1,721,042 research outputs found
Basal expression of the Aspergillus fumigatus transcriptional activator CpcA is sufficient to support pulmonary aspergillosis
No full textAspergillosis is a disease determined by various factors that influence fungal growth and fitness. A conserved signal transduction cascade linking environmental stress to amino acid homeostasis is the Cross-Pathway Control (CPC) system that acts via phosphorylation of the translation initiation factor eIF2 by a sensor kinase to elevate expression of a transcription factor. Ingestion of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages does not trigger this stress response, suggesting that their phagosomal microenvironment is not deficient in amino acids. The cpcC gene encodes the CPC eIF2α kinase, and deletion mutants show increased sensitivity towards amino acid starvation. CpcC is specifically required for the CPC response but has limited influence on the amount of phosphorylated eIF2α. Strains deleted for the cpcC locus are not impaired in virulence in a murine model of pulmonary aspergillosis. Accordingly, basal expression of the Cross-Pathway Control transcriptional activator appears sufficient to support aspergillosis in this disease model. © 2008 Elsevier Inc. All rights reserved
Characterization of the diphtheria toxin-induced mortality in the transgenic CD11cDTR mouse model
No full textDie Untersuchung immunologischer Funktionen auf Zellebene erfolgt häufig über die Verwendung transgener Mauslinien, die es ermöglichen gezielt Zellsorten kurzzeitig oder dauerhaft zu eliminieren und ihren Einfluss dann bei bestimmten immunologischen Vorgängen zu untersuchen. Neben den konventionellen knock-out Mäusen gibt es die Möglichkeit Zellen über das Einbringen eines Primaten-Diphtherietoxinrezeptors, der sich durch eine höhere Affinität zum Diphtherietoxin (DTX) als der endogene Mausrezeptor auszeichnet, spezifisch zu entfernen. Dabei steht der exogene Rezeptor unter der Kontrolle eines zelltypspezifischen Promotors, wobei die Applikation des Toxins zum Zelltod der rezeptortragenden Zellen führt.
Eine dieser transgenen Mauslinien ist die CD11cDTR Maus, bei der CD11c positive Zellen, wie dendritische Zellen oder Alveolarmakrophagen, durch die Gabe von Diphtherietoxin depletiert werden können. Bei Untersuchungen zur Rolle der Alveolarmakrophagen während einer pulmonalen Infektion mit dem humanpathogenen Pilz Aspergillus fumigatus in diesem Modell fiel auf, dass allein die lokale Applikation des Toxins in die Lunge letal war. Durch weitere Versuche hierzu konnte gezeigt werden, dass die letale Wirkung weder durch eine Unterfunktion der Lunge, noch eine erhöhte Pilzlast in der Lunge zu erklären war. Vielmehr wurde demonstriert, dass es zu einer massiven Infiltration von Immunzellen in den Herzmuskel kam, wobei besonders Bereiche, die sich für die Reizweiterleitung verantwortlich zeigten, betroffen schienen. Diese Infiltration durch Leukozyten verursachte zusätzlich schwere Schäden im Herzgewebe und beeinflusste die Repolarisation der Ventrikel während der Erregungsleitung.
Zusammengenommen zeigten die Ergebnisse eine spontane, durch Diphtherietoxin induzierte Myokardinfiltration in diesem Modell, die neben schweren Schäden im Herzgewebe zum Tod der Tiere führte. Seit der Originalpublikation zu dieser Mauslinie, die bereits über 1000 Mal zitiert wurde, beobachteten etliche weitere Studien bei Nutzung dieses Modells, eine fehlende Monozytenpopulation im Zusammenhang mit einer Grunderkrankung, welche sie für eine erhöhte Mortalität verantwortlich machten. Unter Berücksichtigung der hier gewonnen Erkenntnisse müssen diese Publikationen ggf. kritisch betrachtet werden, da die Mortalität möglicherweise nicht im Zusammenhang mit der untersuchten Grunderkrankung stand, sondern durch die DTX Applikation ausgelöst wurde. Nichts desto trotz bietet dieses Mausmodell die Möglichkeit als induzierbares Modell für die Infiltration des Myokards zu dienen, wobei die Klärung der mechanistischen Hintergründe neue Erkenntnisse in Bezug auf Erkrankungen des Myokards liefern könnten.For the characterization of individual cell functions during immunological processes a standard approach is the employment of transgenic mice, which allow an induced depletion of the cell subset of interest. One model for such a conditional cell ablation uses diphtheria toxin (DTX). Animals express the primate diphtheria toxin receptor (DTR), which is characterized by a far stronger affinity to DTX than the murine DTR, under control of a cell type-specific promotor. A DTX challenge of these mice leads to an exclusive death of the primate DTR-expressing cells.
