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Protective activity of aromatic amines and imines against oxidative nerve cell death
No full textOxidative stress is a widespread phenomenon in the pathology of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and amyotrophic lateral sclerosis. Neuronal cell death due to oxidative stress may causally contribute to the pathogeneses of these diseases. Therefore, neuroprotective antioxidants are considered to be a promising approach to slow down disease progression. We have investigated different aromatic amine and imine compounds for neuroprotective antioxidant functions in cell culture, and found that these compounds possess excellent cytoprotective potential in diverse paradigms of oxidative neuronal cell death, including clonal cell lines, primary cerebellar neurons, and organotypic hippocampal slice cultures. Aromatic amines and imines are effective against oxidative glutamate toxicity, glutathione depletion, and hydrogen peroxide toxicity. Their mode of action as direct antioxidants; was experimentally confirmed by electron spin resonance spectroscopy, cell-free brain lipid peroxidation assays, and intracellular peroxide measurements. With half-maximal effective concentrations of 20-75 nm in different neuroprotection experiments, the aromatic imines phenothiazine, phenoxazine, and iminostilbene proved to be about two orders of magnitude more effective than common phenolic antioxidants. This remarkable efficacy could be directly correlated to calculated properties of the compounds by means of a novel, quantitative structure-activity relationship model. We conclude that bridged bisarylimines with a single free NH-bond, such as iminostilbene, are superior neuroprotective antioxidants, and may be promising lead structures for rational drug development
Untersuchung der Expression zentraler Mitophagie-Regulatorproteine im humanen Zellmodell der Parkinsonschen Krankheit
No full textIn der vorliegenden Arbeit wurden die Konsequenzen der MPP+-Exposition auf die Morphologie, Dynamik und die Elimination von Mitochondrien bzw. auf die Expression zentraler Mitophagie-Regulatorproteine bei der Parkinsonschen Krankheit, einer chronischen und progredienten
neurodegenerativen Erkrankung, im humanen Zellmodell erforscht. Mitochondrien sind bei der Parkinsonschen Krankheit stark betroffen, da unter anderem mitochondriale Dysfunktion und oxidativer Stress eine Rolle in der Pathogenese der Krankheit spielen. Mitochondriale Dysfunktion geht mit epigenetischen Veränderungen einher, die mit einer erhöhten Expression zellkernkodierter Untereinheiten der mitochondrialen Atmungskette verbunden sind. Da dies möglicherweise ein kompensatorischer Mechanismus der Neurone ist, die mitochondriale Funktion zu verbessern und aufrecht zu erhalten, sollten in dieser Arbeit die Auswirkungen einer Inhibition der mitochondrialen Atmungskette auf die mitochondriale Morphologie, Dynamik und Elimination der Mitochondrien untersucht werden. Darüber hinaus sollten die Effekte von Phenothiazin auf diese Prozesse untersucht werden.
Es zeigten sich unter Exposition mit 10 μM MPP+ und dem MitoTracker Red Farbstoff morphologische Veränderungen in den untersuchten LUHMES-Zellen, die mit einer erhöhten Fragmentierung von Mitochondrien vereinbar sind. Diese Ergebnisse ähnelten denen, die von Prasertsuksri et al. und Jang et al. beschrieben wurden (Prasertsuksri et al., 2023; Jang et al., 2018). Weiterhin zeigte sich, dass MPP+ als bekannter Komplex-I-Inhibitor in LUHMES-Zellen nicht zu einer kompletten Inhibition des Komplex I führte. Eine Komplex-I-Inhibition führt generell zu einer erhöhten ROS-Produktion (Kitamura et al., 1998; Rossetti et al., 1988), beeinträchtigt die oxidative Phosphorylierung und involviert eine verminderte ATP-Synthese (Ramsay et al., 1991; Di Monte et al., 1986). Mit einer verminderten ATP-Synthese geht wiederum ein Verlust des Δψm einher (Blum et al., 2001). Dies hat Konsequenzen auf verschiedene Stoffwechselpfade bzw. Funktionen der Mitochondrien.
