1,720,989 research outputs found
Untersuchung des Beitrags nicht-kodierender Neumutationen zur genetischen Ätiologie von nicht-syndromalen Lippen-Kiefer-Gaumenspalten
Full text linkIm Rahmen dieses Promotionsprojektes wurde die Rolle von nicht-kodierenden de novo Mutationen (DNMs) bei der Entstehung nicht-syndromaler Lippen-Kiefer-Gaumenspalten (nsCL/P) untersucht. Dafür wurde ein Datensatz von Genomsequenzierungsdaten von betroffenen Individuen sowie deren Eltern aus dem Gabriella Miller Kids First Programm analysiert. Um ätiologisch relevante DNMs zu priorisieren, wurden die identifizierten DNMs u. a. mit funktionellen Datensätzen und Risiko-Scores annotiert und deren Verteilungen mit den Daten einer Kontroll-Kohorte verglichen. Während die meisten Vergleichsanalysen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Kohorten zeigten, konnten wir signifikante Anreicherungen von DNMs in zwei topologically associating domains beobachten, welche bereits durch häufige Risikovarianten in der Ätiologie der nsCL/P (Locus 4q28 und 2p21) bekannt waren. Diese Konvergenz von häufigen und seltenen Varianten bestärkt die Relevanz dieser Risikoloci für nsCL/P und legt Varianten für mögliche funktionelle Untersuchungen nahe. Durch die systematische in silico Auswertung von Transkriptionsfaktorbindestellen und deren Beeinflussung durch DNMs wurden Kandidaten-Transkriptionsfaktoren vorhergesagt, welche über ihre molekularen Netzwerke zur nsCL/P beitragen könnten. Durch Integration von externen funktionellen Datensätzen und molekularen Validierungsexperimenten wurde dadurch der in der kraniofazialen Muskelentwicklung involvierte Transkriptionsfaktor Musculin (MSC) als Kandidat identifiziert. Eine mögliche Beteiligung von MSC in der Ätiologie von nsCL/P wird durch weitere subklinische Phänotypen von nsCL/P und das molekulare Netzwerk, in dem auch weitere, durch genomweite Assoziationsstudien identifizierte nsCL/P Risikogene involviert sind, bestätigt. Die Ergebnisse dieses Projekts liefern einerseits Hinweise für Kandidaten-DNMs und potenziell zugrundeliegende funktionelle Mechanismen für nsC/LP, andererseits sind die hier entwickelten Strategien auf WGS-Daten anderer Phänotypen (speziell Fehlbildungen) übertragbar
Cellular and molecular dynamics of splenic myeloid cells during blood-stage malaria
Full text linkThe spleen is a secondary lymphoid organ with the essential function of maintaining blood homeostasis through its function as a filtering system. Aberrant erythrocytes and infectious particles are recognized and eliminated by specialized phagocytes, the splenic macrophages, that reside in the spleen. These splenic macrophages have different specializations and phenotypes dependent on their sub-tissular niche of residence. To date, four different macrophage subtypes have been identified in distinct splenic compartments: red pulp macrophages (RPM), marginal metallophilic macrophages, marginal zone macrophages and white pulp macrophages. The ontogeny and function of these different splenic macrophages is incompletely understood. Here, novel fate-mapping models were developed to discover new biology on the fate and function of the splenic macrophage populations during steady-state and in the context of parasitic or viral infection. With high-dimensional flow cytometry and immunofluorescent imaging, a so far unrecognized CD163+ RPM subpopulation that develops early during embryogenesis was identified. The CD163 receptor is responsible for uptake of free heme and thereby prevents oxidative stress in the tissue. To understand the functional role of the CD163 receptor on RPM, mice were challenged with blood-stage malaria infection, and the dynamics of the splenic macrophage populations studied. As part of the natural course of infection, Plasmodium parasites cause erythrolysis and the release of free heme. Upon challenge with blood-stage malaria, CD163+ RPM disappeared seven days after infection with P. chabaudi, P. bergheii, and P. yoelii, while CD163- RPM were completely replenished by monocyte-derived macrophages. The splenic architecture was disrupted during acute-phase malaria, and the distinct anatomical zones of red and white pulp, which harbor different macrophage subpopulations, were dissolved. However, while the splenic architecture recovered after the resolution of infection, the spatiotemporal myeloid cell dynamics and functions remained altered. Longitudinal studies, including chloroquine treatment to achieve sterile control of infection, revealed that CD163+ RPM did not recover after 90 days, when the tissue largely returned to its homeostatic state. Using single-cell RNA-sequencing, two distinct cluster of RPM were identified with differential expression of CD163 in the steady-state. The annotated CD163+ RPM cluster remained 90 days after P. chabaudi infection, but CD163 expression was at almost absent compared to expression observed in naïve mice, indicating a persistence of this macrophage population per se, but an inability of these cells to express CD163 after parasite exposure. The failure to express CD163 after infection was also observed in viral infection-models and caused a partial loss of the CD163+ RPM population, that does not recover to steady-state numbers long-term. To test the function of the CD163 receptor, CD163-/- mice were infected showing that CD163 had no impact on the control of parasitemia but lead to an abrogated regeneration of the structure of the marginal zone. In contrast, genetic deficiency of marginal zone macrophages resulted in increased parasitemia during the acute phase of the infection. In summary, this study presents a comprehensive ontogenetic and functional map of splenic macrophage populations and provides evidence that the tight interplay of RPM and marginal zone macrophages is important to resolve malaria infection