A frequently used murine DTR model is the CD11cDTR mouse in which CD11c positive cells, e.g. dendritic cells and macrophage subsets, can be depleted by administration of the toxin. This study employed the CD11cDTR mouse to deeply analyze the function of alveolar macrophages during pulmonary infection with the facultative human pathogenic mold Aspergillus fumigatus. To our surprise, a 100 % lethality could be induced in these mice by i.t. DTX treatment, even without an additional fungal infection. Further investigations revealed that this effect could be linked neither to a defect in pulmonary function nor to an inhibited fungal clearance from the lung. However, a massive cardiac infiltration with leukocytes was found. This infiltration was highly abundant in areas responsible for cardiac conduction and probably led to severe myocardial cell damage, which in turn affected the repolarization of the ventricles in the cardiac cycle.
Taken together these findings revealed a spontaneously induced myocardiac cell destruction after a single diphtheria toxin treatment, which ultimately led to the animal’s death. Among >1.000 citations referring to the original publication of the CD11cDTR mouse many studies have described elevated mortality rates as consequence of a missing monocytic cell population in a particular disease model. All these manuscripts are now put under suspicion, as the major cause of death was possibly the DTX induced myocarditis. Nevertheless, these mice also harbor the opportunity to serve as an animal model of inducible myocardial infiltration and by examination of the underlying mechanisms possibly a better understanding of the illness can be achieved
Verification and characterization of a closed circulatory system in murine long bones
No full textKnochen stellen ein hoch spezialisiertes Gewebe dar, welches die muskelvermittelte Fortbewegung des Lebewesens ermöglicht, dem Schutz von weichen Organen dient, eine Nische für immunologische Zellen bildet, so wie die Homöostase und den Metabolismus reguliert. Darüber hinaus erfolgt in ihrem Knochenmark ausgehend von hämatopoetischen Stammzellen, die in so genannten Knochenmarksnischen lokalisiert sind, die Hämatopoese, die Bildung von Blut- und Immunzellen. Da diese Nischen bisher lediglich eindeutig in Röhrenknochen nachgewiesen wurden, könnte ein funktioneller Unterschied zwischen Röhrenknochen und flachen Knochen vorliegen. Um die Mechanismen zu analysieren, die der Bildung, Interaktion und Rekrutierung von Immunzellen zu Grunde liegen, fokussiert sich diese Doktorarbeit daher ausschließlich auf Röhrenknochen.
Interessanterweise lagen zu Beginn dieser Doktorarbeit keine umfassenden und einheitlichen Modelle zum Blutgefäßsystem und dem geschlossenen Blutkreislauf in Röhrenkochen vor. Das Verständnis des geschlossenen Blutkreislaufs im Röhrenknochen ist aber essentiell, um die generelle Knochenbiologie sowie diverse immunologische Mechanismen, wie die Mobilisierung von Immunzellen aus dem Knochenmark in die Peripherie, zu begreifen. Zur Aufklärung des geschlossenen Blutkreislaufs im Röhrenknochen wurde daher im Rahmen dieser Doktorarbeit ein Verfahren zur Optimierung der optischen Durchlässigkeit entwickelt und patentiert, das auf einer Gewebedehydrierung mittels Ethanol und der Anpassung des refraktiven Indexes mittels Zimtsäureethylester (engl.: ethyl cinnamate, ECi) basiert. Dieses Verfahren ermöglichte die Visualisierung und Analyse von fluoreszent markierten Strukturen in ganzen Organen, weshalb ein zusätzliches Verfahren zur antikörper-basierten Färbung und Identifizierung von Endothelstrukturen etabliert wurde.
