1,721,079 research outputs found
Identification and Analysis of Cleavage Sites and Subdomains in the Group Specific Antigen (Gag) of the Human Endogenous Retrovirus-K(HML-2)
No full textInterestingly at molecular level humans and chimpanzees are very similar. The average DNA
sequence difference between them is ~4% (Varki and Altheide, 2009). Contributing to the
difference in humans are human endogenous retroviruses (HERV), which constitute about 8%
of our genome. The young age and the similarity to other cancer causing betaretroviruses such
as MMTV have led to intense research on the influence of some HERVs on the human
genome as well as oncogenic aspects of HERV encoded proteins. Fundamental properties of
these ancient retroviruses although have remained undiscovered, due to the low expression of
the retroviral proteins. One example is the Gag polyprotein, the major structural protein of all
retroviruses with the ability to form virus like particles in the absence of any other retroviral
protein. The aim of this project was to decipher the processing sites of the Group specific
antigen (Gag) protein of a specific member of the HERV family, HERV-K113, and to identify
all cleavage products.
Although the provirus of HERV-K113 encodes open reading frames for genes of a complex
retrovirus and produces mature virions on low expression levels, it has accumulated mutations
which render it uninfectious. To elevate the expression non-synonymous post-integration
mutations in the gag-pro-pol region of HERV-K113 had previously been identified by a
specific algorithm and reconstituted. The amino acid sequence had then been codon optimized
for mammalian cell. Gag was cloned together with the protease and polymerase sequence into
the vector pcDNA3.1 to set it under the control of a CMV-promoter. Expression of this new
construct, oricoHERV-K113_GagProPol, in mammalian cells led to an enhanced viral protein
expression as seen on Western Blot and in Electron microscopic pictures of purified viral
pellets. The protease defective construct oricoHERV-K113_GagPro-Pol was established to
investigate the maturation process. Comparison of protease defective viral proteins to protease
active viral proteins on silver nitrate stained SDS gel analysis revealed the processing of Gag
proteins and the maturation of VLPs after the release from cells. Alignments of HERV-K113
Gag with the sequences of two beta retroviruses, MPMV and MMTV, had already shown that
the endogenous retroviral Gag harbours the typical domains matrix (MA), capsid (CA) and
nucleocapsid (NC) as well as a phosphorylated protein with a late domain between MA and
CA. The high expression rate of oricoHERV-K113 enabled the investigation of the exact Gag
cleavage sites. Therefore viral proteins were separated by reverse phase high pressure liquid
chromatography. Fractions were screened for Gag subdomains on western blot with previously established antibodies and, in some cases, by mass spectrometry. Proteins
suspected to contain a subdomain were N-terminally sequenced, to determine the N-terminal
cleavage site amino acid sequence. Additional to the common retroviral Gag subdomains MA,
CA and NC the subdomain p15 was confirmed between MA and CA. Typical for a late
domain encoding protein p15 was shown to be phosphorylated by mass spectrometry. All
cleavage sites except the one between MA and p15 belong to type 1 or type 2 cleavage sites.
Mutation of the P1 position at the cleavage sites led to changes in cleavage patterns detected
on Western Blot. Surprisingly two new short proteins were discovered following NC. Both are
rich in glutamine and proline and hence were named QP1 and QP2.
In summary the reconstituted protein sequence of oricoHERV-K113_GagProPol facilitated
the discovery that the HERV-K113 Gag is cleaved by the protease to release the subdomains
MA, p15, CA, NC, QP1 and QP2. The functions of QP1 and QP2 have to be investigated in
the future. Since processing is a prerequisite for replication, analysis of the subdomains and
their processing could lead to the discovery why no original or improved HERV sequence
until now has been shown to replicate
The role of human SAMHD1 in restricting porcine endogenous retroviruses (PERVs) and the innate immune response to PERV infection in human primary immune cells
Get PDFThe release of porcine endogenous retrovirus (PERV) particles from pig cells is a potential risk factor during xenotransplantation by way of productively infecting the human transplant recipient. Potential countermeasures against PERV replication are restriction factors, such as SAMHD1, that block retroviral replication. SAMHD1 is a triphosphohydrolase that depletes the cellular pool of dNTPs in non-cycling cells preventing retroviral reverse transcription. Restriction factors and innate immune responses are the first line of defense against invading pathogens. Sensing of viruses in a cell usually results in the production of type I IFNs that lead to the activation of IFN-stimulated genes.