MicroRNA-149 ist assoziiert mit der Bildung von orofazialen Spalten und veränderter Neuralleistenzell-Migration
Full text linkDie vorliegende Studie befasst sich mit der Untersuchung von miRNAs im Zusammenhang mit der Gesichtsentwicklung und fragt, inwieweit diese eine Rolle bei der Ausbildung der nsCL/P (non-syndromic cleft lip with or without cleft palate), einer häufigen angeborenen Fehlbildung des Menschen, spielen. Besonderer Wert wurde bei der Identifizierung relevanter miRNAs auf die Nutzung humaner Gewebe gelegt, um die Integration mit genetischen Daten zu nsCL/P zu ermöglichen. Mittels systematischer Expressionsanalysen in Neuralleistenzellen (neural crest cells, NCC) wurde miR-149 als mögliche Kandidaten-miRNA in NCC-vermittelten molekularen Prozessen identifiziert. Durch die Analyse von umfangreichen genetischen Daten von nsCL/P-Patienten und Kontrollkohorten konnte Evidenz für einen Zusammenhang zwischen einer nah am miRNA149-liegenden genetischen Variante (rs4921515) und dem erhöhten Risiko für eine Spaltbildung im Gesicht erhalten werden. Als potenzieller Pathomechanismus wurde dabei durch in vitro-Manipulation von NCC die Beeinflussung der Zellmigration nahegelegt. Die Studie, welche durch den Einsatz verschiedener state of the art-Technologien wie z.B. in vitro-Manipulation induzierter pluripotenter Stammzellen und molekularer Hochdurchsatz-Analysen ermöglicht wurde, gibt somit Hinweise auf die Rolle der miRNA-149 in der humanen Gesichtsentwicklung. Die Ergebnisse bedürfen jedoch weiterer unabhängiger Untersuchungen, um die erhobenen genetischen Befunde zu validieren und die Rolle von miR-149 in Bezug auf die kraniofaziale Entwicklung genauer zu verstehen. Der generierte Datensatz zur miRNA-Expression in NCC kann für weitere explorative Analysen, auch in anderen NCC-vermittelten Phänotypen, verwendet werden
Identifizierung seltener genetischer Varianten als Ursache für schweres COVID-19
Full text linkDiese Arbeit untersucht den bisher nur zum Teil verstandenen Zusammenhang zwischen seltenen Wirts-genetischen Varianten und schwerem COVID-19 in 52 Kandidatengenen in einer spanisch/italienischen Kohorte mit 1.772 schwer an COVID-19 Erkrankten und 5.347 Populations-basierten Kontrollen. Insbesondere unter Stratifizierung nach Risikofaktoren wie Alter und Vorerkrankungen zeigten seltene, schädliche Varianten im Gen TLR7 eine signifikante Assoziation zu schwerem COVID-19. Zusätzliche funktionelle sowie 3D-Proteinstruktur-basierte Daten zu Varianten-Pathogenität führten zu höheren Effektstärken. Während bei Männern in Vorarbeiten insbesondere ein X-chromosomal rezessiver Mechanismus diskutiert wurde, stellt diese Arbeit eine neue Hypothese für einen Pathomechanismus bei Frauen auf. Demnach könnten bei Frauen Varianten in Nähe des Dimerisierungs-Interface einen dominant-negativen Effekt durch Beeinträchtigung der Dimerisierung von TLR7 zeigen. Weiterhin wurden in den Genen IFIH1, IFNAR2 und TBK1 Hinweise auf Assoziationen zwischen seltenen Varianten und schwerem COVID-19 gefunden. Insgesamt bietet diese Arbeit deutliche Evidenz für eine Beteiligung von seltenen pathogenen TLR7-Varianten in der Ätiologie von schwerem COVID-19 und zeigt, dass Risikostratifizierung sowie differenzierte Variantenbewertung durch funktionelle in vitro Untersuchungen oder 3D-Proteinstruktur-Analysen die statistische Power von Studien zu seltenen genetischen Varianten erhöhen können
Activation of NLRP3 inflammasome accelerates tau pathology
No full textAlzheimer’s disease (AD) is characterized by the extracellular accumulation of amyloid beta (Aβ), intraneuronal formation of neurofibrillary tangles composed of hyperphosphorylated tau, and activation of microglia, which are the innate immune cells of the brain. Aβ activates microglia to induce NLRP3, ASC and caspase-1 to assemble into the NLRP3 inflammasome. This complex stimulates the production and secretion of inflammatory mediators such as IL-1β and ASC specks.
Here we investigated how the NLRP3 inflammasome contributes to the development and progression of tau pathology. Knockout of Asc or Nlrp3 from mice expressing human tau (“Tau22 mice”) reduced the activity of the tau kinases CaMKII and GSK-3β while promoting the activity of the tau phosphatase PP2A. This strongly protected mice from accumulation of hyperphosphorylated, misfolded tau. These protective effects were stronger in the absence of NLRP3 than in the absence of ASC. We confirmed these protective effects in vitro by incubating primary hippocampal neurons from Tau22 mice in conditioned medium from primary microglia that had been isolated from wild-type, Nlrp3–/– or Asc–/– mice and stimulated with LPS and ATP. Conditioned medium from microglia lacking NLRP3 or ASC led to less tau phosphorylation and accumulation as well as lower CaMKII activity in the hippocampal neurons. Inhibition of the IL-1 receptor or its downstream effectors IRAK4 or MEK1/2 protected the neurons from these effects. Injecting ASC specks directly into the hippocampus induced tau hyperphosphorylation and aggregation in Tau22 mice, but not Tau22/Asc–/– or Tau22/Nlrp3–/– mice. These results suggest that NLRP3 acts via IL-1β signaling to drive tau pathology and potentially also link tauopathy with Aβ pathology.