Die Proteinimportmaschinerie betreffend zeigte sich, dass MPP+ zu einer signifikanten Reduktion des TIM23-Proteinspiegels führte. Da der Proteinimport an der IMM vom Δψm abhängig ist (Becker et al., 2019), deutet der signifikant reduzierte TIM23-Proteinspiegel auf eine mögliche Co-
Regulation von Δψm und TIM23 hin. Reduzierte TIM23-Spiegel sind bekanntermaßen mit einem beeinträchtigten Proteinimport an der IMM verbunden (Franco-Iborra et al., 2018). Als Konsequenzen der MPP+-Behandlung auf die mitochondriale Dynamik zeigten sich signifikant reduzierte Proteinspiegel für das membrangebundene mitochondriale Fissionsprotein Mff und die ebenfalls membrangebundenen Fusionsproteine Mfn1, Mfn2 und Opa1, was auf einen Verlust dieser Proteine durch Induktion der Mitophagie hindeutet. Das zytosolische Fissionsprotein DLP1 hingegen war unter MPP+ kaum verändert, was damit erklärt werden könnte, dass es entweder konstant reguliert wird oder eine geringere Rolle bei der Fission spielt als bisher angenommen. Dies zeigen auch Ergebnisse aus Knockout-Mäusen, in denen es trotz DLP1-Mangel zu Mitophagie kam (Burman et al., 2017).
Die Untersuchung des sehr gut bekannten PINK1/Parkin-abhängigen Mitophagieweges zeigte überraschenderweise und entgegen der Erwartung keine erhöhten PINK1-Proteinspiegel als Korrelat einer Aktivierung dieses Signalweges, sondern einen tendenziell erniedrigten Proteinspiegel. Auch das zytosolische Parkin war tendenziell vermindert. Möglicherweise könnte es durch Aktivierung eines alternativen Signalwegs zu einer Indifferenz von PINK1 und Parkin auf MPP+ kommen. Daher wurde der BNIP3L/Nix-vermittelte Mitophagie-Signalweg ebenfalls untersucht. Hier zeigte sich ein hochsignifikantes Ergebnis mit stark reduzierten Proteinspiegeln unter MPP+, was vermuten lässt, dass in LUHMES-Zellen unter MPP+ nicht der PINK1/Parkin-Signalweg, sondern der rezeptorvermittelte BNIP3L/Nix-Signalweg aktiviert wird. Eine Induktion der Mitophagie unter MPP+ führt somit einerseits zur Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase, indem dysfunktionale und geschädigte Mitochondrien eliminiert werden,
andererseits kann eine gesteigerte Mitophagie durch vermehrte Fissionsereignisse mit einem solchen Verlust an Mitochondrien verbunden sein, dass es zu einer Störung des mitochondrialen Stoffwechsels kommt (Jin et al., 2018; Pöltl et al., 2012).
Es bedarf zukünftiger weiterer Untersuchungen, um insbesondere die hier erhaltenen Ergebnisse der BNIP3L/Nix-vermittelten Mitophagie zu untermauern und weiter zu erforschen.
