1,721,003 research outputs found
Transient and controllable opening of the blood-brain barrier to cytostatic and antibiotic agents by alkylglycerols in rats
No full textThe blood-brain barrier hinders progress in the chemotherapy of brain tumors due to insufficient penetration of anticancer drugs into the brain tissue. Short-chain alkylglycerols affect the physicochemical proper ties of biological membranes. The enhancement of the blood-brain barrier permeability by intra-arterial administration of alkylglycerols was investigated in tumor-free and C6 astroglioma bearing rats. The antineoplastic agents cisplatin and methotrexate and the antibiotics vancomycin and gentamicin were selectively injected into the right internal carotid artery in the absence and presence of various alkylmono-, alkyldi-, and alkyltri-glycerols. In normal rats the intra-arterial administration of the drugs without alkylglycerols resulted in low drug concentrations in brain tissue. In the presence of alkylglycerols (0.01-0.3 M) a reversible (within minutes) and concentration-dependent enrichment of the coinjected agents was found, preferentially in the ipsilateral hemisphere. The extent of drug accumulation in the brain was modified by changes in the chemical structure of the alkylglycerols. The effect increased with the chain length of the alkyl group, decreased with the number of glycerols, and varied from 2- to more than 230-fold compared to controls. In rats with C6 tumors 1-O-pentylglycerol increased the delivery of methotrexate 18-fold in the tumor, 28-fold in the surrounding brain, 18-fold in the contralateral brain, and 19-fold in the cerebellum compared to controls with methotrexate in the absence of pentyl-glycerol. In conclusion, the intra-arterial administration of alkylglycerols represents a novel and well controllable method for enhanced drug delivery to the brain and to brain tumors
The Akt-inhibitor Erufosine induces apoptotic cell death in prostate cancer cells and increases the short term effects of ionizing radiation
No full textAbstract Background and Purpose The phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/Akt pathway is frequently deregulated in prostate cancer and associated with neoplastic transformation, malignant progression, and enhanced resistance to classical chemotherapy and radiotherapy. Thus, it is a promising target for therapeutic intervention. In the present study, the cytotoxic action of the Akt inhibitor Erufosine (ErPC3) was analyzed in prostate cancer cells and compared to the cytotoxicity of the PI3K inhibitor LY294002. Moreover, the efficacy of combined treatment with Akt inhibitors and ionizing radiation in prostate cancer cells was examined. Materials and methods Prostate cancer cell lines PC3, DU145, and LNCaP were treated with ErPC3 (1-100 µM), LY294002 (25-100 µM), irradiated (0-10 Gy), or subjected to combined treatments. Cell viability was determined by the WST-1 assay. Apoptosis induction was analyzed by flow cytometry after staining with propidium iodide in a hypotonic citrate buffer, and by Western blotting using antibodies against caspase-3 and its substrate PARP. Akt activity and regulation of the expression of Bcl-2 family members and key downstream effectors involved in apoptosis regulation were examined by Western blot analysis. Results The Akt inhibitor ErPC3 exerted anti-neoplastic effects in prostate cancer cells, however with different potency. The anti-neoplastic action of ErPC3 was associated with reduced phosphoserine 473-Akt levels and induction of apoptosis. PC3 and LNCaP prostate cancer cells were also sensitive to treatment with the PI3K inhibitor LY294002. However, the ErPC3-sensitive PC3-cells were less susceptible to LY294002 than the ErPC3-refractory LNCaP cells. Although both cell lines were largely resistant to radiation-induced apoptosis, both cell lines showed higher levels of apoptotic cell death when ErPC3 was combined with radiotherapy. Conclusions Our data suggest that constitutive Akt activation and survival are controlled by different different molecular mechanisms in the two prostate cancer cell lines - one which is sensitive to the Akt-inhibitor ErPC3 and one which is more sensitive to the PI3K-inhibitor LY294002. Our findings underline the importance for the definition of predictive biomarkers that allow the selection patients that may benefit from the treatment with a specific signal transduction modifier.</p
Identification and characterization of novel lncRNA PANDAR interacting proteins
No full textDie Expression der lncRNA PANDAR wird p53-abhängig über den CDKN1A Promotor induziert 1. Eine Überexpression der lncRNA PANDAR konnte bereits in einigen Tumorarten beobachtet werden, wobei diese erhöhte Expression mit einem invasiven Phänotyp und einer schlechten Überlebensprognose einherging 2,3. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit konnte gezeigt werden, dass das endogene und durch Doxorubicin-induzierte PANDAR RNA Level je nach Zelllinie variiert. Darüber hinaus führte der PANDAR Knockdown in U2OS Osteosarkomzellen zu einer verringerten Zellviabilität, was auf eine Funktion der lncRNA PANDAR im Zellerhalt hindeutet. Ein Mechanismus für diesen Regulationsprozess ist die Decoy-Funktion der lncRNA PANDAR, wobei die Transkriptionsfaktor-Untereinheit NF-YA von den pro-apoptotischen Zielgenen entfernt wird 1. Die Analyse der direkten Bindung der lncRNA mit heterolog exprimierten und aufgereinigten NF-Y Fragmenten ergab eine Interaktion der PANDAR RNA mit der NF-YA Untereinheit und dem trimeren NF-Y Komplex. Dies deutet auf eine Bindung von PANDAR an eine Region von NF-YA hin, die nicht an der Formung des trimeren Komplexes beteiligt ist. Die Identifizierung des RNA-Bindemotivs von NF-YA ergab die genomisch annotierte Sequenzabfolge C(T/A)G(A/T). Jedoch zeigten die
nachfolgend durchgeführten in vitro Mutationsstudien, dass das NF-YA-Fragment sowohl mit wildtypischen als auch mutierten PANDAR RNA Fragmenten Sequenz-unabhängig interagiert. Die Sequenzspezifität des im NF-YA PAR-CLIP ermittelten RNA-Bindemotivs könnte daher durch weitere Regulationsebenen, wie RNA-Sekundärstrukturen, posttranslationalen Proteinmodifikationen
oder auch durch zusätzlich involvierte NF-YA Domänen des Volllängenproteins vermittelt werden. Für die Identifizierung weiterer PANDAR-bindende Proteine wurden gegen PANDAR gerichtete PNAs
synthetisiert, getestet und im PNA-basierten SILAC-Experiment verwendet. Zusätzliche Validierungsprozesse der massenspektrometrisch analysierten Ergebnisse ergab eine Interaktion mit den unter anderem am Spleißprozess beteiligten Proteinen SAFA, hnRNPUL1, U2AF65 und PTBP1. Darüber hinaus wurde der Effekt der lncRNA PANDAR hinsichtlich der Transkriptvariante BCL-XS
analysiert, wobei PTBP1 das alternative Spleißen dieser Variante initiiert 4. Die Überexpression der lncRNA PANDAR führte zu einer Reduktion der mRNA des pro-apoptotischen Bcl-XS. Hingegen
konnte die gleichzeitige Überexpression von PTBP1 diese Reduktion wieder normalisieren.