This work supports the hypothesis that innate immune activation contributes to tau pathology. In Alzheimer’s disease, early Aβ deposition may induce NLRP3-mediated innate immune responses that lead to tau pathology and neuronal demise. Furthermore, this works shows that NLRP3 inflammasome activations also play a direct role in tauopathies independent of Aβ. In this way, the present work may help to develop new therapies against the disease
The influence of repeat expansions in myotonic dystrophy on the cellular stress response and type I interferon production
Full text linkDie myotone Dystrophie ist eine Multisystemerkrankung, die sich hauptsächlich durch Myotonie, Muskelschwäche, sowie einen früh beginnenden Katarakt und kardiale Erregungsleitungsstörungen auszeichnet. Im Laufe der Zeit wurden zwei Typen dieser Erkrankung definiert, welche auf unterschiedlichen genetischen Defekten basieren. Dem Typ 1 der myotonen Dystrophie (DM1) liegt eine Expansion der CTG-Wiederholungssequenz im 3‘-untranslatierten Bereich des myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) Gens auf dem Chromosom 19q13.3 zugrunde. Der myotone Dystrophie Typ 2 (DM2) wird hingegen durch eine Expansion der CCTG-Wiederholungssequenz im Intron 1 des CCHC-type zinc finger nucleic acid binding protein (CNBP) Gens auf Chromosom 3q21 verursacht. Trotz ähnlicher klinischer Symptome und pathologischer Mechanismen konnten wichtige Unterschiede zwischen den beiden Typen aufgedeckt werden. Daher müssen beide Formen der myotonen Dystrophie als eigenständige Erkrankungen betrachtet werden. Vorarbeiten der Günther-Arbeitsgruppe sowie zwei unabhängige Studien konnten ein erhöhtes Vorkommen von Autoimmunerkrankungen bei DM2 Patienten im Vergleich zur gesunden Population und zu DM1 Patienten feststellen. In dieser Arbeit wurde zudem eine erhöhte Expression von Interferon stimulierten Genen (ISGs) in Fibroblasten von DM2 Patienten nachgewiesen. Eine chronische Interferon Produktion kann zu der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen führen, bei denen das körpereigene Immunsystem nicht nur pathogene, sondern auch endogene Strukturen angreift. Warum Autoimmunerkrankungen bei DM2 Patienten häufiger auftreten, war bisher nicht bekannt. Daher war das Ziel dieser Arbeit den zugrundeliegenden Mechanismus für dieses Phänomen zu untersuchen. Rezeptoren des Immunsystems können modifizierte Nukleinsäuren erkennen, wenn diese in hoher Konzentration in der Umgebung des Rezeptors vorliegen. Daher wurde zunächst die Lokalisation der in DM2 Patienten Fibroblasten zahlreich vorkommenden CCTG Wiederholungssequenzen untersucht. Dabei zeigte sich, dass die DM2 spezifischen RNA Wiederholungssequenzen nicht nur im Nukleus, sondern auch im Zytoplasma auftraten. Eine direkte Erkennung dieser zytosolischen RNA Wiederholungssequenzen durch die im Zytoplasma lokalisierten RNA Rezeptoren konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Allerdings konnte die Translation dieser RNA Wiederholungssequenzen durch den Prozess der Repeat assoziierten non-ATG (RAN) Translation mittels Nachweis der RAN Proteine LPAC und QAGR festgestellt werden. Diese RAN Proteine, sowie die Akkumulation der RNA Wiederholungssequenzen können einen zellulären Stress in den DM2 Patienten Fibroblasten auslösen, der sich in einem chronischen endoplasmatischen Retikulum (ER) Stress manifestierte. Der chronische ER Stress in den Fibroblasten von DM2 Patienten zeichnet sich vor allem durch eine Aktivierung des ATF6 Signalweges aus, um die Anpassung der Zellen an langanhaltenden Stress zu unterstützen. Interessanterweise zeigte sich eine Verbindung zwischen der erhöhten ISG Expression und der Aktivierung des ATF6 Signalweges, da eine Herunterregulierung von ATF6 in DM2 Patienten Fibroblasten zu einer Verringerung der erhöhten ISG Expression führte. Der chronische Stress innerhalb der Patienten Fibroblasten erfasste auch die Mitochondrien, was durch eine erhöhte Menge von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), sowie eine Herunterregulierung von wichtigen mitochondrialen Genen gezeigt wurde. Bemerkenswerterweise war ein erhöhtes Vorkommen mitochondrialer DNA (mtDNA) im Zytoplasma der DM2 Patienten detektierbar, wobei eine erhöhte Apoptose Rate als Auslöser für die mtDNA Freilassung ausgeschlossen werden konnte. Durch eine Depletierung der mtDNA wurde ebenfalls eine Verringerung der ISG Expression in DM2 Patienten Fibroblasten erreicht. Dies wies nicht nur daraufhin, dass die mtDNA in die erhöhte Interferon Produktion in den Patientenzellen beteiligt ist, sondern auch auf eine Verbindung zwischen dem ER und den Mitochondrien. Um zu verstehen, wie mtDNA zu einer erhöhten Interferon Produktion führen kann, wurde der zytosolische DNA Rezeptor cGAS sowie das nachfolgende Adapterprotein STING herunterreguliert. Erstaunlicherweise führten diese Herunterregulierungen zu einer Verringerung der ISG Expression in Fibroblasten von DM2 Patienten. Dies deutet daraufhin, dass die erhöhte Produktion von Interferon in den Zellen der DM2 Patienten durch die Aktivierung des cGAS-STING Signalweges ausgelöst wird. In dieser Arbeit konnte eine erhöhte Stressantwort in Fibroblasten von DM2 Patienten festgestellt werden, die möglicherweise durch die gemeinsame Akkumulierung von RNA Wiederholungssequenzen und RAN Proteinen im Zytoplasma ausgelöst wird. Dieser Stress äußert sich in chronischem ER- und mitochondrialem Stress und führt zu einer Permeabilisierung der mitochondrialen Membran einzelner Mitochondrien. Dadurch können geringe Mengen mtDNA in das Zytoplasma freigesetzt werden, ohne den Prozess der Apoptose auszulösen. Die zytosolische mtDNA aktiviert den cGAS-STING Signalweg und führt zu einer erhöhten Produktion von Interferon, welche die Patienten für die Entwicklung von Autoimmunerkrankung prädisponiert. Durch den in dieser Arbeit aufgedeckten Mechanismus eröffnen sich potentielle therapeutische Ansatzpunkte für die bisher nicht behandelbare Erkrankung. Eine Hemmung des cGAS-STING Signalweges könnte die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen bei den DM2 Patienten reduzieren. Dies ließe sich durch die Einbeziehung von DM2 Patienten in klinische Studien mit cGAS oder STING Inhibitoren prüfen.Myotonic dystrophy, a multi-systemic disorder, is primarily characterised by myotonia, muscle weakness, early-onset cataracts, and cardiac conduction defects. Over time, two distinct types of this disease have been defined, each with unique genetic defects. Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is caused by a CTG repeat expansion in the 3’ untranslated region of the myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) gene on chromosome 19q13.3. In contrast, myotonic dystrophy type 2 (DM2) is caused by a CCTG repeat expansion in intron 1 of the CCHC-type zinc finger nucleic acid binding protein (CNBP, former known as ZNF9) gene on chromosome 3q21. Despite the similarity in clinical presentation and pathological mechanisms, crucial differences between the two types have been uncovered, necessitating their consideration as distinct disease entities. Preliminary investigations by the Günther group, along with two independent studies have revealed a higher prevalence of autoimmune disorders in DM2 patients compared to the healthy population and DM1 patients. Furthermore, the current study has demonstrated an upregulation of interferon stimulated genes (ISGs) in fibroblasts derived from DM2 patients. Chronic interferon production can lead to the development of autoimmune disorders, causing the body´s immune system to mistakenly attack not only pathogens but also endogenous structures. Such misdirected immune responses can result in severe symptoms, significantly compromising the patients’ quality of life. The underlying mechanism for the increased incidence of autoimmune disorders in DM2 patients remains elusive, and this study aimed to unravel the mechanism responsible for this phenomenon. Innate receptors of the immune system can recognise modified nucleic acids when present in high concentrations in the receptor’s environment. Therefore, the localisation of the abundant CCTG repeats in DM2 patient fibroblast was investigated. Accumulation of these repeats was observed not only in the nucleus but also in the cytoplasm. However, there was no evidence for direct recognition of these cytosolic RNA repeats by cytoplasmic RNA receptors. Nevertheless, the translation of these RNA repeats through the process of repeat-associated non-ATG (RAN) translation was confirmed by the detection of the RAN proteins LPAC and QAGR. These RAN proteins and the accumulation of RNA repeats may contribute to cellular stress response, manifesting as chronic endoplasmic reticulum (ER) stress in fibroblasts derived from DM2 patients. Chronic ER stress in DM2 patient fibroblasts is characterised by the activation of the ATF6 signalling pathway, which is thought to support the adaptation of cells to prolonged stress. Interestingly, a connection between the increased ISG expression levels and ATF6 pathway activation was established, as a reduction of ATF6 in DM2 patient fibroblasts led to a reduction of ISG levels. The chronic stress within the patient fibroblasts also extended to the mitochondria. Evidence of mitochondrial stress was found in the form of increased mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and downregulation of essential mitochondrial genes. Notably, an increased presence of mitochondrial DNA (mtDNA) in the cytoplasm of DM2 patient fibroblasts was detected, although its release due to a high apoptosis rate was ruled out. Remarkably, depletion of this mtDNA also resulted in a reduction of ISG expression levels in DM2 patient fibroblasts, indicating the involvement of mtDNA in the increased interferon production in these patients and a connection between the ER and mitochondria. To elucidate how mtDNA can lead to increased interferon production, knockdowns of the cytoplasmic DNA sensing receptor cGAS and the downstream adaptor protein STING were performed. Surprisingly, this genetic manipulation led to a reduction of ISG expression levels in DM2 patient fibroblasts, suggesting that the increased interferon production in DM2 patients is triggered by the activation of the cGAS-STING signalling pathway. This study unveils a heightened stress response in fibroblast derived from DM2 patients. This elevated stress is likely triggered by the combined effect of the RNA repeat accumulation and the presence of RAN proteins in the cytoplasm, manifesting as chronic ER and mitochondrial stress. This persistent stress may lead to the selective permeabilization of mitochondrial membranes, allowing the release of mtDNA into the cytoplasm without inducing apoptosis. Remarkably, this cytoplasmic mtDNA activates the cGAS-STING signalling pathway, resulting in increased interferon production. This cascade of events predisposes DM2 patients to developing autoimmune disorders. The mechanism revealed in this study opens up a new perspective on potential therapies for DM2 patients, as effective treatments have been lacking thus far. The involvement of the cGAS-STING pathway provides the opportunity to explore the use of cGAS or STING inhibitors, which are currently in clinical trials, as a therapeutic approach for DM2 patients
The influence of repeat expansions in myotonic dystrophy on the cellular stress response and type I interferon production
No full textDie myotone Dystrophie ist eine Multisystemerkrankung, die sich hauptsächlich durch Myotonie, Muskelschwäche, sowie einen früh beginnenden Katarakt und kardiale Erregungsleitungsstörungen auszeichnet. Im Laufe der Zeit wurden zwei Typen dieser Erkrankung definiert, welche auf unterschiedlichen genetischen Defekten basieren. Dem Typ 1 der myotonen Dystrophie (DM1) liegt eine Expansion der CTG-Wiederholungssequenz im 3‘-untranslatierten Bereich des myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) Gens auf dem Chromosom 19q13.3 zugrunde. Der myotone Dystrophie Typ 2 (DM2) wird hingegen durch eine Expansion der CCTG-Wiederholungssequenz im Intron 1 des CCHC-type zinc finger nucleic acid binding protein (CNBP) Gens auf Chromosom 3q21 verursacht. Trotz ähnlicher klinischer Symptome und pathologischer Mechanismen konnten wichtige Unterschiede zwischen den beiden Typen aufgedeckt werden. Daher müssen beide Formen der myotonen Dystrophie