The first part of this study focuses on the analysis of the antiviral activity of SAMHD1 against PERV-A/C in human immune cells. To study that, PERV-A/Cs originating from activated porcine PBMCs was used to infect human primary cells from healthy human donors. In parallel, primary cells were transduced with virus-like particles (VLPs) lacking or containing the Vpx protein from SIVmac239. The result showed that SAMHD1 potently restricts PERV-A/C reverse transcription in human monocytes, monocyte-derived dendritic cells (MDDC), macrophages (MDM) or resting-CD4+ T-cells and in monocytic THP-1 cells. Degradation of SAMHD1 by SIVmac Vpx or CRISPR/Cas9 knock-out of SAMHD1 allowed for PERV reverse transcription. Addition of deoxynucleosides alleviated the SAMHD1-mediated restriction suggesting that SAMHD1-mediated degradation of dNTPs restricts PERV replication in these human immune cells.
The aims in the second part of this study were to investigate the IFN response by monitoring induction of IFN stimulated genes following infection by PERV-A/Cs, and to identify the signaling pathways, which play a role in the type I IFNs response. The results showed that PERV-A/C increased (over 100-fold) CXCL-10 production in human MDDCs, monocytes and MDMs compared with non-infected cells or heat-inactivated virus. Treatment with VLP+Vpx or empty VLP did not cause more CXCL-10 induction compared with untreatment. The JAK-inhibitor (AT9283) reduced the CXCL-10 induction in infected cells indicating that the JAK/STAT pathway is activated by PERV-A/C infection of primary human myeloid cells.
In conclusion, the findings in this work highlight SAMHD1 as a potential barrier to PERV-A/C transmission from pig transplants to human recipients during xenotransplantation
Virale und zelluläre Determinanten der HIV-1-induzierten Aktivierung des angeborenen Immunsystems
No full textA fundamental defense mechanism against pathogens is the recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) by pattern recognition receptors (PRRs). These PRRs are integral components of the innate immune system. This recognition process initiates the interferon (IFN) response mechanism, triggering expression of interferon-stimulated genes (ISGs). Many of these ISGs possess antiviral properties that inhibit viruses, including HIV-1. The PPRs and their following signal pathways vary based on cell type. Publications have shown that an unknown pathway mediated over MAVS is activated by intron-containing RNA from HIV-1 in monocyte-derived macrophages (MDMs). However, the mechanism behind the sensing of the viral genomic RNA is yet unknown.
This work identified two distinct stages of immune recognition in MDMs triggered by HIV-1 infection. The first stage occurred prior to reverse transcription and was influenced by the stability of the viral capsid. In the second stage, characterized by a more robust immune response, a short peptide sequence encoded by the N-terminus of gag was crucial to inducing inflammatory responses. While partially spliced or full-length viral RNA in the cytoplasm was required for Gag protein translation, the myristoylation site of Gag was essential to induce innate sensing in MDMs. Furthermore, we examined whether THP-1 or U937 cells in differentiated state showed a similar phenotype to MDMs during HIV-1 infection to identify the molecular mechanisms involved in sensing the virus. We found that U937 cells exhibited robust innate response at a late-stage of virus replication, whereas pre-integration determinants, observed in MDMs, differ. Surprisingly, THP-1 cells exhibited minimal innate immune responses against HIV-1 and showed significant differences from the responses observed in MDMs and U937 cells. Our findings reveal that HIV-1 sensing in differentiated THP-1 and U937 cells does not parallel the responses seen in primary cells. These results enable new research targets in regard to find the cellular sensor, which induces HIV-1 chronic inflammation in MDMs and highlight the importance of research in primary cell systems
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Analyse von HIV-1 Restriktionsfaktorenkandidaten, die nach Aktivierung der Toll-like Rezeptoren 7 und 8 induziert werden
Get PDFBereits 1983 ist erstmals der Typ 1 des Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) beschrieben worden. Bisher besteht keine Chance auf Heilung. Verfügbare Medikamente schaffen es zwar, den Virustiter unter die Nachweisbarkeitsgrenze zu bringen, aber das Virus kann sich nach Absetzen der Medika-mente wieder ausbreiten. Grund dafür ist die Reservoirebildung von HIV in inaktivierten Gedächtnis-zellen. Die angeborene Immunantwort des Körpers gegen das HI-Virus wird, noch bevor das adaptive Immunsystem involviert ist, aktiviert und könnte neue Behandlungsansätze liefern. Ein Teil dieser natürlichen Immunantwort sind die Restriktionsfaktoren. Diese zellulären, antiviralen Proteine sind ein Teil unserer angeborenen Immunantwort gegen virale Infektionen. Das Finden und Untersuchen von weiteren Restriktionsfaktoren könnte daher vielversprechend für die HIV-Forschung sein. Die Expres-sion von Restriktionsfaktoren wird oft stimuliert, nachdem die Zelle durch Mustererkennungsrezepto-ren (pattern recognition receptors, PRR) pathogen assoziierte molekulare Muster (PAMP) detektiert hat. Eine Familie solcher PRRs sind die Toll-like Rezeptoren (TLR). Es wurde bereits gezeigt, dass die TLR 7/8 das virale Genom von HIV erkennen können, und dass die Stimulierung von TLR7/8 durch einen Agonisten (Resiquimod, R848) eine HIV-1 Restriktion hervorruft. Dieser antivirale Block ist neuartig und kann keinem der bisher bekannten Restriktionsfaktoren zugeordnet werden. Ziel dieser Arbeit ist es, mögliche Kandidaten für diesen unbekannten Restriktionsfaktor auf deren antivirale Ak-tivität zu testen. Mittels eines Illumina RNA-Tiefen-Sequenz-Screenings wurde eine Transkriptom-Analyse durchgeführt. Die Analyse identifiziert und ordnet hochregulierte Gene ihrer Expressionsstär-ke nach Stimulierung der TLR7/8. In dieser Arbeit wurden nun acht hochregulierte Gene ausgewählt und analysiert, die die bislang unbekannte TLR 7/8 Restriktion gegen HIV-1 verursachen könnten. Kriterien von diesen acht Genen waren Proteindomänen von bekannten Restriktionsfaktoren, wie die SAM-Domäne, oder bekannte katalytische Aktivitäten der Genprodukte, wie z.B. Ubiquitin Ligase Aktivität. Daraus resultierte die Selektion der Gene SAMD9, SAMD9L, SAMSN1, LAP3, UBE2L6, CMPK2 und HERC5. Um diese als genetisches Material zu erhalten, wurden aus primären humanen R848-stimulierten Monozyten die RNA isoliert und in die komplementäre DNA (cDNA) umgeschrie-ben. Die Gene wurden aus der cDNA amplifiziert und in ein lentivirales Vektorkonstrukt kloniert. Die Expression wurde in HEK-293T Zellen getestet. In ein Experiment wurde nun mit pseudotypisierten GFP und Luciferase-Reporterviren die Infektiosität in HEK-293T der gewählten Gene mit einem Kon-trollplasmid verglichen werden. In HEK-293T Zellen zeigte dies keinen signifikanten Unterschied zu dem Kontrollplasmid. Bislang konnte daher die unbekannte Restriktion noch nicht identifiziert wer-den. Um die Restriktionsfaktorenkandidaten definitiv auszuschließen, werden noch weitere Untersu-chungen in monozytären Zelllinien, wie die U937 Zelllinie, vonnöten sein. Die Entdeckung eines neu-artigen Restriktionsfaktors würde das Verständnis des Replikationszyklus von HIV weiter aufschlüsseln und vielleicht einen Ansatz für eine Therapie liefern.Since the description of the type 1 of the human immunodeficiency virus (HIV) in 1983, potent an-tiretroviral drugs are available that reduce the virus level under the detection limit. However, after discontinuation of the medication the infection breaks out again. The reason for that is the formation of HIV reservoirs in inactive memory-cells. The innate immune response of the body takes action before the adaptive immune system is involved and may allow for new treatment approaches. One part of the innate immune response are the so called restriction factors. These are cellular antiviral proteins that act against viral infections. To find and study new restriction factors can be a promising approach for HIV treatment. The cellular expression of restriction factors is often induced after the pattern recognition receptors (PRR) are stimulated by pathogen-associated molecular patterns (PAMP). One protein family PRRs are the toll-like receptors (TLR). It has already been shown that TLR 7/8 can recognize the viral RNA genome of HIV and that the simulation of TLR 7/8 by their agonist (resiquimod, R848) results in the restriction of HIV-1. This antiviral block is novel and cannot be as-sociated with any of the known restriction factors. The goal of this bachelor thesis is to find possible candidates for this unknown restriction factor and test there antiviral activity. Through illumina deep RNA sequencing a transcriptome analysis was performed. The analysis identified upregulated genes of and ranked those based on their expression level after stimulation with TLR 7/8. In this bachelor thesis We choose eight upregulated genes and analyszed their antiviral activity against HIV-1. Criteria for choosing these eight candidates were protein domains similar to those of known restriction factors like the SAM-domain or their catalytic activity such as ubiquitin ligase activity. We selected the genes SAMD9, SAMD9L, SAMSN1, LAP3, UBE2L6, CMPK2 and HERC5. To get the genetic material of these genes I isolated RNA from primary human monocytes that were stimulated by R848 and tran-scribed the mRNA into complimentary DNA (cDNA). Using the cDNA I amplified the genes of inter-est and cloned them into a lentiviral construct. The expression was tested in HEK-293T cells. Using pseudo-typed GFP and lucifrease reporter virus I tested the infectivity of HIV-1 in HEK-293T cells transfected with the expression plasmids of the chosen genes of interest. None of the genes picked showed a significant antiviral activity compared to the control plasmid in HEK293T cells. In future experiments it will essential to test the antiviral activity of these gens in a cell line closer to human monocytes, such as the monocytic U937 cells. The discovery of a novel restriction factor would im-prove our understanding of the replication cycle of HIV and may allow for a new approach for antivi-ral therapy
Prävalenz und Charakterisierung von HCV in HIV-Neudiagnosen vor Einführung der HCV-spezifischen antiviralen Medikamente im Jahr 2011
Get PDFDas Hepatitis-C-Virus (HCV) gehört zu den durch Blut übertragenen Erregern mit der höchsten Bedeutung für die öffentliche Gesundheit. Aufgrund ähnlicher Transmissionswege werden HIV/HCV-Koinfektionen häufig beobachtet, insbesondere bei intravenösen Drogengebrauchern (IVD) und Männern, die Sex mit Männern, haben (MSM). Mit der Zulassung hocheffektiver, nebenwirkungsarmer antiviraler HCV-Medikamente (engl.: direct acting antivirals (DAA)) im Jahr 2011 wurde die Voraussetzung für die Eliminierung von HCV-Infektionen in der Zukunft geschaffen.