1. Hung T, Wang Y, Lin MF, et al. Nat. Genet. 2011;43(7):621-9. doi:10.1038/ng.848.
2. Ma P, Xu T, Huang M, Shu Y. Biomed. Pharmacother. 2016;78:172-176.
doi:10.1016/j.biopha.2016.01.025.
3. Peng W, Fan H. Biomed. Pharmacother. 2015;72:113-118. doi:10.1016/j.biopha.2015.04.014.
4. Bielli P, Bordi M, Di Biasio V, Sette C. Nucleic Acids Res. 2014;42(19):12070-12081.
doi:10.1093/nar/gku922.The lncRNA PANDAR is transcribed from the CDKN1A promoter in a p53-dependent manner 1. Overexpression of lncRNA PANDAR has been observed in some tumor species, while the overexpression was correlated with an invasive phenotype and a reduced patient survival rate 2,3. In this thesis it has been shown that endogenous and DNA damage-induced PANDAR RNA expression varies depending on the cell line. Furthermore, the knockdown of PANDAR RNA within U2OS
osteosarcoma cells revealed a reduced cell viability, indicating that PANDAR plays an important role for cell sustainability. One mechanism for this regulation process is the decoy function of lncRNA PANDAR, sequestering the transcription factor subunit NF-YA of its pro-apoptotic target genes 1. The analysis of direct binding of lncRNA PANDAR with purified NF-Y fragments revealed an interaction of PANDAR RNA with the NF-YA subunit and the NF-Y trimeric complex, pointing towards a binding of PANDAR to NF-YA in region that is not involved in subunits association. The analysis of RNA binding motif of NF-YA by PAR-CLIP identified the genomic annotated sequence C(T/A)G(A/T) as a possible RNA-binding motif. However, the following mutational studies revealed that NF-YA binds to wildtype and mutated PANDAR RNA fragments in a sequence-independent manner. It is possible that the sequence specificity of the NF-YA PAR-CLIP analyzed RNA binding motive could be mediated by other regulatory mechanisms like RNA secondary structure, posttranslational protein modifications or additional involved NF-YA domains of the full length protein. For identifying novel PANDAR binding proteins, PNAs directed against PANDAR RNA were synthesized, tested and used for a PNA-based SILAC experiment. Further validation steps of mass
spectrometrically analyzed data revealed an interaction of PANDAR RNA with the splicing-involved proteins SAFA, hnRNPUL1, U2AF65 and PTBP1. Furthermore, the effect of lncRNA PANDAR concerning the transcript variant BCL-XS was analyzed, with PTBP1 being involved in the initiation of BCL-XS alternative splicing 4. The overexpression of lncRNA PANDAR reduced the mRNA level of pro-apoptotic BCL-XS, while the simultaneous overexpression of PTBP1 was able to rescue this effect by normalizing BCL-XS mRNA to the initial level.
1. Hung T, Wang Y, Lin MF, et al. Nat. Genet. 2011;43(7):621-9. doi:10.1038/ng.848.
2. Ma P, Xu T, Huang M, Shu Y. Biomed. Pharmacother. 2016;78:172-176.
doi:10.1016/j.biopha.2016.01.025.
3. Peng W, Fan H. Biomed. Pharmacother. 2015;72:113-118. doi:10.1016/j.biopha.2015.04.014.
4. Bielli P, Bordi M, Di Biasio V, Sette C. Nucleic Acids Res. 2014;42(19):12070-12081.
doi:10.1093/nar/gku922
Dihydroartemisinin ist ein Hypoxie-aktives Antitumormittel, welches den zytotoxischen Effekt einer Strahlentherapie verbessern kann
No full textThe microenvironment of solid tumors is mostly characterized by regions of acute and chronic hypoxia which are known to decrease sensitivity of tumor cell to classical chemotherapy and radiotherapy. Here is proposed a novel strategy to overcome therapy resistance of solid tumor cells under acute hypoxia and to increase the efficacy of radiotherapy by using the radical-forming endoperoxide Dihydroartemisinin (DHA) that is known as anti-malaria drug and has only recently been shown to have antineoplastic activity. Aim of the current study was to evaluate the antineoplastic activity of DHA under normoxic and hypoxic conditions, to elucidate the importance of the intrinsic apoptotic pathway for drug activity in both conditions, and to study its potential to improve the cytotoxic action of ionizing radiation.
The cytotoxic effects of DHA were evaluated in colon cancer cells (HCT15, Colo205 and HCT116) and Jurkat T-lymphoma cells using short term and long term assays. For combined treatment, ionizing radiation was applied 10 minutes after DHA treatment.
In normoxia, DHA efficiently induced concentration- and time-dependent apoptosis in Jurkat and colon cancer cells. The cells were also sensitive to DHA-induced apoptosis in hypoxia. Combination treatment with XRT increased clonogenic death in HCT116 cells.
All together findings of the current work suggest that DHA may be a good candidate for the treatment of hypoxic human tumors characterized by apoptosis resistance and for combined treatment with ionizing radiation.Das Mikromilieu solider Tumore ist häufig durch Areale akuter und chronischer Hypoxie gekennzeichnet, welche die Sensitivität von Tumorzellen gegenüber klassischer Chemo- und Radiotherapie verringern. In der vorliegenden Arbeit sollte eine neuartige Strategie untersucht werden, um einer Therapieresistenz solider Tumorzellen bei akuter Hypoxie entgegen zu wirken. Aus früheren Arbeiten ist bekannt, dass das in der Malaria-Prophylaxe verwendete radikalbildende Endoperoxid Dihydroartemisinin (DHA) antineoplastische Aktivität zeigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nun untersucht, welchen antineoplastischen Effekt DHA in Normoxie bzw. Hypoxie zeigt, welche Bedeutung dem intrinsischen Apoptoseweg für die zytotoxische Wirksamkeit von DHA zu kommt und welches Potential DHA besitzt, um die Zytotoxizität durch ionisierende Strahlung (XRT) zu verbessern.
