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Regulation of processing in transcripts with multiple alternative splicing events
No full textEl splicing alternativo juega un rol clave en la generación de la diversidad protéica. En esta tesis se estudió la coordinación en el procesamiento de dos exones alternativos distantes en un mismo gen. Se demostró que mutaciones que inhiben o estimulan la inclusión de un exón alternativo río arriba afectan profundamente el procesamiento de otro exón alternativo ubicado río abajo. Sin embargo, mutaciones similares en el exón alternativo río abajo tienen un efecto mínimo sobre el que se encuentra río arriba. Este efecto polar es específico de promotor y se encuentra aumentado cuando se inhibe la elongación transcripcional. Consistentemente, células de ratones mutantes con inclusión constitutiva o nula del exón alternativo EDA de la fibronectina muestran coordinación con otra región de splicing alternativo lejana, IIICS. Usando PCR específica de alelo, se demostró que la coordinación ocurre en cis, y es afectada, además, por la tasa de elongación transcripcional. Mediante estudios in silico se encontró que el 25% de los genes humanos contiene múltiples regiones de splicing, varios con combinaciones de isoformas que no se ajustan a distribuciones al azar, lo que sugiere la coordinación de las mismas. La coordinación en el splicing alternativo, acoplada a la transcripción de la RNA polimerasa II, supone un nuevo mecanismo de regulación de la expresión génica.Alternative splicing plays a key role in generating protein diversity. In this thesis, the coordination in processing two distant, alternatively spliced exons in the same gene was studied. Mutations that either inhibit or stimulate inclusion of the upstream alternative exon deeply affect inclusion of the downstream one. However, similar mutations at the downstream alternative exon have little effect on the upstream one. This polar effect is promoter specific and is enhanced by inhibition of transcriptional elongation. Consistently, cells from mutant mice with either constitutive or null inclusion of a fibronectin alternative exon revealed coordination with a second alternative splicing region, located far downstream. Using allele-specific RT-PCR, the coordination was shown to occur in cis and to be affected by transcriptional elongation rates. Bioinformatics supports the generality of these findings, indicating that 25% of human genes contain multiple alternative splicing regions and identifying several genes with nonrandom distribution of mRNA isoforms at two alternative regions, suggesting a coordination between them. Alternative splicing coordination, coupled to RNA pol II transcription, sets a platform for a new mechanism involved in gene expression regulation.Fil: Fededa, Juan Pablo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Novel role of argonaute 1 in estrogen triggered transcription and alternative splicing regulation
No full textEn mamíferos las proteínas argonauta están bien caracterizadas como las efectoras delsilenciamiento post-transcripcional mediado por RNAs pequeños. Durante este procesofundamentalmente citoplasmático, dichas proteínas unen RNAs pequeños de 21nucleótidos los cuales por complementariedad de bases, se unen a los mRNA blancoinhibiendo su traducción o promoviendo su degradación. Si bien sabemos que las proteínasargonauta se encuentran tanto en el núcleo como en el citoplasma, es poco lo queconocemos acerca de su relevancia en procesos nucleares. En trabajos previos de nuestrolaboratorio, hemos analizado la unión a la cromatina de argonauta 1 (AGO1) a nivel delgenoma completo de la línea celular mamaria MCF7 y demostramos que AGO1 se une aelementos regulatorios de la transcripción (enhancers), preferentemente cuando éstos seencuentran activos. En este trabajo, continuamos con el análisis de la distribución genómica de AGO1 en lascélulas mamarias MCF7 y hallamos que esta proteína se encuentra mayormente asociada aenhancers cuya activación depende de la unión del receptor de estrógenos alfa (ERα), esdecir, que se activan ante la presencia de la hormona estradiol (E2). Observamos que, aligual que lo que ocurre con ERα, la asociación de AGO1 a estos enhancers depende deltratamiento con E2. En base a esto, estudiamos la relevancia de AGO1 en la activacióntranscripcional disparada por E2 en células MCF7. Encontramos que dicha activacióndepende de AGO1: ante el silenciamiento de la expresión de esta proteína observamos queel efecto del E2 en la activación transcripcional de los enhancers y de los genes blanco sereduce. Este efecto