Ziel dieser Bachelorarbeit ist es einen Überblick über den Anteil von HCV-Infektionen in HIV-Neudiagnosen vor Einführung der Hepatitis-C-DAA-Therapie im Jahr 2011 in Deutschland zu gewinnen. Die Ergebnisse dieser Studie sollen als Basis für nachfolgende Studien zur Beurteilung des potentiellen Einflusses der DAA-Therapie auf den Anteil und die Art der HCV-Infektionen in HIV-Neudiagnosen in Deutschland dienen. Dazu wurden filtergetrocknete Serumproben/Plasmaproben (DSS/DPS) von 1511 HIV-Neuinfizierten, mit HIV-Erstdiagnose zwischen Oktober 2009 und Juni 2011, auf HCV untersucht. Die Proben wurden zunächst mittels Enzymimmunoassay (ELISA) serologisch auf HCV untersucht. Aus den DSS/DPS ELISA-reaktiver Proben wurden die Nukleinsäuren extrahiert und anschließend mithilfe einer quantitativen PCR (qPCR) auf das Vorhandensein von HCV-RNA untersucht. Proben mit einem positiven Nachweis von HCV-RNA wurden mittels nested-PCR und anschließender Sanger-Sequenzierung weiter analysiert, um den HCV-Geno-und Subtyp zu bestimmen. Die Charakterisierung der identifizierten HCV-Infektionen erfolgte auf Basis der demografischen Verteilung im untersuchten Studienpanel, bezüglich Geschlecht, Alter, Herkunft und der Transmissionsgruppe.
In den 1511 untersuchten DSS/DPS von HIV-Neuinfizierten in Deutschland wurde ein Anteil von 5,4% als HCV-seropositiv identifiziert. Darunter befanden sich 4,1% mit aktiver HCV-Infektion und 1,3% mit ausgeheilter HCV-Infektion. Die Untersuchung der HCV-RNA-positiven Proben zeigte, dass hauptsächlich Genotyp 1-Infektionen (57,5%) mit Subtyp 1a (38,3%), gefolgt vom Genotyp 3 (29,8%) mit ausschließlich Subtyp 3a, vorlagen.
Das untersuchte Studienpanel bestand hauptsächlich aus Männern (85,1%), dennoch wurde vergleichsweise ein höherer Anteil an Frauen HCV-seropositiv getestet (4,6% vs. 10,0%). Innerhalb der verschiedenen Altersgruppen konnte der höchste Anteil an HCV-Seropositiven in der Altersgruppe der 25- bis 29-Jährigen (7,8%) identifiziert werden. In Personen nicht-deutscher Herkunft wurde ein höherer Anteil HCV-seropositiv getestet, als in Personen deutscher Herkunft (8,0% vs. 4,4%). Die Mehrheit kam dabei aus Osteuropa (59,3%) und gab IVD als wahrscheinliche Transmissionsgruppe (50,0%) an. In IVDs, unabhängig davon welcher Herkunft, wurde mit 75,5% ein sehr hoher Anteil HCV-seropositiv getestet. Diese Gruppe wies im Vergleich zu den anderen Transmissionsgruppen ein 98,8-fach höheres Risiko einer HCV-Infektion auf. In MSM wurde nur ein geringer Anteil von 2,0% HCV-seropositiv getestet.The hepatitis c virus (HCV) is a blood-borne human pathogen and a major public health problem. Due to similar transmission routes, HIV/HCV coinfections often occur together, especially among high risk groups like intravenous drug users (IVD) and men who have sex with men (MSM). The approval of highly effective, low-side-effect direct acting antivirals (DAA) in 2011 created a precondition for the elimination of HCV infections in the future.