Um dies zu untersuchen, wurde die zytotoxische Wirksamkeit von DHA in Kurzzeit-Assays und Langzeit-Assays in Kolonkrebszelllinien (HCT15, Colo205 und HCT116) und Jurkat T-Lymphomzellen betrachtet. Bei einer kombinierten Behandlung von DHA und XRT erfolgte die Bestrahlung 10 min nach DHA Gabe.
Unter normoxischen Bedingungen induzierte die Behandlung mit DHA eine konzentrations- und zeitabhängige Apoptose in Jurkat- und Kolonkrebszellen. Des Weiteren waren die Zellen unter hypoxischen Bedingungen sensitiv gegenüber der DHA-induzierten Apoptose. Eine kombinierte Behandlung von HCT116 mit XRT und DHA führte in Normoxie zu einem verstärkten klonogenen Tod.
Insgesamt zeigt die Arbeit, dass DHA ein potentieller Kandidat für die Behandlung hypoxischer Tumore alleine und in Kombination mit Bestrahlung ist
Role of Bcl-2 protein family members and associated mitochondrial factors in hypoxia-mediated resistance of tumor cells to apoptosis and radiotherapy
No full textHypoxia, a characteristic of most human solid tumors, is a major obstacle to successful radiotherapy. Aim of this PhD study was to define the role of the Bcl 2 protein family in radioresistance conferred by exposure to acute and adaptation to cycling hypoxia and to evaluate whether pharmacologic targeting of the Bcl 2 rheostat improves sensitivity of hypoxic and hypoxia adapted cancer cells to the cytotoxic action of radiotherapy.
The results demonstrated that exposure to acute and adaptation to cycling hypoxia (represented by hypoxia selected NCI H460 cell model) alters the balance of Bcl 2 family proteins in favor of anti apoptotic family members, thereby elevating the apoptotic threshold and attenuating the success of radiotherapy. It was further shown that blocking anti apoptotic Bcl 2 family members by the clinically relevant BH3 mimetic ABT 263 enhanced the sensitivity of HCT116 colon cancer and NCI H460 lung cancer cells to the cytotoxic action of ionizing radiation. Importantly, this effect was not only observed in normoxia, but to a similar or even higher extent in severe hypoxia. ABT 263 furthermore enhanced the response of xenograft tumors of non selected and hypoxia selected NCI H460 cells to radiotherapy, thereby confirming the beneficial effect of combined treatment in vivo. Targeting the Bcl 2 rheostat with ABT 263 therefore is a particularly promising approach to overcome radioresistance of hypoxic and hypoxia adapted cancer cells. Moreover, intrinsic as well as ABT-263- and irradiation induced regulation of Bcl 2 family members was found to determine therapy sensitivity. In this context, Mcl 1 was identified as a resistance factor that interfered with apoptosis induction by ABT 263, ionizing radiation, and combinatorial administration.
Finally, hypoxia selected NCI H460 cells were characterized by an elevated capability to enhance mitochondrial respiration, which depended on fusion protein Opa1. This represents an additional mechanism of adaptation to adverse hypoxic conditions that might be relevant for improved survival and therapy resistance of cancer cells adapted to cycling hypoxia.
Collectively, the findings of the present PhD thesis provide novel insights into the molecular determinants of hypoxia mediated resistance to apoptosis and radiotherapy and a rationale for future therapies of hypoxic and hypoxia adapted tumor cell fractions
Radiation-induced pneumonitis and fibrosis - Defining the role of immune cells and regulatory molecules
No full textRadiation-induced pneumonitis and fibrosis still constitute a major complication in the treatment of patients with thorax-associated neoplasms. To date, the molecular mechanisms governing the onset and progression of these injuries are not entirely understood and no effective therapies are available. Aim of the present study was to gain more insight into the pathogenesis of radiation-induced pneumonitis and fibrosis, with the ultimate goal to provide a molecular basis for the development of novel and effective strategies for prevention or treatment of these pathologies. At this purpose, investigations on immune cells and on immunomodulatory molecules have been performed in vivo in a C57BL/6 mouse model of whole thorax irradiation with 15 Gray (Gy).
In the present work, a novel immunoregulatory molecule was identified as a key mediator of radiation-induced fibrosis, in that mice deficient in this molecule showed no or minimal fibrosis at 30 weeks post irradiation (p.i.), while wild type (WT) mice showed extensive collagen deposition, and fibrotic areas positive for α-SMA and TGF-β at this time point. Thus, lack of this molecule seems to exert a radioprotective effect. Of note, the progression to a more pronounced fibrosis in WT mice was associated with altered expression of this molecule on immune cells during the pneumonitic phase, and with early and late changes in the composition and phenotype of immune cells, both locally and systemically. Thus, endogenous presence or absence of this immunoregulatory molecule results in distinct responses within the lung tissue, determining the progression and the final outcome of radiation-induced side effects. Remarkably, complete absence of mature B and T cells led to an increased sensitivity to radiation-induced fibrosis.
This model provided evidence for a direct involvement of the immune system in the pathogenesis of lung radiation-induced pneumopathy. Regulation of the immune system during lung responses to ionizing radiation might therefore represent a good target for future treatments
The role of Protein Kinase B (Akt) in the cellular response to ionizing radiation
No full textTumorassoziierte Mutationen in Proteinen des PI3K/Akt-Signalweges, einschließlich Mutationen von Akt1, können in einer Hyperaktvierung dieser Überlebenskinase resultieren, die häufig mit einer Resistenz gegenüber genotoxischen Therapien verbunden ist. Anhand der in dieser Arbeit durchgeführten COSMIC-Datenbankanalyse wurde das Auftreten von Mutationen in Akt1 und anderen PI3K-Signalwegskomponenten in verschiedenen Tumortypen bestätigt und auch eine der Literatur entsprechende Verteilung gefunden. Insbesondere bestätigten diese Analysen frühere Beobachtungen zur klinischen Relevanz der Aminosäuresubstitution in Akt1 von Glutaminsäure (Position 17) zu einem Lysin (E17K) in Brust-, Blasen-, Lungen-, Prostata- und kolorektalem Krebs.
