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Étude des protéines « Plant Mobile Domain », à l'interface entre espèce modèle et plante à intérêt agronomique afin de comprendre leur rôle au cours du processus de maturation du fruit de la tomate
No full textDans le noyau des cellules eucaryotes, l’ADN forme un complexe avec les protéines histones appelé la chromatine. Les modifications de la chromatine, dites épigénétiques, influencent la transcription des gènes. Ces modifications ont aussi un rôle dans la répression des éléments transposables (ETs). Chez Arabidopsis thaliana, les protéines MAINTENANCE OF MERISTEM (MAIN), MAIN-LIKE 1 (MAIL1) et MAIL2 appartiennent à la famille des Plant Mobile Domain (PMD). Les protéines MAIN et MAIL1 interagissent ensemble ainsi qu’avec PROTEIN PHOSPHATASE 7-LIKE (PP7L) afin de réguler la transcription des gènes et réprimer les ETs. Le rôle de MAIL2 dans la cellule reste inconnu. Un homologue de MAIL2, SlPMD2, existe chez Solanum lycopersicum (tomate). Le but de ma thèse a été de décrire plus en détail le mode d’action de MAIN et MAIL1, de comprendre le rôle de MAIL2 dans la cellule et d’explorer le rôle de SlPMD2 chez la tomate. J’ai pu démontrer que MAIN et MAIL1 sont impliquées dans la répression de plusieurs ETs de manière indirecte via le contrôle de la transcription de ICRORCHIDIA 1 (MORC1) qui est un important facteur épigénétique. J’ai pu démontrer par des approches de biochimie que MAIN et MAIL1 interagissent avec la chromatine principalement dans le promoteur de gènes et que ces protéines empêchent la déposition sur certains de ces gènes de la marque épigénétique répressive H3K27me3 par la voie Polycomb. De plus, j'ai montré qu'un motif spécifique d'ADN, que j'ai appelé motif MAIL1-MAIN (M1M), est enrichi dans les régions génomiques liées par MAIN et MAIL1 et pourrait peut-être recruter ces protéines. Par des analyses phénotypiques et transcriptomiques j’ai montré que MAIL2 est requis pour le développement de la graine et pour la bonne transcription de certains gènes. J'ai identifié dans le promoteur de certains de ces gènes dérégulés un motif d'ADN que j'ai appelé le motif MAIL2 (M2M). J’ai pu montrer que dans la tomate SlPMD2 est également requis pour le bon développement de la graine et qu’il contrôle l’expression de plusieurs gènes dans la fleur Enfin, je présente des données préliminaires suggérant que SlPMD2, qui est l'homologue de MAIL2 chez la tomate, est impliqué dans le développement et la germination des graines, très probablement en contrôlant l'expression de gènes spécifiques. Comme chez A. thaliana, j'ai identifié un motif ADN, très similaire au motif M2M, dans le promoteur de plusieurs gènes qui sont misrégulés chez le mutant slpmd2. Dans l'ensemble, mes résultats suggèrent que les protéines PMD pourraient être recrutées dans des régions génomiques spécifiques par le biais d'un motif d’ADN conservé au cours de l'évolution afin d'assurer la correcte expression des gènes, potentiellement en antagonisant la voie Polycomb chez les Angiospermes.In the nucleus of eukaryotic cells, DNA interacts with histone proteins to form a complex called chromatin. Epigenetic modifications of chromatin influence gene transcription. These modifications also play a role in silencing of transposable elements (TEs). In Arabidopsis thaliana, the MAINTENANCE OF MERISTEM (MAIN), MAIN-LIKE 1 (MAIL1) and MAIL2 proteins belong to the Plant Mobile Domain (PMD) family. MAIN and MAIL1 interact with each other and with PROTEIN PHOSPHATASE 7-LIKE (PP7L) to regulate gene transcription and repress TEs. The role of MAIL2 into the cell remains nknown. A homolog of MAIL2, SlPMD2, exists in Solanum lycopersicum (tomato). The aim of my thesis was to describe in more details the mode of action of MAIN and MAIL1, to understand the role of MAIL2 within the cell and to explore the role of SlPMD2 in tomato. I was able to demonstrate that MAIN and MAIL1 are indirectly involved in the silencing of several TEs, by controlling MICRORCHIDIA 1 (MORC1) transcription, which is an important epigenetic factor. Using biochemical approaches, I showed that MAIN and MAIL1 interact with chromatin mainly in gene promoters, and that these proteins prevent the deposition of H3K27me3 mediated by the Polycomb pathway. In addition, I found that a specific DNA motif, called the MAIL1-MAIN (M1M) motif, is enriched at genomic regions targeted by the PMD