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Pilot in vivo toxicological investigation of boron nitride nanotubes
No full textBoron nitride nanotubes (BNNTs) have attracted huge attention in many different research fields thanks to their outstanding chemical and physical properties. During recent years, our group has pioneered the use of BNNTs for biomedical applications, first of all assessing their in vitro cytocompatibility on many different cell lines. At this point, in vivo investigations are necessary before proceeding toward realistic developments of the proposed applications. In this communication, we report a pilot toxicological study of BNNTs in rabbits. Animals were injected with a 1 mg/kg BNNT solution and blood tests were performed up to 72 hours after injection. The analyses aimed at evaluating any acute alteration of hematic parameters that could represent evidence of functional impairment in blood, liver, and kidneys. Even if preliminary, the data are highly promising, as they showed no adverse effects on all the evaluated parameters, and therefore suggest the possibility of the realistic application of BNNTs in the biomedical fiel
Assembly of multi-domain proteins with experimental constraints from atomic force microscopy
No full textUn des principaux défis du domaine de la biologie structurale est l'obtention d'informations à haute résolution sur les grandes macromolécules biologiques. En raison de leurs tailles et de leurs flexibilités, les techniques traditionnelles de biologie structurales sont souvent impuissantes. Une des techniques prometteuses est la microscopie à force atomique (AFM). Contrairement à la microscopie optique, l'AFM utilise une sonde mécanique de très faible taille (<10 nm) pour obtenir des informations topographiques sur du matériel biologique isolé et déposé sur des surfaces ultras plates. L'objectif du travail de thèse est de développer les outils informatiques pour permettre la modélisation de grandes macromolécules au niveau atomique tout en intégrant des contraintes topologiques obtenues par l'imagerie AFM. À partir d'images AFM de hauteur, à haute résolution, un protocole d'assemblage de domaines protéiques a été mis au point. Il utilise une recherche exhaustive dans l'espace tridimensionnel réel de toutes les orientations possibles des domaines de la macromolécule à modéliser qui respectent les contours imposés par l'image AFM. Un jeu de contraintes de distance entre chacun des domaines permet un premier tri des modèles candidats. Un classement final est attribué à chaque modèle selon un score appelé EFactor, estimateur de la ressemblance entre la surface topographique expérimentale et celle du modèle. Le protocole a été validé sur le système modèle que sont les anticorps. Il a été également utilisé pour reconstruire une particule virale (virus de la mosaïque du tabac) et assembler la structure tétramérique de la protéine membranaire l'aquaporine Z.A major challenge in the field of structural biology is to obtain high-resolution information on the major biological macromolecules. Because of their size and their flexibility, the traditional techniques of structural biology are often powerless. One of the promising techniques is atomic force microscopy (AFM). Unlike optical microscopy, AFM uses a mechanical probe of very small size (<10 nm) to obtain topographical information on isolated biological material deposited on ultra flat surfaces. The aim of the thesis was to develop tools to enable the modeling of large macromolecules at the atomic level while incorporating topological constraints obtained by AFM imaging. Using high resolution AFM height images, a protocol for assembling protein domains has been developed. It uses an exhaustive search in real three-dimensional space of all possible orientations of the macromolecule's domains respecting the boundaries imposed by the AFM topographical image. A set of distance constraints between each of the domains allows an initial screening of candidate models. A final ranking is assigned to each model according to a score called EFactor, estimator of the similarity between the experimental topography and the model. The protocol was validated on model systems that are antibodies. It was also used to reconstruct a virus particle (tobacco mosaic virus) and assemble the tetrameric structure of the membrane protein aquaporin Z
Exploring root cell wall stiffness by nanoindentation in Arabidopsis thaliana under abiotic stress
