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Espiritualidade, terapia e cura: um estudo sobre a expressão da experiência no santo daime
No full textDissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Filosofia e Ciências Humanas. Programa de Pós-Graduação em Antropologia SocialO Céu da Mantiqueira é uma comunidade do Santo Daime filiada ao CEFLURIS (Centro Eclético de Fluente Luz Universal Raimundo Irineu Serra) e localizada no sul do estado de Minas Gerais. Neste trabalho, a partir da análise das expressões das experiências dos participantes desta comunidade registradas na forma de desenhos e narrativas - procuro levantar e definir as principais categorias culturais envolvidas na experiência dos processos de cura, saúde e doença para os participantes do Céu da Mantiqueira e compreender estas categorias em suas relações com os procedimentos terapêuticos grupais, buscando identificar os modelos que motivam e sustentam estes procedimentos e categorias culturais. Também procuro situar no contexto das relações sociais e procedimentos terapêuticos as pessoas que trabalham profissionalmente na área da saúde. A temática da cura foi definida a partir de interesses que me parecem centrais para os participantes do Céu da Mantiqueira. Ao longo da trajetória desta comunidade, vários acontecimentos apontam para a construção e reconstrução de uma identidade coletiva enquanto centro de cura. Esta identidade encontra-se ancorada na história do grupo, em interação com a práxis de seus participantes. No Céu da Mantiqueira, espiritualidade e terapia são concebidas e vivenciadas como dimensões que se interpenetram e estão intimamente relacionadas. Observando esta imbricação entre o espiritual e o terapêutico, identifiquei um duplo movimento, convergente e simultâneo, de terapeutização da espiritualidade e espiritualização dos procedimentos terapêuticos. Levanto, assim, a hipótese de que o modelo que fundamenta os procedimentos terapêuticos existentes no Céu da Mantiqueira é o de um continuum espiritual-terapêutico, com a doutrina daimista em um de seus pólos e os procedimentos terapêuticos e as pessoas que trabalham profissionalmente na área da saúde no outro. A substância que circula entre estes dois pólos é formada pelos valores que provém de ambos. Estes valores fundamentam os procedimentos espirituais e terapêuticos. Devido à ênfase na integração entre espiritualidade e terapia, este modelo difere do modelo predominante na biomedicina oficial, baseado no paradigma cartesiano que separa mente e corpo. Penso que o modelo do continuum espiritual-terapêutico pode ajudar a compreender as práticas de cuidados da saúde existentes na contemporaneidade em outros contextos, onde também há uma intersecção entre novas formas de espiritualidade e procedimentos terapêuticos
Genetic transformation of tobaco (Nicotiana tabacum) via Agrobacterium tumefaciens, with tbe pea Lhcbl *2 gene
No full textO sistema coletor de energia luminosa (LHCII) funciona como um sistema antena associado a um centro de reação do PSII. O sistema antena é formado por moléculas de clorofila complexadas às proteínas CAB ("Chlorophill a/b binding proteins"). As moléculas de clorofila são excitadas pela energia luminosa, e quando voltam para o estado de repouso dessa transição, tem-se a liberação de elétrons que são transportados do PSII para PSI, gerando NADPH e ATP. A proteína Lhcb1*2 é a principal proteína CAB, e está associada à cerca de 50% das moléculas de clorofila do PSII. O emprego de técnicas de biotecnologia, como a transformação genética de plantas, representa uma ferramenta adicional para melhorar o potencial produtivo das espécies cultivadas. Por exemplo, o aumento de biomassa é uma característica de ser conseguida em diversas culturas e está relacionada, em grande parte, à capacidade fotossintética das plantas. As plantas superiores, são capazes de ajustar o tamanho do sistema antena (LHCII), localizados nas membranas dos tilacóides dos cloroplastos, como observado em estudos anteriores, em nosso laboratório, sobre a regulação do processo fotossintético, em plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) que superexpressaram o gene quimérico Lhcb1*2 de ervilha. A expressão deste gene foi facilitada pelo promotor constitutivo 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV). Neste caso foram obtidas duas linhagens que têm alta expressão desse transgene e os resultados mostraram que a expressão ectópica do gene Lhcb1*2 resultou em um aumento da capacidade fotossintética das plantas transgênicas em condições limitantes de luz, e também em uma série de efeitos pleiotrópicos no desenvolvimento e anatomia foliar. Assim, o objetivo dessa dissertação foi o de obter-se um maior número de linhagens transgênicas de tabaco, para o estudo posterior de diferentes níveis de expressão do transgene, de forma a entender a relação entre o nível de expressão do transgene e os efeitos sobre o desenvolvimento, anatomia foliar e fisiologia das plantas transgênicas. O sistema de transformação de plantas utilizado foi o de Agrobacterium tumefaciens. A identificação dos transformantes feita por PCR. As plantas PCR positivas foram então autofecundadas, e suas progênies, avaliadas em meio seletivo. As plantas que apresentaram o padrão de seleção, de três plantas resistentes para uma suscetível à canamicina, foram selecionadas. Nove plantas de cada progênie resistente foram novamente autofecundadas, para a identificação de plantas homozigotas para o transgene. Dezessete linhagens, independentes e homozigotas para o transgene, foram obtidas de dezenove plantas com segregação mendeliana (3:1). A análise de Southern blot de 12 plantas PCR positivas e homozigotas para o