1,721,020 research outputs found
AmyloWiki: an integrated database for Bacillus velezensis FZB42, the model strain for plant growth-promoting Bacilli
No full textSince its isolation 20 years ago, many studies have been devoted to Bacillus velezensis FZB42 (former name Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42), which has been gradually accepted as a model organism for Gram-positive rhizobacteria. FZB42 is different from another widely studied bacterial strain, Bacillus subtilis 168, in its many features that are closely associated with plants. FZB42 represents a large group of Bacillus isolates that are beneficial to plants and of great importance in agriculture. In this work a database for FZB42 named 'AmyloWiki' is built to integrate all information of FZB42 available to date. The information includes the genomic, transcriptomic, proteomic, post-translational data as well as FZB42 unique genes, protein regulators, mutant availability, publications and etc. The website is built up with PHP and MySQL with a function of keyword searching, browsing, data-downloading and other functions
characterizing its production and regulation of nonribosomal peptide synthetases
Full text linkBacillus amyloliquefaciens FZB42 ist ein im Boden weit verbreitetes Bakterium. Es kolonisiert Pflanzenwurzeln und werde als Biodünger verwendet, da sie in der Lage sind, Pflanzenwachstum zu fördern. Der domestizierte Stamm B. subtilis 168 ist eng verwand mit B. amyloliquefaciens FZB42, fördert jedoch kein Pflanzenwachstum. Als ein erster Ansatz zur Ermittlung von Gendifferenzen zwischen FZB42 und B. subtilis 168 - wobei zum damaligen Zeitpunkt nur die Genomsequenz letzteren Organismus bekannt war - wurde die Supression Subtractive Hybridisation (SSH) angewandt. Hierdurch wurden mehrere einzigartige Gene in B. amyloliquefaziens identifiziert. Unterdessen beteiligte sich unser Labor in Kollaboration mit dem GenoMik Network in Göttingen an einem Projekt, dessen Ziel die komplette Sequenzierung des Genoms von B. amyloliquefaciens war. Der Hauptanteil der Arbeit, sowie die Koordination des gesamten Projekts wurden von Xiao-Hua Chen und mir selbst durchgeführt. B. amyloliquefaciens FZB42 besitzt die srf, fen, pks1 (bae), bac und dhb Operons, welche für die Synthese von Surfactin, Fengycin, Bacillaene, Bacilysin und Bacillibactin verantwortlich sind und die ebenfalls im Genom von B. subtilis 168 enthalten sind. Das Genom von B. amyloliquefaciens FZB42, beinhaltet die bmy Gencluster, die die Synthese von Bacillomycin D kontrolliert. Ein weiteres in dieser Arbeit verfolgtes Ziel war die Identifizierung der regulatorischen Wege, die die Expression von Bacillomycin D steuern. Es wurde gezeigt, dass globale Regulatoren, wie beispielsweise DegU, DegQ und ComA, die alternativen Sigmafaktoren sigB und sigH und ein neuartiges Rap-Protein die transkriptionale Aktivität des in dieser Arbeit identifizierten Hauptpromotors des bmy-Operons beeinflussen. Es wurde gezeigt, dass DegU seine Effekte nach direkter Bindung an zwei unterschiedliche Regionen im bmy-Promotor ausübt. Es wurde außerdem gezeigt, dass DegU abgesehen von der Aktivierung des Hauptpromoters des bmy-Operons eine zusätzliche, vermutlich eine post-transkriptionale Rolle spielt. Auf ähnliche Weise erwies sich YczE, ein Membranprotein unbekannter Funktion, das neben sfp kodiert liegt, als essentiell für die Bacillomycin D-Produktion. Der Effekt wurde auf einem post-transkriptionalen Level ausgeübt und war unabhängig von DegU.Bacillus amyloliquefaciens FZB42 is widely distributed in the soil. It colonizes the plant roots and is used as bio-fertilizer, since they can promote plant growth.The domesticated strain of B. subtilis 168 is closely related to B. amyloliquefaciens FZB42, but does not promote plant growth. As a first approach to detect gene differentiation between FZB42 and B. subtilis 168, and since only the genome sequence of the latter was known at that point, Suppression Subtractive Hybridization (SSH) was