109 research outputs found
Development of a high-throughput screening assay based on pluripotent stem cells to identify modulators of dopaminergic neurogenesis in humans. Purine-dependent pathways and Lesch-Nyhan disease as proof of principle
No full textLes neurones dopaminergiques du système nerveux central sont principalement localisés dans une région du cerveau appelée le mésencéphale ventral. Ils sont divisés en plusieurs sous-groupes projetant sur différentes structures du cerveau formant ainsi les voies dopaminergiques. Ces voies sont impliquées dans la réalisation de fonctions physiologiques essentielles telles que le contrôle moteur, la mémoire, la cognition, le système de récompense ou encore les émotions. Les altérations du développement de ces neurones peuvent conduire à l'apparition de pathologies potentiellement sévères comme des troubles moteurs, des pathologies neurodégénératives ou neuropsychiatriques. C'est le cas de la maladie de Lesch-Nyhan, une pathologie neurodéveloppementale rare causée par la mutation du gène HPRT1 conduisant à un déficit total ou partiel d'une enzyme clé dans la voie de recyclage des purines : l'HGPRT.Afin de pouvoir explorer les mécanismes à l'origine du développement des neurones dopaminergiques et des pathologies les impliquant, les cellules souches pluripotentes humaines se sont avérées être un modèle in vitro intéressant. Ces dernières années, plusieurs protocoles ont été développés afin de modéliser le développement des neurones dopaminergiques et de leurs progéniteurs à partir de ces cellules, en particulier dans le cadre de la recherche sur la maladie de Parkinson. Au cours de ma thèse, j'ai adapté ces protocoles afin de réaliser la différenciation des progéniteurs du mésencéphale dans un format miniaturisé adapté au criblage à haut débit de petites molécules de façon systématique.J'ai ensuite criblé une banque de molécules afin de chercher à identifier des composés potentiels permettant d'augmenter la neurogénèse des progéniteurs dopaminergiques du mésencéphale ventral comme preuve de principe de ce test. Etant donnée l'implication des neurones dopaminergiques dans la maladie de Lesch-Nyhan et du rôle potentiel des purines dans le développement du cerveau, une banque contenant des ligands purinergiques et des voies dépendantes de l'adénosine a été choisie. Ce criblage m'a permis d'identifier un agoniste du récepteur A3 à l'adénosine comme candidat potentiel. Ce composé s'est avéré efficace pour augmenter le taux de progéniteurs compétents pour la différenciation en neurones dopaminergiques à partir de CSP saines. Il a aussi permis de corriger le défaut de genèse des neurones dopaminergiques lié à la perte de fonction de l'HGPRT dans une lignée de CSP modèle de la maladie de Lesch-Nyhan.Le développement d'un tel test ouvre la voie pour le criblage de plus larges banques de molécules pour l'optimisation du protocole et la recherche de traitement pour des pathologies neurodéveloppementales comme la LND ou, à plus grande échelle, impliquant les nDA. Les résultats obtenus à l'issu de ces travaux nous permettraient également d'explorer le rôle du récepteur à l'adénosine ciblé par le composé dans la mise en place des nDA et son implication potentielle dans la maladie de Lesch-Nyhan.Dopamine neurons of the central nervous system are mainly located in the ventral midbrain. They are divided into several subgroups projecting to different brain structures, forming the dopaminergic pathways. These pathways are involved in essential physiological functions such as motor control, memory, cognition, reward system and emotion. Developmental alterations of these neurons can lead to potentially severe pathologies such as motor disorders, neurodegenerative or neuropsychiatric diseases. Among them, Lesch-Nyhan disease represent a rare neurodevelopmental disorder caused by mutation of the HPRT1 gene leading to total or partial loss of a key enzyme in the purine salvage pathway: HGPRT.To explore the mechanisms underlying the development of dopaminergic neurons and the pathologies involving them, human pluripotent stem cells have proven to be an interesting in vitro model. To elucidate the pathway involved in the genesis of DA neurons, the implementation of a high-throughput screening test based on human pluripotent stem cells to identify modulators of dopaminergic neurogenesis was envisaged. In the past few years, several protocols have been developed to model the development of dopaminergic neurons starting from these cells, especially in the context of research on Parkinson's disease.During my PhD thesis, I modified these protocols to allow the differentiation of dopaminergic progenitors in a miniaturized format adapted to high-throughput screening of small molecules in a systematic way.I then screened a library of molecules to identify potential compounds to increase the neurogenesis of ventral midbrain dopaminergic progenitors as a proof of principle for this test. Given the involvement of dopaminergic neurons in Lesch-Nyhan disease and the potential role of purines in brain development, a library containing purinergic ligands and adenosine-dependent pathways was chosen. This screening allowed me to identify an adenosine A3 receptor agonist as a potential candidate. This compound showed efficiency at increasing the production of progenitors competent to the differentiation in dopaminergic neurons from healthy PSC. It also corrected the default of genesis of dopaminergic neurons induced by HGPRT loss of function in a PSC line model of Lesch-Nyhan disease.The development of such an assay paves the way for the screening of larger molecules libraries for protocol optimization or therapeutic research for neurodevelopmental pathologies such as LND or, on a larger scale, involving nDA. The results obtained from this work would also allow us to explore the role of the adenosine receptor targeted by the compound in the nDA establishment and its potential involvement in Lesch-Nyhan disease
Les cellules souches pluripotentes : des outils pour reproduire et étudier les étapes précoces du développement des réseaux de neurones humains.