The aim of this bachelor thesis is to get an overview of HCV infections in individuals newly diagnosed with HIV before the introduction of the new HCV direct acting antivirals in Germany in 2011. The results of this study should serve as a basis for futher analysis to assess the potential impact of DAA therapy on the proportion and characteristics of HCV infections in new HIV diagnoses in Germany.
Therefore filter-dried serum/plasma spots (DSS/DPS) of 1511 newly HIV infected individuals, who were diagnosed with HIV between October 2009 and June 2011, were screened for Hepatitis C. The samples were first serologically analysed of HCV by an enzyme immunoassay (ELISA). Nucleic acids were then extracted from the ELISA reactive samples and further analysed for the presence of HCV RNA using quantitative PCR (qPCR). Samples with positive detection of HCV RNA were further analysed by nested-PCR, followed by Sanger-Sequencing to identify the HCV geno- and subtype. The characterisation of identified HCV infections was based on the demographic distribution of the study cohort in terms of gender, age, origin and transmission group.
In the 1511 analysed samples a proportion of 5.4% was identified as HCV seropostive. Among the 5.4% HCV seropositive individuals 4.1% had an active HCV infection whilst 1.3% had a resolved HCV infection. The analysis of HCV RNA positive samples for HCV genotyping showed that 57.5% had a genotype 1 infection with mainly subtype 1a (38.3%), followed by genotype 3 (29.8%) with only subtype 3a.
The study cohort mainly consisted of men (85.1%) but a comparatively higher proportion of women was tested HCV seropositive (4.6% vs. 10.0%). Within the different age groups, the highest proportion of HCV seropositive individuals was identified in the age group between 25 and 29 years (7.8%). Based on the origin, a higher proportion of individuals with non-German origin was tested HCV seropositive, compared to persons with German origin (8.0% vs. 4.4%). The majority of non-Germans came from Eastern Europe (59.3%) and specified IVD as the most likely transmission group (50.0%). In IVDs, independent of their origin, a very high proportion of HCV seropositive individuals was identified (75.5%). This risk group had a 98.8%-fold higher chance of getting infected with HCV compared to the other transmission groups. In MSM, only 2.0% were tested HCV seropositive
Evaluation neuer Methoden zur HIV-Inzidenztestung
Get PDFHintergrund: Die Kenntnis der HIV-Neuinfektionen und ihrem Anteil in einer Bevölkerung (HIV-Inzidenz) ist für die epidemiologische Überwachung von HIV (HIV-Surveillance) von zentraler Bedeutung. Dadurch kann die Epidemie in einer Population charakterisiert werden, indem die Trends im Infektionsgeschehen aufgezeigt und wichtige Risikogruppen identifiziert werden, um die entsprechenden Präventionsmaßnahmen vorzunehmen.
Zur Unterscheidung von kürzlich erworbenen und länger bestehenden HIV-Infektionen gibt es verschiedene Methoden. In Deutschland wird routinemäßig der serologische BED-CEIA verwendet, der jedoch relativ geringe Sensitivität (80%) und Spezifität (86%) für die Detektion rezenter Infektionen aufweist. In dieser Arbeit wurde eine neue Methode zur HIV-Inzidenztestung nach dem Vorbild des von Brookmeyer et al. (2012) beschriebenen „Multiassay Algorithm“ (MAA) (2012) etabliert38. Die Ergebnisse des BED-CEIA, des BioRad Aviditätstestes und die klinischen Daten des Patienten wurden für den MAA verwendet.
Material und Methoden: Zur Etablierung und Validierung wurden insgesamt 559 Proben von 449 Patienten der Serokonverter-Studie mit bekanntem Infektionszeitpunkt und bekannten HIV-1 Subtypen untersucht. Zunächst wurde das Protokoll des BioRad Aviditätstest für die Verwendung von filter-getrockneten Plasmaproben (DPS – „Dried Plasma Spots“, 50μl) anhand eines Vortestungspanels (n=117) optimiert. Dafür wurde die Probenpuffermenge zur Elution der Antikörper aus der getrockneten Filterprobe und somit die Vorverdünnung der Probe evaluiert. Daraufhin wurde die Performance von DPS in den beiden Inzidenztesten, BED-CEIA und BioRad Aviditätstest, miteinander verglichen. Schließlich wurde der MAA anhand der Ergebnisse der beiden Inzidenzteste angewendet: a) mit Einbeziehung der klinischen Patientendaten (MAA1) und b) ohne diese (MAA2). Die Assay Cutoffs für den MAA1 und MAA2 wurden so gewählt, dass die höchste Richtigkeit („accuracy“) für das Evaluationspanel erreicht wurde.
Ergebnisse: Bei einer Elution der DPS im 10-fachen Volumen des getropften Plasmas für den BioRad Aviditätstest wurde die beste Differenzierbarkeit für „inzidente“ und „prävalente“ Proben erreicht.
