validation system for CRISPR/Cas9 constructs was set up in maize protoplasts (isolated cells)
Transcriptional study of two transcription factors involved in maize kernel development : ZmZOU involved in embryo-endosperm communication and ZmAFL4 involved in reserves accumulation
No full textLe grain de maïs est composé de 3 compartiments : l’embryon et l’albumen issus de la double fécondation et l’enveloppe d’origine maternelle. Le développement du grain et l’accumulation de réserves demande l’établissement d’une communication étroite entre l’embryon et l’albumen pour coordonner leur développement respectif. Si, des régulateurs majeurs impliqués dans le développement de la graine d’Arabidopsis ont été décrits, ces connaissances restent parcellaires chez les céréales. Les objectifs de ma thèse consistaient d’une part à étudier le contrôle de la communication entre l’embryon et l’albumen et d’autre part la régulation du remplissage du grain de maïs. Par l’analyse de lignées transgéniques sous exprimant ZmZHOUPI (ZmZOU-RNAi), nous avons établi que ce facteur de transcription à domaine bHLH, bien que s’exprimant exclusivement dans l’albumen, affecte significativement le développement de l’embryon (taille de l’embryon, persistance du suspenseur). L’analyse de données RNAseq (grains sauvages versus grains ZmZOU-RNAi) a permis d’identifier des gènes cibles potentiels de ZmZOU. De plus, nous avons montré que 3 facteurs de transcription de type bHLH homologues d’INDUCER OF CBP EXPRESSION (ICE) forment un partenariat avec ZmZOU.D’autre part, nous avons étudié les homologues d'ABA INSENSITIVE3, FUSCA3 et LEAFY COTYLEDON2 (AFL) qui forment un réseau de facteurs de transcription, à domaine B3, régulant l’accumulation d’huile et de protéines de réserves dans l’embryon d’Arabidopsis. Grâce à des analyses phylogénétiques et d’expression, nous avons établi que chez le maïs le réseau AFL, constitué de 5 membres (ZmAFLs), est partiellement conservé. Par dosages et analyse d’expression, nous avons montré que ZmAFL4, en particulier, est impliqué dans le contrôle de la biosynthèse de l’amidon dans l’albumen.Maize kernel is composed of three major compartments: an embryo and an endosperm both produced by double fertilization and the maternally derived seed coat. Seed development and reserves accumulation demands coordination and thus communication between embryo and endosperm allowing specific growth of each compartment. While major regulators involved in seed development have been already described in Arabidopsis, knowledge in cereals remains limited. My thesis purposes were to study on one hand the control of communication between embryo and endosperm and on the other hand regulation of maize kernel filling.By analysis of transgenic lines knock down ZmZHOUPI (ZmZou-RNAi), we showed that this bHLH domain transcription factor, exclusively expressed in endosperm, affect significantly embryo development, size of embryo proper and suspensor persistence. RNAseq data analyses let find putative direct targets of ZmZOU. Additionally, we identified ZmZOU partners, 3 bHLH domain transcription factor homologs of INDUCER OF CBP EXPRESSION (ICE).Furthermore, we studied homologs of three B3 domain transcription factors named ABA INSENSITIVE3, FUSCA3 et LEAFY COTYLEDON2 (AFL) which form a regulatory network governing oil and seed storage proteins accumulation in Arabidopsis embryo. By phylogenetic and expression analysis, we established that 5 genes (ZmAFLs) constitute in maize a partially conserved AFL network. Through dosage and expression analysis, we established that particularly ZmAFL4 is involved in starch biosynthesis regulation
Analyse der Transposons Tn 1721 Tetracyclinresistenz-Gene und resolvaseabhängige Rekombination
No full textImproving Fusarium resistance in maize combining WRKY gene editing and LOX gene overexpression