Diese Methoden wurden zunächst an weichen Organen getestet und etabliert, wobei sich die Niere aufgrund ihrer starken Vaskularisation als besonders geeignet ergab. Folglich wurden das Ethanol-ECi-Verfahren und die Antikörperfärbungen zur Visualisierung von Endothelschädigungen, die durch eine nephrotoxische Nephritis induziert wurden, in ganzen Nieren mittels der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie genutzt. In Kombination mit einem neu entwickelten Algorithmus konnten die entsprechenden Strukturen voll automatisiert quantifiziert werden, wobei die so generierten Daten im Rahmen einer separaten Studie publiziert wurden.
Das Ethanol-ECi-Verfahren wurde darauf folgend dazu genutzt, um Knochen in ihrer Gesamtheit untersuchen zu können, wozu die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie und für hochauflösende Detailaufnahmen die konfokale Laserrastermikroskopie sowie die Zwei-Photonen Laserrastermikroskopie verwendet wurden.
Die entsprechenden Analysen ermöglichten die erstmalige Aufklärung des geschlossenen Blutkreislaufs im murinen Röhrenknochen unter Berücksichtigung der Vaskularisation des kompakten Knochens. Überraschenderweise wurden dabei Blutgefäße identifiziert, die zuvor nicht in der Literatur beschrieben wurden. Diese verbinden die Vaskularisation des Knochenmarks durch den kompakten Knochen hindurch mit dem periostalen Gefäßnetzwerk, weshalb sie als trans-Kortikalgefäße (TKGs) bezeichnet wurden. Das entsprechende Gefäßsystem des kompakten Knochens wurde darüber hinaus bei verschiedenen knochenverändernden Erkrankungen wie der Osteoporose, der Osteopetrose und der rheumatoiden Arthritis untersucht. Hinsichtlich der Osteoporose und der Osteopetrose ergaben sich hoch signifikante Veränderungen der TKGs die mit der Knochendicke korrelierten. So wiesen die osteoporotischen Knochen mit einer geringen Knochendicke weniger Gefäße als die Kontrolltiere auf, während bei den osteopetrotischen Knochen mit einer erhöhten Knochendichte mehr Gefäße vorlagen. Und auch bei der rheumatoiden Arthritis zeigte sich über den chronischen Verlauf der Krankheit hinweg eine stete Zunahme der TKGs, die in der nahezu dreifachen Gefäßanzahl im Vergleich zu den Ausgangswerten resultierte.
Da mittels intravitaler Zwei-Photonen Laserrastermikroskopie gezeigt werden konnte, dass die TKGs zur Auswanderung von Immunzellen aus dem Knochenmark genutzt werden können, wurde mittels durchflusszytometrischer Analysen die Rekrutierung von Immunzellen, am Beispiel der G-CSF vermittelten Mobilisierung von neutrophilen Granulozyten aus dem Knochenmark in die generelle Blutzirkulation, untersucht. Entsprechend der Gefäßanzahlen im kompakten Knochen waren unterschiedlich starke Rekrutierungen nachzuweisen. Die erhöhte Zell-Rekrutierung bei hoher TKG-Anzahl und die niedrigere Rekrutierung bei geringer TKG-Anzahl lassen daher auf eine Korrelation der Gefäßanzahl und der Effektivität der Zellauswanderung aus dem Knochenmark schließen.
Neben den Analysen des murinen Systems wurden auch humane Knochen mittels fotographischer und 7-Tesla magnetresonanzmikroskopischer Aufnahmen untersucht. Dabei ließen sich Strukturen nachweisen, die starke Homologien zu den Blutgefäßen der murinen Röhrenknochen aufwiesen.
Insgesamt wurde durch die Etablierung eines Verfahrens zur Visualisierung und Analyse ganzer Knochen, so wie durch die Aufklärung des geschlossenen Blutkreislaufs im Röhrenknochen die Grundlage für umfassende Studien zu knochenassoziierten Fragestellungen ermöglicht. Neben der Aufklärung der strukturellen Gefäßorganisation können nun auch funktionelle Aspekte des Knochenmarks, Knochenerkrankungen sowie immunologische Mechanismen in diesem bisher nur schwer zugänglichen Organ untersucht werden.Bones represent a highly specialized tissue, which permits the movement and locomotion, protects the internal organs, forms a reservoir for immunologic cells, and regulates the homeostasis and metabolism. Furthermore, the hematopoiesis takes place within distinct stem cell niches in the bone marrow, where blood cells and immune cells are generated. Interestingly, so far these niches have only been clearly identified in long bones but not in flat bones, hinting at functional differences between these two types of bones. Therefore, this thesis is focusing on murine long bones for analyzing the mechanisms of immune cell formation, interactions and recruitment.
