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Identifizierung und Charakterisierung von Genen mit Einfluss auf Entwicklung und Erhalt des Knorpel-/Knochen-Systems
No full textDefects in formation, growth and homeostasis of the skeleton are responsible for various human monogenic and multigenic heritable disorders as skeletal dysplasias, craniosynostosis and ostheoarthritis. Thus, the present dissertation aims at the identification of novel genes and pathways involved in the complex processes of cartilage/bone formation, growth, differentiation and homeostasis, which may serve as candidate genes for the above mentioned disorders. In the first part of my work, I analysed 4748 clones from a human growth plate cartilage cDNA library generated from 20 weeks prenatal- to 2 years postnatal specimens (Tagariello et al., 2005a). In silico analysis of these sequences revealed 1688 individual transcription units, corresponding to known (1274) and to novel, yet uncharacterised genes (414). The EST profile representing with a total of approximately 10% proteins already shown to be involved in cartilage/bone development or homeostasis, reflect the tissue specifity of the library. The EST profile also reflects the developmental stage of the tissue with significant differences in the expression of matrix known compounds compared to corresponding EST profiles from 8-12 and 12-20 week human fetal cartilage. Calculation of the relative frequency of transcripts in our cDNA library, as compared to their abundance in other EST databases, revealed a set of approximately 200 genes, including 81 novel, yet uncharacterised genes, showing increased expression. These genes represent candidates for the large number of osteochondrodysplasias for which the causative gene defects have not yet been identified. In the present thesis, I described the further characterization of a putative candidate gene (ECM3: extracellular matrix protein 3). The predicted protein has a length of 583 amino acids with 12 leucine-rich repeats, a signal peptide and a high homology to ECM2 and BGN. The expression of ECM3 is restricted to a few tissues including placenta as well as normal and osteoarthritic cartilage. Investigation of the high expression level of ECM3 in several specimens of cartilage from osteoarthritis and rheumtatoid arthritis patients in different stages of disease progression by real-time PCR, indicated a function of ECM3 in the pathogenesis of these two forms of chronic arthropathies. Furthermore ECM3 turned out to be an excellent positional candidate gene for a patient with an interesting combination of frontometaphyseal dysplasia and periventricular nodular heterotopia. However, in collaboration with Dr. Zenker (Department of Human Genetics, Erlangen) ECM3 was excluded to be involved in this disease. Instead, an unusual mutation in the Filamin A (FLNA) gene was shown to be the basic cause of the clinical phenotype (Zenker et al., 2004). In the second part of my work I focused on novel genes involved in the process of desmal ossification. I analysed a patient with a craniosynostosis and a de novo balanced translocation. Craniosynostosis is a congenital developmental disorder involving premature fusion of cranial sutures resulting in an abnormal shape of the skull. Little is known about the various forms of craniosynostosis. At birth the patient presented with Crouzon-like brachycephaly, proptosis, midfacial hypoplasia and low set ears. Three-dimensional cranial computer tomography revealed fusion of the lambdoid sutures and distal part of the sagittal suture with a gaping anterior fontanelle. Mutations in the genes for FGFR1-3 were excluded. Standard chromosome analysis revealed a de novo balanced translocation t(9;11)(q33;p15). The identified breakpoint on chromosome 11p15 disrupts the SOX6 gene, a gene known to be involved in skeletal growth and differentiation processes. Screening of the SOX6 gene in 104 patients with various forms of craniosynostosis revealed a missense mutation in one particular patient with an apparently isolated complex craniosynostosis involving the coronal and sagital suture. Interestingly, an evolutionary conserved