No full textFusarium verticillioides (Fv) is a major cereal pathogen causing stalk rot and ear rot in maize, negatively affecting crop productivity and food safety. The maize WRKY transcription factors and the lipoxygenases (ZmLOXs) are well recognized as important players in plant defense against pathogens, and it is known that the host-pathogen lipid cross-talk influences the pathogenesis. In this regard, previous RNA-seq experiments reported the enhanced expression of ZmLOX genes in maize resistant genotypes and GWAS resulted in one SNP significantly associated with ZmWRKY125. The Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/associated Cas9 (CRISPR/Cas9) editing of ZmWRKY125 and the transgenic overexpression of ZmLOX4 genes were carried out to investigate the possible implication of these two genes in the resistance mechanisms against Fv. As regards ZmWRKY125, the CRISPR cloning was based on a double cloning using two different guides (sgRNA) for one gene target. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation was used for introducing in Maize A188 line the construct under the maize promoter ZmpUBI in the binary vector p1609. Mutants from three different transformation events were obtained. For each event, T2 plants will be genotyped to find homozygous for the mutation that in turn will be phenotyped for Fv resistance and fumonisin content. As regards ZmLOX4, the gene was cloned under an overexpressed promoter involved in kernel development in the vector L1781, and the same transformation conditions adopted for the CRISPR/Cas9 editing of ZmWRKY125 were used. Mutants from two different transformation events were obtained. For each event, T2 plants were genotyped in order to find homozygous for the mutation. Homozygous plants will be further evaluated for Fv resistance, fumonisin accumulation, oxylipin content as well as for the expression analysis of the main genes involved in the jasmonic acid pathway
Functional analysis of the transcription factor OCL1 by the characterization of its protein partners and target genes in maize
No full textL'épiderme est un tissu multi-fonctionnel dont la différenciation est essentielle pour le développement et la protection de la plante. Chez le maïs, OCL1 codant pour un facteur de transcription HD-ZIP IV s'exprime spécifiquement dans les cellules externes de l'embryon avant toute différenciation cytologique de l'épiderme, puis dans l'épiderme de plusieurs organes. De plus chez Arabidopsis, certains membres de cette famille jouent des rôles prépondérants dans la différenciation et la maintien de l'identité épidermique. Le but de ce travail a été de réaliser une caractérisation fonctionelle d'OCL1 par la caractérisation de ses interacteurs et de ses gènes cibles. Nous avons tout d'abord démontré son interaction in planta avec ZmSWI3C1 une prtéine possiblement impliquée dans le remodelage de la chromatine. Nous avons montré une étroite co-expression d'OCL1 avec ZmSWI3C1 ce qui laisse penser qu'OCL1 pourrait jouer son rôle régulateur via un remodelage de la chromatine. Dans un deuxième volet, une analyse transciptomique de plantules sur-exprimant OCL1 (OCL1-OE) nous a permis d'identifier 11 gènes cible d'OCL1 directs ou indirects. La majorité d'entre eux pourraient être impliqués dans le métabolisme des lipides, la défense des plantes ou la biosynthèse de la cuticule, en particulier ZmLtpII.12 et ZmWBC1 1a deux gènes codants pour des transporteurs de composés lipidiques et/ou cuticulaires. En appui de ces annotations, nous avons montré une augmentation de composés réduits dans la cuticule des feuilles OCL1-OE corrélés avec une surexpression d'un gène codant pour une réductase des acides gras du type VLCFAs. Nous avons également démontré la trans-activation de ZmLtpII.12 et ZmWBC11a par OCL1. Une boîte L1, l'élément cis