transgene, apenas uma planta revelou-se negativa, e várias, apesar da segregação mendeliana, apresentaram mais de uma cópia do transgene integrado ao seu genoma.The LHCII light harvesting complex acts as an antenna system, associated to the (PSII) core complex. The LHCII is formed by chlorophyll molecules associated to the CAB proteins ("chlorophyll a/b binding proteins"). The chlorophyll molecules are excited by the light energy, before returning to the steady state. From this transition, electrons are liberated and transferred form PSII to PSI, producing NADPH and ATP. The Lhcb 1*2 is the major CAB protein and binds around 50% of total PSII Chlorophyll molecules. The use of biotechnology techniques, such as plant genetic transformation, represent an additional tool to improve the productive potential of cultivated species. For example, the increase in biomass is a (desired) feature to be achieved in several cultures and is largely related, to the photosynthetic capacity of higher plants. The higher plants are able to adjust the size of the LHCII antenna system, located in the thylakoid membrane of the chloroplasts, as observed in previous work in our laboratory, consuming the regulation of the photosynthetic apparatus in transgenic tobacco plants overexpressing the chimeric pea Lhcb1*2 gene. The expression of this gene was facilitated by the constitutive cauliflower mosaic virus 35S promotes (CaMV). ln this case, two lines, showing high expression of the transgene were obtained and the results showed that the ectopic expression of the Lhcb 1*2 lead to an enhanced photosynthetic capacity of these transgenic lines in limiting light conditions and also to a series of pleitropic effects upon development and leaf anatomy. So, the aim of this work was to obtain a larger number of transgenic tabacco lines for a future study of the different levels of the transgene expression , o be able to understand the relation between the transgene expression level and its effects upon development , leaf anatomy and fisiology of these transgenic plants. Toe plant transformation system used was the Agrobacterium tumefaciens one. The identification of the transformants was made by PCR. The PCR positive plants where then selfcrossed, and their progeny, evaluated in selective medium. The plants which showed a selective pattern of three resistant plants to one susceptible to kanamycin, were selected. Nine plants of each resistant progeny were selfcrossed a second time, for the identification of the homozygous transgenic lines. Seventeen independent homozygous transgenic lines were obtained, out of nineteen plants which showed Mendelian Segregation (3: 1 ). From the Southern blot analysis of thirteen PCR positive plants, homozygous plants, only one was not a genuine transformant and others, showed more than one copy of the transgene integrated into their genome, although the pattern of the segregation was Mendelian
Genetic transformation of tobaco (Nicotiana tabacum) via Agrobacterium tumefaciens, with tbe pea Lhcbl *2 gene
No full textO sistema coletor de energia luminosa (LHCII) funciona como um sistema antena associado a um centro de reação do PSII. O sistema antena é formado por moléculas de clorofila complexadas às proteínas CAB ("Chlorophill a/b binding proteins"). As moléculas de clorofila são excitadas pela energia luminosa, e quando voltam para o estado de repouso dessa transição, tem-se a liberação de elétrons que são transportados do PSII para PSI, gerando NADPH e ATP. A proteína Lhcb1*2 é a principal proteína CAB, e está associada à cerca de 50% das moléculas de clorofila do PSII. O emprego de técnicas de biotecnologia, como a transformação genética de plantas, representa uma ferramenta adicional para melhorar o potencial produtivo das espécies cultivadas. Por exemplo, o aumento de biomassa é uma característica de ser conseguida em diversas culturas e está relacionada, em grande parte, à capacidade fotossintética das plantas. As plantas superiores, são capazes de ajustar o tamanho do sistema antena (LHCII), localizados nas membranas dos tilacóides dos cloroplastos, como observado em estudos anteriores, em nosso laboratório, sobre a regulação do processo fotossintético, em plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) que superexpressaram o gene quimérico Lhcb1*2 de ervilha. A expressão deste gene foi facilitada pelo promotor constitutivo 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV). Neste caso foram obtidas duas linhagens que têm alta expressão desse transgene e os resultados mostraram que a expressão ectópica do gene Lhcb1*2 resultou em um aumento da capacidade fotossintética das plantas transgênicas em condições limitantes de luz, e também em uma série de efeitos pleiotrópicos no desenvolvimento e anatomia foliar. Assim, o objetivo dessa dissertação foi o de obter-se um maior número de linhagens transgênicas de tabaco, para o estudo posterior de diferentes níveis de expressão do transgene, de forma a entender a relação entre o nível de expressão do transgene e os efeitos sobre o desenvolvimento, anatomia foliar e fisiologia das plantas transgênicas. O sistema de transformação de plantas utilizado foi o de Agrobacterium tumefaciens. A identificação dos transformantes feita por PCR. As plantas PCR positivas foram então autofecundadas, e suas progênies, avaliadas em meio seletivo. As plantas que apresentaram o padrão de seleção, de três plantas resistentes para uma suscetível à canamicina, foram selecionadas. Nove plantas de cada progênie resistente foram novamente autofecundadas, para a identificação de plantas homozigotas para o transgene. Dezessete linhagens, independentes e homozigotas para o transgene, foram