aspartate residue at position 68 was exchanged against asparagine as a result of the mutation. The affected amino acid is located in the N-terminal part of SOX6 and has so far not been assigned to any functional domain. Since the mutation was also found in the patient´s apparently non-affected mother, it remains open, whether the mutation represents a rare polymorphism or is associated with a craniosynostosis form with reduced penetrance. The breakpoint on chromosome 9 could be located in a region without any known or predicted genes, but interestingly, disrupts patches of evolutionary high conserved non-genic sequences (CNGs) and may thus led to a dysregulation of flanking genes on chromosome 9 or 11 involved in skull vault development. Two interesting target genes of this dysregulation are TLR4 (previously shown to be involved in bone development) and ARM1 a novel gene, identified in the context of my present study.Defekte bei Bildung, Wachstum und Homöostase des Skeletts sind verantwortlich für eine Reihe menschlicher Erkrankungen, zu denen neben zahlreichen Skelettdysplasien und Kraniosynostosen auch Osteoarthrose und rheumatoide Arthritis gehören. Da die diesen Erkrankungen zugrunde liegenden molekularen Prozesse nur in Ansätzen aufgeklärt sind, war es Ziel der Arbeit, neue Gene, die in die komplexen Prozesse der Knorpel-/Knochenbildung, -differenzierung und -homöostase beim Menschen involviert sind, zu identifizieren und molekular zu charakterisieren. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden zunächst insgesamt 4748 ESTs aus humanem fetalen Wachstumsfugenknorpel (20.SSW – 2.Lebensjahr), die im Rahmen eines Kooperationsprojektes mit der Universität Mainz und der Fa. GENterprise generiert worden waren, bioinformatisch ausgewertet und zur Erstellung eines Expressionsprofils verwendet (Tagariello et al., 2005a). Die 4748 ESTs repräsentieren 1688 unterschiedliche Transkripte, die sich auf 1247 bekannte und 414 unbekannte, putative Gene verteilen. Die Spezifität der cDNA-Bibliothek, sowie der gewonnenen Daten, zeigte sich dadurch, dass für ca. 10% aller bekannten Gene in dem ausgewerteten Datensatz bereits eine Funktion in der Knorpel-/Knochenentwicklung und -homöostase nachgewiesen war. Im Vergleich mit entsprechenden Datensätzen anderer Entwicklungsstadien konnten entwicklungsspezifische Unterschiede im Expressionsprofil identifiziert werden. Die Berechnung der relativen Frequenz der ausgewerteten Transkripte, im Vergleich zu der Verteilung der Transkripte in anderen cDNA-Bibliotheken, ergab einen Satz von 81 Genen, die entweder völlig uncharakterisiert sind oder für die bisher keine Funktion bei der Skelettentwicklung beschrieben wurde. Diese Gene stellen mögliche Kandidatengene für Skeletterkrankungen dar. Eines der identifizierten Gene (ECM3: extracellular matrix 3) kodiert für ein putatives Protein mit einem Signalpeptid und 12 „Leucin-reichen Repeats“, das Ähnlichkeit zu den Proteinen BGN, ECM1 und ECM2 aufweist. Die Expression von ECM3 ist auf wenige Gewebe (u.a. Plazenta, sowie normalen und osteoarthrotischen Knorpel) begrenzt. Quantitative Expressionsanalysen mittels „Real-Time“-PCR ergaben eine signifikant höhere Expression des ECM3-Gens in Kniegelenkknorpel-Resektaten einzelner Patienten mit Osteoarthrose oder rheumatoider Arthritis, so dass vermutet werden kann, dass ECM3 in die Pathogenese der beiden chronischen Gelenkerkrankungen involviert ist. Darüber hinaus stellte ECM3 zu Beginn der vorliegenden Arbeit auch ein exzellentes positionelles Kandidatengen für die Frontometaphysäre Dysplasie (FMD) dar. Durch Untersuchung eines seltenen Patienten mit bilateraler Periventrikulärer Nodulärer Heterotopie und einer FMD, die in Zusammenarbeit mit Dr. Zenker (Institut für Humangenetik, Erlangen) durchgeführt wurde, konnte ECM3 im Rahmen der vorliegenden Arbeit als ursächliches Gen ausgeschlossen und stattdessen eine Mutation im Filamin A (FLNA)-Gen nachgewiesen werden (Zenker et al., 2004). Neben der breit angelegten, grundlegenden Strategie zur Genidentifizierung wurde in der vorliegenden Arbeit auch versucht, über einen Patienten-basierten Ansatz Kandidatengene für die Knorpel/Knochenentwicklung