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Durchflusszytometrische Epitop-Kartierung von HCMV-spezifischen T-Zellen herz- und lungentransplantierte Patienten
Get PDFHINTERGRUND: Die Reaktivierung des Humanen Cytomegalievirus (HCMV) ist immer noch eine häufige Ursache für Morbidität und Mortalität unter immunsupprimierten Patienten. Eine effiziente T-Zell-Antwort vermag die unkontrollierte Ausbreitung des Virus zu verhindern. Vieles über diese T-Zell-Antwort ist aber noch unklar. Im Rahmen dieser Studie wurden daher bei HCMV-seropositiven herz- (n = 17) und lungentransplantierten (n = 3) Patienten Epitope in zwei wichtigen T-Zell-Zielen, den HCMV-Proteinen IE-1 (UL123) und pp65 (UL83), identifiziert, die Frequenzen der für diese Epitope spezifischen T-Zellen gemessen und die Klonalität ausgewählter starker CD8+ T-Zell-Antworten untersucht. METHODEN: Dazu wurden Pentadecapeptide, die die gesamte Aminosäure-Sequenz von IE-1 bzw. pp65 umfassten und sich um jeweils 11 Aminosäurereste überlappten, in Pools von 25 bis 30 Peptiden so zusammengefasst, dass jedes Peptid in einer einzigartigen Kombination von drei Pools enthalten war. PBMC der Patienten wurden dann mit den Peptid-Pools stimuliert und die resultierenden T-Zell-Reaktionen durch Färbung von intrazellulär zurückgehaltenem Interferon-gamma durchflusszytometrisch sichtbar gemacht. Immunogene Peptide konnten anhand der jeweiligen drei Pools, die zu IFN-gamma-Produktion führten, eindeutig identifiziert werden. Einige dieser T-Zell-Populationen wurden durch einen IFN-gamma-Sekretions-Assay, magnetische Zellseparation und durchflusszytometrische Feinsortierung aus PBMC isoliert und ihre Klonalität mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion zum Nachweis klonal expandierter gamma-T-Zell-Rezeptor-Rearrangements (TCR-PCR) und anschliessender Fragmentanalyse fluoreszenzmarkierter PCR-Amplifikate untersucht. ERGEBNISSE: Bei den Patienten bestanden grosse Unterschiede hinsichtlich des jeweils immundominanten Proteins, der Dominanz von CD4+ bzw. CD8+ T-Zell-Subpopulation, der antigenen Determinanten, der gemessenen Peptid-spezifischen T-Zell-Frequenzen sowie der Anzahl der identifizierten Epitope. Zehn zuvor noch nicht beschriebene Epitope wurden eben-falls identifiziert und die präsentierenden HLA-Allele der meisten in der Patientengruppe identifizierten Epitope bestimmt. Die mittels TCR-PCR untersuchten CD8+ T-Zell-Reaktionen waren auf einen oder wenige Klone fokussiert. Die Korrelation der experimentellen Daten mit den klinischen Verläufen der Patienten hinsichtlich HCMV-Reaktivierung und -Erkrankung erbrachte jedoch keine Hinweise auf einen konkreten Zusammenhang. SCHLUSSFOLGERUNGEN: Zusammenfassend ermöglichen die hier vorgestellten Methoden die Untersuchung des Langzeitverlaufes der CD4+ und CD8+ T-Zell-Antwort gegen immundominante Proteine auf Epitop-Ebene nach initialer Identifizierung der antigenen Determinanten, die direkte Bestimmung der Frequenzen der Epitop-spezifischen T-Zellen sowie die Untersuchung der Klonalität dieser Reaktionen aus ca. 2 x 20 ml Blut. Die Langzeit-Untersuchung von Patienten mit hohem Risiko für HCMV-Reaktivierung und -Erkrankung kann so zu einem besseren Verständnis der komplexen HCMV-spezifischen T-Zell-Anwort und damit möglicherweise auch zur Verbesserung von Diagnose, Prophylaxe und Therapie dieser Patienten beitragen.BACKGROUND: Human cytomegalovirus (HCMV) reactivation is still a leading cause of morbidity and mortality among immunosuppressed patients. Uncontrolled viral spread is prevented by an efficient T-cell response. However, little is known about the nature of this T-cell response. In this study we identified epitopes in two immunodominant HCMV-proteins, IE-1 (UL123) and pp65 (UL83), measured the frequencies of T-cells specific for these, and studied the clonotypic composition of selected T-cell responses in a group of HCMV-seropositive heart (n = 17) and lung (n = 3) transplant patients. METHODS: For both proteins overlapping pentadecapeptides covering the entire respective amino acid sequences were arranged in pools of 25 peptides each in such a way that every peptide was contained in exactly 3 pools. PBMC were stimulated with the resulting 15 pools for IE-1 or 16 pools or pp65, respectively, as well as with pools containing all peptides of the corresponding protein. Individual peptides leading to a positive T-cell response were identified by flow cytometric detection of intracellular interferon-gamma, each single peptide corresponding to a unique combination of 3 peptide pools. Selected T-cell populations specific for the previously identified single peptides were purified by performing an IFN-gamma secretion assay prior to magnetic cell separation and subsequent fluorescence-activated cell sorting. The clonality of these highly purified peptide-specific T-cell populations was then investigated by a T-cell receptor-gamma rearrangement-PCR and subsequent fragment analysis of fluorescence-labelled PCR amplificates. RESULTS: We observed broad heterogeneity among the patients in terms of the immunodominant protein, number of epitopes, predominance of CD4 or CD8 T-cell responses, and epitope-specific T-cell frequencies. 