Dies macht Akt zu einem wichtigen therapeutischen Angriffspunkt in der Tumortherapie. Obwohl in den letzten Jahren viele Fortschritte zum Verständnis der Regulation und Funktionalität von Akt gewonnen wurden, ist dessen Rolle für die Strahlensensitivität und der Reparatur strahleninduzierter DNA-Schäden unzureichend verstanden. Ziel dieser Arbeit war daher die Ergründung der Effekte von Akt1 auf die zelluläre Strahlenantwort.
Hierzu wurden murine Prostatakarzinomzellen und murine embryonale Fibroblasten mit Überexpression verschiedener Akt1-eGFP-Fusionsproteine generiert, die sich in ihrer PIP3-Bindeeigenschaft und Aktivität unterschieden. Mit Hilfe dieser Zellen konnte gezeigt werden, dass die aktivierungsassoziierten Akt1-E17K und myrAkt1-Varianten mit verstärkter Lokalisation an der Zytoplasmamembran eine verstärkte Zellproliferation aufweisen. Akt1-defiziente MEFs zeigten nach Überexpression von Akt1-E17K ein verstärktes Tumorwachstum in vivo, was auf eine transformierende Aktivität dieser klinisch relevanten Akt-Veränderung hindeutet.
In Kurzzeit- und Langzeitexperimenten zum Zellüberleben nach Bestrahlung zeigten die membranaktivierte Akt1-E17K Mutation und die Phosphorylierungs-imitierende Akt1-TDSD eine erhöhte Resistenz gegen ionisierende Strahlung, während myrAkt1 Zellen durch eine erhöhte Radiosensitivität charakterisiert waren. Untersuchungen zur Kinetik der DNA-Reparatur mittels γ-H2.AX-Assay sowie einem direkten DNA-Schaden-Assay nach Bestrahlung, zeigten eine verlangsamte Reparatur strahlungsinduzierter DNA-Schäden in den myrAkt1-exprimierende Zellen, wogegen die Mutationen TDSD und E17K die Reparatur im zeitlichen Verlauf zwischen 2 - 4 h beschleunigten. Dies deutete darauf hin, dass eine direkte Beschleunigung der DNA-Reparatur zur erhöhten Radioresistenz von Akt1-E17K- und Akt1-TDSD-überexprimierenden Zellen beiträgt.
Interessanterweise zeigten Lokalisationsstudien, dass myrAkt1 an Membranstrukturen akkumuliert und weder vor noch nach Bestrahlung in den Zellkern transloziert. Akt1-E17K
zeigte eine ausgeprägte Membran-Lokalisation; nach Bestrahlung war aber eine vermehrte Kerntranslokation zu beobachten. Akt1-TDSD hingegen zeigte keine verstärkte Membranbindung, sondern war durchgehend zu einem hohen Anteil im Kern zu finden. Der Zusammenhang von erhöhter Kernlokalisation und Radioresistenz lässt vermuten, dass die Anwesenheit von aktivem Akt1 im Nukleus für eine Veränderung der Radiosensitivität notwendig ist. Tatsächlich konnten die Radioresistenz-fördernden Effekte von Akt1-E17K und Akt1-TDSD sowohl durch Vorbehandlung mit einem allosterischen (MK-2206) als auch mit einem kompetitiven Akt-Inhibitor (GDC0068) gehemmt werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass beide Inhibitoren auch den beschleunigenden Effekt dieser Akt1-Varianten auf die DNA-Reparatur antagonisieren. Dies ließ vermuten, dass die Radioresistenz-fördernden Effekte der aktivierungsassoziierten Akt1-Varianten durch Effekte auf die DNA-Reparatur bedingt waren.
Auch die Vorbehandlung mit dem DNA-PK-Inhibitor NU7441 hatte einen Verlust der positiven Wirkung von Akt1-E17K und Akt1-TDSD auf das Zellüberleben und die DNA-Reparatur nach einer Bestrahlung zur Folge. Dies wies auf eine Beteiligung von aktivem, im Kern lokalisierten Akt1 an dem DNA-PKcs-abhängigen DNA-Reparaturweg D-NHEJ hin. Um die Hierarchie der Phosphorylierung der Kinasen DNA-PKcs und Akt1 zu ergründen, wurde ein Kinase-Assay mit diesen beiden Proteinen etabliert. Dabei stellte sich heraus, dass Akt1 direkt durch DNA-PK am Serin 473 phosphoryliert werden kann. Allerdings gab es keine direkte Phosphorylierung von DNA-PK durch aktives Akt1. Diese Ergebnisse bestätigten die in silico Analysen zu Konsensussequenzen und deuten auf eine indirekte Beteiligung von Akt1 bei der DNA-Reparatur mittels D-NHEJ hin. Beispielsweise ist ein Feedback-Mechanismus denkbar, in dem Akt1 nach strahleninduzierter DNA-Schädigung durch DNA-PKcs aktiviert wird und daraufhin potenziell an der DNA-Reparatur-beteiligte Proteine phosphoryliert, um so die Dynamik der Reparatur zu beeinflussen. Darüber hinaus wird so eine Verbindung von Initiation der DNA-Reparatur, Zellzyklus-Arrest und Apoptose-Hemmung hergestellt.
Aus den erzielten Ergebnissen der vorliegenden Arbeit zur Radioresistenz-steigernden Wirkung von E17K kann geschlussfolgert werden, dass diese Mutation einen potentiellen Biomarker für erhöhte Resistenz gegenüber einer Bestrahlung und anderen DNA-schädigenden Therapien darstellt und die betroffenen Patienten somit von einer Intensivierung der genotoxischen Therapie oder einer Kombinationstherapie mit Akt-Inhibitoren profitieren könnten. Dies gilt analog für Patienten mit einer aberranten Erhöhung der Akt1-Aktivität als Folge einer Mutation in PIC3A oder PTEN.
Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden folgende Publikationen mit Teilergebnissen veröffentlicht:
1 Oeck S, Malewicz NM, Hurst S, Rudner J, Jendrossek V. The Focinator - a new open-source tool for high-throughput foci evaluation of DNA damage. Radiat Oncol 2015;10(163):015-0453.