zu identifizieren. Hierzu wurden die Bruchpunkte bei einem Patienten mit Kraniosynostose und einer balancierten Chromosomentranslokation (t(9;11) (q33;p15)) kloniert und sequenziert (Tagariello et al., 2005b). Bei den Kraniosynostosen handelt es sich um die frühzeitige Verknöcherung einer oder mehrerer Schädelnähte, deren Ursachen bisher nur in Ansätzen bekannt sind. Der Bruchpunkt auf Chromosom 11p15 unterbricht das SOX6-Gen, das in Skelettentwicklung und -wachstum involviert ist. Obwohl in der vorliegenden Arbeit eine Missens-Mutation im SOX6-Gen bei einem weiteren Patienten mit Kraniosynostose identifiziert werden konnte, ließ sich ein direkter Nachweis der SOX6-Veränderung als Ursache für das Krankheitsbild nicht erbringen. Der Bruchpunkt auf Chromosom 9q33 ist in einer Region ohne bekannte oder vorhergesagte Gene lokalisiert. Hier unterbricht die Translokation interessanterweise eine Reihe von evolutionär hoch konservierten, nicht-kodierenden und nicht-transkribierten Elementen (CNGs = highly conserved non-genic sequences), was zu möglichen Positionseffekten auf flankierende Gene führen könnte. Zwei interessante Kandidatengene, die den Bruchpunkt flankieren, stellen hierbei die Gene TLR4 (für das eine Funktion bei der Knochenentwicklung bereits nachgewiesen wurde) und das in der vorliegenden Arbeit neu identifizierte und in der Schädeldecke exprimierte Gen ARM1 dar
A novel mutation in FGFR-3 disrupts a putative N-glycosylation site and results in hypochondroplasia
No full text Winterpacht, Andreas, Katja Hilbert, Christiane Stelzer, Thorsten Schweikardt, Heinz Decker, Hugo Segerer, Jürgen Spranger, and Bernhard Zabel. A novel mutation in FGFR-3 disrupts a putative N-glycosylation site and results in hypochondroplasia. Physiol. Genomics 2: 9–12, 2000.—Fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) is a glycoprotein that belongs to the family of tyrosine kinase receptors. Specific mutations in the FGFR3 gene are associated with autosomal dominant human skeletal disorders such as hypochondroplasia, achondroplasia, and thanatophoric dysplasia. Hypochondroplasia (HCH), the mildest form of this group of short-limbed dwarfism disorders, results in ∼60% of cases from a mutation in the intracellular FGFR3-tyrosine kinase domain. The remaining cases may either be caused by defects in other FGFR gene regions or other yet unidentified genes. We describe a novel HCH mutation, the first found outside the common mutation hot spot of this condition. This point mutation, an N328I exchange in the extracellular Ig domain III of the receptor, seems to be unique as it affects a putative N-glycosylation site that is conserved between different FGFRs and species. The amino acid exchange itself most probably has no impact on the three-dimensional structure of the receptor domain, suggesting that the phenotype is the result of altered receptor glycosylation and its pathophysiological consequences. </jats:p
Einfluss von krebsrelevanten Mutationen in SPOC1 auf DNA-Schäden
No full textSPOC1 ist ein epigenetischer Reader, der mit seinem PHD-Finger an die spezifische Histonmodifikation H3K4me2/3 bindet. SPOC1 wurde als ein Gen identifiziert, dessen erhöhte Expression im Tumor mit einer reduzierten Überlebenszeit von Ovarialkarzinompatienten einhergeht. SPOC1 ist an zellulären Differenzierungsprozessen und der Spermatogenese beteiligt. Zudem beeinflusst es die Chromosomenstabilität und die Mitose. Ebenso ist SPOC1 bei der Repression und Regulation viraler Vorgänge, der Tumorgenese sowie an DNA-Reparaturvorgängen beteiligt. SPOC1 beeinflusst diese Prozesse dosisabhängig. Eine Überexpression von SPOC1 führt zu stärker kondensiertem Chromatin und einer verringerten DNA- Reparatur. Ein Mangel von SPOC1 führt zu einer Lockerung des Chromatins und zu einer schnelleren DNA-Reparatur. Zudem erhöht es die Rate des „Non-homologous end joining“ (NHEJ).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu prüfen, ob ein kausaler Zusammenhang zwischen Punktmutationen im SPOC1 Gen und der Tumorentstehung besteht. Dazu wurde der Einfluss von Missense-Mutationen in SPOC1 auf das Vorkommen und die Reparatur von DNA-Schäden untersucht.
Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Mutationen wurden in Tumorproben entdeckt und vom International Cancer Genome Consortium dokumentiert. Die Mutationen p.Cys277Tyr (C277Y) und p.Thr254Pro (T254P) befinden sich im PHD- Finger von SPOC1. C277Y, T254P und SPOC1 Wildtyp (wt) wurde in humane HEK293 Zellen transfiziert. Durch die Transfektion von SPOC1 wt kam es zu einer Überexpression von SPOC1 in den HEK293 Zellen. Anschließend wurde durch Wasserstoffperoxid DNA-Schäden in die Zellen induziert. Die Mutationen in SPOC1 wurden durch einen Immunfluoreszenznachweis von γH2AX Foci und einem Comet Assay auf ihre Auswirkung und auf das Vorkommen von DNA-Schäden beurteilt. Die Mutationen wurden mit dem SPOC1 wt und einer Leerprobe verglichen.
Es konnte für den SPOC1 wt ein dosisabhängiger Effekt auf die Anzahl von DNA- Schäden gezeigt werden. Eine SPOC1 wt Überexpression bewirkt gegensätzliche Effekte. Es führt einerseits zu einer geringeren Menge an DNA-Schäden durch stark kondensiertes Chromatin und erschwert andererseits die DNA-Reparatur dieser Schäden. In in silico Analysen der Mutationen C277Y und T254P konnten Strukturveränderungen im PHD-Finger des SPOC1 festgestellt werden. Für die Mutation T254P konnten keine eindeutigen Zusammenhänge zwischen einem Einfluss auf die DNA-Schäden und Auswirkung durch die Mutation ermittelt werden. Bei der Mutation C277Y konnte ein Einfluss auf die Anzahl der DNA-Schäden nachgewiesen werden. Sie wurde als eine Mutation identifiziert, welche vermutlich durch einen Defekt im PHD- Finger die Bindungseigenschaft des SPOC1 Proteins an das Chromatin beeinträchtigt. Dieses führt zu vermehrten DNA-Schäden und zur Dysregulation von DNA-Reparaturvorgängen. Auf diese Weise könnte die Mutation C277Y an Tumorentstehung bzw. –progression beteiligt sein
Die Rolle von PHF13 in der Spermatogenese
No full textThe production of male gametes through meiosis is an essential process guarded by different check points to ensure proper distribution of genetic material to the haploid sperm cells, enable genetic diversity through recombination and minimise danger to genomic integrity by tight control of transposable elements. This study aimed to elucidate the specific roles of the PHD finger protein PHF13, an epigenetic reader for H3K4me2/3, in spermatogenesis. The protein has diverse functions in different cellular mechanisms, such as DNA damage repair, chromosome segregation and transposon regulation, influencing a variety of biological processes, including but not limited to embryonic development,
stem cell maintenance and tumorigenesis.
In the first part of this work I investigated the testicular single cell transcriptome of a knockout mouse model of PHF13. All cell types are present and cluster together with wildtype cells. By analysing differentially expressed genes and gene regulatory pathways, I could show that while some general transcriptional changes are evident, no cell-type specific pathways are affected. By analysing gene expression over pseudotime as well as through RNA-FISH and RNA-polymerase analysis, I found no general upregulation of gonosomal transcripts during pachytene in the knockout, rebutting the previous working hypothesis of partial MSCI failure. Nevertheless, I was able to demonstrate that
some proteins downregulated by Phf13 knockout localise to the XY-body during the pachytene and diplotene stages of meiotic prophase I.