obtidas de dezenove plantas com segregação mendeliana (3:1). A análise de Southern blot de 12 plantas PCR positivas e homozigotas para o transgene, apenas uma planta revelou-se negativa, e várias, apesar da segregação mendeliana, apresentaram mais de uma cópia do transgene integrado ao seu genoma.The LHCII light harvesting complex acts as an antenna system, associated to the (PSII) core complex. The LHCII is formed by chlorophyll molecules associated to the CAB proteins ("chlorophyll a/b binding proteins"). The chlorophyll molecules are excited by the light energy, before returning to the steady state. From this transition, electrons are liberated and transferred form PSII to PSI, producing NADPH and ATP. The Lhcb 1*2 is the major CAB protein and binds around 50% of total PSII Chlorophyll molecules. The use of biotechnology techniques, such as plant genetic transformation, represent an additional tool to improve the productive potential of cultivated species. For example, the increase in biomass is a (desired) feature to be achieved in several cultures and is largely related, to the photosynthetic capacity of higher plants. The higher plants are able to adjust the size of the LHCII antenna system, located in the thylakoid membrane of the chloroplasts, as observed in previous work in our laboratory, consuming the regulation of the photosynthetic apparatus in transgenic tobacco plants overexpressing the chimeric pea Lhcb1*2 gene. The expression of this gene was facilitated by the constitutive cauliflower mosaic virus 35S promotes (CaMV). ln this case, two lines, showing high expression of the transgene were obtained and the results showed that the ectopic expression of the Lhcb 1*2 lead to an enhanced photosynthetic capacity of these transgenic lines in limiting light conditions and also to a series of pleitropic effects upon development and leaf anatomy. So, the aim of this work was to obtain a larger number of transgenic tabacco lines for a future study of the different levels of the transgene expression , o be able to understand the relation between the transgene expression level and its effects upon development , leaf anatomy and fisiology of these transgenic plants. Toe plant transformation system used was the Agrobacterium tumefaciens one. The identification of the transformants was made by PCR. The PCR positive plants where then selfcrossed, and their progeny, evaluated in selective medium. The plants which showed a selective pattern of three resistant plants to one susceptible to kanamycin, were selected. Nine plants of each resistant progeny were selfcrossed a second time, for the identification of the homozygous transgenic lines. Seventeen independent homozygous transgenic lines were obtained, out of nineteen plants which showed Mendelian Segregation (3: 1 ). From the Southern blot analysis of thirteen PCR positive plants, homozygous plants, only one was not a genuine transformant and others, showed more than one copy of the transgene integrated into their genome, although the pattern of the segregation was Mendelian
Consequences of constitutive expression og Lhcb1*2 gene of Pisum sativum in Nicotiana tabacum plants: Impact of leaves proteomics, assembly of photosystem and influence of plant development
No full textO complexo coletor de luz (LHC) do fotossistema II (PSII) é o principal complexo de proteínas associado a pigmentos situado na membrana dos tilacóides de cloroplastos em plantas. O LHCII funciona como uma antena de transferência de energia para a captura e direcionamento da energia luminosa do PSII para o PSI. A ação coordenada dos dois fotossistemas com o direcionamento do fluxo de elétrons gera a quebra da molécula de água, através da membrana do tilacóide, produzindo força assimilatória ATP e NADPH. A energia química produzida na fotossíntese é de suma importância para a assimilação de carbono, biossíntese de aminoácidos e metabólicos secundários. Portanto, este é um importante gene para estudos em biotecnologia. Linhagens transgênicas de tabaco (TR-1 e TR-2) as quais expressam constitutivamente o transgene Lhcb1*2 de ervilha obtidas por Labate e colaboradores (2004) foram utilizadas nesse trabalho. Estas plantas apresentaram diversos efeitos pleiotrópicos relacionados à anatomia, morfologia, bioquímica e fisiologia. Uma proteína pode não atuar isoladamente, mas freqüentemente interagindo com outras proteínas, influenciando diversos processos metabólicos. O perfil de proteômica dessas linhagens transformantes, em relação à planta selvagem (WT) foi investigado. As proteínas totais foram extraídas de folhas de plantas de três meses crescidas em câmaras de crescimento, então separadas por 2D-PAGE. As proteínas diferencialmente expressas foram identificadas por LC-MS/MS. Os resultados mostram que 244 spots apresentaram alterações significativas na expressão nas duas linhagens transgênicas em relação à WT. 122 spots são expressos exclusivamente nas linhagens transformantes, e 24 spots somente na selvagem. Muitas proteínas como ATP synthase e ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase foram mais expressas nas linhagens transgênicas, mas a glutamine synthetase, uma importante proteína na reciclagem de nitrogênio nos cloroplastos, teve sua expressão diminuída. Para analisar as alterações na expressãode genes relacionados ao ritmo circadiano entre outros, como a conformação do PSII, cotilédones de plântulas estioladas foram submetidas à luz e amostras coletadas depois de 0, 3, 6, 12 e 24 horas. O nível de transcritos foram analisados por PCR quantitativo. A diferenciação de plastídio à cloroplasto maduro foi analisado por microscopia eletrônica de transmissão, para se entender as diferenças entre