employed. Thereby, several unique genes of B. amyloliquefaciens FZB42 could be identified. Meanwhile, our laboratory became engaged in a project aiming to define the complete genome sequence of B. amyloliquefaciens FZB42, in collaboration with the GenoMik Network in Göttingen. The major part of the work and the co-ordination of the whole process were performed by Xiao-Hua Chen and myself. B. amyloliquefaciens FZB42 possesses the srf, fen, pks1 (bae), bac and dhb operons, which are also shared by B. subtilis 168. In addition, the genome of B. amyloliquefaciens FZB42 contains the bmy gene clusters, which controls the synthesis of bacillomycin D. A further issue pursued in this work was to identify the regulatory pathways that govern the expression of bacillomycin D. Global regulators, such as DegU, DegQ and ComA, the alternative sigma factors, sigB and sigH, and a novel Rap protein were found to affect the transcriptional activation of the main promoter of the bmy operon identified in this work. In particular, DegU was shown to mediate its effects, after binding directly to two sites at the bmy promoter region. DegU was shown to play an additional role on bacillomycin D production, presumably a post-transcriptional one. Similarly, YczE, a membrane protein of unknown function, encoded adjacently to sfp proved to be essential for bacillomycin D production, but dispensable for the production of the rest peptide antibiotics produced by B. amyloliquefaciens FZB42. The effect was mediated at a post-transcriptional level and was independent of DegU
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Regulation der Phytaseexpression in Bacillus amyloliquefaciens
Full text linkViele Bacillus Stämme sekretieren Phytasen, diese katalysieren die Dephosphorylierung von myo-Inositolhexakisphosphat (phytate). Das monocystronische phyC Gen aus dem im Boden lebenden Bacillus amyloliquefaciens FZB45 konnte als Teil des, durch Phosphatmangel induzierbaren, PhoPR-Regulons identifiziert werden. Der Transkriptionsstart des SigmaA-abhängigen Promotors wurde 27 bp upstream von Translationsstart bestimmt. Der Promotor weist jedoch eine ungewöhnliche Struktur auf, da die –35 und die –10 Region durch ein 21 bp Fenster voneinander getrennt sind. Die in vitro Transkriptionsanalyse zeigte, dass PhoP-P für die Initiation der phyC-Transkription notwendig ist. Die PhoP-Bindungsstellen der meisten B. subtilis Promotoren, die durch PhoP aktiviert werden, besitzen mindestens vier TTAACA-ähnliche Sequenzmotive, welche durch 5-6 bp- Intervalle getrennt sind. Die upstream Region von phyC aus B. amyloliquefaciens FZB45 weicht von dieser Struktur ab. Hier konnten nur zwei solcher Motive, die für die Bindung eines PhoP-Dimeres zuständig sind und die Positionen -47 und -35 überlagern, identifiziert werden. Ein weiteres Motiv befindet sich zwischen -13 und –8 und überlappt um eine Base mit der –10 Region. Die Funktionen der drei Bindungsstellen konnten durch DNaseI-Footprinting ermittelt werden. Ein PhoP-Dimer besetzt die –35 Region und dirigiert dabei die RNA-Polymerase wahrscheinlich in Richtung –10 Region. Durch die Bindung von PhoP an die PhoP-Erkennungsstelle bei –10 wird die Transkription gehemmt. Diese PhoP-vermittelte duale Kontrolle des phyC-Promotors scheint bis lang einzigartig für Pho-Regulongene zu sein. Der globale Regulator AbrB konnte als weiterer Repressor des phyC identifiziert werden. Die Bindungsstelle befinden sich upstream von –147 und downsteam von +29, müssen aber in weiteren Experimenten genauer spezifiziert werden. Diese Arbeit stellt als erste die Modelle der phyC-Regulation durch PhoP und AbrB vor.Several Bacillus strains secrete phytase, an enzyme catalysing dephosphorylation of myo-inositol hexakisphosphate (phytate). The monocistronic phyC (phytase) gene from environmental Bacillus amyloliquefaciens FZB45 was identified as a member of the phosphate-starvation inducible PhoPR regulon. The transcriptional start was determined downstream of a sigmaA-like promoter