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Ingénierie de génome de bactéries minimales par des outils CRISPR/Cas9
No full textLes mycoplasmes sont des bactéries pathogènes, dotées de petits génomes d’environ 1Mbp, avec une faible teneur en G+C. L'intérêt de la communauté scientifique pour ces bactéries a été récemment renouvelé par des avancées dans les domaines de la synthèse et de la transplantation de génomes. Ces nouvelles approches ont ouvert la voie à l'ingénierie génomique à grande échelle des mycoplasmes. Les systèmes CRISPR/Cas sont des systèmes de défense adaptatifs procaryotes contre les acides nucléiques invasifs. Le système CRISPR de Streptococcus pyogenes est composé d’une endonucléase (SpCas9) et de deux CRISPR ARNs (crRNA et tracrRNA) qui dirigent Cas9 vers sa séquence d’ADN cible. La reconnaissance de l’ADN cible se fait par appariement du crRNA et de la présence en aval d’une séquence nommée protospacer adjacent motif (PAM). Apres cette reconnaissance, Cas9 coupe l’ADN cible. A partir de ce système, un outil génétique simplifié composé de Cas9 et d’un ARN guide (gRNA) a été développé pour de nombreux organismes. Le premier objectif de ma thèse était de combiner les méthodes de biologie synthétique de clonage et de la transplantation de génomes avec les outils CRISPR/Cas9 pour l’ingénierie des génomes de mycoplasmes clonés dans la levure. Nous avons réussi à utiliser cette approche pour enlever des gènes et des régions génomiques dans trois espèces: Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), M. capricolum subsp. capricolum et M. pneumoniae. Afin de développer un système plus adapté aux mycoplasmes, nous avons ensuite caractérisé le système CRISPR/Cas9 de Mycoplasma gallisepticum (Mg). En utilisant une combinaison d'approches in silico et in vivo, la séquence PAM de MgCas9 a été caractérisée comme NNNAAAA. Nous avons alors entrepris de développer un système CRISPR/Cas minimal de M. gallisepticum pour une utilisation directe dans les cellules de mollicutes: le gène codant MgCas9 a été introduit dans le génome de Mmc, mais son activation avec un gRNA chimère entre le crRNA et le tracrRNA de M. gallisepticum n’a pas été obtenue pour le moment
Evolution et caractérisation fonctionnelle d’une ATPase de type F1-likeX0 spécifique des mycoplasmes
No full textLes ATPases F1F sont présentes chez la majorité des bactéries, notamment les mycoplasmes qui sont caractérisés par un génome réduit et un mode de vie parasitaire. En plus de l’opéron codant l’ATPase F1F , des clusters apparentés de sept gènes ont été identifiés dans le génome de nombreux mycoplasmes. Au cours de cette thèse, nous avons cherché à caractériser l’évolution et la fonction de ces clusters supplémentaires. Quatre des protéines codées par ces clusters présentent des similarités structurales avec les sous-unités α, β, g et ε de l’ATPase F1F , résultant en une potentielle structure F1-like. Les trois autres protéines ne présentent aucune similarité avec des protéines connues. Une localisation transmembranaire est prédite pour deux d’entre elles. Deux types d’ATPase F1-like, Type 2 et Type 3, ont été identifiés. Les clusters de Type 2 et de Type 3 pourraient être originaires du groupe phylogénétique Hominis, les clusters de Type 3 ayant vraisemblablement été disséminés par des transferts horizontaux de gènes entre mycoplasmes colonisant le même hôte. Les gènes du cluster de Type 3 de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides sont organisés en opéron et exprimés en milieu axénique. Des études de mutagénèse et de complémentation démontrent que le cluster de Type 3 est associé à une activité ATPase majeure des fractions membranaires. Des analyses biochimiques suggèrent que l’activité ATPase du cluster est sensible au ∆pH mais pas au ∆Ψ. Ces analyses suggèrent que le sodium et le potassium ne sont pas impliqués dans le fonctionnement de l’ATPase F1-likeX . Les sous-unités des ATPases F1-likeX et F1F présentent un comportement différent en présence de détergents. L’ensemble de ces expériences suggèrent que l’ATPase F1-likeX est un complexe plus fragile que l’ATPase F1F . Nos résultats montrent qu’en dépit d’une tendance à la réduction de génome, les mycoplasmes ont développé et échangé des ATPases sans équivalent chez d’autres bactéries. Nous proposons un modèle dans lequel une structure F1-like est associée avec un domaine hypothétique X , enchâssé dans la membrane des mycoplasmes