2 Weisner J, Gontla R, van der Westhuizen L, Oeck S et al. Covalent-Allosteric Kinase Inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl 2015;54(35):10313-10316.Tumor-associated mutations of proteins of the PI3K/Akt pathway, including mutations of Akt1, may result in a hyper activation of this survival kinase. It can be associated with resistance to genotoxic therapies. A COSMIC database analysis, conducted in this project, highlights the incidence of mutations in Akt1 and other PI3K/Akt pathway components in various types of tumors. In particular, this analysis confirmed earlier observations on the clinical relevance of the amino acid substitution in Akt1 of glutamic acid (position 17) to a lysine (E17K) in breast, bladder, lung, prostate and colorectal cancer.
This makes Akt an important therapeutic target in tumor therapy. Progress has been made in understanding of regulation and functionality of Akt, but its role in radiosensitivity and repair of radiation-induced DNA damage is still poorly understood. The aim of this project was the exploration of effects of Akt1 in the cellular radiation response.
For these investigations murine prostate carcinoma cells and murine embryonic fibroblasts overexpressing different Akt1-eGFP fusion proteins, differing in their PIP3-binding property and activity, were generated. The activation-associated Akt1-E17K and myrAkt1 variants with enhanced localization to the cytoplasmic membrane had enhanced cell proliferation. Akt1-deficient MEFs overexpressing Akt1-E17K showed an enhanced tumor growth in vivo, suggesting a transforming activity of this clinically relevant Akt mutation.
In short- and long-term cell survival experiments after irradiation, the membrane-activated Akt1-E17K mutation and the phosphorylation-mimicking Akt1-TDSD had an increased resistance to ionizing radiation in contrast to myrAkt1 expressing cells with an increased radiosensitivity. DNA repair studies by γ-H2.AX assay, as well as direct DNA damage assay after irradiation presented a reduced repair of radiation-induced DNA damage in the myrAkt1-expressing cells. Though, the mutations TDSD and E17K had accelerated DNA repair between 2 and 4 hour. This indicated that an acceleration of DNA repair contributes to increased radioresistance of Akt1-E17K and Akt1-TDSD overexpressing cells.
Interestingly, localization studies revealed accumulation of myrAkt1 at membrane structures. It did not translocate before or after irradiation into the nucleus. Akt1-E17K showed increased membrane localization after irradiation. However, an increased nuclear translocation was observed. In contrast, Akt1-TDSD showed no enhanced membrane binding, but was found in a high proportion in the nucleus. The relationship between increased nuclear localization and radioresistance suggests that the presence of active Akt1 in the nucleus is necessary for a change in radiosensitivity. In fact, radioresistance-promoting effects of Akt1-E17K and Akt1-TDSD were inhibited by pretreatment with an allosteric (MK-2206) as well as a competitive Akt inhibitor (GDC0068). Both inhibitors antagonized the accelerating effect on the kinetics
of DNA repair of these Akt variants expressing cells. These results that the radioresistance-promoting effects of activation associated Akt1 variants are based on direct effects on DNA repair.
Likewise the pretreatment with the DNA-PK inhibitor NU7441 resulted in a loss of the positive effect of Akt1-E17K and Akt1-TDSD on cell survival and DNA repair after a radiation exposure. The participation of active, nucleus localized Akt1 on the DNA-PKcs-dependent DNA repair pathway D-NHEJ. To explore the hierarchy of phosphorylation of the kinases DNA-PKcs and Akt1, a kinase assay was established. It was found that Akt1 can be phosphorylated directly by DNA-PKcs at serine 473. However, there was no direct phosphorylation of DNA-PKcs via active Akt1. These results confirmed the in silico analysis of consensus sequences and suggest an indirect interaction of Akt1 in the DNA repair by D-NHEJ. For example, a feedback mechanism is conceivable, that is activated after radiation-induced DNA damage by Akt1’s phosphorylation via DNA-PKcs. Activated Akt1 could potentially phosphorylate DNA repair-involved proteins in order to influence the dynamics of repair. In addition, as a compound of initiation of DNA repair, cell cycle arrest and apoptosis inhibition is initiated.
Concluding from these results E17K mutation is a potential biomarker for increased resistance to radiation and other DNA-damaging therapies. Patients with tumors carrying this mutation could benefit from Akt inhibitors in combination with genotoxic therapy. Patients with aberrant increased Akt activity as a result of a mutation in PTEN or PIC3A could also profit from this combination therapy
Optimization of radiation therapy by targeted modulation of apoptosis signaling pathways
No full textStrahlentherapie ist ein wesentlicher Bestandteil kurativer Behandlungsverfahren in der Therapie maligner Tumore. Allerdings zeigen einige Tumore (wie das Glioblastom) ein schlechtes Ansprechen auf Bestrahlung. Ursache hierfür sind u.a. Mutationen in Apoptose- und Überlebenssignalwegen, die während der Tumorentwicklung entstanden sind und zur Therapie-Resistenz der Tumorzellen beitragen können. Da die Induktion der Apoptose zur zytotoxischen Wirksamkeit der Bestrahlung beiträgt eröffnen Behandlungsansätze mit Substanzen, die direkt auf die gestörten Signalwege einwirken, die Möglichkeit die Strahlenresistenz zu überwinden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war daher zum einen, die Effizienz einer kombinierten Behandlung aus Bestrahlung und den membrangerichteten Alkylphosphocholinen ErPC bzw. ErPC3 in schwer therapierbaren malignen Gliomen zu beurteilen. Des weiteren sollte der molekulare Mechanismus der erhöhten Zytotoxizität nach kombinierter Behandlung im Gliomzell- sowie im Jurkat-Lymphomzellmodell analysiert werden.
Außerdem sollten weitere Details zum Wirkmechanismus der Kombinationsbehandlung aus Bestrahlung und Stimulation des Zelltodrezeptorwegs im Jurkat-Modell untersucht werden. Dazu wurden der native Ligand TRAIL bzw. der gegen den TRAIL-Rezeptor 2 gerichtete agonistische Antikörper ETR-2 eingesetzt.