No full textThe use of pluripotent stem cells for the study of autism and the discovery of new therapeutics
No full textObjectifs : Le gène SHANK3 code pour une protéine dite d’« échafaudage » localisée dans les synapses des neurones glutamatergiques. Elle est nécessaire au bon assemblage des protéines de la densité postsynaptique et est cruciale pour une transmission synaptique efficace. Des anomalies génétiques conduisant à la diminution de la protéine SHANK3 sont impliquées dans plusieurs maladies psychiatriques, incluant des formes génétiques de troubles du spectre autistique ainsi que la schizophrénie. Les mutations étant hétérozygotes, il serait théoriquement possible d’augmenter l’expression de la protéine SHANK3 en augmentant la transcription de l’allèle sain par des traitements chimiques. Cependant, la régulation transcriptionnelle du gène SHANK3 est très peu connue dans les neurones humains par manque de modèles cellulaires pertinents. L’objectif de mon travail de thèse a été de tirer avantage des propriétés d’autorenouvellement et de pluripotence des cellules souches pluripotentes humaines (Human Pluripotent Stem Cells, hPSC) pour produire une grande quantité de neurones humains glutamatergiques in vitro puis de les utiliser comme ressource cellulaire pour développer une technique de criblage à haut débit afin d’identifier des modulateurs de la transcription du gène SHANK3. Résultats : Des précurseurs neuronaux ont été dérivés à partir d’une lignée de cellules souches embryonnaires humaines (SA001, 46 XY, Cellartis, Suède) puis différenciés pendant 14 jours, dans des plaques 384 puits, afin d’obtenir une population composée d’au moins 70 % de neurones corticaux glutamatergiques. Une méthode à haut débit automatisée et miniaturisée basée sur la technique FastLane (Qiagen) a été développée pour extraire les ARNm directement à partir des plaques 384 puits. Les variations d’ARNm de SHANK3 induites par les différents traitements ont ensuite été quantifiées par qPCR Taqman en duplex, en normalisant avec le gène de ménage Cyclophiline A, et en rapportant aux niveaux d’ARNm de neurones non traités (Méthode de 2-ΔΔCt). Un criblage sur 205 composés, incluant des inhibiteurs de kinase, des régulateurs épigénétiques et des médicaments repositionnables, a été réalisé et 28 hits augmentant de plus de 30 % l’ARNm de SHANK3 ont été découverts. Seize composés ont été confirmés par des expériences de dose réponses sur l’ARNm de SHANK3. Des expériences d’immunofluorescence par imagerie à haut contenu ont confirmées que 4 composés augmentaient de façon significative les niveaux de la protéine SHANK3 dans le réseau neuritique, incluant des inhibiteurs de la kinase cycline dépendante 5 (Cdk5) avec la roscovitine et le lithium (régulateur d’humeur), l’antiépileptique acide valproïque et l’antipsychotique fluoxétine. Des mesures fonctionnelles de flux calcique ont validé l’effet du lithium et de l’acide valproïque sur la force synaptique glutamatergique. Enfin, le potentiel de ces composés a également été exploré sur des neurones différenciés à partir de cellules souches induites à la pluripotence (Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC) d’individus autistes portant une mutation sur le gène SHANK3. Conclusion : Cette étude démontre qu’il est possible d’identifier des voies de régulation de protéines clés synaptiques, comme SHANK3, par méthode de criblage à haut débit en utilisant des neurones humains dérivés d’hPSC, incluant des neurones représentatifs d’individus autistes avec la technologie iPSC. Cette nouvelle approche devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires responsable de l’autisme et la découverte de nouveaux composés thérapeutiques, personnalisables à de sous-groupes de sujets autistes classifiés en fonction du gène ou de la voie de signalisation à corriger plutôt qu’en fonction de leurs symptômes cliniques hétérogènes.Aims: The SHANK3 gene codes for a scaffold protein located in synapses of glutamatergic neurons. It plays a crucial role in the postsynaptic density assembly and in controlling glutamatergic synaptic transmission. Genetic anomalies leading to a decrease in SHANK3 protein expression are implicated in several psychiatric conditions, including genetic forms of autism spectrum disorders and schizophrenia. Mutations being heterozygous, treatments that increase SHANK3 protein through transcriptional regulation may be therapeutically useful. However, little is known about SHANK3 gene transcriptional regulation in human neurons because of the lack of a relevant cellular model. Here I took advantage of the self-renewing and pluripotency properties of human pluripotent stem cells (hPSC) to produce a large amount of human glutamatergic neurons in vitro and use them as a cellular resource to develop a large-scale screening strategy to identify SHANK3 gene