In dieser Arbeit wurde auch die antioxidative Wirkung von Phenothiazin (PHT) auf die MPP+-induzierte Modulation der mitochondrialen Morphologie, Dynamik und Mitophagie analysiert. Dabei konnte mit einer niedrigen nanomolaren Konzentration von 20 nM gezeigt werden, dass
PHT auf die morphologischen Veränderungen unter MPP+ einen ausgeprägten und deutlich sichtbar revertierenden Effekt hat. Da die Komplex-I-Inhibition durch MPP+ einerseits mit einer erhöhten ROS-Produktion (Kitamura et al., 1998; Rossetti et al., 1988) und dem Risiko für oxidativen Stress einhergeht (Drechsel und Patel, 2008), in dessen Folge Mitochondrien geschädigt werden, andererseits mit einer Beeinträchtigung der OXPHOS und dem Risiko für den Verlust des Δψm mit Depolarisation, benötigt das Mitochondrium eine homöostatische Antwort. Die selektive Abtrennung geschädigter Anteile mit noch vorhandenem Δψm konnte gezeigt werden. PHT lieferte durch seinen deutlich mindernden Effekt auf die Fragmentierung den Nachweis, dass es vor oxidativer Schädigung schützen und die mitochondriale Integrität zu erhalten vermag. Diese Ergebnisse ähnelten denen von PHT in vivo, das in dopaminergen Neuronen der Substantia nigra eine antioxidative Wirkung zeigte und signifikant vor Schäden
durch oxidativen Stress schützen konnte (Tapias et al., 2019).
Für die Fissionsproteine Mff und DLP1, die Fusionsproteine Mfn1 und Mfn2 sowie die Mitophagieproteine PINK1 und Parkin konnten allenfalls mild schützende Wirkungen von PHT beobachtet werden, die jedoch nicht signifikant waren. Dies impliziert, dass die Mito-Fission und Mito-Fusion hier im wesentlichen ROS-unabhängig induziert wurden. Für die Translokase der inneren Mitochondrienmembran TIM23 und das Fusionsprotein der inneren Mitochondrienmembran Opa1, deren beide Funktionen vom Δψm über der inneren Mitochondrienmembran abhängen, konnten die unter MPP+ signifikant reduzierten Proteinspiegel durch die Gabe von PHT signifikant erhöht werden. PHT zeigte also einen signifikanten Effekt und war möglicherweise in der Lage, das Δψm zu schützen. Diese Ergebnisse koinzidieren durchaus mit in vivo-Neuronen, in denen PHT die Komplex-I-Aktivität stabilisieren (Tapias et al., 2019) und zur Aufrechterhaltung des Δψm beitragen konnte.VI, 144 Seiten ; Illustrationen, Diagramm
Untersuchung der Auswirkungen einer reversiblen Blockade von NMDA-Rezeptoren in vivo auf die Expression und den Phosphorylierungsstatus des Mikrotubuli- assoziierten Proteins Tau
No full textix, 65 Seiten : Illustrationen, Diagramm
Antioxidant structural functions of tyrosine and tryptophan in membrane proteins and peptide hormones
No full text0\. Titelseite und Inhaltsverzeichnis
1\. Einführung 6
2\. Material und Methoden 13
3\. Ergebnisse 27
4\. Diskussion und Perspektive 52
5\. Referenzen 68
6\. Abkürzungsverzeichnis 82
7\. Danksagung 84
8\. Publikationen des Autors 85
9\. Zusammenfassung 87
10\. Summary 89Die Transmembrandomänen integraler Membranproteine zeigen eine
außergewöhnliche Anreicherung mit den Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan,
besonders ausgeprägt in der Region, die dem Bereich der höchsten Dichte in der
Lipidmembran entspricht. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß diese
beiden Aminosäuren essentielle antioxidative Funktionen in der Lipidmembran
ausüben und die Zelle vor oxidativer Zerstörung schützen. Tyrosin und
Tryptophan enthaltende Peptide mit Sequenzen, wie sie in den
Transmembrandomänen verschiedener integraler Membranproteine auftauchen,
verhindern die Disintegration der Zellmembran und den Zelltod neuronaler
Zellen unter oxidativem Streß. Langkettig acylierte Tyrosin- und
Tryptophanderivate, nicht jedoch Derivate des Phenylalanins, anderer
Aminosäuren, und auch nicht nur kurzkettig acylierte Derivate, sind effektive