os genótipos em estudo no desenvolvimento vegetal. A expressão constitutiva do gene Lhcb1*2 de ervilha em plantas transgênicas de tabaco acarretou a indução e repressão de várias proteínas e genes em distintos passos de vias metabólicas, estabilizando a homeostase celular, exercendo uma influência significativa no desenvolvimento vegetal e produção de biomassa.The light harvesting complex (LHC) of photosystem II (PSII) is the major ensemble of pigmet-biding proteins situated in the thylakoid membranes of the chloroplast in plants. The LHCbII functions as an energy-transferring antenna for capturing and delivering light energy to the photosystems PSII and PSI. The coordinated actions of the two photosystems in turn drive the flow of electrons, generated by the splitting of water, through the thylakoid membranes to produce the assimilatory force ATP and NADPH. The chemical energy produced by photosynthesis is very important for the assimilation of carbon, amino acids biosynthesis, and secundary metabolism. Therefore it is an important gene for biotechnological studies. Transgenic tobacco lines (TR-1 and TR-2) which express the pea Lhcb1*2 transgene constitutively obtained by Labate et al. (2004) were used in this work. These plants presented pleiotropic effects related to anatomy, morphology, biochemistry and physiology. As a protein may not act by itself, but it is, frequently interacting with other proteins, influencing a lot of metabolic processes. The proteomic profile of these transgenic lines, in relation to the wild type (WT), was investigated. The total proteins extracted from leaves of three-month old plants grown in growth chambers were separated by 2DPAGE. The differentially expressed proteins were identified by LC-MS/MS. The results showed that 225 spots displayed significant changes in the expression of the two transgenic lines in relation to the WT. 122 spots were exclusively expressed in the transgenic lines, and 24 only in the wild type. Many proteins as ATP synthase and ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase are overexpressed in the transgenic lines, but the glutamine synthetase, an important protein tor nitrogen recycling in the chloroplasts, showed a reducted level of expression. In order to analyse the alterations of the expression of genes related to the circadian rhythm among others, involved in the conformation of the PSII, cotyledons from etiolated seedlings were thenexposed to light and samples collected after 0, 3, 6, 12 and 24 hours. The level of transcripts were analysed by RT/RT-PCR. The PSII conformation were analysed by transmition electron microscopy, with the aim of verifying the evolution of plastids into the chloroplasts which could be leading to changes in plant development. The overexpression of the pea Lhcb1*2 gene in transgenic tobacco plants, lead to the induction and suppression of several proteins and genes in key metabolic pathways, as a way to establish a cellular homeostasis, exerting a significant influence on plant development and biomass production
O uso da Ayahuasca no contexto urbano: um lugar entre o tradicional e o moderno.
No full textTCC (graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Filosofia e Ciências Humanas, História.O presente trabalho têm por objetivo fazer apontamentos acerca de algumas características fundamentais e atuais que envolvem as religiões ayahuasqueiras no Brasil, que são originalmente: as doutrinas da linha do CICLU, de mestre Irineu, o pioneiro da religiosidade daimista no Brasil, iniciada nos anos 30 e oficializada em estatuto em 1971; a Barquinha da Santa Cruz, fundada em 1945 por Daniel de Matos; e por último a União do Vegetal, surgida em Rondônia em 1961 através de Gabriel da Costa. Estas três religiões tem em comum em suas praticas a bebida de origem indígena denominada Ayahuasca, tendo sido rebatizada no Brasil por “Daime”, “Vegetal” ou ainda “Hoasca”. Estas religiões, ou doutrinas, sofreram todas, ao longo do tempo, inúmeras fissuras e ramificações, não sem conflitos e disputas, fazendo surgir com isso, muitas vezes, novos elementos rituais e simbólicos, recriando por assim dizer, as modalidades possíveis de comunhão desta bebida tida por esses grupos como sagrada. Vimos ocorrer também, a partir dos anos 1970 e 80, uma acelerada expansão destas religiões e suas dissidências para o resto do país e exterior. Defendemos que essa expansão contribuiu para o encontro destas religiões ditas “tradicionais” com o entorno da cultura urbana e moderna, estabelecendo novas abordagens reflexivas típicas de religiosidades pós-tradicionais da cultura Nova Era. São algumas características pertinentes destes encontros e desencontros que tentaremos aqui discutir.This study aim to make notes about some fundamental characteristics and current involving Ayahuasca religions in Brazil, which are originally: the doctrines of online CICLU, master Irineu Serra, the pioneer of religiosity Daime in Brazil, started in the 30s and official status in 1971; Barquinha da Santa Cruz, founded in 1945 by Daniel de Matos, and finally the União do Vegetal, which emerged in Rondônia in 1961 by Gabriel da Costa. These three religions have in common in their practices of indigenous drink called Ayahuasca, and was renamed in Brazil "Daime", "Vegetal" or "Hoasca". These religions or doctrines, suffered all, over time, numerous cracks and ramifications, not without conflicts and disputes, giving rise to it often, new rituals and symbolic elements, recreating so to speak, the possible ways of communion this drink taken by such groups as sacred. We saw occur also from the 1970s and '80s, an accelerated expansion of these religions and their dissent to the rest of the country and abroad. We argue that this expansion contributed to the meeting these religions called "traditional" with the surrounding urban and modern culture, establishing new approaches reflective of typical post- traditional religiosity of the New Age culture. Are some relevant characteristics of these agreements and disagreements that will try to discuss here