es acompañado, además, por una disminución del reclutamiento de ERαasí como también por una reducción en la frecuencia de interacción entre un enhancer y elpromotor de uno de sus genes blanco. Estos hallazgos proponen un rol fundamental para AGO1 en la activación transcripcional dependiente de estradiol. AGO1 interacciona con ERαde forma E2 dependiente, reforzando la idea de que AGO1 actúa directamente en laactivación transcripcional disparada por estrógenos. Por otro lado, estudiamos la relevancia de un enhancer intragénico dependiente de E2 en lamodulación del patrón de splicing alternativo de un evento que se encuentra río arriba dedicho elemento regulatorio. Utilizamos como modelo de estudio el exón cassette alternativo 107 del gen SYNE2. Vimos que la inclusión de dicho exón en el mRNA disminuye con eltratamiento de células con E2 de manera dependiente de AGO1. Más allá del estudio de un caso puntual en el que AGO1 regula el splicing alternativo, estos resultados permitenpostular un modelo en el que el proceso de splicing alternativo es modulado por eventosasociados a la activación de un enhancer intragénico cercano.In mammals, argonaute proteins are best known as the effectors of siRNA-mediated posttranscriptionalgene silencing. In this cytoplasmic process, argonautes bind 21 nt longsiRNAs which associate with their target mRNAs through base pairing, inducing theirdegradation or inhibiting their translation. Although argonaute proteins can be found both inthe cytoplasm and in the nucleus of mammalian cells, little is known about their roles innuclear functions. In a previous work from our laboratory, we analyzed the genomicdistribution of argonaute 1 (AGO1) in the mammary cell line MCF7 and demonstrated that itbinds active transcriptional enhancers. Further analysis presented here revealed that AGO1preferentially associates with estrogen receptor alpha (ERα)-dependent enhancers which areactivated upon treatment with estradiol (E2). Moreover, we uncover that AGO1 binding tothese enhancers is dependent on E2 treatment, as it is observed for ERα. We thereforesought to determine whether AGO1 is relevant for ERα-triggered transcriptional activation in MCF7 cells. We demonstrate here that AGO1 is necessary for this activation: AGO1silencing impairs enhancer activation as well as expression of ERα-target genes. Reducedrecruitment of ERα to the enhancers and reduced interaction frequency between anenhancer and the promoter of one of its target genes are also observed upon AGO1silencing. Altogether these findings indicate that AGO1 plays a key role in E2-triggeredtranscriptional activation. We found that AGO1 interacts with ERα in an E2 dependentmanner, further supporting the idea that AGO1 is directly involved in estrogen dependenttranscripcional activation. Additionally, we studied the relevance of an intragenic E2-dependent enhancer in thergulation of an alternative splicing event located upstream of this regulatory element. Totackle this, we used the alternative cassette exon 107 of the SYNE2 gene as a model. Results shown here revealed that the inclusion of exon 107 in SYNE2 mRNA decreasesupon E2 treatment, in an AGO1-dependent manner. These findings not only revealed a rolefor AGO1 in alternative splicing regulation, but also allow us to postulate a model in whichalternative splicing outcomes depend on regulatory events associated to a nearby intragenicenhancer.Fil: Gómez Acuña, Luciana I.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Rol de la RNA polimerasa II en la regulación del splicing alternativo de genes eucariotas
No full textLa transcripción y el procesamiento del mRNA ocurren coordinadamente en la célula. La RNA polimerasa II (pol II) se halla en el centro de este acoplamiento y puede dirigir tanto la síntesis de mensajeros como su procesamiento simultáneo. En esta tesis se estudiaron dos modos generales de regulación del splicing alternativo en los cuales la pol II juega un papel central. Demostramos que una mutante lenta de pol II afecta el splicing alternativo tanto de genes transfectados transitoriamente como de genes endógenos. Esto constituye una prueba directa del control de la elongación sobre el splicing alternativo in vivo. Por otro lado se encontró que el dominio carboxilo terminal (CTD) de la pol II regula el splicing alternativo del exón EDI de la fibronectina. Se demostró que el CTD es necesario para que una proteína de la familia SR, SRp20, ejerza su acción negativa sobre la inclusión de EDI, mientras que la acción estimulante sobre la inclusión de EDI de otra proteína SR, SF2/ASF, es independiente del CTD. Esto sugiere