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Entwicklung von multivalenten Sonden zur gezielten Analyse und Beeinflussung Ras-abhängiger Signalwege
No full textDie kleine GTPase Ras ist ein zentrales Element bei der Regulation vieler zellulärer Prozesse. Ras ist über Lipidanker in Membranen eingebettet und wird intrazellulär durch das Zusammenspiel von GEF und GAP aktiviert bzw. deaktiviert. Aktiviertes, d.h. GTP-beladenes Ras rekrutiert diverse Effektorproteine über deren Ras-bindende Domäne (RBD) an die Membran, wo diese Proteine aktiviert werden und dann die biologischen Aktivitäten von Ras vermitteln. Aufgrund seiner initialen Rolle bei der zellulären Transformation und Tumorigenese wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um die Funktionalität von Ras zu unterdrücken, und um insbesondere der transformierenden Wirkung infolge einer deregulierten Ras-Aktivität entgegenzuwirken. Dabei zielen bisherige Ansätze vorwiegend auf die Suppression der Expression oder der Prozessierung des Proteins ab. In dieser Arbeit wird die Etablierung eines neuartigen Ansatzes beschrieben, der es erlaubt die Aktivität des vollständig prozessierten, reifen Ras-Proteins zu modulieren. Hierfür wurden RBD des Ras-Effektors Raf-1 zu Oligomeren aus zwei bzw. drei Domänen verknüpft. Um die Variabilität dieser Konstrukte zu erhöhen, wurden Oligomere bestehend aus der wildtypischen oder mutierten RBD, die eine abgeschwächte Affinität gegenüber Ras-GTP aufweisen, entwickelt. Diese Konstrukte werden zusammenfassend als multivalent scavengers of oncogenic Ras(MSOR) bezeichnet. Durch in vitroVersuche mit rekombinant hergestellten MSOR konnte gezeigt werden, dass die mutierten Varianten eine geringere Affinität für aktives Ras besitzen als die wildtypischen. Diese Versuche demonstrieren aber vor allem, dass die Stärke der Bindung an Ras-GTP mit der Zahl der jeweils miteinander verknüpften Bindedomänen zunimmt, wodurch die Interaktion stabilisiert wird. Die Wechselwirkung von MSOR und Ras ließ sich auch in vivo durch Expression fluoreszenzmarkierter Varianten (eGFP-MSOR) demonstrieren. Durch ektopische Expression verschiedener Ras-Varianten in Cos-7 Zellen konnte die GTP-spezifische Interaktion der eGFP-MSOR mit verschiedenen Mitgliedern der Ras-Subfamilie einschließlich der Ras-Isoformen nachgewiesen werden. Die Modulation der Ras-Aktivität durch MSOR wurde nach Koexpression von MSOR und Ras in verschiedenen Zelllinien durch die Analyse ausgewählter Ras-vermittelter zellulärer Prozesse studiert. Es wurde gezeigt, dass das wildtypische trimere MSOR-Konstrukt (eGFP-WT-3) die Ras(G12V)-vermittelte ERK2-Phosphorylierung und MMP1-Genexpression deutlich supprimieren kann. In Übereinstimmung mit der blockierenden Wirkung der MSOR konnte auch die Invasivität sowie das substratunabhängige Wachstum im Soft-Agar mit eGFP-WT-3 unterdrückt werden. Die Befunde korrelieren mit der Fähigkeit dieses MSOR, einerseits die Ras(G12V)-vermittelte Genexpression matrix-degradierender Enzyme wie Cathepsin L oder uPA aufzuheben und andererseits die Expression pro-apoptotischer Faktoren zu fördern. In diesem Zusammenhang wurde zudem beobachtet, dass die Expression oligomerer wildtypischer MSOR in Cos-7 Zellen zur Apoptose dieser Zellen führt. Die Wirksamkeit der MSOR in den Transformationsassays verdeutlicht deren inhibitorisches Potential gegenüber Ras-vermittelten Effekten. Viele der publizierten Untersuchungen zur Visualisierung der Ras-Aktivität erfolgten ausschließlich unter Bedingungen der Ras-Überexpression. Dies führt jedoch zu unphysiologischen Effekten, weshalb die Inzidenz einiger Befunde für die in vivoSituation fraglich ist. Ein besonders wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist der Nachweis, dass MSOR aufgrund ihrer effektiven Bindung an Ras-GTP auch als Reporter endogener Ras-Aktivität eingesetzt werden können. Nach Expression von eGFP-R59A,N64D-3 konnte die EGF- und TPA-induzierte Aktivierung des endogenen Ras anhand der Translokation des Reporters mittels konfokaler Mikroskopie in Echtzeit verfolgt werden. Das endogene Ras wird nach Stimulation nahezu ausschließlich an der Plasmamembran aktiviert. Die in der Literatur postulierte stimulus-abhängige Aktivierung von heterolog exprimiertem Ras im perinuklären Bereich, respektive Golgi-Apparat oder in Endosomen konnte hingegen nicht beobachtet werden. Da eGFP-R59A,N64D-3 ein sensitiver Detektor für endogenes Ras ist, belegt dieses Ergebnis die unterschiedliche räumliche Aktivierung von endogenem gegenüber überexprimiertem Ras. Die entwickelten MSOR-Konstrukte bieten ein Spektrum neuartiger Moleküle, mit denen sich zum einen die Ras-Aktivierung in vivo verfolgen lässt, die anderseits aber auch wirksam mit Ras-spezifischen Effekten interferieren können. Durch den modularen Aufbau der Konstrukte aus einzelnen Domänen, deren Affinität für Ras-GTP variiert werden kann, wird eine zielorientierte Anwendung der MSOR möglich