proteins. Besides, phenotypic and transcriptomic analyses showed that MAIL2 is required for seed development and for the correct expression of several genes, a fraction of them carrying another specific DNA motif called MAIL2 motif (M2M) in their promoter. Finally, I present preliminary data suggesting that SlPMD2, which is the MAIL2 counterpart in tomato, is involved in seed development and germination, most likely by controlling the expression of specific genes. Like in A. thaliana, I identified a DNA motif, which is highly similar to the M2M motif, in the promoter of several genes that are misregulated in the slpmd2 mutant. Altogether, my results suggest that PMD proteins might be recruited at specific genomic regions through an evolutionary conserved DNA motif to ensure the proper expression of genes, possibly by antagonizing the Polycomb pathway in Angiosperms
Molecular and physiological characterization of tomato (Solanum lycopersicon) ethylene response factor (ERF)
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Regulation of tomato fruit ripening
No full textFruit ripening is a sophisticatedly orchestrated developmental process, unique to plants, that results in major physiological and metabolic changes, ultimately leading to fruit decay and seed dispersal. Because of their strong impact on fruit nutritional and sensory qualities, the ripeningassociated changes have been a matter of sustained investigation aiming at unravelling the molecular and genetic basis of fruit ripening. Tomato rapidly emerged as the model of choice for fleshy fruit research and a wealth of genetic resources and genomics tools have been developed, providing new entries into the regulatory mechanisms involved in the triggering and coordination of the ripening process. Some of the key components participating in the control of tomato fruit ripening have been uncovered, but our knowledge of the network of signalling pathways engaged in this complex developmental process remains fragmentary. This review highlights the main advances and emphasizes issues still to be addressed using the rapidly developing ‘omics’ approaches
Molecular mechanisms underlying the transition to ripening in tomato fruit
No full textLa maturation des fruits charnus est la dernière étape de leur développement, durant laquelle ils acquièrent leurs qualités organoleptiques et deviennent comestibles. Chez les fruits climactériques tels que la tomate, la maturation est caractérisée par une production autocatalytique d'éthylène et une augmentation de la respiration. Bien que l'éthylène ait été considéré comme l'hormone clé de la maturation des fruits climactériques, les mécanismes moléculaires expliquant la transition vers la maturation restent mal compris. De plus, alors que la plupart des études se sont concentrées sur le péricarpe les études portant sur le tissu loculaire restent rares. La première partie de cette thèse porte sur l’étude des changements transcriptionnel qui surviennent au cours du stade qui précède l’entrée en maturation appelé Mature Green (MG). Nous avons analysé l’évolution du profil transcriptomique global entre les stades MG précoce (Early MG ; EMG) et MG tardif (Late MG ; LMG), dans le gel et le péricarpe, séparément. L’étude montre que la transition du stade EMG au stade LMG s’accompagne d’une reprogrammation transcriptomique massive qui a lieu d'abord dans les tissus loculaires et qui s'étend ensuite au péricarpe. Ce changement est particulièrement remarquable pour 48 familles de facteurs de transcription sur 54 dans la tomate, soulignant l'ampleur des changements transcriptomiques précoces dans le gel. La combinaison des données transcriptomiques et métabolomiques suggèrent un changement de l’homéostasie hormonale entre les stades EMG et LMG, mettant en évidence le contrôle multi-hormonal de l'initiation de la maturation. De plus, l’étude met en évidence les rôles antagonistes de l'éthylène et de l'auxine lors de l’initiation de la maturation et montre que le traitement du fruit par l’auxine exogène induit la répression de la production d’éthylène en régulant négativement les gènes impliqués dans la biosynthèse autocatalytique d'éthylène. La deuxième partie de la thèse porte sur le rôle des facteurs de transcription appartenant à la famille des Ethylene Response Factors (ERF) dans l'initiation de la maturation. Les ERF sont les derniers acteurs de la voie de signalisation de l'éthylène