Moreover, single cell RNA sequencing revealed previously undetected RNA expression of Phf13 not only in spermatogonia, but also spermatocytes. Through 5’ RACE and qPCR analyses I determined the presence of a second, truncated PHF13 isoform specifically in testis. Detailed immunocytologcial analysis of meiocyte populations revealed that both protein isoforms are present at low levels in spermatocytes, localising to the XY body. The shorter protein, termed miniPHF13, was detected in a punctum close to the XY body in spermatocytes and at the base of elongating spermatids, reminiscent of the dense body, an enigmatic meiotic structure. Using CoIP of transfected HeLa cells, I confirmed interaction of PHF13 with SIN3A and YBX1, previously identified in ES cells, and demonstrated a colocalisation in testis tissue. While proof of interaction in testis is still outstanding, this finding nevertheless points towards concerted action of PHF13 and SIN3A in the maintenance of the spermatogonial stem cell pool.
To take a completely different approach to evaluate PHF13 function, in the final part I heterologously expressed human PHF13 and deletion variants lacking either the N- or C-terminus in Drosophila melanogaster, which does not possess a Phf13 homologue. Using various driver genes I evaluated the effect of transgene expression in somatic, mitotic and early meiotic testicular cell populations. While I did not find an effect of ectopic PHF13 on fertility in the flies, expression of full-length PHF13 under ptc-control, active in testicular cyst cells, but also during spacial patterning and neuronal development, lead to a decline in viability and caused neuronal locomotor defects.
In conclusion, the essential function of PHF13 in spermatogenesis is the maintenance of the stem cell pool, most likely through interaction with the histone remodeling complexes SIN3A/HDAC1 and PRC2. Although localising to the XY body, it is not essential for meiotic sex chromosome inactivation. A newly identified truncated isoform is present in the dense body of pachytene spermatocytes. Additionally, results obtained by heterlogous expression of PHF13 in flies point towards a role for PHF13 in brain development and memory formation, an area that has not been extensively studied so far.Die Produktion männlicher Keimzellen durch Meiose ist ein für die Fortpflanzung grundlegender Prozess, dessen korrekter Ablauf an verschiedenen Fixpunkten kontrolliert wird. Dadurch wird die richtige Verteilung von genetischem Material an die haploiden Spermien sichergestellt, genetische Vielfalt durch Rekombination ermöglicht und durch strikte Regulation von transposablen Elementen genomische Integrität gewahrt. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, die spezifische Rolle des PHD-Finger Proteins PHF13, einem epigenetischen ”Reader” von H3K4me2/3, in der Spermatogenese aufzuklären. Das Protein erfüllt verschiedene Funktionen in unterschiedlichen zellulären Mechanismen, z.B. DNA-Reparatur, Chromosomenverteilung und Transposon-Kontrolle, wodurch es Einfluss auf verschiedene biologische Prozesse nimmt. Dazu gehören unter Anderem Embryonalentwicklung, Stammzellerhalt und Tumorgenese.
Im ersten Teil dieser Arbeit untersuchte ich das testikuläre Transkriptom eines Phf13-knockout Mausmodells auf Einzelzellebene. Es zeigte sich, dass alle Zelltypen vorhanden sind und zusammen mit den Wildtyp-Zellen Cluster bilden. Durch Analyse von differentiell exprimierten Genen und regulatorischen Signalwegen konnte ich zeigen, dass zwar einige generelle transkriptionelle Veränderungen vorhanden sind, aber keine Zelltyp-spezifischen Signalwege betroffen sind. Bei Analyse der Genexpression über Pseudozeit, RNA-FISH und der Untersuchung der Verteilung von differentiell phosphotylierten RNA-Polymerase II-Varianten am XY-Körperchen fand ich keine generelle vermehrte Expression gonosomaler Transkripte während des Pachytäns im Knockout. Dies widerlegt die vorhergehende Arbeitshypothese, dass die meiotische Geschlechtschromosomeninaktivierung teilweise fehlschlägt. Dennoch war ich in der Lage zu zeigen, dass einige Proteine, die durch den knockout von Phf13 herunterreguliert werden, während des Pachytän- und Diplotänstadiums der meiotischen Prophase I im XY-Körperchen lokalisiert sind.