At the beginning of this project, only contrary concepts of the bone vascularization and the blood circulation in long bones were existing. Certainly, the knowledge about the blood circulation in long bones is essential for understanding general aspects of bone biology as well as complex immunologic mechanisms. For example, the process of im-mune cell mobilization from the bone marrow to peripheral sites cannot be explained without this knowledge. To identify the fully circulatory system of long bones, a method for optical clearing of soft and hard organs, based on tissue dehydration via Ethanol and the refractive index matching via Ethyl cinnamate (ECi) was established, published and patented within this thesis. This method allowed the visualization and analysis of fluorescently labeled structures in whole organs. Therefore, an additional approach for in vivo labeling of endothelial structures was established.
First, these methods were tested and established on soft organs, whereupon kidneys were extremely suitable as they are highly vascularized. Thus the Ethanol-ECi-method and the antibody-labeling of endothelial structures were used for visualizing endothelial damage in whole kidneys induced via nephrotoxic nephritis. For whole organ imaging, a light sheet fluorescence microscope (LSFM) was used, which allows imaging of samples up to two centimeters size. In combination with a newly generated algorithm, this method facilitated a fully automated quantification and characterization of glomerular tufts in whole kidneys. The regarding results were published in a separated study.
Subsequently, the LSFM was used to analyze ECi-cleared long bones and two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) was used for high resolution imaging. Based on the generated data, a closed vascular system in long bones was identified for the first time. Surprisingly, a completely new type of vessels, running through the compact bone connecting the endosteal vessels with the periosteal vessel network, could be visualized. Therefore, these newly identified structures were named transcortical vessels (TCVs).
In addition to the identification and characterization of a closed vessel network, the ef-fects of changes on bone formation to these structures were analyzed. Osteoporosis, a model for bone loss, and osteopetrosis, a model for increased bone mass, were investi-gated. Furthermore, the effects of acute and chronic rheumatoid arthritis on long bones were studied. The osteoporotic bones as well as the osteopetrotic bones showed highly significant changes in TCV numbers and their structure, which correlated with the bone mass. Thus, a lower bone mass was associated with decreased TCV numbers, while increased bone mass showed increased TCV numbers compared to healthy bones. In case of the rheumatoid arthritis, a constant increase in TCV numbers was observed during pathogenesis.
Furthermore, it was shown by intravital TPLSM, that the TCVs can be used for cell re-cruitment from the bone marrow to peripheral sites. Accordingly, the cell recruitment after stimulation via the granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) was analyzed by flow cytometric measurements. Interestingly, the percentages of recruited neutrophil granulocytes correlated with the TCV numbers at defined time points. In case of high TCV, numbers more cells were recruited compared to healthy control, while reduced TCV numbers resulted in reduced cell recruitment. This might hint at a correlation be-tween the vessel architecture of long bones and cell recruitment effectivity.
Beside the analysis of murine long bones, also human bones were analyzed by photography and 7Tesla magnetic resonance tomography imaging. Various structures were observed, which showed high homology to the murine structures.
The establishment of a new method for the visualization and analysis of whole bones as well as the identification of a closed vascular system in murine long bones provide a basis for a broad range of bone associated studies. In addition to the structural aspects of vessel organization, also functional aspects of the bone marrow, bone associated diseases and immunologic mechanisms can now be studied in this, so far, hardly accessible organ
Its influence upon the HGF reaction of A549 cells and upon a FRET-based RhoA activity biosenor
No full textDie kleine GTPase RhoA ist ein regulatorisches Protein mit zahlreichen Funktionen in der Organisation des Aktin-Cytoskeletts: Induktion von Stressfasern, Stabilisierung von Aktin-Filamenten sowie die Regulation von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakten sind bekannte Beispiele. Die Ausübung derart diverser Funktionen muss wiederum selbst zeitlich und örtlich präzise koordiniert werden. Dies ist möglich, da RhoA im GTP-gebundenen Zustand aktiv, im GDP-gebundenen Zustand jedoch inaktiv ist: RhoA wird durch zahlreiche Proteine reguliert, die seinen Nukleotid-Bindungszustand direkt verändern oder dies verhindern. Weitere Regulationsmechanismen für RhoA umfassen diverse kovalente Modifikationen, die seine Bindungsaffinitäten ändern oder es sogar für die proteasomale Degradation markieren.