Breast Cancer Stem Cells: Eradication by Differentiation Therapy?
No full textDuring metastasis, migrating breast cancer stem cells undergo a loss of polarity leading to an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). Gupta et al. (2009) use this attribute of cancer stem cells to develop a high-throughput screen, which successfully identifies small molecules that specifically inhibit cancer stem cell proliferation through the induction of differentiation
Receptor-mediated endocytosis of transferrin-polycation conjugates. An efficient way to introduce DNA into hematopoietic cells.
No full textMost current gene transfer methods function satisfactorily in specialized systems involving established cell lines but are often not applicable with nonadherent, primary hematopoietic cells, which are notoriously difficult to transfect. To approach this problem, we have investigated an alternative method of gene transfer, "transferrinfection," in which DNA complexed to transferrin-polycation conjugates is introduced into cells by receptor-mediated endocytosis [Wagner, E., Zenke, M., Cotten, M., Beug, H. & Birnstiel, M. L. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414]. We show here that transferrin-polylysine and transferrin-protamine, when complexed to plasmid DNA containing a luciferase reporter gene, is efficiently bound and moved into avian erythroblasts by endocytosis. Successful transfer and expression of the luciferase reporter gene depends on specific interaction of the transferrin-polylysine-DNA complex with the transferrin receptor and occurs in a significant fraction (greater than 95%) of the cells. Gene transfer efficiency by transferrinfection is lower than with an optimized DEAE-dextran transfection method but reaches similar efficiencies when the cells are treated with chloroquine. Because the procedure in the absence of chloroquine is completely nontoxic to cells, a constant expression level of transferred genes may be maintained by repeated additions of transferrin-polylysine-DNA complex. In addition, the usefulness of transferrinfection for gene transfer into primary hematopoietic cells is demonstrated
Identification of a form of the avian erythroblastosis virus erb-B gene product at the cell surface
No full textControl of erythropoiesis by erythropoietin and stem cell factor: a novel role for Bruton's tyrosine kinase
No full textErythropoietin (Epo) and stem cell factor (SCF) are essential factors in the control of survival, expansion and differentiation of erythroid progenitors. Upon activation, their receptors, the EpoR and c-Kit, initiate multiple signalling pathways that control many cellular processes. To control erythropoiesis, the strength, duration and specificity of signalling must be tightly controlled. Negative feed-back regulation is extensively studied, but positive feed-forward control is relatively little studied. The cytoplasmic tyrosine kinase Bruton's tyrosine kinase (Btk) was found to be phosphorylated by Jak2 in response to Epo and appeared to be required for fast and efficient phosphorylation of Epo-induced targets including the EpoR itself and downstream targets such as PLCgamma and Stat5. Erythroid progenitors deficient in Btk fail to undergo renewal divisions and differentiate instead at low, physiologic concentrations of Epo and SCF. In addition, Btk is phosphorylated by SCF, which causes association of Btk with TRAIL-receptor1. In absence of Btk, erythroid progenitors are hypersensitive to TRAIL. Thus, Btk modulates signalling in erythroid progenitors to enhance expansion of erythroid progenitors. The complexity of signalling by the EpoR/c-Kit signalosome and its control by Btk is discussed with respect to normal and aberrant erythropoiesi
Transferrin-polycation-mediated introduction of DNA into human leukemic cells. Stimulation by agents that affect the survival of transfected DNA or modulate transferrin receptor levels.