Des Weiteren enthüllte Einzelzell-RNA-Sequenzierung eine zuvor unentdeckte RNA-Expression von Phf13 nicht nur in Spermatogonien, sondern auch in Spermatozyten. Durch 5’ RACE und qPCR-Analysen konnte ich die Präsenz einer zweiten, verkürzten PHF13 Isoform speziell im Hoden zeigen. Detaillierte immunzytologische Analyse von Meiozyten-Populationen ergab, dass beide Proteinformen in niedriger Konzentration in Spermatozyten vorhanden sind, wo sie im XY-Körperchen
lokalisiert sind. Das kürzere Protein, das miniPHF13 genannt wurde, wurde in einer punktförmigen Struktur nahe beim XY-Körperchen in Spermatozyten und an der Basis des ”Kopfes” von elongierenden Spermatiden detektiert. Dieses Signal-Muster deckt sich mit dem des sogenannten ”dense body”, einer enigmatischen meiotischen Struktur. Durch CoIP-Experimente mit transfizierten HeLa-Zellen bestätigte ich die Interaktion von PHF13 mit SIN3A und YBX1, die zuvor in ES Zellen identifiziert worden waren, und konnte eine Colokalisation in Hodengewebe zeigen. Während diese Interaktion im Hoden noch bestätigt werden muss, deutet dieser Befund dennoch auf eine gemeinschaftliche Funktion von PHF13 und SIN3A beim Erhalt des spermatogonalen Stammzellreservoirs hin.
Um einen völlig anderen Ansatz zur Untersuchung der Funktion von PHF13 zu verwenden, exprimierte ich im letzten Teil dieser Arbeit humanes PHF13 und Deletionsmutanten, denen entweder N- oder C-Terminus fehlte, in Drosophila melanogaster, einem Organismus, der selbst kein Phf13-Homolog besitzt. Mittels verschiedener Treiber-Gene untersuchte ich den Effekt der Expression von PHF13 in somatischen, mitotischen und frühen meiotischen testikulären Zellpopulationen. Während ich keinen Effekt von ektopem PHF13 auf die Fertilität der Fliegen nachweisen konnte, führte Expression des kompletten PHF13-Proteins unter der Kontrolle von ptc, einem Protein das nicht nur in testikulären Zyst-Zellen, sondern sowohl während der Bestimmung der Segmentpolarität als auch während der neuronalen Entwicklung aktiv ist, zu einer Reduktion der Lebensfähigkeit und verursachte Locomotor-Defizite.
Abschließend ist die Hauptfunktion von PHF13 während der Spermatogenese der Erhalt des Stammzellreservoirs, sehr wahrscheinlich durch Interaktion mit den Histon-Remodellierungskomplexen SIN3A/HDAC1 und PRC2. Obwohl das Protein im XY-Körperchen präsent ist, ist es nicht notwendig für die meiotische Geschlechtschromosomeninaktivierung. Eine zum ersten Mal identifizierte verkürzte Isoform von PHF13 ist im ”dense body” von Pachytän-Spermatozyten vorhanden. Des Weiteren deuten Ergebnisse, die durch die heterologe Expression von PHF13 in Taufliegen erlangt wurden, darauf hin, dass PHF13 eine Rolle in der Gehirnentwicklung und Gedächtnisbildung spielt, die bisher noch nicht weiter untersucht wurde
Analyse genomweiter Veränderungen der DNA Methylierung in Brustkrebs zur Identifizierung von Biomarkern für die Prognose und Mechanismen der Tumorgenese
No full textGenome-wide DNA methylation analyses increasingly facilitate the discovery of aberrant DNA methylated genes in breast cancer (BC), creating a need for determination of which of these events are of importance for tumorigenesis and diagnosis of BC. The first part of this study describes the utilization of genome-wide DNA methylation changes as biomarkers for prognosis of BC. Promoter methylation of CKM, CDO1 and TAC1 were discovered as markers for prediction of poor survival in BC patients. Combinations of these novel biomarkers appeared particularly promising by improving the age- and stage-independent prognostic accuracy. The additional prognostic information provided by these combination markers may prove especially useful in the clinical management of early-stage BC disease where a more accurate stratification could help to identify patients with a high risk for metastases that would profit from adjuvant chemotherapy. The second part of this study presents a comprehensive approach that addresses the functional significance of epigenetic silencing of the marker gene CDO1 for breast tumorigenesis and therapy resistance. DNA methylation of CDO1 is a frequent and tumor-specific event that correlates with gene inactivation, disease