Engineering the genome of minimal bacteria using CRISPR/Cas9 tools
No full textLes mycoplasmes sont des bactéries pathogènes, dotées de petits génomes d’environ 1Mbp, avec une faible teneur en G+C. L'intérêt de la communauté scientifique pour ces bactéries a été récemment renouvelé par des avancées dans les domaines de la synthèse et de la transplantation de génomes. Ces nouvelles approches ont ouvert la voie à l'ingénierie génomique à grande échelle des mycoplasmes. Les systèmes CRISPR/Cas sont des systèmes de défense adaptatifs procaryotes contre les acides nucléiques invasifs. Le système CRISPR de Streptococcus pyogenes est composé d’une endonucléase (SpCas9) et de deux CRISPR ARNs (crRNA et tracrRNA) qui dirigent Cas9 vers sa séquence d’ADN cible. La reconnaissance de l’ADN cible se fait par appariement du crRNA et de la présence en aval d’une séquence nommée protospacer adjacent motif (PAM). Apres cette reconnaissance, Cas9 coupe l’ADN cible. A partir de ce système, un outil génétique simplifié composé de Cas9 et d’un ARN guide (gRNA) a été développé pour de nombreux organismes. Le premier objectif de ma thèse était de combiner les méthodes de biologie synthétique de clonage et de la transplantation de génomes avec les outils CRISPR/Cas9 pour l’ingénierie des génomes de mycoplasmes clonés dans la levure. Nous avons réussi à utiliser cette approche pour enlever des gènes et des régions génomiques dans trois espèces: Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), M. capricolum subsp. capricolum et M. pneumoniae. Afin de développer un système plus adapté aux mycoplasmes, nous avons ensuite caractérisé le système CRISPR/Cas9 de Mycoplasma gallisepticum (Mg). En utilisant une combinaison d'approches in silico et in vivo, la séquence PAM de MgCas9 a été caractérisée comme NNNAAAA. Nous avons alors entrepris de développer un système CRISPR/Cas minimal de M. gallisepticum pour une utilisation directe dans les cellules de mollicutes: le gène codant MgCas9 a été introduit dans le génome de Mmc, mais son activation avec un gRNA chimère entre le crRNA et le tracrRNA de M. gallisepticum n’a pas été obtenue pour le moment.Mycoplasmas are small pathogenic bacteria that are characterized by reduced genomes of about 1 Mbp with a low G+C content. The interest of the scientific community towards these species has been recently renewed by successful synthesis of their genome and transplantation experiments. These new genetic tools opened the way to further applications and developments for large-scale genome engineering programmes. CRISPR/Cas systems are natural systems that provide bacteria and archaea with an adaptive defense mechanism against invading nucleic acids. The CRISPR system from Streptococcus pyogenes includes an endonuclease (SpCas9) and two CRISPR RNAs (crRNA et tracrRNA) which role are to drive Cas9 to a target sequence. Target recognition depends on a specific pairing of the crRNA and the presence of a motif named protospacer adjacent motif (PAM). After recognition, Cas9 cleaves the targeted DNA. From the natural S. pyogenes system, a simplified genetic tool including Cas9 and a guide RNA (gRNA) was developed for many organisms . The first goal of my thesis was to combine the synthetic biology methods of genome cloning in yeast and back transplantation into recipient cells with a CRISPR/Cas9 tool for efficient engineering of mycoplasma genomes cloned in yeast. We succeeded in removing genes and genomic regions in three different species, Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), M. capricolum subsp. capricolum and M. pneumoniae. Then, in order to develop a system optimized for mycoplasma genome editing, we characterized a natural CRISPR/Cas9 system derived from Mycoplasma gallisepticum (Mg). Using a combination of in silico and in vivo approaches, MgCas9 PAM sequence was characterized as NNNAAAA. We then started to develop a minimal CRISPR/Cas system from M. gallisepticum for direct genome editing in mollicutes. Thus we introduced MgCas9 encoding gene in Mmc and tried to activate it with a newly designed gRNA, a chimeric molecule between the crRNA and the tracrRNA of M. gallisepticum, without success yet