Anhand eines für Deutschland repräsentativen Probenpanels hinsichtlich der HIV-Subtypenverteilung (85% Subtyp B und 15% Subtyp „non-B“) konnte mit dem MAA1 eine signifikant höhere Richtigkeit (91,5%), Spezifität (95,8%) und geringere FRR (4,2%) im Vergleich zum BED-CEIA (alle p<0,005) erzielt werden. Eine nahezu signifikant höhere Richtigkeit (90,9%) wurde mit dem MAA2 erreicht (p= 0,09). Die ermittelten Test Cutoffs für den MAA1 betrugen: BED-CEIA: 1,7 ODn; BioRad Avidität: 40%; CD4 Zellzahl 50 Zellen/μl und Viruslast: 400 Kopien/ml. Für den MAA 2 betrugen diese: BED-CEIA: 1,6 ODn; BioRad Avidität: 40%. Die mittlere Infektionsdauer (MDR) betrug 59 Tage für den MAA 1 und 68 Tage für den MAA 2.
Schlussfolgerung: Die beiden MAAs, MAA1 und MAA2, konnten mit höheren Richtigkeiten als neue Methode zur HIV-Inzidenztestung etabliert werden. Die ermittelten Test Cutoffs waren vergleichbar mit denen von Brookmeyer et al. (2012)38. Die MDRs waren mit 59 Tagen (MAA1) und 68 Tagen (MAA2) jedoch kürzer als die publizierten MDRs. Zur Validierung dieser Daten bedarf es einer Untersuchung einer größeren Studienpopulation.Background: Information about newly diagnosed HIV-infections and their ratio in a population (HIV-incidence) is crucial for the epidemiological surveillance. Therefor the epidemic in a population can be characterized by recognizing changes over time and identifying risk groups to conduct preventive treatments.
Different methods exist to discriminate recent from long-term HIV-infections. In Germany, the serological test BED-CEIA is used for routine, which though showed low rates in sensitivity (80%) and specificity (86%).
In this work, the “Multiassay Algorithm” (MAA) which was described by Brookmeyer et al. (2012) was established38. Test results of the BED-CEIA, the BioRad Avidity assay and clinical dates of the patient were used for the MAA.
Material and Methods: Altogether, 559 samples of 449 patients from the Seroconverter-study with documented date of infection were examined. In the first instance, the protocol of the BioRad Avidity assay was established for dried plasma spots (DPS) in pre-test panel (n=117). Therefor we evaluated the amount of the dilution buffer for the elution of the antibodies from the dried filter samples and thus the pre-dilution of the samples. Afterwards, the performance of DPS was compared in both incidence assays, the BED-CEIA and the BioRad Avidity assay. Eventually, the MAA was applied for both incidence assays in which two different MAAs: a) including the clinical data of the patient (MAA 1) and b) without any data (MAA 2), were chosen and generated for the highest accuracy in the evaluation panel.
Results: A dilution of 1:10 for the BioRad avidity protocol, the best differentiability for “incident” and “prevalent” samples were achieved.
In respect of a test panel, which was representative for the German subtype panel (85% subtype B and 15% subtype “non-B”), we achieved significantly better results for the MAA 1 with an accuracy of 91,5%, a sensitivity of 86,2%, a specificity of 95,8% and a false-recent rate of 4,2% in comparison to the BED-CEIA (p<0.005) and nearly significantly higher accuracy (90,9%) for the MAA2 (p=0.09). The generated cutoffs for the MAA 1 are: BED-CEIA: 1.7 ODn; BioRad Avidity: 40%; CD4 cell count 50 cells/μl and viral load: 400 copies/ml. For the MAA 2 the cutoffs are: BED-CEIA: 1.6 ODn; BioRad Avidity: 40%.
The mean duration of recency (MDR) was estimated over 59 days for the MAA 1 and 68 days for the MAA 2.
Conclusions: Both MAAs, MAA 1 and MAA 2, have been established as a new method for HIV incidence testing with higher accuracies. The generated test cutoffs were comparable with those of Brookmeyer et al. (2012)38. However, the MDRs were much shorter than the publicized MDRs with 59 days (MAA 1) and 68 days (MAA 2). For further validation, the examination of a broader study population is required
The role of human SAMHD1 in restricting porcine endogenous retroviruses (PERVs) and the innate immune response to PERV infection in human primary immune cells
Get PDFDie Freisetzung von Porcinen Endogenen Retroviren (PERVs) aus Schweinezellen ist ein
potenzieller Risikofaktor während der Xenotransplantation. PERV ist in der Lage, in humanen
Zelllinien zu replizieren. Mögliche Abwehrmechanismen gegen die PERV-Replikation sind
zelluläre Restriktionsfaktoren. Dazu gehört SAMHD1, eine Triphosphohydrolase, die den
zellulären dNTP Pool in sich nicht teilenden Zellen erschöpft und die reverse Transkription
damit verhindert. Restriktionsfaktoren und die angeborene Immunität sind die erste
Verteidigungslinie gegen eindringende Krankheitserreger. Die Erkennung viraler Strukturen
führt oftmals zur Produktion von Typ-I-Interferonen und nachfolgend zur Expression von
IFN-stimulierten Genen.