et les membres de la sous-classe ERF.E présentent une expression associée à la maturation. Les ERF.E sont caractérisées par un domaine N-terminal conservé, qui est substrat de la dégradation par la voie de la "N-end rule" en conditions normales d'oxygène. Des mesures d’oxygène au cours de la maturation dans différents tissus du fruit ont montré que contrairement au péricarpe qui se maintient en état de normoxie (concentration normale d’oxygène), le gel loculaire subit une baisse de la concentration d’oxygène pour se retrouver en condition d’hypoxie suggérant que la physiologie du gel diffère significativement entre le stade EMG (normoxie), et le stade LMG (hypoxie). L'ensemble de ces données suggère qu'au cours du stade MG, les fruits subissent des changements physiologiques et transcriptomiques importants qui pourraient être à l’origine de l’acquisition de la compétence à mûrir. Afin de déterminer le rôle des SlERF.E au cours de cette étape, leur régulation post-traductionnelle a été étudiée en réponse à l’hypoxie. Les études d’expression transitoire ont démontré qu’en condition d’hypoxie les ERF.E s’accumulent préférentiellement dans le noyau. De plus, la dégradation des protéines SlERF.E est favorisée en condition normoxique, tandis que l'hypoxie conduit à leur stabilisation, confirmant le rôle de l’oxygène dans la régulation des protéines SlERF.E. Enfin, pour mieux comprendre le rôle des ERF.E dans la maturation, des tomates transgéniques surexprimant SlERF.E2 ou SlERF.E4 ainsi que des lignées knock-out pour ces gènes ont été générées. Les lignées de surexpression montrent une maturation retardée, une production réduite d'éthylène et un retard de la déplétion en oxygène, suggérant que ces ERF codent pour des régulateurs négatifs de la maturation.Ripening is the final stage of development for fleshy fruits, during which they become edible and acquire unique sensory qualities. In climacteric fruits such as tomato, ripening is characterized by a burst of autocatalytic ethylene production and an increase in respiration. Because of this burst, ethylene has been considered the key hormone in climacteric fruit ripening. Although our knowledge of the mechanisms that regulate fruit ripening has improved considerably over the past decades, the molecular mechanisms underlying the transition to ripening remain poorly understood. Previous studies of tomato fruit ripening have focused on deciphering the dynamic changes in the pericarp tissues between Mature Green (MG) and Breaker (Br) stages, neglecting what occurs in the locular tissues. The first part of this thesis addresses the transcriptomic changes between the Early Mature Green (EMG) and Late Mature Green (LMG) stages, in gel and pericarp separately. The data shows that the shift from the inability to initiate ripening to the capacity to undergo full ripening requires a massive transcriptomic reprogramming that takes place first in the locular tissues and then extends to the pericarp. Genome-wide transcriptomic profiling revealed that 48 out of 54 transcription factor families are engaged in the global reprogramming of gene expression, thus highlighting the extent of the transcriptomic changes underlying fruit ripening. We observed extensive reformed hormone homeostasis during ripening onset, underlining the multi-hormonal control of ripening initiation. In addition, our data unveil the antagonistic roles of ethylene and auxin during the onset of ripening and show that auxin treatment represses climacteric ethylene production through the downregulation of genes involved in System-2 of ethylene biosynthesis. The second part of the thesis addresses the role of the Ethylene Response Factors (ERF) in ripening initiation. ERFs mediate the last step in the ethylene signaling pathway and members of the ERF.E clade in the tomato display a remarkable ripening-associated expression pattern. ERF.E members are characterized by a conserved N-terminal domain, described as the substrate for degradation by the N-end rule pathway in normal oxygen conditions. Using physiological approaches, we demonstrated that the locular gel tissue undergoes drastic depletion of oxygen (hypoxia) as the ripening progresses. In contrast, other tissues, such as the pericarp and columella maintain their normoxia status and fail to experience hypoxia. Whereas all previous studies considered the MG stage as homogeneous, we show that the physiology