Engineering the genome of minimal bacteria using CRISPR/Cas9 tools
No full textLes mycoplasmes sont des bactéries pathogènes, dotées de petits génomes d’environ 1Mbp, avec une faible teneur en G+C. L'intérêt de la communauté scientifique pour ces bactéries a été récemment renouvelé par des avancées dans les domaines de la synthèse et de la transplantation de génomes. Ces nouvelles approches ont ouvert la voie à l'ingénierie génomique à grande échelle des mycoplasmes. Les systèmes CRISPR/Cas sont des systèmes de défense adaptatifs procaryotes contre les acides nucléiques invasifs. Le système CRISPR de Streptococcus pyogenes est composé d’une endonucléase (SpCas9) et de deux CRISPR ARNs (crRNA et tracrRNA) qui dirigent Cas9 vers sa séquence d’ADN cible. La reconnaissance de l’ADN cible se fait par appariement du crRNA et de la présence en aval d’une séquence nommée protospacer adjacent motif (PAM). Apres cette reconnaissance, Cas9 coupe l’ADN cible. A partir de ce système, un outil génétique simplifié composé de Cas9 et d’un ARN guide (gRNA) a été développé pour de nombreux organismes. Le premier objectif de ma thèse était de combiner les méthodes de biologie synthétique de clonage et de la transplantation de génomes avec les outils CRISPR/Cas9 pour l’ingénierie des génomes de mycoplasmes clonés dans la levure. Nous avons réussi à utiliser cette approche pour enlever des gènes et des régions génomiques dans trois espèces: Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), M. capricolum subsp. capricolum et M. pneumoniae. Afin de développer un système plus adapté aux mycoplasmes, nous avons ensuite caractérisé le système CRISPR/Cas9 de Mycoplasma gallisepticum (Mg). En utilisant une combinaison d'approches in silico et in vivo, la séquence PAM de MgCas9 a été caractérisée comme NNNAAAA. Nous avons alors entrepris de développer un système CRISPR/Cas minimal de M. gallisepticum pour une utilisation directe dans les cellules de mollicutes: le gène codant MgCas9 a été introduit dans le génome de Mmc, mais son activation avec un gRNA chimère entre le crRNA et le tracrRNA de M. gallisepticum n’a pas été obtenue pour le moment.Mycoplasmas are small pathogenic bacteria that are characterized by reduced genomes of about 1 Mbp with a low G+C content. The interest of the scientific community towards these species has been recently renewed by successful synthesis of their genome and transplantation experiments. These new genetic tools opened the way to further applications and developments for large-scale genome engineering programmes. CRISPR/Cas systems are natural systems that provide bacteria and archaea with an adaptive defense mechanism against invading nucleic acids. The CRISPR system from Streptococcus pyogenes includes an endonuclease (SpCas9) and two CRISPR RNAs (crRNA et tracrRNA) which role are to drive Cas9 to a target sequence. Target recognition depends on a specific pairing of the crRNA and the presence of a motif named protospacer adjacent motif (PAM). After recognition, Cas9 cleaves the targeted DNA. From the natural S. pyogenes system, a simplified genetic tool including Cas9 and a guide RNA (gRNA) was developed for many organisms . The first goal of my thesis was to combine the synthetic biology methods of genome cloning in yeast and back transplantation into recipient cells with a CRISPR/Cas9 tool for efficient engineering of mycoplasma genomes cloned in yeast. We succeeded in removing genes and genomic regions in three different species, Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), M. capricolum subsp. capricolum and M. pneumoniae. Then, in order to develop a system optimized for mycoplasma genome editing, we characterized a natural CRISPR/Cas9 system derived from Mycoplasma gallisepticum (Mg). Using a combination of in silico and in vivo approaches, MgCas9 PAM sequence was characterized as NNNAAAA. We then started to develop a minimal CRISPR/Cas system from M. gallisepticum for direct genome editing in mollicutes. Thus we introduced MgCas9 encoding gene in Mmc and tried to activate it with a newly designed gRNA, a chimeric molecule between the crRNA and the tracrRNA of M. gallisepticum, without success yet