region located 27 bp upstream of the translation start codon. Inspection of the phyC promoter sequence revealed an unusual structure, since the -35 and -10 region are separated by a window of 21 bp. In vitro transcription analysis established that PhoP-P is necessary to initiate the transcription from phyC promoter. PhoP binding boxes occurring in most B. subtilis promoters activated by PhoP consist of at least four TTAACA-like sequences repeated at intervals of 5-6 bps. The upstream region of the B. amyloliquefaciens FZB45 phyC gene deviates from this general architecture in that there is only one appropriate binding site for the dimeric PhoP protein, which consists of two motives centered at -47 and -35 and separated by five base pairs. A single PhoP binding site is located at -13 to -8, nearly matching the -10 consensus. Functionality of the three PhoP binding boxes was demonstrated by DNaseI footprinting suggesting that a pair of dimeric PhoP molecules cover the -35 region directing the RNA-polymerase to the –10 region. Binding of PhoP at a single PhoP binding site covering the -10 consensus repress the transcription. It seems to be a unique feature of the phyC promoter structure and has not been reported for any other member of the PhoPR regulon, previously. Furthermore an inhibitory effect via AbrB, a global regulator, could be verified. The binding regions could be determine upstream of –147 and downstream of +29, but have to be specify in further experiments. This work presents for the first time the models for the regulation of phyC in Bacillus via PhoP and AbrB
Molecular mechanisms controlling bacilysin biosynthesis in plant growth promoting rhizobacterium - Bacillus amyloliquefaciens FZB42
Full text linkBacillus amyloliquefaciens FZB42 ist ein grampositives Bakterium, das in der Rhizosphäre das Pflanzenwachstum fördert (PGPR - Plant Growth Promotion) und pathogene Organismen hemmt. Abgesehen von dieser Fähigkeit produziert es eine Vielzahl von sekundären Metaboliten, die sowohl ribosomale als auch nicht-ribosomale Peptide umfassen. In dieser Arbeit erfolgte die Untersuchung der transkriptionellen Aktivierung und Regulation der Bacilysin- Biosynthese an den Promotoren der bac- und ywfH- Gene. Durch 5´-Deletionsanalysen wurde der Promotor von Bacilysin identifiziert. Die A (Sigmafaktor A) - abhängige Transkription startet über die konservierten Promotorelemente (-10 und -35) von den bac- und ywfH Genen. Die Untersuchungen der Promotoraktivitäten vom Wildtyp und den erzeugten Regulationsmutanten erfolgten über in vivo ß-Galaktosidase-(Reporter)-Assays. Die Ergebnisse der Reporter-Aktivitäten zeigten, dass Transkriptionsregulatoren die Expression der Bacilysin- Gene aktivieren. Mehrere globale Regulatoren wie DegU, ComA, Hpr und AbrB beeinflussen die Genexpression. In dieser Arbeit wurde mithilfe von DNaseI Footprinting-Analysen die DegU-Bindung an die bac- und ywfH- Promotoren bestätigt.Die negative Regulation der Bacilysin-Biosynthese wird durch den Regulator der transienten Phase Hpr bewerkstelligt. Eine direkte Hpr-Bindung an bac Promotor wurde mit DNaseI Footprint-Analysen gezeigt. Der Promotor des monocistronischen Gens ywfH wurde aber durch Hpr nicht beeinflusst. Die anderen Transkriptionsregulatoren, wie ComA und AbrB, regulieren die Genexpression von Bacilysin indirekt über DegQ und Hpr. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass der globale Regulator AbrB den Promotor vom hpr-Gen direkt kontrolliert. Zusammenfassend liefert diese Studie neue Informationen über die genetische Regulation der Bacilysin- Biosynthese in B. amyloliquefaciens FZB42.Bacillus amyloliquefaciens FZB42 is a Gram-positive, pathogen-suppressing and plant-growth promoting rhizobacterium. Apart from this ability, it produces a vast array of secondary metabolites, which includes both ribosomal and non-ribosomal peptides. In this work, the transcriptional activation and regulation of bacilysin biosynthesis were studied at the promoters of bac