Abschließend sollte an Jurkatzellen getestet werden, ob eine Dreifachkombination aus Bestrahlung, ErPC3 und TRAIL einen zusätzlichen Benefit zur Doppelbehandlung in der Therapie von Tumorzellen erzielen kann.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl ErPC als auch ErPC3 die Sensitivität maligner Gliomzellen (T98G, A172, U87MG) gegenüber strahleninduzierter Apoptose steigern. Dabei ergaben sich je nach eingesetzter Strahlendosis bzw. ErPC/ErPC3-Konzentration sub-additive bis synergistische Kombinationseffekte. Die sehr gute Kombinationswirkung für T98G konnte auch im klinisch relevanten Koloniebildungstest durch effiziente Reduktion der Koloniebildung bestätigt werden.
Untersuchungen zum Zelltod nach kombinierter Behandlung enthüllten die Apoptose als wichtigen zytotoxischen Mechanismus, einhergehend mit Caspasen-Aktivierung und PARP-Spaltung. Dabei war der mitochondriale Zelltodweg entscheidend für die Apoptose-Induktion. In Jurkat Zellen kam ein zusätzlicher Verstärkerloop über retrograde Spaltung von Caspase 8 und Bid zum tragen.
Als pro-apoptotische Effekte am Mitochondrium wurde in Glioblastomzellen eine zunehmende Aktivierung von Bax und eine Hochregulation von pro-apoptotischen BH3-only Proteinen beobachtet. Parallel dazu wurde PKB/Akt oberhalb des Mitochondriums durch Dephosphorylierung inaktiviert. Über die verminderte Phosphorylierung wurde die Aktivität des Transkriptionsfaktors FKHRL1 entsprechend erhöht, der u.a. die Transkription von Bim, Puma und Noxa induziert. Im Lymphomzellmodell verlangsamte die Überexpression von Bcl-2 die Effizienz der Behandlung, während das Fehlen von Bax und Bak zur vollständigen Blockade des Effekts führte. Hier scheint die Abnahme an anti-apoptotischem Mcl-1 für die pro-apoptotische Wirkung im Jurkat-Modell essentiell zu sein.
In T98G konnte nach Kombinationsbehandlung aus Bestrahlung und ErPC3 über vermehrte -H2AX-Foci-Bildung eine verstärkte Induktion von Strahlenschäden aufgezeigt werden. Die Persistenz der Foci nach 24h spricht für irreparable Schäden an der DNA und somit für einen Beitrag von DNA-Schaden-vermittelter Apoptose am Gesamtzelltod.
Des weiteren wurde das Zellzyklusprotein Rb durch aktivierte Caspasen abgebaut, wodurch seine hemmende Wirkung auf den Transkriptionsfaktor E2F1 entfällt. Dadurch könnten weitere apoptosefördernde Mechanismen in Gang gesetzt werden, die den mitochondrialen Zelltodweg unterstützen.
Die Kombination aus Bestrahlung und TRAIL bzw. ETR-2 war sowohl in Bak-positiven als auch in Bak-negativen JCAM ein effizienter Auslöser von Apoptose. Trotz Abhängigkeit der strahleninduzierten Apoptose vom Vorhandensein des mitochondrialen Zelltodwegs war die Kombination aus Bestrahlung und Stimulation mit TRAIL bzw. ETR-2 in Bak-negativen Zellen nicht weniger effizient als in Bak-positiven. Damit sind mit diesen Kombinations-behandlungen optimale Voraussetzungen geschaffen, um Tumore mit schweren Defekten im mitochondrialen Zelltodweg effektiv in die Apoptose zu treiben.
Die Dreifachbehandlung aus Bestrahlung, TRAIL und ErPC3 zeigte im getesteten Jurkat-Modell ausgezeichnete Kombinationswirkungen: Trotz starker Dosisreduktion von TRAIL und ErPC3 im Vergleich zur Zweifachkombination wurde bereits 12 h nach Dreifachbehandlung über 90% Apoptose nachgewiesen.
Die in vitro erhobenen Daten zeugen von vielversprechenden Kombinationen aus Bestrahlung mit ErPC/ErPC3, Bestrahlung mit TRAIL/ETR-2 oder der Dreifachkombination aller getesteten Stimuli und machen sie zu aussichtsreichen und hoffnungsvollen Ansätzen bei der Therapie maligner Gliome und anderer solider Tumore mit ausgeprägter Resistenz gegenüber Bestrahlung und Chemotherapie.Radiotherapy is an integral part of curative treatment concepts in the therapy of malignant glioma. However, some tumors (like glioblastoma) show high intrinsic resistance to radiotherapy. This can be caused by mutations in apoptosis and survival signaling pathways that raised during tumor development resulting to apoptosis resistance of tumor cells. Since induction of cell death including apoptosis conributes to the cytotoxic action of ionizing radiation, new treatment concepts targeting defective signaling pathways may be siuted to overcome treatment resistance.
The aim of the present study was to evaluate the efficacy of combined treatment with ionizing radiation and the membrane targeted alkylphosphocholines ErPC and ErPC3 in highly resistant glioma cell lines. Moreover the molecular mechanism of increased cytotoxicity of combined treatment should be analyzed in glioma- and Jurkat-lymphoma cell-models. Besides, further details of the molecular mechanism after treatment with ionizing radiation and stimulation of cell death receptor pathway should be determined. For that purpose the native ligand TRAIL that acts via TRAIL receptor 1 and 2 as well as the activating agonistic antibody ETR-2 against TRAIL receptor 2 were used. Finally it should be determined in Jurkat cells whether triple combination of ionizing radiation, ErPC3 and TRAIL results in a further benefit compared to duplex combinations.
In the present study ErPC and ErPC3 increased the sensitivity of malignant glioma cell lines (T98G, A172, U87MG) towards radiation-induced apoptosis. Dependent on radiation dose and used concentration of ErPC additive to synergistic combination effects could be observed. The excellent combination effect in T98G cells was further confirmed by efficient reduction of colonies in clinically relevant clonogenic survival assay.
Investigations about cell death after combined treatment revealed apoptosis as important cytotoxic mechanism characterized by activation of caspases and PARP-cleavage.
The mitochondrial cell death pathway was critical for induction of apoptosis in both cell types. In Jurkat cells an additional feedback loop via caspase 8 and Bid could be demonstrated. In glioblastoma pro-apoptotic effects on mitochondria involved increased activation of Bax as well as upregulation of pro-apoptotic BH3-only proteins. In parallel PKB/Akt was inactivating dephosphorylated upstream of the mitochondrion. Decreased phosphorylation of PBK/Akt resulted in increased activity of the transcription factor FKHRL1 which is responsible amongst others for the induction of Puma and Noxa.