transcription modulators. Results: Neuronal precursors were differentiated from one human embryonic stem cell line (SA001, 46 XY, Cellartis, Sweden). Cultures containing more than 70% of neurons with a cortical glutamatergic phenotype were reproducibly obtained in 384-well plates upon 14 days of precursor differentiation. Automated and high-throughput mRNA extraction was performed using Fastlane technology (Qiagen) in 384-well plates. SHANK3 mRNA levels were quantified using duplex Taqman qPCR, normalized to Cyclophilin A mRNA levels, then to SHANK3 mRNA levels of vehicle-treated cells in order to determine SHANK3 mRNA variations induced by the compound treatment (2-ΔΔCt method). A screening assay was conducted on 205 compounds, including kinase inhibitors, epigenetic regulators and repositionable marketed drugs, and 28 compounds successfully passed the hit selection criteria yielding SHANK3 mRNA increases of at least 30% from mean control values with a statistical cut-off of 2 standard deviation. Sixteen compounds were confirmed by dose-response experiments on SHANK3 mRNA. Further immunofluorescence studies using high content imaging confirmed that 4 compounds increased levels of SHANK3 protein in the neuritic network. Thus, this screening identified as SHANK3 regulators 2 Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) inhibitors the lead molecule, roscovitine and the mood regulator, lithium; the antiepileptic drug valproïc acid and the antipsychotic fluoxetine. In addition, functional calcium flux experiments validated lithium and valproïc acid effect on glutamatergic synaptic strength. Finally, the compounds were also tested on neurons differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSC) of autistic patients bearing SHANK3 mutation. Conclusion: This study demonstrates that cellular pathways regulating a key synaptic protein, SHANK3, can be explored on a large scale using hPSC-derived neurons, including autistic individuals neurons using iPSC technology. This approach should help improving knowledge of the molecular mechanisms responsible of autism and promote the discovery of new therapeutic compounds, personalized to autistic subgroups of individuals stratified according to gene or pathway dysfunction rather than according to clinical heterogeneous symptoms
Modelization of dopaminergic neurons dysfunction associated with Lesch-Nyhan syndrome using induced pluripotent stem cells
No full textLa maladie de Lesch-Nyhan (MLN) est une maladie rare dont la prévalence est estimée à une naissance sur 380 000. Il s’agit d’une maladie métabolique d’origine génétique liée au chromosome X, impliquant le gène de la HGPRT (hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl-transférase). Les mutations dans ce gène entrainent un déficit d’activité de l’enzyme qui joue un rôle central dans le métabolisme des purines. Cette baisse d’activité provoque un défaut de fonctionnement de la voie de recyclage des purines induisant l’accumulation d’acide urique dans les articulations (goutte) et les reins (lithiase) qui peut être contrôlée par la prise d’allopurinol. En revanche, ces symptômes sont généralement accompagnés de troubles neurologiques quant à eux encore totalement inexpliqués et non traités. Ces derniers se traduisent par un handicap moteur important avec des mouvements anormaux (dystonie) et des troubles du tonus (hypotonie axiale). Dans les cas les plus graves des troubles du comportement peuvent également survenir se manifestant par des évènements importants d'automutilation (morsure des lèvres et des doigts). Des études menées en imagerie cérébrale, ont permis d’identifier chez les malades une diminution de la concentration cérébrale en dopamine mais aucune étude n’a encore pu lier de façon évidente le déficit en dopamine et la HGPRT, rendant difficile le développement de thérapies efficaces. L’objectif de ce travail a été de tirer avantage des propriétés d’auto renouvellement et de pluripotence des cellules souches induites à la pluripotence humaines (iPSC) pour produire d'authentiques neurones dopaminergiques (nDA) puis de les utiliser afin de déterminer dans quelle mesure la HGPRT est essentielle au développement et à l’homéostasie des nDA. Pour cela nous avons sélectionnés des fibroblastes obtenus à partir de biopsie de peau d’enfants atteints par la MLN que nous avons reprogrammé en iPSC. Ces iPSC ont été caractérisées et en particulier, l’expression protéique et l’activité enzymatique de la HGPRT a été contrôlée afin de valider notre modèle pathologique. Un protocole de différenciation de neurones dopaminergiques à partir d’iPSC a ensuite été mis au point pour permettre l’étude des différents stades de développement des neurones DA. Celui-ci permet d’obtenir des précurseurs exprimant pour 60% des cellules les marqueurs caractéristiques des précurseurs du mésencéphale