No full textLes activités humaines provoquent un réchauffement de la planète et des changements climatiques qui affectent la santé des plantes entrainant une dégradation de la qualité du sol. Les racines des plantes sont les premières à détecter les changements dans la composition du sol et à réagir en conséquence. L'une des causes les plus courantes de la dégradation des sols est la carence en phosphate et la nature acide du sol, qui entraînent la solubilisation des métaux, ce qui a pour conséquence l'inhibition de la croissance des racines et la diminution de la production agricole.Le phénomène d'inhibition de la croissance des racines est largement étudié en présence de Fe et Al. Cependant, les aspects mécaniques impliqués dans l'inhibition de la croissance des racines en présence de métaux sont peu connus. Notre travail vise à quantifier le changement de la réponse nanomécanique des racines de plantes vivantes en présence de métaux. En particulier, nous nous intéressons à la relation entre le phénotype d'arrêt de la croissance des racines et un changement de la rigidité de la paroi cellulaire primaire externe de la zone de transition de la racine d'Arabidopsis thaliana.Dans ce travail de recherche, nous avons établi un protocole expérimental robuste pour mesurer la paroi cellulaire primaire externe d'Arabidopsis en utilisant des expériences de nanoindentation avec la microscopie à force atomique (AFM). Les courbes force-distance sont le résultat d'expériences de nanoindentation verticale par un levier AFM. Un modèle mécanique basé sur le contact (Sneddon pour une pointe AFM axisymétrique) a été appliqué pour extraire le module élastique (module d’Young) des courbes force-distance.Une partie importante de ce travail s'est concentrée sur l'obtention d'un protocole robuste qui permet d’analyser l’impact du fer ou de l'aluminium à différentes concentrations, la rigidité de la racine de la plante et la croissance de la racine de la plante. Dans nos conditions expérimentales, les résultats ont révélé qu'à une faible concentration de Fe et d'Al ( 10 µM), aucun effet sur la croissance et la rigidité des racines n'a été observé. Cependant, à des concentrations élevées (>10 µM et 20 µM) de Fe ou d'Al, des valeurs de rigidité plus élevées sont observées, mais sans arrêt détectable de la croissance racinaire. De manière surprenante, lorsque les deux métaux (Fe et Al) sont combinés à 10 µM chacun, une grande rigidité de la paroi cellulaire est observée en même temps qu'un arrêt total de la croissance des racines. Le changement majeur dans le phénotype observé lorsque l'Al est présent avec le Fe suggère que le malate pourrait être impliqué dans l'effet observé. Nous avons donc mesuré le changement de rigidité chez un mutant d'Arabidopsis (almt1) déficient dans l'exsudation du malate. Dans les mêmes conditions expérimentales que le type sauvage (10 µM), la présence combinée de Fe et d'Al n'a pas modifié la rigidité de la paroi cellulaire et aucune inhibition de la croissance des racines n'a été observée.Toutes ces observations nous ont permis de présenter un modèle spéculatif dans lequel le changement de rigidité de la paroi cellulaire primaire externe a une double origine. Premièrement, en présence d'une quantité suffisante de Fe ou Al (10-20 µM), l'accumulation de Fe3+ et Al3+ hautement chargés se lie à la pectine chargée négativement. Cette liaison induit une modification de la rigidité de la pectine. Deuxièmement, en présence de Fe et d'Al, l'exsudation de malate causée par la présence d'Al augmente l'accumulation de Fe3+ dans l'apoplaste, qui à son tour active une réponse redox, telle que les espèces réactives de l'oxygène qui déclenche un arrêt de la croissance de la racine, avec une augmentation de la rigidité de la paroi cellulaire. Ces résultats sont également étayés par une modification de la déformabilité de la paroi cellulaire, déterminée par la théorie trimécanique récemment développéeLife on earth would not be possible without plants. Human activities have resulted in Global warming with climate change affecting the plant health. Use of excessive fertilizers and insecticides leads to degradation of soil quality. Plant roots are the first one to detect changes in soil composition and react accordingly. One of the most common causes of soil degradation is phosphate deficiency and acidic nature of the soil, causing metal solubilization, resulting in root growth inhibition and decrease in crop production.The phenomenon of root growth inhibition is widely studied in the presence of iron and aluminum. However, little is known about the mechanics involved in root growth inhibition in presence of metals. Our work aims at quantifying the change of the nanomechanical response of living plant roots in presence of metals. In particular, we are interested in the relationship between the root growth arrest phenotype and a possible change in the stiffness of the external primary cell wall of the transition zone of Arabidopsis thaliana root.In this research work, we established a robust experimental protocol to measure the external primary cell wall of Arabidopsis using nanoindentation experiments with atomic force microscopy (AFM). Force-distance curves are the output of vertical nanoindentation experiments by an AFM cantilever. A contact-based mechanical model (Sneddon for axisymmetric AFM tip) was applied to extract the elastic modulus (Young’s modulus) from force-distance curves.A significant part of this work focused on obtaining a robust protocol that introduces minimum impact from external factors such as root growth, root immobilization, or root nanoindentation. With this protocol, we analyzed iron or aluminum stress at different concentrations, plant