In dieser Arbeit wurde die Rolle von RhoA in der HGF-induzierten Stimulation von A549-Zellen untersucht. Bewegungsanalysen von Lebendzellaufnahmen zeigten, dass sich weder die RNAi-vermittelte Depletion des RhoA-Inaktivators p190A, noch die von RhoA selbst deutlich auf die HGF-induzierte Bewegung der Zellen auswirken. Biochemische Analysen zeigten, dass RhoA selbst infolge der HGF-Stimulation so reguliert wird, dass die Menge aktiven RhoAs ansteigt, während gleichzeitig die Gesamt-Menge an RhoA sinkt. Die Beobachtung dieser gegensätzlichen Regulation bietet eine Grundlage für zukünftige Studien der bei der RhoA-Regulation wirkenden Kompensationsmechanismen.
Eine andere Fragestellung dieser Arbeit war, inwiefern die intrazelluläre Regulation von RhoA mit modernen, fluoreszenz-basierten Methoden zur Beobachtung der RhoA-Aktivität interferiert. Dies wurde am Beispiel eines genetisch codierten, FRET-basierten RhoA-Aktivitäts-Biosensors untersucht. Analysen zahlreicher Varianten des Biosensors mittels stimulierter Akzeptor-Emission, FLIM- und TIRF-Mikroskopie zeigten, dass das Signal des Biosensors nicht wie ursprünglich publiziert hauptsächlich durch variierende FRET-Effizienz in der Zelle und auch nicht unmittelbar durch den Nukleotid-Beladungszustand des Biosensors bestimmt wird. Stattdessen beeinflusst die Bindung des Biosensors an die Zellmembran seine Fluoreszenz. Die Ergebnisse legen auch nahe, dass der RhoA-Biosensor entgegen der bisherigen Annahmen nicht in vollem Umfang für die zellulären Regulationsmechanismen zugänglich ist. Insgesamt können die Ergebnisse dieser Arbeit für die Konstruktion und Verwendung von Rho-GTPase-Biosensoren von Nutzen sein: Sie liefern für zukünftige Studien konkrete Anregungen, welche möglichen intrazellulären Einflüsse auf die gemessenen Daten bedacht und überprüft werden sollten.The small GTPase RhoA is a regulatory protein with multiple functions concerning the organization of the cytoskeleton. These include induction of stress fibers, stabilization of actin filaments and regulation of cell-cell and cell-matrix contacts. With this diverse range of functions, RhoA itself needs to be precisely regulated in a spatio-temporal manner. This is achieved by the fact that RhoA is active when it is GTP-bound, while its GDP-bound form is inactive: There are a plethora of proteins either directly changing its nucleotide-bound state or preventing the change. Further regulatory mechanisms of RhoA include covalent modifications, which influence its affinity towards other proteins or the plasma membrane or even target it for proteasomal degradation.
Within the framework of this thesis the role of RhoA as well as its regulation in the context of HGF-mediated A549 lung cancer cell motility was investigated. Analysis of movement in time-lapse phase contrast movies showed that neither RNAi-mediated depletion of the RhoA-inactivator p190A nor of RhoA itself markedly influenced the movement of the cells in response to HGF. Biochemical analyses revealed bidirectional regulation of RhoA protein amount and activity levels: While the total amount of RhoA decreased upon stimulation with HGF, RhoA activity increased. This finding of simultaneous, yet oppositional regulation might inspire further research on the detailed mechanism of this process.