of the gel tissues differs significantly between the EMG (normoxia), and the LMG stage (hypoxia). Altogether, the data suggest that tomato fruits experience dramatic physiological and transcriptomic changes during the MG stage that lead the fruit to gain competency to ripen, a fate-determining point of the whole process of ripening. To further investigate the putative role of SlERF.E members during the transition to ripening, we addressed their regulation under hypoxia at the protein level. The data show that hypoxia induces a decrease in membrane localization of SlERF.E proteins while promoting their accumulation in the nucleus. Moreover, normoxia promotes the degradation of SlERF.E proteins, while hypoxia leads to their stabilization, revealing the role of oxygen concentration in the post-translational regulation of SlERF.E. We generated knocked-out and over-expressing tomato lines for SlERF.E2 and SlERF.E4 to gain insight on their functional significance. Over-expressing lines display delayed ripening, reduced ethylene production, and retarded depletion of oxygen, supporting the hypothesis that these genes encode for negative regulators of climacteric ripening. Overall, the outcome of the study sheds new light on the complex mechanisms and molecular factors regulating the initiation of the ripening process
Caractérisation moléculaire et physiologique des facteurs de réponse à l’éthylène (ERF) chez la tomate (Solanum lycopersicon)
No full textLa phytohormone éthylène, contrôle de nombreux processus physiologique durant le développement des plantes, ainsi que la réponse aux stress biotiques et abiotiques. Les ERF (Facteurs de Réponse à l’Ethylène) sont les derniers facteurs de transcription de la voie de transduction de cette hormone. Ils sont par leur nombre, de bons candidats pour expliquer la diversité de réponse à l’éthylène. Dans cette étude 28 ERF de tomates ont été isolés, caractérisés et renommés. Des études d’interaction ADN/protéine montrent que l’environnement du cis-élément est déterminant pour l’interaction GCC/ERF. Des expériences d’expression transitoire des ERF ont permis de démontrer que leur activité transcriptionnelle est indépendante de leur classe d’appartenance. Leur profil d’expression suggère une spécificité de réponse au cours du développement végétatif ou de la maturation, ainsi qu’un rôle prépondérant dans l’initiation du fruit. L’analyse fonctionnelle est illustrée par deux exemples. D’une part, la surexpression de SlERF2 dans la tomate induit une germination précoce des graines où il a été montré que la MANNANASE2, un marqueur de la germination, est fortement induit dans les graines transgéniques. D’autre part, la surexpression d’ATERF13 fusionné à un domaine répresseur dominant induit une insensibilité partielle à l’éthylène et une hypersensibilité au stress salin. ABSTRACT: The phytohormone ethylene controls many physiological aspects of the plant development
and stress response. ERFs (Ethylene Response Factors) are the last transcription factors of the ethylene transduction pathway. By their number, they are good candidates to explain the diversity of ethylene response. In this work 28 tomato ERFs have been isolated, characterized and renamed. DNA/protein interaction studies indicate that flanking regions of the ciselement are decisive for the GCC/ERF binding. Transient expression studies of ERFs demonstrated that the transcriptional activity is independent of the class they belong to. The study of their expression pattern revealed a specific response for some ERFs during the vegetative growth whereas others are preferentially expressed in fruit, from fruit set to ripening. The physiological significance of the ERFs is addressed through two examples. First, over-expression of the SlERF2 gene in the tomato resulted in premature seed germination in which MANNANASE2, a germination marker, is dramatically enhanced in the transgenic seeds. Second, over-expression of AtERF13 fused to a dominant repressor domain induces a partial insensitivity to ethylene and hypersensitivity to salt stress
Regulation and role of class E Ethylene Response Factors (ERF.E) in climacteric fruit ripening