root stiffness, and plant root growth. In our experimental conditions, results revealed that in a low concentration of iron and aluminum ( 10 µM), no effect on the root growth and on the stiffness was observed. However, at high concentration (> 10 µM and 20 µM) of Fe or Al, higher stiffness values are observed, but without a detectable root growth arrest. Root growth arrest is determined by measuring the length of plant roots. Surprisingly, when both the metals (Fe and Al) are combined at 10 µM each, a large cell wall stiffness is observed concomitantly with a total root growth arrest. The major change in the observed phenotype when Al is present with Fe suggested that malate could be involved in the observed effect. Thus, we measured the stiffness change in Arabidopsis mutant (almt1) deficient in malate exudation. In the same experimental conditions as wild type, the combined presence of Fe and Al did not alter the cell wall stiffness and no root growth inhibition was observed.All these observations helped us to present a speculative model where the change in stiffness of the external primary cell wall has a double origin. First, in presence of sufficient individual metals (10-20 µM), the accumulation of highly charged Fe3+ and Al3+ bind to negatively charged pectin. Such a binding induces a change in pectin stiffness. Second, in the presence of both Fe and Al, the exudation of malate caused by the presence of Al increases the accumulation of Fe3+ in the apoplast, which in turn activate a redox-couple response, such as reactive oxygen species, that triggers a root growth arrest, with an increase in cell wall stiffness. These results are also supported by a change in cell wall deformability as determined by the recently developed trimechanic theory
On stabilization of a neutral aromatic ligand by π–cation interactions in monoclonal antibodies
No full textInternational audienceIt has been shown that anti-PAH mAb can bind a particular cross-reactant by adopting two distinct "red" and "blue" conformations of its binding sites [N.M. Grubor et al. PNAS 102, 2005, 7453-7458]. In the case of red conformation of pyrene (Py)/anti-PAH mAb (with a broad fluorescence (0,0)-band with fwhm ~140 cm(-1)), the central role in complex formation was played by π-π interactions. The nature of the blue-shifted conformation with very narrow fluorescence (0,0)-band (fwhm ~75 cm(-1)) was left unclear due to the lack of suitable data for comparison. In this work, we suggest spectroscopic and modeling results obtained for the blue conformation of Py in several mAb (including 4D5 mAb) are consistent with π-cation interactions, underscoring the importance of π-cation interaction in ligand binding and stabilization in agreement with earlier modeling studies [J-L. Pellequer, et al. J. Mol. Biol. 302, 2000, 691-699]. We propose considerable narrowing of the fluorescence origin band of ligand in the protein environment could be regarded as a simple indicator of π-cation interactions. Since 4D5 mAb forms only the blue-shifted conformation, while anti-PAH and 8E11 mAbs form both blue- and red-shifted conformations, we suggest mAb interactions, with Py molecules lacking H-bonding functionality, may induce distinct conformations of mAb binding sites that allow binding by π-π and/or π-cation interactions
Pilot in vivo toxicological investigation of boron nitride nanotubes
No full textGianni Ciofani1, Serena Danti2, Giada Graziana Genchi1,3, Delfo D&#39;Alessandro2, Jean-Luc Pellequer4, Micha&euml;l Odorico4, Virgilio Mattoli1, Mario Giorgi51Italian Institute of Technology, Center of MicroBioRobotics co Scuola Superiore Sant&#39;Anna, 2Department of Neuroscience, University of Pisa, 3The BioRobotics Institute, Scuola Superiore Sant&#39;Anna, Pisa, Italy; 4Commissariat &agrave; l&#39;Energie Atomique, Institut de Biologie Environnementale et Biotechnologie, Department of Biochemistry and Nuclear Toxicology, Bagnols-sur-C&egrave;ze, France; 5Division of Pharmacology and Toxicology, Veterinary Clinics Department, University of Pisa, Pisa, ItalyAbstract: Boron nitride nanotubes (BNNTs) have attracted huge attention in many different research fields thanks to their outstanding chemical and physical properties. During recent years, our group has pioneered the use of BNNTs for biomedical applications, first of all assessing their in vitro cytocompatibility on many different cell lines. At this point, in vivo investigations are necessary before proceeding toward realistic developments of the proposed applications. In this communication, we report a pilot toxicological study of BNNTs in rabbits. Animals were injected with a 1 mg/kg BNNT solution and blood tests were performed up to 72 hours after injection. The analyses aimed at evaluating any acute alteration of hematic parameters that could represent evidence of functional impairment in blood, liver, and kidneys. Even if preliminary, the data are highly promising, as they showed no adverse effects on all the evaluated parameters, and therefore suggest the possibility of the realistic application of BNNTs in the biomedical field.Keywords: boron nitride nanotubes, in vivo testing, toxicolog