que el CTD actúa reclutando a SRp20 y no a SF2/ASF a la proximidad de EDI, llevando a la exclusión del mismo. Se sabe que la fosforilación del CTD controla la elongación de la pol II. Sin embargo, el efecto inhibitorio de SRp20 persiste cuando la elongación se encuentra reducida en presencia de la pol II lenta o por la droga DRB. Estos resultados sugieren que la elongación y el reclutamiento de factores de splicing contribuyen independientemente al control transcripcional del splicing alternativo.Transcription and mRNA processing occur in a highly coordinated manner within the cell. RNA polymerase II (pol II) lies in the center of this coupling and is capable of carrying both the synthesis of mRNAs and their simultaneous processing. In this Thesis we studied two general modes of alternative splicing regulation where pol II plays a central role. We demonstrate that a slow pol II mutant affects alternative splicing of both transiently transfected minigenes and endogenous genes. These results provide a direct proof for the elongation control of alternative splicing in vivo. Additionally, we found that the carboxy-terminal domain (CTD) of pol II regulates the alternative splicing of fibronectin EDI exon. We found that the CTD is required for the inhibitory action of the SR protein SRp20 on the inclusion of EDI into the mature mRNA, whereas SR protein SF2/ASF stimulates EDI inclusion in a CTD-independent manner. This suggests that the CTD acts by recruiting SRp20 but not SF2/ASF to the vicinity of EDI leading to exon skipping. CTD phosphorylation controls transcription elongation which is a major contributor to alternative splicing regulation. However, the SRp20 effect is still observed when transcription elongation is reduced by the slow pol II or DRB. These results suggest that elongation and splicing factor recruitment contribute independently to the transcriptional control of alternative splicing.Fil: de la Mata, Manuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Alternative splicing regulation in plants. Effects of light-triggered retrograde signaling and the arginin methyltransferase PRMT5
Full text linkComo organismos sésiles, las plantas superiores se caracterizan por un alto grado de plasticidad en el desarrollo en respuesta a las señales ambientales, optimizando así sus funciones de una manera que maximiza sus posibilidades de supervivencia y reproducción. Son capaces de detectar la calidad, cantidad y dirección de la luz, y utilizarla como una señal externa para optimizar su crecimiento. Por otra parte, el splicing alternativo es un mecanismo esencial para aumentar la plasticidad del transcriptoma que juega importantes roles en varios aspectos del desarrollo de los metazoos. Sin embargo, poco se conoce del proceso en plantas y de las consecuencias del mismo. Aquí demostramos que el splicing alternativo de varios genes de Arabidopsis thaliana está regulado por transiciones de luz/oscuridad. Para el caso particular de RSp31 (un gen que codifica para una proteína reguladora de splicing o SR) es la intensidad de la luz incidente la que tiene un efecto directo sobre su transcripción y procesamiento. El cloroplasto percibe la luz y genera una señal (retrógrada) capaz de viajar por la planta que provoca los cambios observados en la abundancia relativa de isoformas de RSp31. Las plastoquinonas, componentes de la cadena de transporte electrónico fotosintético, serían un lugar de integración de diferentes señales y una pieza clave en la respuesta de RSp31 a la luz. Por otra parte, demostramos que la metil‐transferasa de proteínas PRMT5 es un importante regulador del proceso de splicing alternativo en Arabidopsis thaliana y está involucrada en la generación de respuestas circadianas en esta planta. Reunimos evidencia que apunta a un efecto sobre el reconocimiento de los sitios dadores (5’ss) de splicing en el mecanismo por el cual PRMT5 ejerce su modulación sobre el proceso de splicing alternativo. Tal mecanismo estaría conservado en Drosophila melanogaster. En este organismo, al igual que en Arabidopsis, PRMT5 regula la expresión y los patrones de splicing alternativo de numerosos genes. Sin embargo, si bien controla la actividad locomotora (una respuesta mediada por el reloj), su vínculo con el oscilador central es más difuso.As sessile organisms, higher plants are characterized by a high degree of developmental plasticity in response to environmental signals, thereby optimizing their developmental patterns in a manner that maximizes their chances of survival and reproduction. Plants are able to detect the quality, quantity and direction of light and to