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
CRISPR/Cas9 chez les mollicutes : Du système naturel aux outils d’ingénierie de génome
No full textCRISPR/Cas systems are widely represented in bacteria and archaea and provide them an adaptative defense mechanism against exogenous DNA or RNA. Because of its wide use as a genome engineering tool, type II CRISPR system from Streptococcus pyogenes has been extensively studied. The core system includes the endonuclease Cas9 and one sgRNA that drives Cas9 on a target site with a recognition specificity depending on the NGG Protospacer Adjacent Motif (PAM). Mollicutes are minimal bacteria that have no cell wall and most of them use an alternative genetic code. Their genomes are AT rich (~70-75%) with a size ranging from 0.58 to 2.2 Mbp. Most of them have a parasitic lifestyle and are pathogens of a wide host diversity including humans, other animals and plants. For most mollicutes species, genome engineering currently remains challenging mainly because homologous recombination is poorly efficient. The aim of my thesis was to (1) characterize CRISPR/Cas9 systems of mollicutes, (2) develop a genome engineering tool based on endogenous CRISPR/Cas9 system and, (3) extend the toolbox for some mycoplasmas of veterinary interest for which any precise genetics tool was available.The first part of my thesis work was a global survey of CRISPR systems in mollicutes. Complete or degraded CRISPR systems were found in 21 out of the 52 representatives mollicutes species included in the study. Phylogenetic reconstruction indicated a probable unique origin of mycoplasma CRISPR/Cas9 systems while two different origins were predicted for systems present in spiroplasmas. Comparison of the predicted structures Cas9 from mollicutes and Staphylococcus aureus showed a strong structural proximity except for the PI domain that is involved in the interaction with the PAM sequence. This suggests probable differences of PAM recognition specificity. We next focused on the CRISPR/Cas9 system of the bird pathogen Mycoplasma gallisepticum (Mgal). The functionality of the system was demonstrated in vivo and a minimal system including Cas9 and a sgRNA was designed and evaluated in vitro. An extensive evaluation of the PAM motifs recognized by two MgalCas9 from two distinct strains of Mgal isolated in chicken and house-finch was conducted using an in vitro cleavage assay coupled with a deep sequencing strategy. A difference of PAM consensus was observed between the two strains and was correlated with a recent host jump from chicken to American house-finch. Next, a set of “all in one” plasmids was constructed and MgalCas9 was successfully used as a tool for precise DNA cleavage in different mycoplasma species: Mgal, Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (Mcap), Mycoplasma pulmonis et Mycoplasma mycoides subsp. mycoides. Using this counter selection tool, we were able to cure the Mcap genome from a 23 kbp auto-excisable genetic mobile element (ICE). In order to overcome the low efficiency of natural recombination in mycoplasmas that limits genome engineering possibilities, I developed two new generations tools. The first one is a “CRISPR Base Editor” consisting in an inactivated Cas9 protein that is fused to a deaminase protein (pmcDA1). This hybrid enzyme allowed very specific base modification in the mycoplasma genome. This simple tool was demonstrated to be highly efficient in three main pathogenic mycoplasmas, opening new possibilities for their study. The second tool is based on the phage recombination system RecET that was used to drive homologous recombination in mycoplasma. For the very first time in Mgal, this tool allowed us to perform large scale and precise modifications (Insertion, deletion and replacement).In conclusion, my PhD thesis was dedicated to the studies of CRISPR system of mycoplasma and the development of new precise genome engineering tools for these bacteria. This work opened unprecedent