and ywfH genes. The promoter of bacilysin was identified using 5''-deletion analysis. Sigma factor A (σA) was found to start transcription via conserved promoter elements (-10 and -35) of bac and ywfH genes. lacZ reporter fusion studies were performed in wild type and regulatory mutants. The results show the involvement of transcriptional regulators to activate the expression of bacilysin genes. Several global regulators such as DegU, ComA, Hpr and AbrB were identified and found to influence gene expression. In particular, I confirmed DegU binding in bac and ywfH promoters using radioactive DNase I footprinting. Furthermore, Hpr, a transition state regulator was found negatively to control bacilysin biosynthesis. Hpr binding to bac promoter was demonstrated using radioactive DNase I footprinting. Remarkably, Hpr does not influence the promoter of the monocistronic gene, ywfH. The other transcriptional regulators, such as ComA and AbrB, were correlated indirectly to affect the gene expression of bacilysin via DegQ and Hpr, respectively. The gene regulation of hpr was studied in this work. It was demonstrated that AbrB, a global regulator, directly controls the promoter of the hpr gene. However, the consensus sequence for AbrB binding was not identified, since it covers the entire promoter region in the DNA-protein interaction study. To conclude, this study provides new information regarding the genetic regulation of bacilysin biosynthesis in B. amyloliquefaciens FZB42
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
The effect of cell wall structure on pneumococcal virulence
Full text linkStreptococcus pneumoniae ist ein gram-positives Bakterium und ein Krankheitserreger des Menschen. Ein Charakteristikum des Bakteriums ist, dass es Cholin-Reste in seine dicke Zellwand einbaut. Das Ziel meiner Doktorarbeit war herauszufinden, inwiefern diese Cholin-Reste zur Virulenz des Bakteriums während experimenteller Sepsis und Meningitis beitragen. Dabei konnte ich feststellen, das cholinierte Wildtyp-Bakterien hoch virulent waren, ungestört im Wirt wachsen konnten und letztendlich zu einer massiven Überaktivierung des Wirts-Immunsystems (gemessen anhand der Zytokine IL-1beta, IL-6, IL-12, TNFalpha) sowie zum Tode der Versuchtiere führten. Im Gegensatz dazu waren cholin-freie Bakterien nicht in der Lage eine permanente Infektion im Wirt zu etablieren. So wuchsen sie nur anfangs und wurden vom Wirts-Immunsystem kontrolliert und beseitigt, sodass alle Tiere überlebten. Die Injektion von cholin-freien und cholinierten, hoch aufgereinigten Zellwänden, führte zu der Schlussfolgerung, dass Cholin in der Zellwand ein Immunevasionsmechanismus der Bakterien sein muss. Ausserdem waren cholin-freie Bakterien in der Lage einen protektiven, serotyp-spezifischen Immunschutz im Wirt zu induzieren.Streptococcus pneumonia is a major human pathogen. Since it is a gram positive bacterium it is characterized by the production of a thick cell wall. Being auxotrophic for choline, the pneumococcus attaches this aminoalcohol to its teichoic acids thus decorating its surface with choline-residues. The aim of this work was to investigate the role that these choline residues play in the virulence of the bacterium. By using an isogenic choline-containing and choline-free pair of S. pneumoniae I was able to demonstrate that surface bound choline is essential for the virulence of the bacterium in animal models of experimental sepsis and meningitis. In either model choline-containing bacteria were able to persistently grow within the host system, continuously stimulate the production of proinflammatory cytokines (IL-1beta, IL-6, IL-12, TNFalpha) and eventually led to the death of all infected animals within 24h. In contrast, choline-free bacteria showed only transient growth within the host and induced only moderate and limited expression of cytokines. Consequently, the bacterium was virtually avirulent and all animals survived. Intracisternal application of highly purified cholinated and choline-free cell wall preparations, induced a comparable activation of the immune system. These findings led to the conclusion that choline residues contribute to an immunevasion strategy that allows the bacteria to grow despite an ongoing immune response. Although being avirulent choline-free bacteria were able to induce serotype specific immunity in the animals