Inhibitoren der zellulären Peroxidakkumulation, der Lipidperoxidation sowie
des oxidativen Zelltods. Die antioxidative Funktion von intramembranärem
Tyrosin und Tryptophan liefert eine spezifische Erklärung für ihr distinktes
Verteilungsmuster in Transmembranproteinen sowie möglicherweise auch für die
hohe Vulnerabilität der sich durch einen sehr niedrigen Membranproteingehalt
auszeichnenden neuronalen Membranen gegenüber oxidativem Streß. Diese hohe
Vulnerabilität wird bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen
beobachtet, und langkettig acylierte Tyrosin- und Tryptophanderivate könnten
Dank ihrer potentiellen Blut-Hirn-Schrankengängigkeit interessante
Leitstrukturen für die pharmazeutische Entwicklung neuroprotektiver Agentien
sein. Peptidhormone sind eine zweite, in dieser Arbeit neu beschriebene Klasse
endogener, antioxidativ wirksamer Strukturen, deren radikalmodulatorische
Effekte auf ihren Tyrosin-und Tryptophangehalt zurückzuführen sind. Die
kurzkettigen sekretorischen Peptide LHRH, Enkephalin, Angiotensin und Oxytocin
wirken als biochemische Antioxidantien in wäßrigen Systemen. Sie reagieren
direkt mit freien Peroxylradikalen, verhindern die Oxidation von LDL, und sie
hemmen die Peroxidation von Hirnmembranen. Außerdem sättigen sie reaktive
Stickstoffspezies wie Stickstoffmonoxid und Peroxynitrit ab und wirken als
direkte Spinquencher, wobei ihre antioxidativen Eigenschaften auf dem
Vorhandensein frei zugänglicher Tyrosin- und Tryptophanreste beruhen. Als
Produkte aus der Reaktion von Peptidhormonen mit freien Radikalen lassen sich
verschiedene Peptid-Radikal-Addukte sowie auch modifizierte Peptiddimere
nachweisen. Signifikante antioxidative Effekte werden in nanomolaren
Konzentrationen beobachtet. Vermutlich stellen sekretorische Peptidhormone
somit einen wichtigen Teil des endogenen antioxidativen Verteidigungssystems
dar, und die direkte chemische Wechselwirkung zwischen radikalischen
Signalmolekülen wie Peroxynitrit und Peptidhormonen könnte ein ungewöhnlicher
Typus des Crosstalks zwischen biologischen Signalen sein. Das Potential der
beschriebenen Antioxidantien für die Entwicklung neuer Pharmaka für den
Einsatz bei degenerativen Erkrankungen des Menschen wird diskutiert.
Schließlich werden die gefundenen, generellen antioxidativen Eigenschaften
Tyrosin- und Tryptophan-tragender Strukturen mit einigen bislang nicht in
diesem Zusammenhang diskutierten biochemischen Erkenntnissen in Beziehung
gesetzt, und es wird die Hypothese aufgestellt, daß Tyrosin und Tryptophan
evolutiv sehr junge Aminosäuren sind, die erst nach dem Auftreten von
Sauerstoff in der Biosphäre vor 2,5 Milliarden Jahren zu den anderen codierten
Aminosäuren hinzugekommen sind.The transmembrane domains of integral membrane proteins show an astounding
accumulation of tyrosine and tryptophan residues, especially in the membrane
region with the highest lipid density. It is shown that these residues perform
vital antioxidant functions inside lipid bilayers and protect cells from
oxidative destruction. First, tyrosine- and tryptophan-containing peptides
representing stretches from the transmembrane domains of different integral
membrane proteins prevent oxidative lysis in neuronal cells. Second, long-
chain acylated tyrosine and tryptophan, but not phenylalanine, other amino
acids, or short-chain acylated derivatives, are potent inhibitors of
intracellular peroxide accumulation, lipid peroxidation, and oxidative cell
death of clonal cells, primary neurons and organotypic slice cultures. The
antioxidant functions of tyrosine and tryptophan provide a specific
explanation for (i) their unique transmembrane distribution pattern and (ii)
the high vulnerabiliy of low-protein neuronal membranes to oxidative stress,
which is a characteristic phenomenon observed in neurodegenerative disorders.