No full textWe have subverted a receptor-mediated endocytosis event to transport genes into human leukemic cells. By coupling the natural iron-delivery protein transferrin to the DNA-binding polycations polylysine or protamine, we have created protein conjugates that bind nucleic acids and carry them into the cell during the normal transferrin cycle [Wagner, E., Zenke, M., Cotten, M., Beug, H. & Birnstiel, M. L. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414]. We demonstrate here that this procedure is useful for a human leukemic cell line. We enhanced the rate of gene delivery by (i) increasing the transferrin receptor density through treatment of the cells with the cell-permeable iron chelator desferrioxamine, (ii) interfering with the synthesis of heme with succinyl acetone treatment, or (iii) stimulating the degradation of heme with cobalt chloride treatment. Consistent with gene delivery as an endocytosis event, we show that the subsequent expression in K-562 cells of a gene included in the transported DNA depends upon the cellular presence of the lysosomotropic agent chloroquine. By contrast, monensin blocks "transferrinfection," as does incubation of the cells at 18 degrees C
TGFβ signaling is necessary for carcinoma cell invasiveness and metastasis
No full textAbstractBackground: Invasive growth of epithelial tumor cells, a major cause of death from cancer in humans, involves loss of epithelial polarity and dedifferentiation. Transforming growth factor β (TGFβ) is regarded as a major tumor suppressor during early tumor development because it inhibits cell-cycle progression and tumor growth. Many dedifferentiated, late-stage tumors are resistant to growth inhibition by TGFβ, however, and even secrete TGFβ. In line with this, TGFβ is involved in angiogenesis, wound healing and epithelial–mesenchymal transition (EMT) during development. Ha-Ras-transformed mammary epithelial cells (EpRas) undergo TGFβ-induced EMT maintained via a TGFβ autocrine loop. Thus, we have analyzed whether signal transduction by the TGFβ receptor (TGFβR) is required for local tumor cell invasion and metastasis.Results: A dominant-negative type II TGFβR (TGFβRII-dn) was expressed using retroviral vectors in EpRas cells and highly metastatic mesenchymal mouse colon carcinoma cells (CT26). In both cell types, TGFβRII-dn blocked TGFβR signaling and heavily delayed tumor formation. In EpRas cells, TGFβRII-dn prevented EMT. In the dedifferentiated mesenchymal CT26 cells, TGFβRII-dn caused mesenchymal-to-epithelial transition and inhibited their in vitro invasiveness in several assays. In addition, TGFβRII-dn completely abolished metastasis formation by CT26 cells. Furthermore, several human carcinoma lines lost in vitro invasiveness when treated with neutralizing TGFβ antibodies or soluble receptor variants. Finally, human colon carcinoma cells (hnPCC) expressing a mutated, non-functional TGFβRII were non-invasive in vitro, a defect restored by re-expressing wild-type TGFβRII.Conclusions: Cell-autonomous TGFβ signaling is required for both induction and maintenance of in vitro invasiveness and metastasis during late-stage tumorigenesis. TGFβRII therefore represents a potential target for therapeutical intervention in human tumorigenesis
Diverse cellular and molecular mechanisms contribute to epithelial plasticity and metastasis
No full textG1-CDK Activity Is Required for Both Proliferation and Viability of Myeloid/Erythroid Progenitors: A Critical Function of the v-Erba Oncoprotein
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