progression and outcome. This event occurs in multiple types of cancer and moreover, CDO1 function can alternatively be silenced by repressive chromatin or protein damaging missense mutations in tumors without CDO1 methylation. Restoration of CDO1 function in BC cells increases levels of ROS and leads to reduced viability and growth, as well as sensitization to anthracyclines. These findings suggest that silencing of CDO1 may be a critical event in tumorigenesis that contributes to the survival of BC cells and their resistance to reactive oxygen species (ROS)-generating anthracyclines through reducing cellular ROS levels. This study further provides potential clinical implications by showing that BC cells with epigenetically silenced CDO1 can be sensitized to anthracycline therapy through 5-azacytidine induced expression of CDO1. Overall, this study demonstrates how genome-wide DNA methylation changes can be utilized for identification of novel biomarkers for prognosis of BC and how the in-depth study of such marker genes can uncover new mechanisms that contribute to tumorigenesis and therapy resistance.Genomweite DNA-Methylierungsanalysen ermöglichen zunehmend die Entdeckung von Genen mit anormaler Methylierung in Brustkrebs. Dadurch entsteht die Notwendigkeit, jene Ereignisse zu identifizieren, welche für die Entstehung und Diagnose von Brustkrebs von Bedeutung für sind. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit beschreibt die Verwendung von abnormal methylierten Genen als Biomarker für die Prognose von Brustkrebs. Promotormethylierung von CKM, CDO1 und TAC1 wurde hierbei als ein Marker für einen ungünstigen Krankheitsverlauf in Patientinnen mit Brustkrebs identifiziert. Kombinationen dieser neuen Biomarker scheinen besonders aussichtsreich, da sie die prognostische Genauigkeit unabhängig vom Alter und Tumorstadium verbessern. Die ergänzende prognostische Informationen dieser Markerkombinationen kann sich für die klinische Diagnose von Brustkrebs im Frühstadium der Erkrankung als besonders praktisch erweisen. Hier könnte eine genauere Klassifizierung helfen, Patientinnen mit einem hohen Risiko für Metastasierung zu identifizieren, welchen von der adjuvanten Chemotherapie profitieren. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit präsentiert einen umfassenden Ansatz zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung der epigenetischen Inaktivierung des Markergenes CDO1 für die Entstehung und Therapieresistenz von Brustkrebs. Es konnte gezeigt werden, dass DNA-Methylierung von CDO1 ein häufiges und tumorspezifisches Ereignis darstellt, welches mit Geninaktivierung, Krankheitsverlauf und ungünstigem Krankheitsausgang korreliert. Dieses Ereignis tritt in mehreren unterschiedlichen Krebserkrankungen auf. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Funktion von CDO1 in Tumoren welche keine Methylierung in diesem Gen aufweisen alternativ durch eine repressive Chromatinstruktur oder durch Missense-Mutationen inaktiviert werden kann. Die Wiederherstellung der CDO1 Funktion in Brustkrebszellen führt zur Erhöhung des ROS-Gehalts und zu verminderter Lebensfähigkeit und Wachstum der Zellen sowie einer Sensibilisierung gegen Anthrazykline. Diese Resultate legen nahe, dass die Inaktivierung von CDO1 ein kritisches Ereignis für die Tumorentstehung darstellt, welches zum Überleben von Brustkrebszellen beiträgt und durch den Abbau von zellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) deren Resistenz gegen ROS-erzeugende Anthrazykline bewirkt. Weiterhin zeigt die Arbeit potenzielle klinische Implikationen auf. So können Brustkrebszellen mit epigenetisch inaktiviertem CDO1 durch die induzierte Expression von CDO1 mit 5-Azacytidin für die Therapie mit Anthrazyklinen sensibilisiert werden. Die vorliegende Doktorarbeit zeigt, wie genomweite Veränderungen der DNA-Methylierung zur Identifizierung von neuen Biomarkern für die Brustkrebsprognose genutzt werden können und wie die umfangreiche Analyse solcher Markergene zur Indentifizierung neuer Mechanismen der Tumorgenese und Therapieresistenz führen kann
Identifizierung und Charakterisierung von Genen mit spezieller Funktion in der Skelettentwicklung