reconnu par les protéines HD-ZIP IV chez Arabidopsis, a été trouvé au sein du premier intron de ZmWBC11a et est nécessaire pour l'activation directe de ZmWBC11a par OCL1.Epidermis is multi-functional tissue which differentiation is essential for the development and protection of plant. In maize, OCL1 encoding an HD-ZIP IV transcription factor is specifically expressed in young epidermal cells. Moreover in Arabidopsis, some members of thi family play crucial roles in the differentation and maintenance of the epidermal cell fate. The aim of this work was to make up the functional characterization of OCL1 through the characterization of its target genes and interacting proteins. We first demonstrated in planta its interaction with ZmSWI3C1, a putative chromatin remodeling protein. We showed a tight co-expression of OCL1 with ZmSWI3C1 that allowed us to hypothesis for a regulatory role of OCL1 via a chromatin remodeling. Secondly, a trancriptome analysis of planets over-expressing OCL1 (OCL-OE) allowed us to identify 11 direct or indirect target genes of OCL1. The majority of them are putatively involved in lipid metabolism, defense or cuticle biosynthesis, in particular two genes encoding putative transporter of lipid/cuticle compounds ZmLtpII.12 and ZmWBC11a. In support of these annotations, we showed changes in the reduction level of epicuticular wax compounds of OCL1-OE leaves, correlated with the transcriptional up-regulation a gene coding for a particular maize fatty acylCoA reductase. We also demonstrated the trans-activation of ZmLtpII.12 and ZmWBC11a by OCL1. A L1box, the cis-element recognize by HD-ZIP proteins in Arabidopsis, was found in the first intron of ZmWBC11a and was required for the direct activation of ZmWBC11a by OCL1.LYON-ENS Sciences (693872304) / SudocSudocFranceF
Analyse des gènes ZmOCL et PK8 impliqués dans l'embryogenèse précoce du maïs
No full textLYON-ENS Sciences (693872304) / SudocSudocFranceF
LES GENES ZMAE, LEUR FONCTION ET LEUR REGULATION DANS L'ALBUMEN ET LES EMBRYONS ANDROGENETIQUES DU MAIS
No full textDEUX NOUVEAUX GENES, ZMAE (EMBRYONS ANDROGENETIQUES), ONT ETE ISOLES PRECEDEMMENT AU LABORATOIRE A PARTIR DE JEUNES CULTURES D'EMBRYONS ANDROGENETIQUES DE MAIS. BIEN QUE ZMAE1 ET ZMAE3 NE PRESENTENT PAS D'HOMOLOGIE DE SEQUENCE ENTRE EUX, TOUS LES DEUX CODENT DES PROTEINES DE PETITE TAILLE, HYDROPHILES, DE FONCTION INCONNUE. AU COURS DES DEVELOPPEMENTS EMBRYONNAIRES IN PLANTA, LE GENE ZMAE1, QUI APPARTIENT A UNE FAMILLE MULTIGENIQUE, EST TRANSCRIT A LA FOIS DANS LA REGION QUI ENTOURE L'EMBRYON (ESR) ET DANS LA ZONE DE TRANSFERT (BETL) DE L'ALBUMEN. LE GENE ZMAE3, PRESENT EN COPIE UNIQUE, EST EXPRIME SPECIFIQUEMENT DANS L'ESR DE L'ALBUMEN. NOUS RAPPORTONS D'ABORD LE CLONAGE, LE SEQUENCAGE ET L'ANALYSE FONCTIONNELLE DES SEQUENCES PROMOTRICES DE CES GENES. AUCUNE ACTIVITE PROMOTRICE N'A ETE DETECTEE AVEC UN FRAGMENT DE 1,1 KB EN AMONT DE ZMAE1. EN REVANCHE, UN PROMOTEUR POTENTIEL DE ZMAE3 MESURANT 1,1 KB A DIRIGE L'EXPRESSION DU GENE RAPPORTEUR GUS, DANS DES EMBRYONS ANDROGENETIQUES ET DES SUSPENSIONS CELLULAIRES DE MAIS TRANSFORMES TRANSITOIREMENT AINSI QUE DANS L'ESR DE CARYOPSES DE MAIS TRANSGENIQUES. NOUS AVONS EGALEMENT DEMONTRE QUE LA BOITE AE, UNE SEQUENCE DE 18 PB REPETEE TROIS FOIS DANS LE PROMOTEUR DE ZMAE1, PRESENTE UNE FOIS DANS LE PROMOTEUR DE ZMAE3, ET RETROUVEE AUSSI DANS D'AUTRES PROMOTEURS SPECIFIQUES DE L'ALBUMEN, EST CAPABLE DE LIER DES PROTEINES PRESENTES DANS DES EXTRAITS NUCLEAIRES DE MOITIES INFERIEURES DE CARYOPSES DE MAIS. LA BOITE AE EST DONC UN BON CANDIDAT POUR EXPLIQUER, AU MOINS EN PARTIE, LA SPECIFICITE SPATIO-TEMPORELLE DES PROMOTEURS ZMAE. LORS D'UNE ANALYSE FONCTIONNELLE, NOUS AVONS DEMONTRE IN VIVO QUE LA PROTEINE ZMAE1 EST SECRETEE MAIS AUCUNE FONCTION PRECISE N'A PU LUI ETRE ATTRIBUEE. PAR CONTRE, NOUS PROPOSONS QUE LA PROTEINE ZMAE3 A DES PROPRIETES ANTIFONGIQUES ET QU'ELLE DEFEND LE CARYOPSE CONTRE L'ATTAQUE DE PATHOGENES. NOUS SOULIGNONS LES SIMILITUDES DE STRUCTURE ET DE SEQUENCE ENTRE ZMAE3 ET LA FAMILLE DES BASAL LAYER ANTIFUNGAL PROTEINS (BAPS), DES PROTEINES DONT L'ACTIVITE ANTIFONGIQUE A ETE DEMONTREE IN VITRO. NOUS AVONS DEMONTRE IN VIVO QUE LA PROTEINE ZMAE3 EST SECRETEE. DE PLUS, NOUS AVONS PRODUIT DES MAIS TRANSGENIQUES SENS ET ANTISENS QUI SERONT UTILES POUR TESTER NOTRE HYPOTHESE IN PLANTA.LYON-ENS Sciences (693872304) / SudocSudocFranceF