use it as an external cue to optimize their growth. On the other hand, alternative splicing is an essential mechanism to increase transcriptome’s plasticity that plays important roles in various aspects of metazoan development. However, little is known of this process and its consequences in plants. Here we show that alternative splicing of several genes of Arabidopsis thaliana is regulated by light/dark transitions. For the particular case of RSp31 (a gene encoding a splicing regulator or SR protein) it is the intensity of light what leads to the effect on transcription and processing. The chloroplast senses light and creates a retrograde signal that travels through the plant that causes the observed changes in the relative abundance of RSp31’s isoforms. The plastoquinone pool, from the photosynthetic electron transport chain, would be a place for integration of different signals and a key factor responsible for RSp31 responses to light. We also identified the protein‐arginine methyltransferase PRMT5 as an important splicing regulator in Arabidopsis thaliana which is involved in circadian responses. We raised evidence pointing at an effect on the recognition of the splicing donor sites (5'ss) underlying the mechanism by which PRMT5 regulates the alternative splicing process. Such a mechanism would be conserved in Drosophila melanogaster. However, while controlling locomotor activity in this organism (a response mediated by the clock), the link to the central oscillator appears more diffuse.Fil:Petrillo, Ezequiel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Respuesta al daño al ADN: un ejemplo de acoplamiento entre transcripción y splicing alternativo
Full text linkEl splicing alternativo (AS) explica cómo se obtiene una gran cantidad de proteínas a partir de una cantidad limitada de genes. Este proceso es afectado no sólo por la interacción de proteínas reguladoras del AS con sus secuencias blanco en los pre‐mRNAs sino que, dado que ocurre en íntimo contacto con la maquinaria transcripcional, es también afectado por ésta (acoplamiento transcripción/AS). Interesantemente, un gran número de genes involucrados en apoptosis son regulados por splicing alternativo produciendo mRNAs que codifican para proteínas con funciones antagónicas. Sin embargo poco se sabe sobre la regulación del AS en condiciones de estrés. En esta tesis se ha investigado cómo la respuesta al daño al DNA inducido por la luz UV provoca cambios en los patrones de AS de minigenes transfectados transitoriamente o de genes endógenos como Bcl‐x y caspasa 9. El UV induce la hiperfosforilación del dominio carboxilo terminal (CTD) de la RNA polimerasa II (pol II) y consecuentemente con esto afecta preferencialmente el AS co‐transcripcional. El efecto de UV es sistémico ya que el daño del DNA molde no es necesario y no involucra al factor de transcripción p53 como demostramos al utilizar células que carecen de éste clásico factor de respuesta a estrés. Utilizando la técnica de FRAP, en combinación con polimerasas mutantes en su CTD que imitan no sólo el estado hiperfosforilado sino también los efectos de la luz UV sobre el AS, demostramos que la hiperfosforilación del CTD inhibe la tasa de elongación de la pol II afectando así el acoplamiento entre la transcripción y el AS. Confirmando la relevancia de este mecanismo, la apoptosis inducida por luz UV en células p53‐/‐ es prevenida al revertir el cambio en el AS de Bcl‐x. Para evaluar la generalidad de nuestros resultados utilizamos microarrays de AS y encontramos que la irradiación con UV promueve una mayor proporción de cambios en AS en el grupo de genes donde también ha afectado su transcripción. Estos resultados sugieren que el acoplamiento entre la transcripción y el AS es clave en la respuesta al daño en el DNA.Alternative splicing (AS) explains how a vast protein diversity is achieved with a limited number of genes and its regulation not only depends on the interaction of splicing factors with their target sequences in the pre‐mRNA but is coupled to RNA polymerase II (pol II) transcription. AS seems to play a key role in DNA damage response as suggested by the large number of apoptotic genes that are alternatively spliced, with often antagonistic roles of the isoforms generated. However, little is known about AS regulation in a DNA damage derived stress situation. In this thesis we show that ultraviolet (UV) radiation affects alternative splicing of transfected and endogenous genes like Bcl‐x and caspase 9 (C9). UV light induces the hyperphosphorylation of the carboxy terminal domain of the pol II and by doing so it affects