The second part of the study addressed the impact of intracellular RhoA regulation on the readout of fluorescent tools to studying RhoA activity. To this end, a genetically encoded, FRET-based RhoA activity biosensor was analyzed in the intracellular context. Stimulated emission, FLIM and TIRF microscopy experiments performed with various versions of the biosensor showed that its readout is not dependent on varying FRET efficiency as was originally published. Furthermore, the readout does not directly reflect the nucleotide binding state of the biosensor. Instead, binding of the biosensor to the plasma membrane influences its readout. Additional observations suggest that contrary to the prevalent assumption, the RhoA biosensor is less accessible to intracellular regulators than the endogenous RhoA protein. In summary, the findings presented here provide inspiration for the construction and application of Rho GTPase activity biosensors: Future approaches in this field can profit from this thesis by considering the possible influences of the cellular context on the biosensor and including appropriate control measurements
Influence of hypoxia inducible factor-1 in dendritic cells on the course of acute and chronic viral infections
No full textDer Transkriptionsfaktorkomplex Hypoxie-induzierbarer Faktor (HIF)-1 reguliert sowohl die zelluläre Anpassung an eine sauerstoffarme Umgebung als auch das Genexpressionsprofil von dendritischen Zellen (DC) und Makrophagen bei Entzündungsprozessen. Um den Einfluss einer HIF-1 Defizienz auf virale Infektionen zu untersuchen, wurden Kontrollmäuse und Mäuse mit einem konditionellen HIF-1α Knock-out in dendritischen Zellen mit dem murinen Friend Leukämievirus (FV) infiziert. In suszeptiblen Mäusen verursacht die FV Infektion eine Epo-unabhängige tödliche Erythroleukämie und Splenomegalie, resistente Mäuse wie unsere Versuchstiere hingegen reagieren auf eine akute FV Infektion mit einer starken Immunantwort, welche in eine persistierende Infektion übergeht.
Die akute FV Infektion führte zu keinen Unterschieden in den Milzgewichten und der Immunantwort bei Kontroll- und Knock-out-Mäusen, jedoch wiesen Tiere mit funktionellem dendritischem HIF 1α einen partiellen Verlust der Milzarchitektur auf. Vor allem die frühe Akutinfektion beeinflusste die Genexpression in den dendritischen Zellen, welche sowohl zu einer Induktion der HIF-1α mRNA- und HIF-1 Zielgenexpression als auch einer erhöhten Genexpression der MHC-Komplexe sowie des Toll-like Rezeptors 7 führte. Erst die späte Akutinfektion resultierte in einer vermehrten HIF-1α Proteinakkumulation und einer gesteigerten Aktivierung der dendritischen Zellen. Dabei waren die aktivierten DCs aus Kontroll- und Knock-out-Mäusen dazu in der Lage die Aktivierung und zytotoxische Aktivität von CD8+ T-Zellen, welche bei den Knock-out-Tieren stärker ausfiel und maßgeblich für die Limitierung der akuten FV verantwortlich war, in vivo und in vitro zu induzieren. Während alle Knock-out-Tiere in der Lage waren die Virusreplikation nach chronischer FV Infektion einzuschränken und sich vollständig von der Infektion zu erholen, entwickelten einige der Kontrollmäuse eine rezidivierende Infektion. Dabei führte die FV-induzierte Erythrozyten¬proliferation zu einer massiven Splenomegalie, welche von einem kompletten Verlust der Milzarchitektur begleitet wurde. Zudem konnte in diesen Mäusen eine erhöhte Anzahl an dendritischen Zellen, Makrophagen und Granulozyten sowie eine verminderte Anzahl an adaptiven Immunzellen nachgewiesen werden. Der zeitgleiche signifikante Anstieg von myeloischen Suppressorzellen schien im direkten Zusammenhang mit der Depletion der Lymphozytenpopulation und der rezidivierenden chronischen FV Infektion zu stehen.