Overexpression of Bcl-2 decreased the efficacy of combined treatment in the Jurkat-lymphoma-model while deficiency of Bax and Bak resulted in a complete abrogation of the effect.
Moreover the decrease of anti-apoptotic Mcl-1 seemed to be essential for the pro-apoptotic action in the Jurkat-model.
In T98G an increased induction of radiation damage after combined treatment (ionizing radiation plus ErPC3) was identified by formation of -H2AX-foci. The persistence of these foci after 24h pointed to irreparable damaged DNA and therefore refers to a contribution of DNA-damage induced apoptosis on total cell death.
In addition the cell cycle protein Rb was degraded by activated caspases which may abolish the inhibiting influence on the transcription factor E2F1. Thus, further apoptosis-promoting mechanisms could be implemented that support the mitochondrial cell death pathway.
Combined treatment with ionizing radiation and TRAIL or ETR-2 efficiently induced apoptosis in Bak-positive as well as in Bak-negative JCAM cells. Despite dependence of radiation-induced apoptosis by an intact mitochondrial cell death pathway combined treatment (ionizing radiation plus TRAIL or ETR-2) was not less efficient in Bak-negative than in Bak-positive JCAM. Therefore these combined treatment settings are an optimal prerequisite to force tumor cells with severe defects in mitochondrial cell death execution effectively into apoptosis.
The triple treatment with ionizing radiation, TRAIL and ErPC3 showed excellent efficacy in the Jurkat-model: Despite strong dose reduction of TRAIL and ErPC3 compared to duplex treatments more than 90% apoptosis was observed already 12h after triple treatment.
The in vitro results attest antineoplastic activity of radiation and ErPC/ErPC3, radiation and TRAIL or ETR-2 as well as triple treatment making these combined treatment settings promising new approaches for therapy of malignant glioma or other tumors highly resistant towards radiation or chemotherapy
Die Rolle von strahleninduzierten Immunveränderungen für die Normalgewebstoxizität mit einem Fokus auf dem CD73/Adenosin Signalweg und Makrophagen
No full textRadiotherapy (RT) is besides surgery and chemotherapy one standard treatment option for patients suffering from neoplasms in the thoracic room, e.g. lung cancer, breast cancer or head and neck cancer. Due to high normal tissue toxicity of the lung pneumonitis and lung fibrosis are dose-limiting side effects of any RT within the thoracic room, thereby increasing the risk of local relapses and loss of tumor control. Up to now no curative therapies are available to prevent or treat those life-threatening diseases, thus there is a high need to investigate mechanisms that reduce normal tissue toxicity after irradiation. It has been reported that the infiltration of various immune cells is a common feature of radiation-induced pneumonitis and fibrosis. For other fibrotic diseases of the lung e.g. idiopathic pulmonary fibrosis a contribution of CD73 and adenosine on disease progression was reported. Therefore, the present project aimed to give new insights into the contribution of different immune cells to radiation-induced pneumopathy and a potential impact of CD73 and adenosine on disease progression.
To study radiation-induced pneumopathy a murine model was used. C57BL/6 wildtype and CD73 knockout (CD73-/-) mice were irradiated with a single high dose of 15 Gy over their whole thorax to study radiation-induced pneumonitis and fibrosis. Thorax irradiation of C57BL/6 mice altered the composition of T cell populations locally and systemically (cervical lymph nodes and spleen). In the lung irradiation led at 3 weeks to increased levels of regulatory T cells (Treg). At six and twelve weeks upon irradiation (pneumonitic phase) an influx of CD3+ T cells was observed. In addition to an increased CD73 expression on T cells, CD73 expression and activity was also upregulated on other immune cells and non-leukocytes in the irradiated lung. Moreover, elevated levels of Treg were found during the fibrotic phase. The upregulation of CD73 was paralleled by progressively accumulating levels of extracellular adenosine. CD73 deficient mice failed to accumulate adenosine in the bronchoalveolar lavage fluid and exhibited significantly less radiation-induced lung fibrosis. Furthermore, treatment of wild-type mice with pegylated adenosine deaminase (PEG-ADA) or CD73 antibodies also significantly reduced radiation-induced lung fibrosis. The development of radiation-induced pulmonary fibrosis in WT mice was accompanied by the accumulation of macrophages within organized clusters expressing pro-fibrotic marker proteins. Interestingly, in CD73-/- mice no organized macrophage clusters and no upregulation of anti-inflammatory markers on macrophages was observed during the fibrotic phase. Furthermore, CD73-/- mice showed a differential expression of members of the hyaluronic system.
Taken together the data reveal important roles in disease development for Treg during the early and late phases upon RT as well as for macrophages that accumulate in organized clusters and express anti-inflammatory markers during the fibrotic phase. Importantly the loss of CD73 was associated with reduced levels of adenosine, reduced fibrosis development and accumulation of anti-inflammatory macrophages in organized clusters. While targeting CD73/adenosine provides new treatment possibilities to reduce radiation-induced lung toxicity, the extent of macrophage impact still needs further investigations.Strahlentherapie ist neben chirurgischen Eingriffen und Chemotherapie eine der Standardbehandlungsmethoden für Patienten, die an Krebserkrankungen im Brustbereich leiden. Dazu gehören beispielsweise Lungen-, Brust- und Kopf-Hals-Krebs. Aufgrund hoher Normalgewebstoxizität der Lungen stellen sich Pneumonitis und Lungenfibrose als dosislimitierende Nebenwirkungen der Strahlentherapie im Brustbereich dar. Dadurch erhöht sich das Risiko von lokalen Rezidiven und dem Verlust der Tumorkontrolle. Da es bisher keine kurativen Therapien zur Vorbeugung oder Behandlung dieser lebensbedrohlichen Folgeerkrankungen gibt, besteht ein großes Interesse an der Erforschung von Mechanismen, die die Normalgewebstoxizität durch Bestrahlung reduzieren können. Es ist bekannt, dass strahleninduzierte Pneumonitis und Fibrose mit der Einwanderung von verschiedenen Immunzellen einhergehen. In anderen fibrotischen Erkrankungen der Lunge wie z.B. der idiopatischen Lungenfibrose wurde eine Beteiligung von CD73 und Adenosin in der Krankheitsentwicklung nachgewiesen. Deshalb setzte sich das vorliegende Projekt zum Ziel neue Einblicke in die Beteiligung verschiedener Immunzellen zur Entstehung strahleninduzierter Lungenerkrankungen zu liefern, sowie den möglichen Einfluss von CD73 und Adenosin auf den Krankheitsverlauf zu untersuchen.