Due to their high antioxidant efficacy and their presumed active passage
through the blood-brain barrier, long-chain acylated tyrosine and tryptophan
derivatives might be very promising lead structures for neuroprotective drug
design. A second novel class of endogenous antioxidant structures whose
radical-modulatory effects are based on tyrosine and tryptophan residues, are
peptide hormones. The short-chain secretory peptides luteinizing hormone
releasing hormone (LHRH), enkephalin, angiotensin, and oxytocin, are
biochemical antioxidants in aqueous medium. They directly scavenge free
peroxyl radicals, they prevent the oxidation of low-density lipoprotein, and
they inhibit lipid peroxidation in brain membranes. Their capacity to directly
suppress free radical-mediated reactions is demonstrated by electron spin
resonance spectroscopy. Electrospray ionisation mass spectrometry analysis of
the free radical-quenching reaction reveals distinct oxidation products,
including peptide dimers. Moreover, secretory peptide hormones can scavenge
reactive nitrogen species derived from nitric oxide and peroxynitrite. A
structure-activity relationship analysis indicates that their antioxidant
activity is based on the occurrence of solvent-exposed tyrosine and tryptophan
residues, which is consistent with the mass spectrometry results. Significant
effects in vitro can be observed at nanomolar concentrations, which makes
these peptides comparable in potency to classical low molecular mass
antioxidants. It is concluded that (i) secretory peptide hormones may
constitute an important part of the endogenous antioxidant defence system, and
that (ii) the immediate chemical interaction between radical signalling
molecules and peptide hormones might represent a special type of direct cross-
talk between biological signals. The potential of the described novel
antioxidant molecules with respect to drug design and pharmacological use in
human disease is discussed. Finally, the elucidated general antioxidant
properties of tyrosine- and tryptophan-based cellular structures are combined
with biochemical knowledge from other disciplines leading to the hypothesis
that tyrosine and tryptophan may be two young amino acids from an evolutionary
point of view, whose advent might have been triggered by the appearance of
molecular oxygen in the biosphere 2.5 billion years ago
Respiratory chain cysteine and methionine usage indicate a causal role for thiyl radicals in aging
No full textConditional immortalization of human B cells by CD40 ligation
No full textIt is generally assumed that human differentiated cells have a limited life-span and proliferation capacity in vivo, and that genetic modifications are a prerequisite for their immortalization in vitro. Here we readdress this issue, studying the long-term proliferation potential of human B cells. It was shown earlier that human B cells from peripheral blood of healthy donors can be efficiently induced to proliferate for up to ten weeks in vitro by stimulating their receptor CD40 in the presence of interleukin-4. When we applied the same stimuli under conditions of modified cell number and culture size, we were surprised to find that our treatment induced B cells to proliferate throughout an observation period of presently up to 1650 days, representing more than 370 population doublings, which suggested that these B cells were immortalized in vitro. Long-term CD40-stimulated B cell cultures could be established from most healthy adult human donors. These B cells had a constant phenotype, were free from Epstein-Barr virus, and remained dependent on CD40 ligation. They had constitutive telomerase activity and stabilized telomere length. Moreover, they were susceptible to activation by Toll-like receptor 9 ligands, and could be used to expand antigen-specific cytotoxic T cells in vitro. Our results indicate that human somatic cells can evade senescence and be conditionally immortalized by external stimulation only, without a requirement for genetic manipulation or oncoviral infection. Conditionally immortalized human B cells are a new tool for immunotherapy and studies of B cell oncogenesis, activation, and function
Antioxidant neuroprotection in Alzheimer’s disease as preventive and therapeutic approach2 2This article is part of a series of reviews on “Causes and Consequences of Oxidative Stress in Alzheimer’s Disease.” The full list of papers may be found on the homepage of the journal.
No full textCytoprotective antioxidant function of tyrosine and tryptophan residues in transmembrane proteins
No full text- …