Daraus folgernd unterstützt die HIF-1α Defizienz der dendritischen Zellen während einer Langzeitinfektion die Erholung und Einschränkung der Virusreplikation, so dass das dendritische HIF-1α insgesamt einen wichtigen Einfluss auf den Verlauf von chronischen Virusinfektionen haben könnte.In addition to cellular adaption to hypoxia the transcription factor complex hypoxia-inducible factor (HIF)-1 regulates the gene expression profile of dendritic cells (DC) and macrophages during inflammation. To investigate the activation and influence of HIF-1 deficiency in viral infections we infected control and CD11c+ dendritic cell specific HIF-1α knockout mice with the murine Friend leukemia virus (FV) to cause an acute or a chronic infection. Resistant mice like our experimental animals are known to become persistently infected after developing a strong immune response during the acute phase of infection, while FV induces an Epo independent lethal erythroleukemia and splenomegaly in susceptible mice. After acute Friend virus infection we did not find differences in spleen weight and immune cell populations but a partial loss of spleen architecture of mice with a functional dendritic HIF-1α. Early acute FV infection influenced the gene expression profile of dendritic cells and led to an increase of HIF-1α mRNA and HIF-1 target gene expression as well as an upregulation of the gene expression of MHC complexes and Toll-like receptor 7. Only after late acute infection we detected an increased induction of HIF-1α protein and activation of the dendritic cells. Both activated control and knock-out DCs were able to induce the activation and cytotoxic activity of CD8+ T cells in vivo and in vitro which was primarily responsible for limiting the acute FV infection and was induced to a greater extent by Knock-out mice. Following chronic FV infection all knock-out mice were able to restrict viral replication, whereas some of the control mice developed a recurrent infection accompanied by a massive splenomegaly. This led to a complete loss of splenic architecture which was due to FV induced erythrocyte proliferation. Additionally, these mice showed an increased number of dendritic cells, macrophages, and granulocytes and a decreased adaptive immune cell population. Concurrently we detected a significant increase of myeloid derived suppressor cells which seemed to be interdependent with the depletion of lymphocytes and the recurrent chronic FV infection.
Thus, our results indicate that HIF-1α deficiency in dendritic cells promotes a better recovery and restriction of viral replication after long-term infection and that dendritic HIF-1α may have an important influence on the course of chronic infection
Charakterisierung des murinen pulmonalen phagoyztischen Netzwerks während einer Aspergillus fumigatus Infektion
No full textAspergillus fumigatus ist ein ubiquitärer, luftübertragener Schimmelpilz, der eine weit verbreitete Gefahr für immunsupprimierte Patienten darstellt und in der Lage ist, die invasive Aspergillose (IA) hervorzurufen, ein Krankheitsbild mit hoher Sterblichkeitsrate. In immunkompetenten Individuen hingegen wird diese Infektion sehr effizient mit Hilfe der phagozytotischen Eigenschaften verschiedener Zelltypen des Immunsystems, wie beispielsweise Alveolarmakrophagen, Neutrophile Granulozyten und Dendritische Zellen, bekämpft. Möglicherweise spielen jedoch neben den drei oben genannten professionellen Phagozyten, auch „unprofessionelle“ phagozytotische Zellen, wie die alveolaren Epithelzellen des Typs I und II (AEC) eine zentrale Rolle für die Bewältigung der Pilzinvasion. Obwohl bereits viele Studien die Interaktion zwischen professionellen Phagozyten und A. fumigatus detailliert analysiert haben, konzentrieren sich nur wenige Arbeiten auf die Interaktion des Pilzes mit alveolaren Epithelzellen. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit mit der Analyse der Proteomregulation der AECII nach pulmonaler A.fumigatus Infektion begonnen. Zuerst wurde ein Protokoll zur negativen, magnetischen Isolierung muriner AECII mit einer Reinheit von über 90% erfolgreich etabliert. Mit Hilfe dieser Methode wurden dann AECII aus infizierten Mauslungen isoliert und ihr Proteom im Vergleich zu AECII aus nicht infizierten Tieren mittels Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LCMS) analysiert. Aus der sich ergebenden Liste signifikant regulierter Proteine wurde das Protein mit der deutlichsten Hochregulierung für weitere Untersuchungen im Rahmen von A.fumigatus Infektionen ausgewählt. Durch weitere experimentelle Ansätze, wie qRT-PCR, Western Blot und Immunhistochemie konnte zunächst die deutliche Hochregulierung des Proteins bestätigt werden. Anschließend wurde ein Mausmodel mit knock-out für das entsprechende Protein verwendet, um seine Bedeutung unter Infektionsbedingungen zu untersuchen. Aus Parametern wie Überlebensrate, Kolonie bildenden Einheiten (CFUs), Neutrophilenrekrutierung in die Lunge infizierter Tiere und TNF-α-Sekretions-Level in Proben aus der bronchoalveolaren Lavage, konnten keine Unterschiede in dieser Mauslinie im Vergleich zu Wildtypmäusen festgestellt werden. Die Rolle und Bedeutung weiterer vielversprechenden Proteine aus der in dieser Arbeit erstellten Liste sollten daher in künftigen Arbeiten charakterisiert werden