10 previously unknown epitopes were identified, and the HLA-restriction of most of the identified epitopes could be determined. The investigated T-cell responses showed a high degree of clonal focussing. These data were correlated to the patients episodes of HCMV reactivation, but a correlation between differences in the T-cell responses and a different clinical outcome in terms of HCMV-reactivation could not be established. CONCLUSIONS: In summary, this novel approach allows the rapid identification of epitopes contained in a given protein, direct determination of T-cell frequencies, and investigation of the T-cell clonality in the CD4 and CD8 T-cell subsets from as little as 2 times 20 ml of blood. Long-term follow-up of patients at risk for HCMV reactivation and disease may thus allow a more detailed insight into the complexity of the T-cell response to HCMV and may thus lead to improved diagnosis, prophylaxis and therapy
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Get PDF“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Get PDFWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
[Buchbesprechung] Fachlexikon ABC Virologie : Hrsg. von Erhard Geißler. 1. Aufl. 408 S., 117 Zeichn. 35 Tab. und 16 Fototafeln. Harri Deutsch Verlag, Thun, Frankfurt/M., 1986. ISBN 3-87144-919-9. DM 29,80.
No full text"Ehrlich färbt am besten!" : zum 150. Geburtstag des Begründers der Immunologie und Chemotherapie Paul Ehrlich
No full textVirological diagnostics of influenza: detection of infectious agents and assessment of immunity
No full textZum virologischen Nachweis einer akuten Influenza und zur Überprüfung des Immunstatus steht eine Vielzahl von Untersuchungsmethoden zur Verfügung. Bei Verdacht auf eine Influenzavirusinfektion liefert der Rachenabstrich das geeignete Untersuchungsmaterial. Das tiefe Nasopharynxaspirat ist etwas sensitiver, Sputum etwas weniger ergiebig. Die RT-PCR ermöglicht in 1–2 h nach Materialeingang ein sensitives und spezifisches Ergebnis. Typen, Subtypen und Driftvarianten lassen sich durch geeignete Primersonden, die kommerziell zur Verfügung stehen, einwandfrei identifizieren. Demgegenüber ist die Zellkultur-gestützte Virusisolierung zeitaufwendiger und stärker abhängig von einer sachgerechten Materialgewinnung und –überbringung (Kühlkette). PCR und Virusanzüchtung ermöglichen die geno- bzw. phänotypische Testung auf Therapieresistenzen. Der Antigentest ist eine einfache (bed-side) Schnellmethode. Seine Spezifität ist gut, die Sensitivität limitiert; daher kann der Antigentest nicht zur individuellen Ausschlussdiagnose eingesetzt werden. Influenzavirusspezifische Antikörper erscheinen im Blut erst in der zweiten Krankheitswoche. Die Serodiagnostik erfolgt typenspezifisch mit Komplementbindungsreaktion (KBR), IFT und ELISA über eine signifikante Titerbewegung oder den Nachweis von IgA-Antikörpern. IgG-spezifische IFT und ELISA Methoden geben Auskunft über die Influenzavirus-typspezifische Durchseuchung. Die klinisch relevantere subtypen- und variantenspezifische Influenzavirusimmunität wird mit dem HHT oder NT gemessen.A variety of methods are available for virological diagnosis and immunity assessment of influenza. For virus detection, the clinical specimen is usually the respiratory swab. In terms of sensitivity, nasopharyngeal aspirates are superior and sputum specimens are inferior. The diagnostic method of choice is RT-PCR of viral DNA sequences coding for matrix and nucleoprotein, which define influenza virus types A, B, C, or coding for haemagglutinin and neuraminidase spikes on the viral envelope identifying influenza virus A subtypes and strains. Gene-specific primer probes are commercially available. PCR takes 1–2 h after the arrival of the clinical specimen. Cell culture based virus isolation combined with intracellular antigen detection needs 1–2 days, but is regarded as gold standard. Transport of the swabs in an ice chest is recommendable. Direct antigen detection in the clinical specimen by the use of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or immunofluorescence test (IFT) is the most rapid (bedside) method, but of inferior sensitivity. Therapy resistance analysis is done by genotyping subsequent to PCR amplification or by the cell culture method (phenotyping). Antibodies due to influenza virus are produced during the second week after infection and may confirm or disprove virological diagnosis. ELISA and IFT apply nucleoprotein or matrix proteins as antigens and differentiate between the Ig classes IgA (IgM) and IgG indicating an acute or passed infection. Complement fixing antibodies do not persist. Influenza virus immunity is assessed by neutralisation assay or – more simply – by haemagglutination inhibition in a type-, subtype- and even variant-specific manner
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