No full textLe mûrissement des tomates est un processus finement régulé avec de nombreux changements dynamiques qui concernent les voies du métabolisme primaire et secondaire, la respiration ou encore la signalisation hormonale. Comme les autres fruits climactérique, la tomate connait une transition développementale du stade « pré-maturation » à la phase de maturation qui est associée à une augmentation de la respiration au début de la maturation et à une augmentation de la production autocatalytique d'éthylène. Les facteur de réponse à l'éthylène, de la sous-clade E (ERF.E), ont un profil d'expression fortement associé au mûrissement du fruits de tomate. Les protéines ERF.E de la tomate sont notamment caractérisées par la présence d'un motif N-terminal conservé, qui a été identifié comme cible de la voie N-end rule en condition d’hypoxie chez leurs orthologues d'Arabidopsis. Cette étude dévoile pour la première le rôle positif de ERF.E1 dans la maturation des fruits de la tomate. La surexpression d'ERF.E1 favorise l'initiation du mûrissement, et est accompagnée d'une production avancée d'éthylène et d'une déplétion précoce de l'oxygène dans le gel, par rapport aux lignées WT et KO-erf.e1. ERF.E1 régule positivement les activités promotrices des gènes clés de la maturation, RIN et NOR, ainsi que les gènes de biosynthèse de l'éthylène du système 2. De plus, les résultats ont montré qu’en condition d’hypoxie, ERF.E1 est régulé aux niveaux transcriptionnel et post-traductionnel. En effet, les conditions hypoxiques induisent l’expression d’ERF.E1 et stabilise la protéine ERF.E1. Cette thèse se concentre principalement sur le rôle d'ERF.E1 dans l'initiation de la maturation, grâce à la caractérisation des lignées altéré dans l’expression de ERF.E1 et à l’étude des réseaux d'interaction protéiques potentiels d'ERF.E1.Tomato fruit ripening is a finely regulated process with many well-known dynamic changes, from metabolites, color, and respiration rate to hormone level. As a climacteric fruit, tomato fruit experiences a developmental transition characterized by a burst of respiration at the onset of ripening and a rise in autocatalytic ethylene production. Ethylene Response Factors (ERFs) are end mediators of ethylene responses and members of subclade E (ERF.E) of this transcription factor family display remarkable ripening-associated expression patterns in tomato fruit. Notably, tomato ERF.E proteins are characterized by the presence of a consensus N-terminal motif, which has been identified in their Arabidopsis orthologs as the target of the N-end rule pathway under hypoxia. The first outcome of our study is to reveal that initiation of tomato fruit ripening is preceded by a dramatic drop in oxygen levels in locular gel, thus giving a solid physiological marker of ripening initiation. The study also unveils the function of ERF.E1 in tomato fruit ripening showing that overexpression of ERF.E1 promotes the initiation of ripening, by advancing both ethylene production and oxygen depletion event in the gel, compared with the WT and KO-erf.e1 lines. ERF.E1 positively regulates the promoter activities of key ripening genes, RIN and NOR, as well as the ethylene biosynthesis genes involved in System 2 ethylene production. In addition, the data show that ERF.E1 is regulated by hypoxia at both transcriptional and post-translational levels. Hypoxia conditions induce transcription of ERF.E1 and promote ERF.E1 protein stability. Overall, while the study unraveled the role of ERF.E1 in ripening initiation based on the analysis of ERF.E1 impaired lines are altered at the early ripening stages it also uncovered potential proteins interacting with the ERF.E1 network components
Caractérisation moléculaire et physiologique des facteurs de réponse à l éthylène (ERF) chez la tomate (Solanum lycopersicon)
No full textLa phytohormone éthylène, contrôle de nombreux processus physiologique durant le développement des plantes, ainsi que la réponse aux stress biotiques et abiotiques. Les ERF (Facteurs de Réponse à l Ethylène) sont les derniers facteurs de transcription de la voie de transduction de cette hormone. Ils sont par leur nombre, de bons candidats pour expliquer la diversité de réponse à l éthylène. Dans cette étude 28 ERF de tomates ont été isolés, caractérisés et renommés. Des études d interaction ADN/protéine montrent que l environnement du cis-élément est déterminant pour l interaction GCC/ERF. Des expériences d expression transitoire des ERF ont permis de démontrer que leur activité transcriptionnelle est indépendante de leur classe d appartenance. Leur profil d expression suggère une spécificité de réponse au cours du