Der erste Teil dieser Arbeit fokussiert auf den Nachweis der antiviralen Aktivität von
SAMHD1 gegen rekombinante PERV-A/C in menschlichen Immunzellen. Um dies zu
untersuchen, wurden diese Viren aus aktivierten PBMCs von Schweinen gewonnen, um
humane Primärzellen von gesunden Spendern zu infizieren. Parallel dazu wurden
Primärzellen mit virusähnlichen Partikeln transduziert, welche zum Teil zusätzlich das Vpx-
Protein von SIVmac239 enthielten. Das Ergebnis zeigte, dass SAMHD1 die reverse
Transkription von PERV-A/C in menschlichen Monozyten, von Monozyten abgeleiteten
dendritischen Zellen (MDDC), Makrophagen (MDM) oder ruhenden CD4+ T-Zellen und in
monozytischen THP-1-Zellen wirksam einschränkt. Die Degradation von SAMHD1 durch
SIVmac Vpx oder CRISPR/Cas9-Knock-out von SAMHD1 ermöglichte die reverse
Transkription von PERV. Die Zugabe von Deoxynukleosiden milderte die SAMHD1-
vermittelte Restriktion, was darauf hindeutet, dass der SAMHD1-vermittelte Abbau von
dNTPs die PERV-Replikation in diesen menschlichen Immunzellen einschränkt.
Im zweiten Teil dieser Studie erfolgte die Untersuchung der IFN-Reaktion durch Analyse der
Induktion von IFN-stimulierten Genen in humanen Primärzellen nach Infektion durch PERVA/
C. Die Ergebnisse zeigen, dass PERV-A/C die CXCL-10-Produktion in humanen MDDCs,
Monozyten und MDMs über 100-fach erhöht. Aufgrund der profunden Inhibition dieser
Aktivierung mit dem JAK-Inhibitor (AT9283) wird daraus geschlossen, dass dieser
Signalweg für die CXCL-10 Induktion bei einer PERV-A/C Infektion in humanen
myeloischen Zellen verantwortlich ist. Die erhaltenen Ergebnisse belegen dass SAMHD1 ein
potenzielles Hindernis für die Übertragung von PERV-A/C von Schweinetransplantaten auf
Menschen während der Xenotransplantation darstellt.The release of porcine endogenous retrovirus (PERV) particles from pig cells is a potential
risk factor during xenotransplantation by way of productively infecting the human transplant
recipient. Potential countermeasures against PERV replication are restriction factors, such as
SAMHD1, that block retroviral replication. SAMHD1 is a triphosphohydrolase that depletes
the cellular pool of dNTPs in non-cycling cells preventing retroviral reverse transcription.
Restriction factors and innate immune responses are the first line of defense against invading
pathogens. Sensing of viruses in a cell usually results in the production of type I IFNs that
lead to the activation of IFN-stimulated genes.
The first part of this study focuses on the analysis of the antiviral activity of SAMHD1 against
PERV-A/C in human immune cells. To study that, PERV-A/Cs originating from activated
porcine PBMCs was used to infect human primary cells from healthy human donors. In
parallel, primary cells were transduced with virus-like particles (VLPs) lacking or containing
the Vpx protein from SIVmac239. The result showed that SAMHD1 potently restricts PERVA/
C reverse transcription in human monocytes, monocyte-derived dendritic cells (MDDC),
macrophages (MDM) or resting-CD4+ T-cells and in monocytic THP-1 cells. Degradation of
SAMHD1 by SIVmac Vpx or CRISPR/Cas9 knock-out of SAMHD1 allowed for PERV
reverse transcription. Addition of deoxynucleosides alleviated the SAMHD1-mediated
restriction suggesting that SAMHD1-mediated degradation of dNTPs restricts PERV
replication in these human immune cells.
The aims in the second part of this study were to investigate the IFN response by monitoring
induction of IFN stimulated genes following infection by PERV-A/Cs, and to identify the
signaling pathways, which play a role in the type I IFNs response. The results showed that
PERV-A/C increased (over 100-fold) CXCL-10 production in human MDDCs, monocytes
and MDMs compared with non-infected cells or heat-inactivated virus. Treatment with
VLP+Vpx or empty VLP did not cause more CXCL-10 induction compared with untreatment.
The JAK-inhibitor (AT9283) reduced the CXCL-10 induction in infected cells indicating that
the JAK/STAT pathway is activated by PERV-A/C infection of primary human myeloid cells.