Effects of overexpression of the miox2 gene from Arabidopsis, in secondary cell-wall carbohydrate composition in transgenic tobacco plants
No full textAs paredes celulares vegetais são estruturas essenciais para o crescimento e desenvolvimento das plantas. Além das suas diversas funções biológicas, os componentes polissacarídicos constituintes das paredes celulares (celulose, hemiceluloses e pectinas) são de vital importância como fonte natural de fibras para a nutrição humana e animal e são considerados os principais recursos renováveis do planeta, utilizados como matéria-prima para diversos processos industriais, por exemplo nos processos de produção de polpa celulósica. Todos esses fatores têm despertado grande interesse no estudo da composição e biossíntese das paredes celulares. A biossíntese dos seus polímeros se inicia no citoplasma das células, onde ocorre a formação dos precursores por uma rota metabólica complexa de biossíntese de açúcares-nucleotídeo. O entendimento da regulação dessa rota metabólica é fundamental para modular a dinâmica de biossíntese desses açúcares e assim tentar manipular as propriedades bioquímicas das paredes celulares. Nesse contexto, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo avaliar o efeito da superexpressão do gene miox2 de Arabidopsis thaliana em plantas de Nicotiana tabacum. O produto desse gene é a enzima mio-inositol oxigenase (E.C. 1.13.99.1), cuja função é converter o mio-inositol em ácido D-glucurônico, composto central da rota de biossíntese de açúcares-nucleotídeo. Foram determinadas quatro isoformas tecido-específicas para o gene miox (miox1, miox2, miox4 e miox5) em Arabidopsis, sendo que a isoforma miox2 é a predominante em caules. Esse gene foi clonado em trabalhos anteriores realizados no laboratório e no presente trabalho, o cDNA do gene miox2 foi superexpresso em plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) a fim de se avaliar o efeito da superexpressão na composição de carboidratos de parede celular secundária. As linhagens de plantas transgênicas obtidas, não mostraram diferenças visualmente perceptíveis em comparação aos controles, indicando ausência de alterações fisiológicas e morfológicas. Foram quantificados os monossacarídeos de paredes celulares secundárias (arabinose, ramnose, galactose, glicose, xilose, manose), os ácidos urônicos (ácido galacturônico e glucurônico) e as ligninas (solúvel e insolúvel), a partir de tecido xilemático e parênquima medular do caule. A ausência de modificações significativas nas proporções desses metabólitos, indica que as plantas exercem um estrito controle na regulação da biossíntese de paredes celulares secundárias de forma que a superexpressão do gene miox2 não provocou nenhuma alteração altamente significativa. Outros genes candidatos e os mecanismos envolvidos na sua regulação deverão ser testados quanto ao nível de transcrição, modificações pós-trancricionais e pós-traducionais a fim de entender a regulação do fluxo de carbono para a biossíntese de paredes celulares.Cell-walls are essential structures for plant development and growth. Apart from its biological functions, the polyssacharides that make cell-walls (cellulose, hemicellulose and pectins) are the principal natural fibrous materials used for human and animal nutrition. They are also considered the most important renewable resource on earth and their use as industrial raw material is inevitable. An example is the use of wood in the production of pulp and paper. For all these reasons, the study of molecular composition and biosynthesis of plant cell-walls has been a matter of great interest for researchers over the past few years. Cell-wall polyssacharides biosynthesis begins at the cytoplasm, where a pool of UDP-glucose and other activated sugar nucleotide precursors are generated by multiple and complex interconvertion reactions. Understanding how cells control the metabolic pathways responsible for sugar nucleotide precursors synthesis, would be a primary requirement for manipulating them in an attempt to generate plants with improved properties for human use. In that context, tha aim of this research work was to analyze the effects of Arabidopsis thaliana miox2 gene overexpression in a plant model system (Nicotiana tabacum). The product of miox2 gene is myo-inositol oxygenase enzyme 2 (E.C.1.13.99.1) which converts D-glucuronic acid, an important sugar nucleotide precursor, from its substrate myo-inositol. Four isoforms of miox gene, with apparent tissue specific expression (miox1, miox2, miox4 and miox5) were already determined, but miox2 is the one primarily expressed in stems. Its cDNA was cloned from Arabidopsis thaliana in previous works and overexpressed in tobacco plants. Five normal transgenic lines were obtained, showing no phenotypically differences relative to the control line. This fact implied that miox2 overexpression did not alter any physiological nor morphological aspect of plant development. The cell-wall monossacharides (arabinose, rhamnose, galactose, glucose, xylose and mannose), uronic acids (galacturonic and glucuronic acid) and lignins (soluble and insoluble) from stem xylem and parenchymal tissue were quantified. The absence of major changes in any of the compounds measured for the transgenic lines indicated that they were able to adjust their level of carbohydrate composition. Plants seem to regulate the proportions of sugar nucleotide precursors through highly complex metabolic pathways that establish strong compensatory mechanisms. It will be necessary to study other candidate genes and some aspects of their regulation at transcriptional, postranscriptional and postransaltional level, as an attempt to understand the cell-wall carbohydrate flux