Perspectives Toward an Integrative Structural Biology Pipeline With Atomic Force Microscopy Topographic Images
No full textInternational audienceAfter the recent double revolutions in structural biology, which include the use of direct detectors for cryo-electron microscopy resulting in a significant improvement in the expected resolution of large macromolecule structures, and the advent of AlphaFold which allows for near-accurate prediction of any protein structures, the field of structural biology is now pursuing more ambitious targets, including several MDa assemblies. But complex target systems cannot be tackled using a single biophysical technique. The field of integrative structural biology has emerged as a global solution. The aim is to integrate data from multiple complementary techniques to produce a final three-dimensional model that cannot be obtained from any single technique. The absence of atomic force microscopy data from integrative structural biology platforms is not necessarily due to its nm resolution, as opposed to Å resolution for x-ray crystallography, nuclear magnetic resonance, or electron microscopy. Rather a significant issue was that the AFM topographic data lacked interpretability. Fortunately, with the introduction of the AFM-Assembly pipeline and other similar tools, it is now possible to integrate AFM topographic data into integrative modeling platforms. The advantages of single molecule techniques, such as AFM, include the ability to confirm experimentally any assembled molecular models or to produce alternative conformations that mimic the inherent flexibility of large proteins or complexes. The review begins with a brief overview of the historical developments of AFM data in structural biology, followed by an examination of the strengths and limitations of AFM imaging, which have hindered its integration into modern modeling platforms. This review discusses the correction and improvement of AFM topographic images, as well as the principles behind the AFM-Assembly pipeline. It also presents and discusses a series of challenges that need to be addressed in order to improve the incorporation of AFM data into integrative modeling platform. | Integrative Structural BiologyThe study of molecular recognition has followed the second and third precepts of Descartes [1], also known as the reductionism approach. This approach assumes that understanding the three-dimensional (3D) structures of biological macromolecules and complexes is a prerequisite for comprehending their assembly and subsequent function. Over the past 30 years, high-resolution molecular structures obtained through x-ray diffraction or nuclear magnetic resonance (NMR) techniques have provided a detailed understanding of the molecular mechanisms of these macromolecules [2]. However, these techniques have mostly been successful in studying small, globular, and soluble molecules. Despite the successes achieved in the study of some large assemblies, such as nucleosomes, ribosomes, or viruses, significant challenges remain when attempting to investigate membrane proteins, large multivalent machineries, or large highly flexible</div
Modélisation moléculaire par homologie des protéines : ses applications en Biologie et en Bioinformatique
No full textMes activités de recherche se focalisent sur l’étude structurale de la fonction des protéines tant au point de vue expérimental que théorique et plus particulièrement l’aspect de la reconnaissance intermoléculaire. Notre système de référence est celui de la reconnaissance antigène-anticorps. Ce système est le prototype parfait, de part sa fonction, mais également grâce à la dynamique de ce processus lié au concept de maturation. Aucours de ma thèse de doctorat, nous avons mesuré les constantes d’affinité, à l’équilibre et en cinétique, entre des anticorps monoclonaux et un antigène multivalent (virus de la mosaïque du tabac, VMT). De manière inattendue, nos résultats ont démontré une coopérativité négative dans la liaison d’anticorps au VMT. A partir de mon premier stage postdoctoral et jusqu’à aujourd’hui, ma recherche s’est orientée vers l’aspect structuralde la reconnaissance ; incluant le développement de fonctions énergétiques et de techniques d’analyse des structures tridimensionnelles, la construction de modèles moléculaires et l’assemblage de ligand dans leur recepteur.Ce mémoire résume mes cinq dernières années d’activités scientifiques dans le domaine de la modélisation moléculaire, bien que la parution de publications ne reflète guère ce laps de temps. La modélisation moléculaire est une discipline récente qui nécessite, à mon sens, une introduction formelle. Dans ce mémoire on définit la modélisation moléculaire comme l’ensemble des techniques qui permettent d’étudier la fonction d’unemolécule grâce à la connaissance de sa structure tridimensionnelle. Ces techniques incluent la modélisation par homologie, les méthodes de simulations, les méthodes d’assemblage (docking), les méthodes d’étude du repliement ab-initio