Expression bakterieller Phytasen in Pflanzen
Full text linkDie Verfügbarkeit des Makroelementes Phosphor ist für Lebewesen eingeschränkt. Besonders bei der Pflanzenproduktion und der Tierernährung spielt die Phosphorverfügbarkeit eine wichtige Rolle bei der ökonomischen Nutzung der Ressourcen. In den Fokus der Wissenschaft zur Lösung des Phosphorproblems gerieten die Phytasen, da monogastrische Tiere nicht in der Lage sind das in den Pflanzensamen gespeicherte Phytat zu nutzen. Die gentechnische Veränderung von Pflanzen stellt eine effiziente Möglichkeit zur Produktion von phosphatfreisetzenden Enzymen, zur Erhöhung der Biomasseproduktion und zur Veränderung der Inhaltstoffe dar. In dieser Arbeit wurden erfolgreich transgene Pflanzen der Arten Nicotiana tabacum L. cv. Samsun und Hordeum vulgare L. cv. Golden Promise erzeugt, die in der Lage waren die Phytase aus Klebsiella sp. ASR1 bzw. aus Bacillus amyloliquefaciens FZB45 zu produzieren. Es wurde für jedes Protein eine Strategie zur Reinigung des aktiven Enzyms aus den verschiedenen Wirtsorganismen entwickelt und seine biochemischen Eigenschaften charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die β-Propeller-Phytase aus Bacillus im Gegensatz zur sauren Phytase aus Klebsiella durch die posttranslationale Modifikation teilweise ihre Eigenschaften ändert. Die Auswirkungen der heterologen Expression der Phytasen auf die Veränderung der Anteile von Phytinsäure und anorganischem Phosphor, in Relation zum gesamten Phosphor, in den Gerstensamen wurden untersucht. Es wurde eine Reduktion des Phytinsäuregehaltes um 19 % und eine Erhöhung des Gehalts anorganischem Phosphor zwischen 27 % und 78 nachgewiesen. Mit Hilfe von spezifischen Signalsequenzen gelang es die Phytaseproteine aus der Wurzel in das umgebende Medium zu sekretieren. Die Sekretion der Bacillus Phytase führte zu einer Steigerung der Biomasseproduktion von Nicotiana tabacum L. unter unsterilen Wachstumsbedingungen mit Phytat als einziger P-Quelle um 34 %.Due to the bad availability of phosphorus in natural habitats the improvement of phosphorus accessibility to organisms became an important topic of research, particularly for agriculture and animal nutrition. In plant seeds phosphorus is bound to D-myo-inositol to form phytic acid that is indigestible for mono gastric animals. Therefore the use of phytases to hydrolyze the phytic acid and to mobilize the anorganic phosphorus came in focus to science. Genetic engineering gave the opportunity to improve the phosphorus availability. Genetic manipulation of plants is a suitable tool to produce phosphorus releasing enzymes, thereby increasing the biomass and decreasing the content of phytic acid in plants. In this work I generated transgenic plants of Nicotiana tabacum and Hordeum vulgare vulgare which successfully express the phytase gene phyK from Klebsiella pneumonia ASR1 and phyC from Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Chromatographically purification strategies were developed and biochemical properties were characterized for all phytase proteins. All enzymes were active and PhyC was posttranslational modified. The effect of the recombinant phytase activity to total phosphorus, phytic acid and anorganic phosphorus content of barley seeds were elucidated. The phyK-expression in barley seeds yield a reduction of phytic acid content of about 19 % and an increase of anorganic phosphorus of about 78 %. Transgenic barley seeds with phyC gene expression show an increase of anorganic phosphorus content from 27 % to 48 % but no decrease in phytic acid content. In growth experiments no special phenotypes of plant containing the recombinant protein were visible. The insertion of apoplastic signal sequences in front of the phytase genes resulted in secretion of the proteins into the rhizosphere. The secretion of PhyC led to an improved growth of Nicotiana tabacum under unsterile conditions with sodium phytate as single phosphorus source increasing the biomass up to 34 %