ventral (MV), tout en respectant les différentes étapes clés du développement des nDA. Après l’induction de la différenciation des précurseurs en neurones, la population neuronale est composée d’au moins 20% de nDA exprimant les deux enzymes de la voie de synthèse de la dopamine TH et AADC. Ces différentes étapes du développement des nDA ont ensuite été analysées en comparant des cellules porteuses de mutations associées à la MLN et des cellules contrôles. Une anomalie neuro-développementale survenant à un stade précoce de la formation des nDA a été identifiée. Lors de l’étape ultime de différenciation, la proportion de précurseurs du MV capables de sortir du cycle cellulaire et donnant des neurones matures est plus faible dans les cultures de cellules porteuses des mutations MLN. Cette étude a permis dans un premier temps de démontrer qu’il était possible de modéliser une maladie impactant un gène essentiel dans le métabolisme à l’aide des iPSC. De plus, nous avons montré qu’il est possible d’identifier l’étape critique dans la genèse des nDA en utilisant des neurones humains dérivés d’iPSC issus d’enfants atteints de MLN. Cette approche apporte ainsi une meilleure compréhension sur les mécanismes responsables de la pathologie, et de nouveaux axes de recherche pour des approches thérapeutiques.Lesch-Nyhan disease (LND) is a rare genetic disease with a prevalence estimated to 1:380,000. LND is a metabolic Xchromosome linked disorder that essentially affects boys and involves HGPRT gene (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase). Mutations in this gene result in a deficit of enzyme activity that plays a central role in the metabolism of purines. This activity deficiency induces a dysfunction on purine recycling pathway and promotes accumulation of uric acid in the joints (gout) and kidneys (stones) controlled using allopurinol. Next to these metabolic symptoms are neurological disorders which are not understood and efficiently controlled. These involve abnormal movements (dystonia) and low tonus (axial hypotonia). A unique feature of LND is the occurrence of self-injurious behaviors known as SIB (biting of lips and fingers). Brain imaging studies have revealed in LND patient a decrease of cerebral dopamine concentration but no study has yet been able to clearly link dopamine defect and HGPRT loss of activity, making it difficult to develop effective therapies. The aim of my study was to take advantage of the self-renewal and pluripotency properties of human induced pluripotent stem cells (iPSC) to produce dopaminergic neurons (nDA), then to use them to determine in which extend HGPRT is essential to the development and homeostasis of nDA. To that purpose, we selected fibroblasts obtained from skin biopsies of LND children that we have reprogrammed into iPSC. These iPSC were characterized and in particular, protein expression and enzymatic activity of HGPRT was assessed to validate our pathological model. We developed a protocol to differentiate dopaminergic neurons from iPSC to allow the study of different stages of nDA development. It provides mature precursors of nDA, expressing the typical marker of ventral midbrain (VM), while respecting the different key stages of nDA development. Upon terminal differentiation, these precursors produce at least 20% of nDA that express the two main enzymes of the dopamine synthesis pathway, namely TH and AADC. These different stages of nDA development were analyzed comparing LND and control IPSC. Neurodevelopmental abnormality occurring at an early stage of nDA formation was identified. At the final stage of differentiation, the proportion of MV precursors able to exit the cell cycle and differentiate as mature neurons is lower in LND culture compared to controls. This study provided evidences that it is possible to model a metabolic disease with iPSC and that they are essential tools to study neurodevelopmental disorders. This approach provides a better understanding of mechanisms responsible for the disease, and new research directions for therapeutic approaches
Participation des caspases à la mort neuronale induite par une ischémie focale chez la souris
No full textPARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF
Contribution of Human Pluripotent Stem Cell-Based Models to Drug Discovery for Neurological Disorders