Einen weiteren zu untersuchenden Zelltyp in dieser Studie stellten die Neutrophilen Granulozyten dar, da sie in Bezug auf Anzahl und Funktion die wichtigsten Zellen im Verlauf einer A.fumigatus-Infektion der Lunge sind. Darüber hinaus ist Neutropenie die häufigste Todesursache bei Patienten mit invasiver Aspergillose . Das Ziel in diesem Teil der Studie war es, die Neutrophilen Granulozyten aus verschiedenen Stellen der Maus zu isolieren. Zu diesem Zweck mussten Protokolle etabliert werden für die Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark, Blut und bronchoalveolarer Lavage (BAL) von A. fumigatus infizierten Tieren . Die neue „Catchup“ Mauslinie mit transgenen tdTomato exprimierenden Neutrophilen stellte hierfür das perfekte Werkzeug dar. Nach der Isolierung von Neutrophilen wurde ihre Proteinzusammensetzung mittels LCMS charakterisiert. Über 3000 Proteine wurden detektiert und mittels Hauptkomponentenanalyse untersucht. Diese Daten zeigten, dass die Neutrophilengruppe aus der BAL-Isolation mit unmittelbarem Kontakt zu Pilzsporen die deutlichsten Änderungen bezogen auf die Proteinmenge aufweist. Diesem Ergebnis folgend sollten sich künftige Untersuchungen, wie z.B. die Charakterisierung von Phänotypen in entsprechenden knock out Mäusen, auf Proteine konzentrieren, die in dieser experimentellen Gruppe deutlich reguliert waren.Aspergillus fumigatus is a ubiquitous, airborne mold and a common threat for immunosuppressed patients as it can induce invasive aspergillosis, characterized by a tremendously high mortality rate. Immunocompetent individuals on the other hand, encounter this infection very efficiently due to the phagocytic action of different immune cell types such as alveolar macrophages, neutrophil granulocytes and dendritic cells we believe, that beside these professional phagocytes, “unprofessional” phagocytic cells, such as alveolar epithelial type I and II cells (AEC) also constitute a central element for encountering fungal invasion.
Although many studies have deeply analyzed the interaction between professional phagocytes and A. fumigatus, just few works have concentrated on the fungal interaction with alveolar epithelial cells. With this ground, we started with analyzing the proteome regulation of AECII after pulmonary A. fumigatus infection. We started with the successful establishment of a negative, magnetic isolation protocol to isolate primary murine AECII with purity greater than 90 %. Using this method, we isolated AECII from infected murine lungs and characterized their proteomic constitution by liquid chromatography mass spectrometry (LCMS) in comparison to AECII from uninfected animals. From the resulting list of significantly regulated proteins the protein with the highest up-regulation was chosen for further investigation in the context of an A. fumigatus infection. By additional experimental approaches, such as qRT-PCR, Western Blot and Immunohistology we could first of all confirm the initially detected high level of up-regulation. Subsequently, we employed a knock-out mouse model for the protein to investigate its significance under infection conditions. Addressing different parameters, such as survival, colony forming units (CFU), Neutrophil recruitment to the lungs of the infected animals and TNF- α secretion level in bronchoalveolar lavage fluid, we unfortunately could not find a different behavior of this mouse strain, compared to wildtype animals. Hence, future work should characterize the role and importance of further promising proteins from the generated list of this work.
The next cell type to investigate in this study was neutrophil granulocytes as they are known to be the major immune cells in number and function for facing A. fumigatus infection inside the lung. Additionally, neutropenia is the main cause of death for IA patients. The aim for this part of the study was to isolate neutrophil granulocytes from different sites of the same mouse. In other words, protocols for neutrophil isolation of bone marrow, blood and bronchoalveolar lavage (BAL) of A. fumigatus infected animals had to be set up. The novel “Catchup” mouse line with transgenic tdTomato expressing neutrophils was the useful tool to perform this task. After neutrophil isolation, they were further investigated in protein level by LCMS. Over 3000 proteins were detected and analyzed in a principal component plot. According to this data the neutrophil group isolated from BAL with direct contact to fungal spores indicated the most variance in protein abundancies. With this hint further investigation on the expressed proteins from this experimental group should be performed such as looking for phenotypes in the knock out mice for the most relevant regulated proteins during A. fumigatus infection
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
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