co‐transcriptional AS preferentially. The UV effect is systemic as demonstrated by the fact that the actual damage of the DNA template in cis is not necessary and also p53 independent because it is observed in cells lacking this classic stress response factor. By using the FRAP technique and in combination with mutant polymerases that not only mimic the hyperphosphorylated state of its CTD but also the UV effect on AS, we demonstrated that the UV induced CTD hyperphosphorylation inhibits pol II transcriptional elongation rates which in turn affects AS decisions through its coupling with transcription. Confirming the relevance of this mechanism, apoptosis promoted by UV light in cells lacking p53 is prevented when the change in AS of the apoptotic gene Bcl‐x is reverted. To evaluate the generality of these results and using splicingsensitive microarrays, we found a significant overlap of the subsets of genes changing AS with UV light and those that also downregulate their expression, suggesting that transcription/AS coupling is a key feature of the DNA damage response.Fil:Muñoz, Manuel Javier. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
¨Epigenetic¨ regulation of alternative splicing during neuronal differentiation
Full text linkLas modificaciones epigenéticas son cruciales para el establecimiento y mantenimiento de programas de diferenciación celular. Un posible mecanismo de regulación está determinado por el efecto de la estructura de la cromatina en los patrones de splicing alternativo. Las marcas epigenéticas pueden provocar cambios en la tasa de elongación de la ARN polimerasa II, así como afectar el reclutamiento de diversos factores y, de esta manera, modular los patrones de splicing alternativo. Aquí descubrimos el mecanismo por el cual el splicing alternativo de la molécula de adhesión celular neural (NCAM) es regulado durante la diferenciación neuronal mediante la estructura cromatínica. Por otra parte, nos centramos en la regulación del splicing alternativo de G9a, la enzima responsable de la dimetilación en lisina 9 de histona H3 (H3K9me2) en eucromatina de mamíferos. Demostramos que G9a es necesaria para la diferenciación de la línea celular neuronal de ratón N2a y que la inclusión de su exón alternativo (E10) aumenta la localización nuclear de G9a, probablemente debido a la mayor exposición de una secuencia de localización nuclear cercana. Por último, mostramos que la isoforma de G9a que incluye el E10 es necesaria para la diferenciación neuronal y que regula el patrón de splicing alternativo de su propio ARN mensajero precursor promoviendo una mayor inclusión del E10. Nuestros resultados indican que, mediante el control de su splicing alternativo, G9a promueve la diferenciación neuronal y gatilla un mecanismo de retroalimentación positiva que reafirma el compromiso a la diferenciación celular.Epigenetic modifications are critical for the establishment and maintenance of differentiation programs. One possible mechanism of regulation is determined by the effect of chromatin structure on alternative splicing patterns. Epigenetic marks can cause changes in elongation rate of RNA polymerase II, as well as affect the recruitment of different factors, and thus modulate alternative splicing choices. Here we discovered the mechanism by which the alternative splicing of the neural cell adhesion molecule (NCAM) is regulated during neuronal differentiation by chromatin structure. Moreover, we focused on the regulation of G9a alternative splicing, the enzyme responsible for dimethylation of lysine 9 in histone H3 (H3K9me2) in mammalian euchromatin. We demonstrate here that the G9a methyltransferase is required for differentiation of the mouse neuronal cell line N2a and that inclusion of its alternative exon 10 (E10) increases during neuronal differentiation of cultured cells, as well as in the developing mouse brain. Although E10 inclusion greatly stimulates overall H3K9me2 levels, it does not affect G9a catalytic activity. Instead, E10 increases G9a nuclear localization, predictably due to higher exposure of a neighboring nuclear localization signal. We show that G9a inclusion of E10 isoform is necessary for neuron differentiation and regulates the alternative splicing pattern of its own pre-mRNA, enhancing E10 inclusion. Overall, our findings indicate that, by regulating its own alternative splicing, G9a promotes neuron differentiation and creates a positive feedback loop that reinforces the cellular commitment to differentiation.Fil:Fiszbein, Ana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
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