In conclusion, the findings in this work highlight SAMHD1 as a potential barrier to PERVA/
C transmission from pig transplants to human recipients during xenotransplantation
Etablierung einer subtypgenerischen HIV-1 envelope PCR zur Bestimmung des Korezeptor-Tropismus aus Plasma und dried fluid spots
Get PDFDie Entwicklung antiretroviraler Medikamente förderte in den letzten Jahren sowohl die
Prävention von HIV als auch die Verbesserung des Krankheitsbildes infizierter
Patienten. Im Angesicht, der sich entwickelnden Resistenzen gegenüber antiretroviraler
Medikamente, ist es notwendig die Forschung diesbezüglich zu vertiefen. Das Wissen
über die Expression und Regulation der Korezeptoren ist von großer Bedeutung für das
Verstehen der HIV Pathogenität.
Das Ziel dieser Arbeit war es ein einfaches und robustes polymerase Kettenreaktion
Setup (polymerase chain reaction, PCR) zu etablieren, um von HIV-positivem Plasma
als auch von getrockneten Serum Proben der Serokonverterstudie bzw. der Molekularen
Surveillance den HIV Korezeptorgebrauch zu bestimmen. Dazu wurde im Rahmen
dieser Arbeit eine subtypgenerische full-length envelope PCR etabliert. Diese ist in der
Lage, den gesamten env open reading frame zu amplifizieren, sodass die viralen
Glykoproteine gp120 und gp41 aus humanem Plasma sequenziert werden können. Die
Arbeit umfasst weiterhin die Etablierung einer hochsensitiven PCR zur Amplifikation des
gp120 V3-loops und dessen Sequenzierung durch Next Generation Sequencing (NGS,
Illumina).
Die Erforschung des Korezeptor-Tropismus erfolgte auf Grundlage des V3-loops und
ermöglichte es, den Korezeptorgebrauch der Infektionsdauer gegenüberzustellen. In
dieser Arbeit konnten erfolgreich zwei PCR-Setups etabliert werden, um diese
Fragenstellung, besonders im Zuge der Umstellung auf NGS basierte Verfahren, zu
ermöglichen. Für filtergetrocknetes Material konnte eine sehr gute Nachweisgrenze von
102 Kop./mL für das 500 Bp Amplikon und für das 3200 Bp Amplikon der Plasmaproben
eine ausreichend gute Nachweisgrenze von 103 Kop./mL erreicht werden. Die
Sequenzierung des full-length env mittels NGS war erfolgreich und eine Ableitung des
Korezeptorgebrauchs war bis zu einem Minoritätengrenzwert von bis zu 3 % möglich.
Das etablierte PCR-Setup wird einen wichtigen Beitrag leisten, um den Anteil
übertragener X4-Troper Viren zu berechnen. Die Nutzung von Maraviroc als
Korezeptorantagonist zur Behandlung von HIV-1 Infektionen unterstreicht die Wichtigkeit
eines aufmerksamen klinischen Monitorings der virologischen Antwort eines unter
Therapie stehenden Patienten.Over the last years, the development of antiretroviral Medication supported the
prevention of HIV and improved the living conditions of infected patients. Due to evolving
antiretroviral resistances, it is necessary to expand the concerning research. The
knowledge about expression and regulation of coreceptors is of major value for
understanding the HIV pathogenicity.
The aim of this work was to establish a simple and robust polymerase chain reaction
(PCR) setup to determine the HIV coreceptor use of both the HIV positive plasma and
dried serum spots found in the samples of the seroconverter study and molecular
surveillance, respectively. This was done by establishing a subtype generic full-length
envelope PCR that is capable to amplify the entire env open reading frame to sequence
the viral glycoproteins gp120 and gp41 from human plasma. Furthermore, this work
includes an establishment of a high sensitive PCR to amplify the gp120 V3-loop and
furthermore sequencing this fragment with next generation sequencing (NGS, Illumina).
The exploration of coreceptor tropism was based on the V3-loop fragment and enabled
the comparison of coreceptor use to the duration of infection. For this research question,
especially for the transition to NGS based methods, two PCR setups were successfully
established. A very good detection limit of 102 cop./mL was achieved for filter dried
material with 500 bp amplicon and a sufficiently well detection limit of 103 cop./mL for
plasma samples with a 3200 bp amplicon for subtype B reference strain. The NGS
sequencing of the full-length env was successful and a derivation of the coreceptor
usage was possible up to a minority limit of 3 %. However, the established PCR setup
will play an important role for the proportion calculation of transferred X4-tropic viruses.
The use of maraviroc as coreceptor-antagonist for treatment of HIV-1 infections
emphasises the importance of an attentive clinical monitoring of the virological answer
of patients under treatment
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