Cloning and characterization of two glycosidases from the acidothermophile Alicyclobacillus acidocaldarius ATCC27009
Full text linkZwei Glykosylhydrolasen des acidothermophilen Bakteriums Alicyclobacillus acidocaldarius konnten charakterisiert werden. Die jeweiligen Gene wurden kloniert und sequenziert. Das intrazelluläre Enzym CelA und das extrazelluläre Enzym CelB könnten zusammen eine tragende Rolle im Abbau von beta-1,4-verknüpften Polysacchariden spielen. Ein Gen, welches für eine beta-1,4-Endoglucanase (CelA) kodiert, wurde kloniert und überexpremiert. Das Enzym wurde gereinigt. Das Protein besitzt eine Immunoglobulin-ähnliche Domäne, jedoch keine Cellulosebindedomäne. Zusammen mit den Sequenzähnlichkeiten der katalytischen Domäne zeigen diese Merkmale, daß das Protein zur Familie 9, Untergruppe E1 der Glykosylhydrolasen gehört. CelA zeigte höchste Aktivität gegenüber beta-1,4-Glucanen, besaß jedoch auch Aktivität gegen Haferspelzenxylan. Das Enzym hatte ein pH optimum von 5.5 und ein Temperaturoptimum von 70 °C. Im Protein waren zwei Zink- und zwei Calcium-Ionen gebunden, die wahrscheinlich wichtig für die Temperaturstabilität sind. Gegenüber p-Nitrophenylglykosiden ergab sich ein überraschendes Hydrolysemuster: Höchste Aktivität wurde auf dem Cellobiosidderivat gefunden, eine niedrigere Aktivität fand sich auf dem Cellotetraosederivat, wohingegen keine Aktivität auf den Glucose- und Cellotriosederivaten gemessen wurden. Das Hydrolysemuster führte zu dem Schluß, daß in CelA die Bindung von beta-1,4-Glucanen entweder auf der nicht reduzierenden Seite der -2 Substratunterbindestelle sterisch verhindert wird, oder alternativ zwei starke Substratunterbindestellen -1 und -2 vorhanden sind. Es wurde kein Signalpeptid zur Markierung des Proteins für die Translokation über die Membran gefunden. Zusammen mit der hohen Aktivität gegenüber Oligosacchariden, dem fast neutralen pH Optimum und der Inaktivierung bei niedrigem pH, deutet dies auf eine Rolle des Proteins als cytoplasmatisches Enzym zum Abbau importierter Oligosaccharide hin. Ein zweites Enzym mit Xylanase- und Cellulaseaktivität wurde zunächst aus A. acidocaldarius Kulturen gereinigt. CelB besaß eine molekulare Masse von 100 kDa und konnte nur mit Hilfe von Detergenz von den Zellen abgelöst werden. Klonierung und Sequenzanalyse des entsprechenden Gens ergaben einen offenen Leserahmen, welches für ein Präprotein kodierte, das ein typisches Sec-abhängiges Signalpeptid besaß. Gereinigtes, rekombinantes CelB und eine verkürzte Variante, der die letzten 203 Aminosäuren fehlten, zeigten Enzymaktivitäten, die dem Wildtypprotein ähnlich waren. Ein niedriges pH-Optimum von 4 wurde bestimmt. Auch die Stabilität war bei niedrigem pH hoch, wobei das Enzym nach Inkubation über nacht bei pH 1.5 bis 7 eine Restaktivität von 80 % aufwies. Das Temperaturoptimum betrug 80 °C. Bei dieser Temperatur war das Enzym auch stabil und zeigte nach 1 h 60 % Restaktivität. CelB hatte die Spezifität eines Endoenzyms, jedoch wurden nach längeren Inkubationszeiten Cellobiose und Xylobiose aus Cellulose bzw. Xylan freigesetzt. Das Enzym gehörte zur Familie 51 der Glykosylhydrolasen, aber es war erst der zweite Eintrag dieser Familie mit typischer Endoglucanaseaktivität. CelB hatte höchste Sequenzähnlichkeit mit der zweiten Endoglucanase, EGF aus Fibrobacter succinogenes, wobei diese beiden Proteine eine markante Gruppe im phylogenetischen Baum dieser Familie bildeten. Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung der katalytischen Domänen ergab, daß CelB in Übereinstimmung mit der Anpassung an einen niedrigen pH-Wert, weniger geladene Aminosäuren als die neutrophilen Enzyme der gleichen Familie besitzt. Wildtyp-CelB und unverkürztes, rekombinantes CelB waren nur in Anwesenheit von Detergenz löslich. Dagegen war das verkürzte CelB Protein vollständig in Wasser löslich. Daher wird eine Rolle der C-terminalen Region bei der Zellassoziation nahegelegt. Dieser hydrophobe Bereich zeigte lokale Übereinstimmungen der Aminosäuresequenz mit einer hydrophoben Region einer Amylase aus dem gleichen Organismus.Two glycoside hydrolases from the thermoacidophilic bacterium Alicyclobacillus acidocaldarius were characterized and the corresponding genes cloned and sequenced. Together the intracellular enzyme CelA and the extracellular enzyme CelB may play a major role in the degradation of beta-1,4-linked polysaccharides. A gene encoding a beta-1,4-endoglucanase (CelA) was cloned and the enzyme overexpressed and purified. The protein contained an immunoglobulin-like domain but lacked a cellulose-binding domain. In conjunction with sequence similarities of the catalytic domain these features demonsrated the protein to be a member of glycoside hydrolase family 9, subgroup E1. CelA was most active against substrates containing beta-1,4-linked glucans, but also exhibited activity against oat spelt xylan. It displayed a pH optimum of 5.5 and a temperature optimum of 70 °C. The protein was found to contain one zinc and two calcium ions, likely to be important for temperature stability. It showed a striking pattern of hydrolysis on p-nitrophenyl glycosides, with highest activity on the cellobioside derivative, some on the cellotetraoside derivative and none on the glucoside and trioside derivatives. The hydrolysis patterns led to the conclusion that CelA contained a steric block for beta-1,4-linked glucans on the non reducing side of subsite -2 or, alternatively, two strong binding sites -1 and -2. No signal peptide for transport of CelA across the membrane was detected. This, together with high activity on oligosaccharides, a near neutral pH optimum, and inactivation at low pH, suggests a role for the protein as a cytoplasmic enzyme for the degradation of imported oligosaccharides. A second enzyme with xylanase and cellulase activity was purified from A. acidocaldarius cultures. CelB displayed a molecular mass of 100 kDa and could only be removed from cells with the help of detergent. Cloning and sequence analysis of the corresponding gene revealed an ORF encoding a preprotein with a typical sec-dependent signal peptide. Purified recombinant CelB and a truncated varient lacking the C-terminal 203 amino acid residues displayed enzymatic properties similar to the wild-type protein. A low pH optimum of 4 was found. Stability was also high at low pH, the enzyme retaining 80 % of activity after incubation over night from pH 1.5 to 7. The temperature optimum was 80 °C, a temperature at which the enzyme was also stable, showing 60 % residual activity after 1 h. CelB displayed an endo mode of action, but release of cellobiose and xylobiose from cellulose and xylan, respectively, was observed after prelonged periods of incubation. CelB belonged to glycoside hydrolase family 51, but it was only the second entry in this family with activity typical of an endoglucanase. Highest sequence similarity was found towards the other endoglucanase, EGF from Fibrobacter succinogenes, the two forming a distinct group in the phylogenetic tree of this family. Analysis of the amino acid composition of the catalytic domains demonstrated that CelB contains fewer charged amino acids than its neutrophilic counterparts, which is in line with adaptation to low pH. Wild-type and full-length recombinant CelB were soluble only in detergent. In contrast, truncated CelB was completely water soluble, suggesting a role of the C-terminal region in cell association. This C-terminal hydrophobic region displayed local sequence similarities to a hydrophobic region of an amylase from the same organism
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