Metabolomic approach to understand resistance mecanisms to Fusarium graminearum and trichothecenes accumulation
No full textParmi les nombreux pathogènes fongiques susceptibles d’infecter les épis de maïs, les espèces appartenant au genre Fusarium sont particulièrement préoccupantes pour la filière maïsicole. La fusariose est susceptible d’induire des pertes de rendement considérables et est fréquemment associée à une contamination des épis par des mycotoxines. Un des leviers prometteur repose sur la sélection génétique de plantes résistantes à Fusarium et à l’accumulation de mycotoxines. Plusieurs Quantitative Trait Loci (QTL) ont été identifiés d’après la caractérisation moléculaire de la résistance à la fusariose chez le maïs. Cependant malgré les progrès des approches génétiques, les mécanismes moléculaires impliqués restent en grande partie inconnus. L’identification de métabolites majeurs associés à la résistance reste donc indispensable pour la création d’un outil d’aide à la sélection variétale. Une approche métabolomique combinant de la spectrométrie de masse et de la 1H-RMN a été mise au point pour identifier un ensemble de métabolites de défense, constitutifs ou induits par l’infection, susceptibles d’intervenir dans la résistance à Fusarium. Cette approche a été appliquée aux grains à deux stades de développement sur 20 variétés présentant des degrés de résistance contrastés inoculés ou non avec une souche de Fusarium graminearum toxinogène par le canal des soies. Les résultats obtenus mettent en évidence un panel de métabolites liés à la résistance ou la sensibilité des variétés de maïs.Fusarium graminearum is the main causal agent of maize ear rot or Gibberella ear rot (GER), an important fungal disease affecting maize. GER leads to significant economic loss and serious health issues due to the ability of F. graminearum to produce mycotoxins such as type B trichothecenes. One promising approach to control Giberella Ear Rot and reduce mycotoxins contamination is to promote host-genetic resistance. Several Quantitative Trait Loci (QTLs) have been identified in maize. However molecular basis to resistance to Fusarium infection remains largely unknown and the success of selection for GER resistance is still challenging. Biochemical approaches can provide valuable insights in the mechanisms crops employ against F. graminearum and its production of mycotoxins. A biochemical profiling could actually be an efficient way to decipher plant-pathogen interactions and progress in screening resistant maize lines. This study aims to elucidate the metabolic profiling of F. graminearum resistance and toxin accumulation in kernels toward the combination of high resolution mass spectrometry and 1H NMR to identify a large set of metabolites, preformed, constitutive as well as inducible defense metabolites that could play a key role in GER resistance. This approach was applied to kernels harvested at two developmental stages. Twenty genotypes with contrasting levels of resistance were inoculated, or not, with a toxigenic Fusarium graminearum strain through the silk channel. The obtained data allowed highlighting a set of biochemical compounds linked to the resistance or susceptibility of maize genotype
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