als eigenständige Erkrankungen betrachtet werden. Vorarbeiten der Günther-Arbeitsgruppe sowie zwei unabhängige Studien konnten ein erhöhtes Vorkommen von Autoimmunerkrankungen bei DM2 Patienten im Vergleich zur gesunden Population und zu DM1 Patienten feststellen. In dieser Arbeit wurde zudem eine erhöhte Expression von Interferon stimulierten Genen (ISGs) in Fibroblasten von DM2 Patienten nachgewiesen. Eine chronische Interferon Produktion kann zu der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen führen, bei denen das körpereigene Immunsystem nicht nur pathogene, sondern auch endogene Strukturen angreift. Warum Autoimmunerkrankungen bei DM2 Patienten häufiger auftreten, war bisher nicht bekannt. Daher war das Ziel dieser Arbeit den zugrundeliegenden Mechanismus für dieses Phänomen zu untersuchen. Rezeptoren des Immunsystems können modifizierte Nukleinsäuren erkennen, wenn diese in hoher Konzentration in der Umgebung des Rezeptors vorliegen. Daher wurde zunächst die Lokalisation der in DM2 Patienten Fibroblasten zahlreich vorkommenden CCTG Wiederholungssequenzen untersucht. Dabei zeigte sich, dass die DM2 spezifischen RNA Wiederholungssequenzen nicht nur im Nukleus, sondern auch im Zytoplasma auftraten. Eine direkte Erkennung dieser zytosolischen RNA Wiederholungssequenzen durch die im Zytoplasma lokalisierten RNA Rezeptoren konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Allerdings konnte die Translation dieser RNA Wiederholungssequenzen durch den Prozess der Repeat assoziierten non-ATG (RAN) Translation mittels Nachweis der RAN Proteine LPAC und QAGR festgestellt werden. Diese RAN Proteine, sowie die Akkumulation der RNA Wiederholungssequenzen können einen zellulären Stress in den DM2 Patienten Fibroblasten auslösen, der sich in einem chronischen endoplasmatischen Retikulum (ER) Stress manifestierte. Der chronische ER Stress in den Fibroblasten von DM2 Patienten zeichnet sich vor allem durch eine Aktivierung des ATF6 Signalweges aus, um die Anpassung der Zellen an langanhaltenden Stress zu unterstützen. Interessanterweise zeigte sich eine Verbindung zwischen der erhöhten ISG Expression und der Aktivierung des ATF6 Signalweges, da eine Herunterregulierung von ATF6 in DM2 Patienten Fibroblasten zu einer Verringerung der erhöhten ISG Expression führte. Der chronische Stress innerhalb der Patienten Fibroblasten erfasste auch die Mitochondrien, was durch eine erhöhte Menge von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), sowie eine Herunterregulierung von wichtigen mitochondrialen Genen gezeigt wurde. Bemerkenswerterweise war ein erhöhtes Vorkommen mitochondrialer DNA (mtDNA) im Zytoplasma der DM2 Patienten detektierbar, wobei eine erhöhte Apoptose Rate als Auslöser für die mtDNA Freilassung ausgeschlossen werden konnte. Durch eine Depletierung der mtDNA wurde ebenfalls eine Verringerung der ISG Expression in DM2 Patienten Fibroblasten erreicht. Dies wies nicht nur daraufhin, dass die mtDNA in die erhöhte Interferon Produktion in den Patientenzellen beteiligt ist, sondern auch auf eine Verbindung zwischen dem ER und den Mitochondrien. Um zu verstehen, wie mtDNA zu einer erhöhten Interferon Produktion führen kann, wurde der zytosolische DNA Rezeptor cGAS sowie das nachfolgende Adapterprotein STING herunterreguliert. Erstaunlicherweise führten diese Herunterregulierungen zu einer Verringerung der ISG Expression in Fibroblasten von DM2 Patienten. Dies deutet daraufhin, dass die erhöhte Produktion von Interferon in den Zellen der DM2 Patienten durch die Aktivierung des cGAS-STING Signalweges ausgelöst wird. In dieser Arbeit konnte eine erhöhte Stressantwort in Fibroblasten von DM2 Patienten festgestellt werden, die möglicherweise durch die gemeinsame Akkumulierung von RNA Wiederholungssequenzen und RAN Proteinen im Zytoplasma ausgelöst wird. Dieser Stress äußert sich in chronischem ER- und mitochondrialem Stress und führt zu einer Permeabilisierung der mitochondrialen Membran einzelner Mitochondrien. Dadurch können geringe Mengen mtDNA in das Zytoplasma freigesetzt werden, ohne den Prozess der Apoptose auszulösen. Die zytosolische mtDNA aktiviert den cGAS-STING Signalweg und führt zu einer erhöhten Produktion von Interferon, welche die Patienten für die Entwicklung von Autoimmunerkrankung prädisponiert. Durch den in dieser Arbeit aufgedeckten Mechanismus eröffnen sich potentielle therapeutische Ansatzpunkte für die bisher nicht behandelbare Erkrankung. Eine Hemmung des cGAS-STING Signalweges könnte die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen bei den DM2 Patienten reduzieren. Dies ließe sich durch die Einbeziehung von DM2 Patienten in klinische Studien mit cGAS oder STING Inhibitoren prüfen.Myotonic dystrophy, a multi-systemic disorder, is primarily characterised by myotonia, muscle weakness, early-onset cataracts, and cardiac conduction defects. Over time, two distinct types of this disease have been defined, each with unique genetic defects. Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is caused by a CTG repeat expansion in the 3’ untranslated region of the myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) gene on chromosome 19q13.3. In contrast, myotonic dystrophy type 2 (DM2) is caused by a CCTG repeat expansion in intron 1 of the CCHC-type zinc finger nucleic acid binding protein (CNBP, former known as ZNF9) gene on chromosome 3q21. Despite the similarity in clinical presentation and pathological mechanisms, crucial differences between the two types have been uncovered, necessitating their consideration as distinct disease entities. Preliminary investigations by the Günther group, along with two independent studies have revealed a higher prevalence of autoimmune disorders in DM2 patients compared to the healthy population and DM1 patients. Furthermore, the current study has demonstrated an upregulation of interferon stimulated genes (ISGs) in fibroblasts derived from DM2 patients. Chronic interferon production can lead to the development of autoimmune disorders, causing the body´s immune system to mistakenly attack not only pathogens but also endogenous structures. Such misdirected immune responses can result in severe symptoms, significantly compromising