possibilities for the study of pathogenic mycoplasmas and further biotechnological applications.Les systèmes CRISPR/Cas sont largement représentés chez les bactéries et les archées et sont à la base de mécanismes de défense adaptatifs contre l’ADN et l’ARN exogène. De par son intérêt comme outil génétique, le système CRISPR de type II de Streptococcus pyogenes a été particulièrement étudié. Il est composé principalement d’une endonucléase Cas9 et d’un sgRNA qui a pour rôle de guider Cas9 jusqu’à une séquence cible, la spécificité de reconnaissance dépendant également d’une séquence NGG située en aval appelée PAM. Les mollicutes sont des bactéries minimales, dépourvues de paroi et qui utilisent, pour la plupart, un code génétique alternatif. Elles possèdent de petits génomes riches en AT (~70-75%) allant de 0,58 à 2,2 Mpb. La plupart d’entre elles ont un mode de vie parasitique et sont des pathogènes d’une grande diversité d’hôtes (plantes et animaux y compris humains). Chez la plupart des mollicutes, les possibilités d’ingénierie génomique restent limitées car la recombinaison homologue est peu efficace. Le but de ma thèse a été de (1) caractériser les systèmes CRISPR//Cas9 des mollicutes, (2) développer un outil endogène CRISPR/Cas9 pour l’ingénierie de génome de mollicutes et (3) d’étendre cette boite à outils chez certaines espèces d’intérêt pour lesquelles aucun outil génétique de précision n’était disponible.La première partie de mon travail de thèse était l’étude globale des systèmes CRISPR chez les mollicutes. Une reconstruction phylogénétique a permis de mettre évidence une origine commune pour tous les systèmes CRISPR de mycoplasmes et deux origines pour les systèmes de spiroplasmes. L’étude structurale de la protéine Cas9 des mollicutes montre une forte proximité structurale avec la protéine Cas9 de Staphylococcus aureus à l’exception du domaine PI qui intervient dans l’interaction avec la séquence PAM, ce qui suggère que les séquences PAM des systèmes de mollicutes sont sans doute très différentes. Le système CRISPR/Cas9 de Mycoplasma gallisepticum (Mgal), un pathogène d’oiseau, a ensuite été l’objet d’une étude approfondie. Le système naturel a été démontré comme fonctionnel in vivo et le système minimal composé de la MgalCas9 et d’un sgRNA a permis d’induire un clivage de l’ADN in vitro. Une différence de séquence PAM consensus a été observée entre deux souches de Mgal isolées de poulet et de pinson et a pu être mise en corrélation avec le récent changement d’hôte du pathogène et l’émergence de celui-ci dans les populations de pinsons d’Amérique. Un plasmide « all-in-one » contenant le système a été conçu, et la fonctionnalité du système comme outil précis de clivage a été démontré dans différentes espèces, notamment Mgal, Mycoplasma capricolum (Mcap), Mycoplasma pulmonis et Mycoplasma mycoides. Cet outil de contre sélection a été appliqué à Mcap afin de curer son génome d’un élément mobile intégré de 23 kpb (ICE). Finalement, pour pallier à la faible efficacité de recombinaison des mycoplasmes, deux nouveaux outils d’ingénierie génomique ont été mis au point. Un outil « CRISPR Base Editor », composé d’une protéine Cas9 désactivée, fusionnée à une protéine de type déaminase, qui permet de faire des modifications de base de manière très ciblée. La fonctionnalité de cet outil, très efficace et simple d’utilisation, a été validée dans 3 espèces pathogènes majeures de mycoplasmes. Le second outil est basé sur l’importation d’un système de recombinaison RecET issu de phages. Chez Mgal, cet outil d’ingénierie de génome permet ainsi pour la première fois de réaliser des modifications précises à plus grande échelle (délétions, insertions et remplacements).En conclusion, nos travaux ont concerné l’étude fonctionnelle des systèmes CRISPR des mycoplasmes et le développement d’outils d’ingénierie de génomes chez ces mêmes bactéries. Ce travail ouvre de manière significative les possibilités d’étude et d’utilisation des mycoplasmes pour des applications biotechnologiques
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Full text linkWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
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