Zur Untersuchung strahleninduzierter Lungenerkrankungen wurde ein murines Model verwendet. C57BL/6 Wildtyp und CD73 Knockout (CD73-/-) Mäuse wurden dazu mit einer einmaligen hohen Bestrahlungsdosis von 15 Gy über ihrem gesamten Thorax bestrahlt, um anschließend strahleninduzierte Pneumonitis und Fibrose untersuchen zu können. Die Thoraxbestrahlung von C57BL/6 Mäusen veränderte die Zusammensetzung der T-Zellpopulationen sowohl lokal als auch systemisch (zervikale Lymphknoten und Milz). In der Lunge führte die Bestrahlung zu einer Erhöhung der Anteile an regulatorischen T-Zellen (Treg) 3 Wochen nach Bestrahlung. Ein Einstrom von CD3+ T-Zellen wurde sechs und zwölf Wochen nach der Strahlenbehandlung (pneumonitische Phase) beobachtet. Die Expression und Aktivität von CD73 in bestrahlten Lungen, war nicht nur auf T-Zellen zu beobachten, sondern auch auf weiteren Immunzellen und Zellen, die nicht zu den Leukozyten gehören, erhöht. Darüber hinaus wurden erhöhte Anteile von Treg auch in der fibrotischen Phase nachgewiesen. Die Hochregulierung von CD73 ging einher mit einer zunehmenden Akkumulation von extrazellulärem Adenosin. In bestrahlten CD73-/- Mäusen hingegen war kein erhöhtes Adenosin sichtbar, welches anhand einer Lungenwaschung (BALF) gemessen wurde.Zudem entwickelten die Tiere eine signifikant verminderte strahleninduzierte Fibrose. Darüber hinaus konnte die Behandlung von Wildtyp Mäusen mit pegylierter Adenosindeaminase (PEG-ADA) oder einem CD73 Antikörper ebenso zu einer signifikant verminderten Lungenfibrose führen. Die Entwicklung einer strahleninduzierten Lungenfibrose ging einher mit der Akkumulation von Makrophagen in organisierten Verbänden, sowie der Expression von pro-fibrotischen Markerproteinen. Interessanterweise wurden in CD73-/- Mäusen keine organisierten Verbände von Makrophagen gefunden. Ferner wurde keine Hochregulierung von anti-inflammatorischen Markerproteinen beobachtet. Darüber hinaus zeigten CD73-/- Mäuse eine veränderte Expression von Proteinen des Hyaluronsäure-System.
Zusammenfassend deuten die Ergebnisse auf entscheidende Beiträge zur Krankheitsentstehung von Treg, während der frühen und späten Phase nach Strahlentherapie, und für Makrophagen, die sich in in der fibrotischen Phase in organisierten Verbänden akkumulieren und anti-inflammatorische Marker exprimieren, hin. Der Verlust von CD73 führte zu verminderten Adenosin Leveln, verminderter Fibroseentwicklung und Akkumulation von anti-inflammatorischen Makrophagen in organisierten Verbänden. Durch gezieltes Behandeln von CD73/Adenosin ergeben sich neue Behandlungsmöglichkeiten zur Reduzierung strahleninduzierter Normalgewebstoxizität. Das Ausmaß des Beitrags von Makrophagen zur strahleninduzierten Lungenfibrose bedarf allerdings weiterer Untersuchungen
Impact of vascular remodeling on the development and regression of tissue fibrosis
No full textFibrosis is a pathological process with limited therapeutic options that can occur in almost every tissue or organ of the body. Among others, pulmonary fibrosis and liver fibrosis are two increasingly important fibrotic diseases worldwide. Both are characterized by an increased accumulation of myofibroblasts and an excessive deposition of matrix proteins, mostly collagen. These processes lead to scar formation and the destruction of the organ. Furthermore lung and liver fibrosis are associated with an extensive remodeling of the blood and the lymphatic vasculature, though the impact of vascular remodeling on the development and regression of tissue fibrosis is still a matter of debate.
Numerous Papers deal with the role of hemangiogenesis in pulmonary fibrosis, yet the role of the lymphatic vasculature in the pathogenesis of pulmonary fibrosis remains to be elucidated. In a murine model of pulmonary fibrosis we show that lymphatics exhibit ectopic mural cell coverage. Lymphatic endothelial cells in fibrotic lungs showed an increased expression of platelet-derived growth factor B (PDGF-B), which led to the recruitment of platelet-derived growth factor receptor-β (PDGFR-β)-expressing mural cells. This abnormal lymphatic vascular pattern in fibrotic lungs caused impaired lymphatic drainage and led to a perilymphatic accumulation of fibrogenic molecules. The pharmacological inhibition of the PDGF-B/PDGFR-β-signaling at the onset of mural cell recruitment prevented mural cell recruitment to lymphatics and restored the transport capacity of the lymphatic vessels.
The second part of this thesis investigates the impact of vascular remodeling on liver fibrosis. To date there is no clear evidence whether angiogenesis is a pro- or antifibrotic mediator in liver fibrosis. Furthermore, although liver fibrosis is known to be reversible, the role of hemangiogenesis in the regression of liver fibrosis has not been studied yet. Macrophages are a major source of VEGF-A (VEGF), the most important angiogenic transcription factor. To address the question how hemangiogenesis is affected by macrophage-derived VEGF in liver fibrosis and to determine its impact on the regression of liver fibrosis, we used a murine knockout model for myeloid cell-derived VEGF. We were able to show that myeloid cell-derived VEGF is a major VEGF-source during the resolution of liver fibrosis. Mice that lack myeloid cell-derived VEGF were not able to resolve liver fibrosis. VEGF-deficient mice showed lower expression and activity of matrix metalloproteinases (MMP) and liver sinusoids failed to migrate into fibrotic areas. The reintroduction of myeloid cell-derived VEGF prior to the recovery phase by means of bone marrow transplantation led to an increase in MMP-expression and -activity and resulted in increased collagen degradation. Hence liver sinusoids entered perisinusoidal and pericentral fibrotic areas and supported the regression of the liver fibrosis
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