Nuclear proteome characterization of one and four-month-old sugarcane (Saccharum spp) leaves
No full textA cana-de-açúcar é uma cultura economicamente importante, cultivada especialmente pelo seu colmo, que constitui a matéria-prima para produtos como o açúcar e o bioetanol. Ademais, a compreensão do proteoma nuclear é essencial para decifrar os mecanismos que governam a regulação gênica. No presente estudo, é demonstrado o isolamento e a identificação através de 1D SDS-PAGE de proteínas nucleares originadas de folhas jovens de plantas de cana-de-açúcar. Os núcleos foram isolados de folhas F+1 frescas de cana-de-açúcar de 1 e 4 meses, usando o protocolo modificado de Folta e Kaufman (2000). O experimento consistiu em um delineamento inteiramente casualizado, com três repetições de 18 plantas cada. Após a purificação usando o gradiente de percoll, a integridade do núcleo foi avaliada por meio da coloração com orceína acetolática 1% e com DAPI. Os resultados obtidos revelam os núcleos como esferas uniformes com o diâmetro médio de 5 ?m. As proteínas nucleares foram isoladas usando o reagente TRI Reagent (Sigma) e quantificadas por meio do método de Bradford. As análises de Western blot foram usadas para demonstrar o enriquecimento de proteínas nucleares. As membranas foram incubadas com a RUBISCO, PEPCase, OEE1, Histona e PCNA. A presença da PCNA e da Histona foram detectadas apenas no extrato de proteínas nucleares, já a RUBISCO, a PEPCase e a OEE1 foram detectadas de forma abundante no extrato de proteínas total e reduzida na fração nuclear. Para a caracterização do proteoma nuclear, 60 ?g de proteínas foram separadas por SDS-PAGE e cada canaleta dividida em 20 bandas. As proteínas de cada banda foram digeridas e purificadas. A identificação foi realizada por meio de espectrometria de massas (Synapt G2 HDMS) e analisadas usando o ProteinLynx e o banco de dados SUCEST. Programas como BaCelLo, WoLF PSORT, Plant-mPloc, SherLoc e PSORT foram usados para a predição da localização subcelular das proteínas identificadas. A classe de proteínas identificadas mais abundante se relaciona à montagem de nucleossomos, e é representada principalmente pelas histonas, como H2A.2, H2A.8, H3.3, H2B.1, H2B.2, dentre outras. Ademais, ainda foram encontradas classes menos abundantes relacionadas ao metabolismo do DNA, do RNA, regulação da transcrição, dentre outras. Alguns fatores de transcrição e outras proteínas nucleares típicas também foram identificadas, porém, possivelmente em decorrência de sua baixa abundância, não foram observados em todas as repetições. Os resultados encontrados mostram a aplicabilidade da metodologia para criar um perfil preciso do proteoma nuclear de cana-de-açúcar.Sugarcane is a cash crop, cultivated for its stalks which accumulate sucrose, the raw material for products like sugar and bioethanol. Nuclear proteome comprehension is essential for deciphering the mechanisms that governs genome regulation and function. In the present study, we report the isolation and identification by 1D SDS-PAGE of nuclear proteins from young sugarcane leaves. The nuclei were isolated from fresh tissue of one and four-month-old sugarcane F+1 leaves, using the modified protocol of Folta and Kaufman (2000). The experiment consisted on a completely randomized design, three biological repetitions each with 18 plants. After purification using a percoll gradient, nucleus integrity was evaluated by staining with 1% acetolactic orcein and with DAPI. The results obtained reveal nuclei as uniform spheres with an average diameter of 5 ?m. The nuclear proteins were isolated using TRI Reagent (Sigma) and quantified by Bradford. Western blot analysis were used to prove enrichment for nuclear proteins. Membranes were incubated with RUBISCO, PEPCase, OEE1, Histone and PCNA. The presence of PCNA and Histone were detected only in the nuclear fraction. RUBISCO, PEPCase and OEE1 were very abundant in the total protein fraction and reduced in the nuclear fraction. For the characterization of nuclear proteome, 60 ?g of proteins were separated by SDSPAGE and each lane divided into 20 sections, the proteins from each section were digested and purified. Protein identification was carried out by mass spectrometry (Synapt G2 HDMS) and analyzed using ProteinLynx and SUCEST database. Softwares, such as BaCelLo, WoLF PSORT, Plant-mPloc, SherLoc and PSORT were also used to predict the subcelular localization of the identified proteins. The most abundant protein class is related to the nucleosome assembly. It is represented specially by histones like H2A.2, H2A.8, H3.3, H2B.1, H2B.2, among others. Besides, less abundant classes like the ones related to DNA and RNA metabolism, regulation of transcription and others were also found. Some transcription factors and other typical nuclear proteins were identified as well, but, possibly due to their low abundance, they were not observed in all three repetitions. These results show the applicability of this method to create an accurate sugarcane nuclear proteome profile
Characterization of brazilian sparkling wine proteomics and its relationship with the foaming formation quality