the patients’ quality of life. The underlying mechanism for the increased incidence of autoimmune disorders in DM2 patients remains elusive, and this study aimed to unravel the mechanism responsible for this phenomenon. Innate receptors of the immune system can recognise modified nucleic acids when present in high concentrations in the receptor’s environment. Therefore, the localisation of the abundant CCTG repeats in DM2 patient fibroblast was investigated. Accumulation of these repeats was observed not only in the nucleus but also in the cytoplasm. However, there was no evidence for direct recognition of these cytosolic RNA repeats by cytoplasmic RNA receptors. Nevertheless, the translation of these RNA repeats through the process of repeat-associated non-ATG (RAN) translation was confirmed by the detection of the RAN proteins LPAC and QAGR. These RAN proteins and the accumulation of RNA repeats may contribute to cellular stress response, manifesting as chronic endoplasmic reticulum (ER) stress in fibroblasts derived from DM2 patients. Chronic ER stress in DM2 patient fibroblasts is characterised by the activation of the ATF6 signalling pathway, which is thought to support the adaptation of cells to prolonged stress. Interestingly, a connection between the increased ISG expression levels and ATF6 pathway activation was established, as a reduction of ATF6 in DM2 patient fibroblasts led to a reduction of ISG levels. The chronic stress within the patient fibroblasts also extended to the mitochondria. Evidence of mitochondrial stress was found in the form of increased mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and downregulation of essential mitochondrial genes. Notably, an increased presence of mitochondrial DNA (mtDNA) in the cytoplasm of DM2 patient fibroblasts was detected, although its release due to a high apoptosis rate was ruled out. Remarkably, depletion of this mtDNA also resulted in a reduction of ISG expression levels in DM2 patient fibroblasts, indicating the involvement of mtDNA in the increased interferon production in these patients and a connection between the ER and mitochondria. To elucidate how mtDNA can lead to increased interferon production, knockdowns of the cytoplasmic DNA sensing receptor cGAS and the downstream adaptor protein STING were performed. Surprisingly, this genetic manipulation led to a reduction of ISG expression levels in DM2 patient fibroblasts, suggesting that the increased interferon production in DM2 patients is triggered by the activation of the cGAS-STING signalling pathway. This study unveils a heightened stress response in fibroblast derived from DM2 patients. This elevated stress is likely triggered by the combined effect of the RNA repeat accumulation and the presence of RAN proteins in the cytoplasm, manifesting as chronic ER and mitochondrial stress. This persistent stress may lead to the selective permeabilization of mitochondrial membranes, allowing the release of mtDNA into the cytoplasm without inducing apoptosis. Remarkably, this cytoplasmic mtDNA activates the cGAS-STING signalling pathway, resulting in increased interferon production. This cascade of events predisposes DM2 patients to developing autoimmune disorders. The mechanism revealed in this study opens up a new perspective on potential therapies for DM2 patients, as effective treatments have been lacking thus far. The involvement of the cGAS-STING pathway provides the opportunity to explore the use of cGAS or STING inhibitors, which are currently in clinical trials, as a therapeutic approach for DM2 patients
The influence of repeat expansions in myotonic dystrophy on the cellular stress response and type I interferon production
No full textDie myotone Dystrophie ist eine Multisystemerkrankung, die sich hauptsächlich durch Myotonie, Muskelschwäche, sowie einen früh beginnenden Katarakt und kardiale Erregungsleitungsstörungen auszeichnet. Im Laufe der Zeit wurden zwei Typen dieser Erkrankung definiert, welche auf unterschiedlichen genetischen Defekten basieren. Dem Typ 1 der myotonen Dystrophie (DM1) liegt eine Expansion der CTG-Wiederholungssequenz im 3‘-untranslatierten Bereich des myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) Gens auf dem Chromosom 19q13.3 zugrunde. Der myotone Dystrophie Typ 2 (DM2) wird hingegen durch eine Expansion der CCTG-Wiederholungssequenz im Intron 1 des CCHC-type zinc finger nucleic acid binding protein (CNBP) Gens auf Chromosom 3q21 verursacht. Trotz ähnlicher klinischer Symptome und pathologischer Mechanismen konnten wichtige Unterschiede zwischen den beiden Typen aufgedeckt werden. Daher müssen beide Formen der myotonen Dystrophie als eigenständige Erkrankungen betrachtet werden. Vorarbeiten der Günther-Arbeitsgruppe sowie zwei unabhängige Studien konnten ein erhöhtes Vorkommen von Autoimmunerkrankungen bei DM2 Patienten im Vergleich zur gesunden Population und zu DM1 Patienten feststellen. In dieser Arbeit wurde zudem eine erhöhte Expression von Interferon stimulierten Genen (ISGs) in Fibroblasten von DM2 Patienten nachgewiesen. Eine chronische Interferon Produktion kann zu der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen führen, bei denen das körpereigene Immunsystem nicht nur pathogene, sondern auch endogene Strukturen angreift. Warum Autoimmunerkrankungen bei DM2 Patienten häufiger auftreten, war bisher nicht bekannt. Daher war das Ziel dieser Arbeit den zugrundeliegenden Mechanismus für dieses Phänomen zu untersuchen. Rezeptoren des Immunsystems können modifizierte Nukleinsäuren erkennen, wenn diese in hoher Konzentration in der Umgebung des Rezeptors vorliegen. Daher wurde zunächst die Lokalisation der in DM2 Patienten Fibroblasten zahlreich vorkommenden CCTG Wiederholungssequenzen untersucht. Dabei zeigte sich, dass die DM2 spezifischen RNA Wiederholungssequenzen nicht nur im Nukleus, sondern auch im Zytoplasma auftraten. Eine direkte Erkennung dieser zytosolischen RNA Wiederholungssequenzen durch die im Zytoplasma lokalisierten RNA Rezeptoren konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Allerdings konnte die Translation dieser RNA Wiederholungssequenzen durch den Prozess der Repeat assoziierten non-ATG (RAN) Translation mittels Nachweis der RAN Proteine LPAC und QAGR festgestellt werden. Diese RAN Proteine, sowie die Akkumulation der RNA Wiederholungssequenzen können einen zellulären Stress in den DM2 Patienten Fibroblasten auslösen, der sich in einem chronischen endoplasmatischen Retikulum (ER) Stress manifestierte. Der chronische ER Stress in den Fibroblasten von DM2 Patienten zeichnet sich vor allem durch eine Aktivierung des ATF6 Signalweges aus, um die Anpassung der Zellen an langanhaltenden Stress zu unterstützen. Interessanterweise zeigte sich eine Verbindung zwischen der erhöhten ISG Expression und der Aktivierung des ATF6 Signalweges, da eine Herunterregulierung von ATF6 in DM2 Patienten Fibroblasten zu einer Verringerung der erhöhten ISG Expression führte. Der chronische Stress innerhalb der Patienten Fibroblasten erfasste auch die Mitochondrien, was durch eine erhöhte Menge von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), sowie eine Herunterregulierung von wichtigen mitochondrialen Genen gezeigt wurde. Bemerkenswerterweise war ein erhöhtes Vorkommen mitochondrialer DNA (mtDNA) im Zytoplasma der DM2 Patienten detektierbar, wobei eine erhöhte Apoptose Rate als Auslöser für die mtDNA Freilassung ausgeschlossen werden konnte. Durch eine Depletierung der mtDNA wurde ebenfalls eine Verringerung der ISG Expression in DM2 Patienten Fibroblasten erreicht. Dies wies nicht nur daraufhin, dass die mtDNA in die erhöhte Interferon Produktion in den Patientenzellen beteiligt ist, sondern auch auf eine Verbindung zwischen dem ER und den Mitochondrien. Um zu verstehen, wie mtDNA zu einer erhöhten Interferon Produktion führen kann, wurde der zytosolische DNA Rezeptor cGAS sowie das nachfolgende Adapterprotein STING herunterreguliert. Erstaunlicherweise führten diese Herunterregulierungen zu einer Verringerung der ISG Expression in Fibroblasten von DM2 Patienten. Dies deutet daraufhin, dass die erhöhte Produktion von Interferon in den Zellen der DM2 Patienten durch die Aktivierung des cGAS-STING Signalweges ausgelöst wird. In dieser Arbeit konnte eine erhöhte Stressantwort in Fibroblasten von DM2 Patienten festgestellt werden, die möglicherweise durch die gemeinsame Akkumulierung von RNA Wiederholungssequenzen und RAN Proteinen im Zytoplasma ausgelöst wird. Dieser Stress äußert sich in chronischem ER- und mitochondrialem Stress und führt zu einer Permeabilisierung der mitochondrialen Membran einzelner Mitochondrien. Dadurch können geringe Mengen mtDNA in das Zytoplasma freigesetzt werden, ohne den Prozess der Apoptose auszulösen. Die zytosolische mtDNA aktiviert den cGAS-STING Signalweg und führt zu einer erhöhten Produktion von Interferon, welche die Patienten für die Entwicklung von Autoimmunerkrankung prädisponiert. Durch den in dieser Arbeit aufgedeckten Mechanismus eröffnen sich potentielle therapeutische Ansatzpunkte für die bisher nicht behandelbare Erkrankung. Eine Hemmung des cGAS-STING Signalweges könnte die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen bei den DM2 Patienten reduzieren. Dies ließe sich durch die Einbeziehung von DM2 Patienten in klinische Studien mit cGAS oder STING Inhibitoren prüfen.Myotonic dystrophy, a multi-systemic disorder, is primarily characterised by myotonia, muscle weakness, early-onset cataracts, and cardiac conduction defects. Over time, two distinct types of this disease have been defined, each with unique genetic defects. Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is caused by a CTG repeat expansion in the 3’ untranslated region of the myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) gene on chromosome 19q13.3. In contrast, myotonic dystrophy type 2 (DM2) is caused by a CCTG repeat expansion in intron 1 of the CCHC-type zinc finger nucleic acid binding protein (CNBP, former known as ZNF9) gene on chromosome 3q21. Despite the similarity in clinical presentation and pathological mechanisms, crucial differences between the two types have been uncovered, necessitating their consideration as distinct disease entities. Preliminary investigations by the Günther group, along with two independent studies have revealed a higher prevalence of autoimmune disorders in DM2 patients compared to the healthy population and DM1 patients. Furthermore, the current study has demonstrated an upregulation of interferon stimulated genes (ISGs) in fibroblasts derived from DM2 patients. Chronic interferon production can lead to the development of autoimmune disorders, causing the body´s immune system to mistakenly attack not only pathogens but also endogenous structures. Such misdirected immune responses can result in severe symptoms, significantly compromising the patients’ quality of life. The underlying mechanism for the increased incidence of autoimmune disorders in DM2 patients remains elusive, and this study aimed to unravel the mechanism responsible for this phenomenon. Innate receptors of the immune system can recognise modified nucleic acids when present in high concentrations in the receptor’s environment. Therefore, the localisation of the abundant CCTG repeats in DM2 patient fibroblast was investigated. Accumulation of these repeats was observed not only in the nucleus but also in the cytoplasm. However, there was no evidence for direct recognition of these cytosolic RNA repeats by cytoplasmic RNA receptors. Nevertheless, the translation of these RNA repeats through the process of repeat-associated non-ATG (RAN) translation was confirmed by the detection of the RAN proteins LPAC and QAGR. These RAN proteins and the accumulation of RNA repeats may contribute to cellular stress response, manifesting as chronic endoplasmic reticulum (ER) stress in fibroblasts derived from DM2 patients. Chronic ER stress in DM2 patient fibroblasts is characterised by the activation of the ATF6 signalling pathway, which is thought to support the adaptation of cells to prolonged stress. Interestingly, a connection between the increased ISG expression levels and ATF6 pathway activation was established, as a reduction of ATF6 in DM2 patient fibroblasts led to a reduction of ISG levels. The chronic stress within the patient fibroblasts also extended to the mitochondria. Evidence