développement végétatif ou de la maturation, ainsi qu un rôle prépondérant dans l initiation du fruit. L analyse fonctionnelle est illustrée par deux exemples. D une part, la surexpression de SlERF2 dans la tomate induit une germination précoce des graines où il a été montré que la MANNANASE2, un marqueur de la germination, est fortement induit dans les graines transgéniques. D autre part, la surexpression d ATERF13 fusionné à un domaine répresseur dominant induit une insensibilité partielle à l éthylène et une hypersensibilité au stress salin.The phytohormone ethylene controls many physiological aspects of the plant development and stress response. ERFs (Ethylene Response Factors) are the last transcription factors of the ethylene transduction pathway. By their number, they are good candidates to explain the diversity of ethylene response. In this work 28 tomato ERFs have been isolated, characterized and renamed. DNA/protein interaction studies indicate that flanking regions of the ciselement are decisive for the GCC/ERF binding. Transient expression studies of ERFs demonstrated that the transcriptional activity is independent of the class they belong to. The study of their expression pattern revealed a specific response for some ERFs during the vegetative growth whereas others are preferentially expressed in fruit, from fruit set to ripening. The physiological significance of the ERFs is addressed through two examples. First, over-expression of the SlERF2 gene in the tomato resulted in premature seed germination in which MANNANASE2, a germination marker, is dramatically enhanced in the transgenic seeds. Second, over-expression of AtERF13 fused to a dominant repressor domain induces a partial insensitivity to ethylene and hypersensitivity to salt stress.TOULOUSE-ENSAT-Documentation (315552324) / SudocSudocFranceF
Functional analysis and binding affinity of tomato ethylene response factors provide insight on the molecular bases of plant differential responses to ethylene
No full textBackground : The phytohormone ethylene is involved in a wide range of developmental processes and in mediating plant responses to biotic and abiotic stresses. Ethylene signalling acts via a linear transduction pathway leading to the activation of Ethylene Response Factor genes (ERF)which represent one of the largest gene families of plant transcription factors. How an apparently simple signalling pathway can account for the complex and widely diverse plant responses to ethylene remains yet an unanswered question. Building on the recent release of the complete tomato genome sequence, the present study aims at gaining better insight on distinctive features among ERF proteins. Results : A set of 28 cDNA clones encoding ERFs in the tomato (Solanum lycopersicon) were isolated and shown to fall into nine distinct subclasses characterised by specific conserved motifs most of which with unknown function. In addition of being able to regulate the transcriptional activity of GCC-box containing promoters, tomato ERFs are also shown to be active on promoters lacking this canonical ethylene-responsive-element. Moreover, the data reveal that ERF affinity to the GCC-box depends on the nucleotide environment surrounding this cis-acting element. Site-directed mutagenesis revealed that the nature of the flanking nucleotides can either enhance or reduce the binding affinity, thus conferring the binding specificity of various ERFs to target promoters. Based on their expression pattern, ERF genes can be clustered in two main clades given their preferential expression in reproductive or vegetative tissues. The regulation of several tomato ERF genes by both ethylene and auxin, suggests their potential contribution to the convergence mechanism between the signalling pathways of the two hormones. Conclusions : The data reveal that regions flanking the core GCC-box sequence are part of the discrimination mechanism by which ERFs selectively bind to their target promoters. ERF tissue-specific expression combined to their responsiveness to both ethylene and auxin bring some insight on the complexity and fine regulation mechanisms involving these transcriptional mediators. All together the data support the hypothesis that ERFs are the main component enabling ethylene to regulate a wide range of physiological processes in a highly specific and coordinated manner
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