No full textUma das características de qualidade dos vinhos espumantes, e que também impõe a sua identidade, é a aparência das borbulhas. Tradicionalmente, acredita-se que a capacidade de formação e estabilização dessas borbulhas depende de macromoléculas do vinho, em especial das proteínas, devido a sua ação tensoativa. Este trabalho de doutorado visou o estudo proteômico do vinho espumante brasileiro a fim de identificar quais proteínas estão presentes nesses vinhos para entender melhor a influência dessas na estabilização da espuma (perlage e colarinho), e com o intuito de potencializar essa característica em nossos produtos. Foram utilizados os métodos de extração de proteínas clássico, ácido tricloroacético/acetona e de última geração, biblioteca combinatória de ligantes peptídicos, sendo estas separadas por SDS-PAGE, 2DE e OFFGEL. As proteínas extraídas foram digeridas com tripsina e a mistura de peptídeos analisada por nLC-MS/MS com metodologia shotgun. Os resultados iniciais obtidos por eletroforese 2DE e OFFGEL, mostraram a presença de três grupos de proteínas de massa molecular distintas, sendo duas próximas a 25 kDa e uma próxima a 70 kDa. Estas proteínas parecem estar presentes nos vinhos em mais de uma isoforma evidenciado pelo espalhamento de todas as bandas de mesma massa molecular em diferentes pH. Foram identificadas 40 proteínas, sendo 17 proteínas de organismos do sub-reino Viridiplantae e 23 proteínas pertencentes ao gênero Saccharomyces, onde 10 e 6 proteínas, respectivamente, estão presentes em pelo menos duas amostras de espumantes nacionais. Dessas, seis proteínas foram identificadas pela primeira vez em vinhos. Três proteínas originárias da levedura Saccharomyces cerevisiae estão presentes em todos os produtos analisados, podendo essas proteínas serem as responsáveis pela melhor formação de espuma observada em nossos produtos em relação ao Champagne (vinho espumante tradicional da França).The type of fizzy bubbles is one of the aspects that characterizes the quality of sparkling wines and also helps defining their identity. Traditionally, it is believed that the ability of these bubbles to form and stabilize depends on the macromolecules found in the wine, particularly proteins, due to their surfactant action. The aim of this work is the proteomic study of the brazilian sparkling wines in order to identify which proteins are present to better understand the influence of these molecules in the foam formation (perlage and collar), in order to improve our products. The protein extraction methods used were the classical TCA/acetone precipitation and the modern combinatory peptide ligand library. Then, proteins were separated by SDS-PAGE, 2DE and OFFGEL. The protein extracted were digested with trypsin and the peptide mixture were analyzed with nLC-MS/MS using the shotgun method. The first results obtained by electrophoresis 2DE and OFFGEL showed the presence of three groups of proteins with different molecular mass, two of them close to 25 kDa and the other one close to 70 kDa. These proteins appear to be present in wine in more than one isoform evidenced by spreading in all bands of similar molecular weight at different pH. In total, 40 proteins were identified, 17 protein from Viridiplantae sub-kingdom organisms and 23 proteins belonging to Saccharomyces genus, where 10 and 6 proteins, respectively, are present in at least two samples of domestic sparkling wines. Six of those proteins were identified in wine for the first time. Three proteins originating from Saccharomyces cerevisiae are present in all analyzed products, and those may be responsible for a better foam formation observed in our products in comparison to Champagne (traditional French sparkling wine)
Optimization of SAAT (Sonication-Assited Agrobacterium-Mediated transformation) technique to transform Phaseolus vulgaris
No full textPhaseolus vulgaris L. era considerado recalcitrante à transformação por Agrobacterium. Entretanto, alterações no meio de co-cultivo, utilização de linhagens hipervirulentas de Agrobacterium e de vetores binários contendo genes vir demonstraram que o feijoeiro é susceptível à Agrobacterium. No entanto, ainda não foram obtidas plantas transgênicas de feijoeiro por meio deste método. Em 1997, Trick & Finer descreveram a metodologia SAAT ("Sonication assisted Agrobacterium mediated transformation"). Esta técnica consiste em produzir microferimentos no explante através da sonicação por curtos períodos de tempo na presença do Agrobacterium. Por meio deste método foram obtidas plantas transgênicas de soja e trigo. O objetivo do presente trabalho foi ajustar a metodologia SAAT para a transformação de P. vulgaris. A variedade de feijoeiro utilizada foi a Olathe Pinto, a linhagem de Agrobacterium tumefaciens foi LBA4404:pTOK. Foram estudados o efeito do pré-tratamento, tempo de co-cultivo, duração do SAAT e presença de acetoceringona. Os resultados demonstram que a expressão transitória e estável da β-glucoronidase foi maior quando os eixos embrionários foram pré-tratados por 10 a 14 dias em meio de multibrotação. O antibiótico geneticina (G418) apresentou maior capacidade de seleção de brotos do que canamicina, nas concentrações estudadas. SAAT de 60 segundos dos explantes apresenta melhor expressão transitória e estável da β-glucoronidase. O tempo de co-cultivo líquido de 2 horas seguido de 48 horas em meio sólido, na ausência de acetoceringona, apresentou a maior expressão transitória. A presença de acetoceringona (20 mg/l) aumentou a expressão transitória. Pré-incubação por 24 horas não aumentou a eficiência do tratamento SAAT. As análises de microscopia óptica e de varredura demonstraram a presença de rupturas na epiderme, quebras da parede celular e invasão do Agrobacterium nos tecidos subepidérmicos. Os resultados demonstraram que o método SAAT é uma técnica