des protéines. Les approches spectroscopiques comme la résonance magnétique nucléaire (RMN) ou le dichroisme circulaire et la microscopie électronique (ME) sont également inclues. Au sens littéral notre définition intègre également la diffraction des rayons X (RX).L’objectif de ce mémoire est de décrire en détail une de ces techniques : la modélisation par homologie. Ce mémoire focalise principalement sur les protéines bien que la modélisation moléculaire s’applique aussi bien aux acides nucléiques, aux sucres ou aux lipides. En dépit de la jeunesse de cette discipline, il est pratiquement impossible de la couvrir en son intégralité. Malgré une recherche bibliographique approfondie, elle est certainement incomplète due à l’interdisciplinarité de cette technique qui couvre tous les champs de recherches, de la théorie fondamentale à la médecine. Ce mémoire espère présenter l’impact de la modélisation par homologie dans la biologie moderne de la manière la plus juste.Ce mémoire comprend quatre parties. Après une introduction générale, on présentera en détail les diverses approches employées pour la modélisation par homologie. Les contributions personnelles à cette discipline seront enfin exposées. La perspective d’évolution de la modélisation moléculaire sera finalement brièvement discutée
Synthesis of new self-assembled monolayers with functional organosilanes capable of auto-association by H-bonds
No full textIl existe une très forte demande en biocapteurs pour la détection d’agents pathogènes dans le domaine environnemental et médical. Dans ce contexte, le contrôle de l’état de surface des biocapteurs joue un rôle crucial. Les monocouches auto-assemblées (Self-Assembled Monolayers, SAMs) permettent de fonctionnaliser de manière homogène et reproductible ces surfaces. Ces SAMs sont généralement obtenues à partir d’agents de couplage siliciés à longue chaîne alkyle. Mais, ces composés sont souvent difficiles à synthétiser et à purifier en raison de leurs faibles solubilités dans les solvants organiques. C’est pour cela que nous avons proposé d’introduire une fonction polaire (amide ou urée) au sein de ces films. Ces fonctions permettent également un auto-assemblage des molécules sur le substrat au moyen de liaisons hydrogène entre les molécules. Les nouvelles monocouches fonctionnelles ont été caractérisées entre autres par spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption par modulation de polarisation (PM-IRRAS) ce qui a permis d’identifier les différents groupes moléculaires. Ces monocouches ont aussi montré leurs capacités à immobiliser une molécule biologique (Protéine A).There is an increasing demand for biosensors to detect pathogens in environmental and medical fields. In this context, the control of the surface properties plays an important role. Self-Assembled Monolayers (SAMs) allow to functionalize these surfaces homogeneously and reproducible. SAMs on silicon based surfaces are usually obtained from silylated coupling agents with long alkyl chain. However, these compounds are often difficult to purify owing to their low solubility in organic solvents. That’s why we proposed to introduce a polar function (amide or urea) in the molecular structure. These precursors were also capable of association by H-bonds and offer possibilities to control the organic assembly on the surfaces. The new functional monolayers were characterized by Polarization Modulation Infrared Reflection Adsorption Spectroscopy (PM-IRRAS) and others techniques such as XPS and contact angle in order to identify the different molecular groups on the surface. These functionalized monolayers have also shown their ability to immobilize biomolecules (Protein A)
Marc van Regenmortel, personal recollections on a forward‐thinking editor
No full textInternational audienceAbstract Marc van Regenmortel was the Editor‐in‐Chief of the Journal of Molecular Recognition for the last 25 years. Without attempting to summarize Marc's exceptional career and achievements, we would like to tell the story of the tortuous and contingent path to the unravelling of a key molecular recognition process in antigenicity. Life is indeed full of contingencies and scientific life, full of meetings and random encounters, is prone to contingencies, a key element in discovery and innovation
BEPITOPE: predicting the location of continuous epitopes and patterns in proteins
No full textInternational audienceIn growing need of obtaining highly specific monoclonal antibodies against novel proteins, we developed new functions implemented in the program BEPITOPE to predict continuous protein epitopes. This program not only can compute, combine, display and print prediction profiles, but also provides a list of suggested linear peptides to be synthesized. Novel facilities incorporated in BEPITOPE include the treatment of a whole genome, the search for a user-defined pattern, and the combination of prediction to pattern profiles. This latter approach is useful to remove unwanted predictions such as those including glycosylation sites
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