No full textOne of the major obstacles to the identification of therapeutic interventions for central nervous system disorders has been the difficulty in studying the step-by-step progression of diseases in neuronal networks that are amenable to drug screening. Recent advances in the field of human pluripotent stem cell (PSC) biology offers the capability to create patient-specific human neurons with defined clinical profiles using reprogramming technology, which provides unprecedented opportunities for both the investigation of pathogenic mechanisms of brain disorders and the discovery of novel therapeutic strategies via drug screening. Many examples not only of the creation of human pluripotent stem cells as models of monogenic neurological disorders, but also of more challenging cases of complex multifactorial disorders now exist. Here, we review the state-of-the art brain cell types obtainable from PSCs and amenable to compound-screening formats. We then provide examples illustrating how these models contribute to the definition of new molecular or functional targets for drug discovery and to the design of novel pharmacological approaches for rare genetic disorders, as well as frequent neurodegenerative diseases and psychiatric disorders
Intracerebral transplantation for neurological disorders. Lessons from developmental, experimental and clinical studies
No full textThe use of human pluripotent stem cells for cell therapy faces a number of challenges that are progressively answered by results from clinical trials and experimental research. Among these is the control of differentiation before transplantation and the prediction of cell fate after administration into the human body, two aspects that condition both the safety and efficacy of the approach. For neurological disorders, this includes two steps: firstly, the identification of the optimal maturation stage for transplantation along the continuum that transforms pluripotent stem cells into fully differentiated neural cell types, together with the derivation of robust protocols for large-scale production of end-products, and, secondly, the understanding of environmental cues that will allow maintenance of commitment and avoid the development of adverse structures. This review will summarize our knowledge on developmental processes that have been applied to achieve robust in vitro differentiation of pluripotent stem cells into neural progenitors, and will examine the effects of the recipient brain environment on the pre-transplantation commitment
Pluripotent stem cells as a model to study non-coding RNAs function in human neurogenesis
No full textAs fine regulators of gene expression, non-coding RNAs, and more particularly micro-RNAs (miRNAs), have emerged as key players in the development of the nervous system. In vivo experiments manipulating miRNAs expression as neurogenesis proceeds are very challenging in the mammalian embryo and totally impossible in the Human. Human pluripotent stem cells (hPSC), from embryonic origin (hESC) or induced from adult somatic cells (iPSC), represent an opportunity to study the role of miRNAs in the earliest steps of human neurogenesis in both physiological and pathological contexts. Robust protocols are now available to convert pluripotent stem cells into several sub-types of fully functional neurons, recapitulating key developmental milestones along differentiation. This provides a convenient cellular system for dissecting the role of miRNAs in phenotypic transitions critical to brain development and plasticity that may be impaired in neurological diseases with onset during development. The aim of this review is to illustrate how hPSCS can be used to recapitulate early steps of human neurogenesis and summarize recent reports of their contribution to the study of the role of miRNA in regulating development of the nervous system
Notch promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells
No full textA central challenge in embryonic stem (ES) cell biology is to understand how to impose direction on primary lineage commitment. In basal culture conditions, the majority of ES cells convert asynchronously into neural cells. However, many cells resist differentiation and others adopt nonneural fates. Mosaic activation of the neural reporter Sox-green fluorescent protein suggests regulation by cell-cell interactions. We detected expression of Notch receptors and ligands in mouse ES cells and investigated the role of this pathway. Genetic manipulation to activate Notch constitutively does not alter the stem cell phenotype. However, upon withdrawal of self-renewal stimuli, differentiation is directed rapidly and exclusively into the neural lineage. Conversely, pharmacological or genetic interference with Notch signalling suppresses the neural fate choice. Notch promotion of neural commitment requires parallel signalling through the fibroblast growth factor receptor. Stromal cells expressing Notch ligand stimulate neural specification of human ES cells, indicating that this is a conserved pathway in pluripotent stem cells. These findings define an unexpected and decisive role for Notch in ES cell fate determination. Limiting activation of endogenous Notch results in heterogeneous lineage commitment. Manipulation of Notch signalling is therefore likely to be a key factor in taking command of ES cell lineage choice
- …