viável para a transformação de P. vulgaris via Agrobacterium.Common bean was considered recalcitrant to Agrobacterium-mediated transformation. After some studies with co-cultivation medium, pre-treatment of explants, hipervirulent Agrobacterium strains and binary vectors with vir genes, it has been reported the susceptibility of Phaseolus vulgaris to some Agrobacterium strains. However, still no transgenic bean has been reported using this method. The Agrobacterium-mediated transformation of P.vulgaris presents several problems, such as the interaction Agrobacterium-host, explant maturity, pre-culture conditions, co-cultivation medium, and selection strategies. The technique SAAT consists to produce microwounds of the explant through sonication during short period of time in presence of Agrobacterium. Using this method Trick & Finer (1997; 1998) obtained transgenic wheat and soybean. The objective of the present work is to adjust the SAAT method to transform common bean. The bean variety used was Olathe Pinto, and Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404:pTOK. Transient and stable transformation increased when mature embryos were pre-treated during 10 to 14 days in cytokinin-induced shoot organogenesis medium. Geneticin (G418) was observed to be better than kanamycin to select shoots. SAA T duration effect on transient and stable transformation shown, in both experiments, that 60 seconds presents the best results. Co-cultivation conditions, without acetosyringone, of 2 hours in liquid medium followed by 48 hours in solid medium presented the higher transient expression. Acetosyringone (20 mg/L) increases transient expression and pre-incubation for 24 hours didn't increase SAAT efficiency. Scanning and optical microscopy demonstrated that sonication produces microwounds in the explant epidermal surface, cell wall break and Agrobacterium invasion of subepidermal tissue. Results shown that SAAT is a promising method to transform of P. vulgaris
Growth analysis, biomass production, photosynthesis and amino acid biosynthesis in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum L.) plants over expressing the pea lhcb1*2 gene.
No full textA biomassa vegetal, seja como produto de interesse econômico ou do ponto de vista ecológico, é estritamente dependente do processo fotossintético. O advento das técnicas de biologia molecular e transformação genética de plantas trouxe boas perspectivas para a alteração do processo fotossintético, já que pouco foi conseguido com o melhoramento vegetal tradicional. Modificações genéticas nos LHCs (estruturas responsáveis pela captação e transferência da energia luminosa) mostram-se promissoras. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum, L.) que expressam o gene quimérico Lhcb1*2 de ervilha têm sido estudadas por apresentarem uma série de alterações no metabolismo fotossintético, além de um ganho genético em relação à planta selvagem original. Vários autores observaram mudanças morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e adaptativas que favorecem estas plantas em diversas condições de cultivo. Diversos experimentos foram realizados no intuito de melhor caracterizar as plantas transformadas com o gene Lhcb1*2 de ervilha. O potencial produtivo foi avaliado através da análise de crescimento e produção de massa seca. O metabolismo fotossintético foi analisado através de medidas de assimilação de CO2, fluorescência da clorofila a, metabólitos do ciclo de Calvin-Benson, glicólise e ciclo de Krebs, carboidratos (amido e sacarose) e aminoácidos. Os resultados obtidos mostram uma redução da taxa de fotorrespiração pelas plantas transgênicas. Esta redução promoveu o aumento do período de crescimento vegetativo e produção de biomassa, à semelhança do que ocorre em plantas cultivadas sob baixa pressão de oxigênio (5%) ou alto CO2. Entretanto, ao contrário do que ocorre nessas condições, a produção de sementes e o peso nas linhagens transgênicas não foram reduzidos.Plant biomass, seen either from the economic or the ecological points of view, is highly dependent upon photosynthesys. The development of molecular biology and genetic engineering techniques brought great perspectives for the improvement of the photosynthetic process, since few progress had been achieved with traditional plant breeding. Genetic alteration of the LHCs (structures responsible for the capture and distribution of radiant energy) seems promising. Transgenic tobacco plants (Nicotiana tabacum, L.) over expressing the pea Lhcb1*2 gene have been studied. They present several alterations in the photosynthetic metabolism which lead to a genetic improvement of them in relation to the original plant. Many authors observed morphological, physiological, biochemical and adaptative changes which were benefical to these plants to diverse growing conditions. Several experiments were carried out in order to better characterize these transgenic tobacco lines. The potential for production was evaluated, via dry wight and growth rate. The photosynthetic metabolism was analyzed through CO2 assimilation, chlorophyll fluorescence, metabolites of the Calvin-Benson, glycolysis and Krebs cycles, carbohydrates (starch and sucrose) contents and amino acids. The results obtained show a reduction in photorespiration rate in the transgenic plants. Such reduction lead to on extension of the plant growing period and on enlargment of the biomass, similar to what occurs in plants growing under low O2 (5%) or high CO2 conditions. However, in contrast to what normally happens under these conditions, dry weight and seed production were not reduced in the transgenic lines
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