of mitochondrial stress was found in the form of increased mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and downregulation of essential mitochondrial genes. Notably, an increased presence of mitochondrial DNA (mtDNA) in the cytoplasm of DM2 patient fibroblasts was detected, although its release due to a high apoptosis rate was ruled out. Remarkably, depletion of this mtDNA also resulted in a reduction of ISG expression levels in DM2 patient fibroblasts, indicating the involvement of mtDNA in the increased interferon production in these patients and a connection between the ER and mitochondria. To elucidate how mtDNA can lead to increased interferon production, knockdowns of the cytoplasmic DNA sensing receptor cGAS and the downstream adaptor protein STING were performed. Surprisingly, this genetic manipulation led to a reduction of ISG expression levels in DM2 patient fibroblasts, suggesting that the increased interferon production in DM2 patients is triggered by the activation of the cGAS-STING signalling pathway. This study unveils a heightened stress response in fibroblast derived from DM2 patients. This elevated stress is likely triggered by the combined effect of the RNA repeat accumulation and the presence of RAN proteins in the cytoplasm, manifesting as chronic ER and mitochondrial stress. This persistent stress may lead to the selective permeabilization of mitochondrial membranes, allowing the release of mtDNA into the cytoplasm without inducing apoptosis. Remarkably, this cytoplasmic mtDNA activates the cGAS-STING signalling pathway, resulting in increased interferon production. This cascade of events predisposes DM2 patients to developing autoimmune disorders. The mechanism revealed in this study opens up a new perspective on potential therapies for DM2 patients, as effective treatments have been lacking thus far. The involvement of the cGAS-STING pathway provides the opportunity to explore the use of cGAS or STING inhibitors, which are currently in clinical trials, as a therapeutic approach for DM2 patients
Immunogene und immunsuppressive Eigenschaften des transmembranen Hüllproteins gp41 von HIV
Full text linkDie Entwicklung eines effektiven HIV-Impfstoffes ist bis heute nicht gelungen.Konventionelle Immunisierungsstrategien mit rekombinant hergestellten Hüllproteinen des Virus in verschiedensten Formen induzierten keine subtypenübergreifende, protektive Immunantwort gegen HIV. Die Gewinnung und Charakterisierung der gp41-spezifischen breit neutralisierenden monoklonalen Antikörper 2F5 und 4E10 bildete die Grundlage einer Reihe neuer epitopgerichteter Ansätze für die HIV-Impfstoffentwicklung. Bisherige Immunisierungsstudien basierten auf der Verwendung des linearen Hauptepitopes (E2) der beiden Antikörper aus dem C-terminalen Teil der Ektodomäne von gp41. Nach neueren Erkenntnissen, reicht für eine effektive Neutralisation durch 2F5 oder 4E10 die Bindung dieser Antikörper an ihr lineares Epitop in der membran proximalen externen Region (MPER) von gp41 allein nicht aus. Vielmehr wurde die Beteiligung einer N-terminalen Domäne (E1) von gp41 an der neutralisationsaktiven Bindung von 2F5 bzw. 4E10 postuliert. In dieser Arbeit wurden die beiden 2F5 und 4E10 spezifischen Epitopbereiche E1 und E2 des gp41 erstmals in das strukturell verwandte transmembrane Hüllprotein des Koala Retrovirus (KoRV) eingebracht. Die Applikation der hergestellten Antigene erfolgte sowohl in Form der codierenden DNA mittels ballistischer Immunisierung (GeneGun®) als auch durch bakteriell exprimierte Proteine. Mit beiden Strategien konnten für drei Hybridproteine in den ersten Studien eine HIV-1 gp41 spezifische, breit neutralisierende humorale Immunantwort induziert werden. Diese Ergebnisse konnten jedoch in späteren Studien nicht reproduziert werden. Die Analyse der induzierten Immunantworten zeigte eine Verlagerung der Hauptimmunantwort als deren Ursache eine bakterielle Fremdinfektion der Versuchtiere diskutiert wurde. Zur Evaluierung der Immunisierungsstudien wurde ein neuartiger real time PCR basierter in vitro Neutralisationstest um Kontrollen zur Virusspezifität und Cytotoxizität erweitert.The development of an effective HIV vaccine is considered the to play a key role in controlling the HIV pandemic. Conventional immunisation strategies using recombinant envelope proteins of the virus did not lead to the induction of a broad range protective immunity. A new target sequence for the induction of a broadly neutralising humoral immune response has been discovered through the characterization of the gp41 specific broadly neutralising monoclonal antibodies 2F5 and 4E10. Until now all attempts to induce 2F5/4E10 like neutralising antibodies failed. So far only the linear main epitope (E2) of 2F5 and 4E10, located in the C-terminal part of the gp41 ectodomain was used as the target sequence. However, it was recently shown that an N-terminal domain (E1) of gp41 increases the avidity of 2F5 to its epitope. The E1 domain may therefore be involved in the mediation of a neutralisation active binding. For the first time immunisation strategies have been developed that target both previously identified domains (E1 and E2) of gp41. The sequences corresponding to E1 and E2 have been introduced at homologous positions in the structurally related transmembrane envelope protein p15E of the Koala Retrovirus (KoRV). These generated hybrid antigens have been used for immunisation of wistar rats. They were applied as recombinant proteins expressed in E.coli and as DNA using a ballistic immunisation (GeneGun®) approach. Although in first trials neutralising antibodies specific for gp41 of HIV-1 were induced, these results could not be reproduced. Analysis of the induced antibodies showed a shift of their binding specifity. A bacterial infection of the used animals was identified as the cause of the unexpected shift in the antigen specific humoral immune response. For evaluation of the immunisation studies a new neutralisation assay based on the measurement of provirus integration by duplex real time PCR has been extended for controls of virus specifity and cytotoxicity
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