No full textA complex regulatory network is responsible for the formation and homeostasis of more than 200 different and uniquely shaped bones of the skeleton. However, the underlying genes and mechanisms have only partly been elucidated yet. Genetic studies of skeletal diseases and analyses of animal models may contribute to a better understanding of these highly complex processes and may help to identify and further characterize genes involved in skeletal development. Thus, two different strategies were used in the present dissertation. On the one hand, I analyzed the genetic cause of the spondylo-epi-metaphyseal dysplasia (SEMD) with joint laxity and leptodactyly (SEMD-JL Hall type) in a consanguineous family. Homozygosity mapping revealed an 8 Mb candidate region on chromosome 14 (14q22.1 - q23.1) comprising 64 annotated genes. This is the first report of a genetic locus for SEMD-JL. After ranking of candidate genes I could identify a mutation (c.6345A>G) in ninein (NIN) leading to the substitution of a highly conserved amino acid (p.N2082D) using Sanger sequencing. To verify this mutation, the whole exome of the index patient was sequenced using Next Generation Sequencing. In addition to the NIN mutation I found a second mutation (c.283C>T) within the linkage region, namely in the polymerase epsilon subunit 2 (POLE2) gene, which also leads to the substitution of a highly conserved amino acid (p.P95S). Both mutations segregate with the disease phenotype. Although the functional analyses could not link any of the mutations directly with the disease, bioinformatics analyses together with data from the literature indicate that the mutation in the centrosomal protein NIN is the causative mutation in the presented family with SEMD-JL Hall type. In addition, this may point to a possible role of ninein in skeletal development. On the other hand, selenoprotein M (SELM) was functionally characterized. I could show that Selm is prominently expressed in bones and tendons during development. A significant coexpression of Selm with osteocalcin (Bglap) and type I collagen (Col1a1) in bones, and with scleraxis (Scx) and tenomodulin (Tnmd) in tendons could be detected revealing expression in osteoblasts and tenocytes, respectively. Moreover, I showed that SELM is involved in the Unfolded Protein Response (UPR) in osteoblasts and a target gene of XBP1(s). Together with data from the literature and a potential interaction with the protein disulfide isomerase (PDI) these results indicate that SELM could play a role in the correct folding and processing of secretory (matrix) proteins during development.Das Skelett besteht aus über 200 unterschiedlichen und einzigartig geformten Knochen, für deren Bildung und Homöostase ein komplexes regulatorisches Netzwerk notwendig ist, dessen einzelne Komponenten bisher nur zum Teil bekannt sind. Genetische Studien von Skeletterkrankungen und Untersuchungen am Tiermodell können dazu beitragen, diese hochkomplexen Prozesse besser zu verstehen, neue Gene zu identifizieren und deren Rolle während der Skelettentwicklung näher zu charakterisieren. Dementsprechend wurden hierzu in der vorliegenden Arbeit zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Zum einen wurde die genetische Ursache der Spondylo-epi-metaphysären Dysplasie (SEMD) mit Gelenkschwäche (joint laxity) und Leptodaktylie (SEMD-JL Typ Hall) in einer konsanguinen Familie untersucht. Dabei wurde mittels Homozygotie-Kartierung eine 8 Mb und 64 annotierte Gene umfassende Kandidatenregion auf Chromosom 14 (14q22.1 bis 14q23.1) identifiziert. Dies ist der erste kartierte Lokus für die SEMD-JL. Nach Priorisierung und Kategorisierung der Kandidatengene konnte durch Sanger-Sequenzierung eine Mutation (c.6345A>G) in Ninein (NIN), die zu einem Austausch einer hoch konservierten Aminosäure (p.N2082D) führt, identifiziert werden. Um diese Mutation zu bestätigen, wurde mittels Next Generation Sequencing das komplette Exom der Indexpatientin sequenziert. Dabei wurde neben der NIN-Mutation noch eine zweite Mutation (c.283C>T) in der Polymerase epsilon Untereinheit 2 (POLE2) innerhalb der Kopplungsregion gefunden, die ebenfalls zu einem Austausch einer hochkonservierten Aminosäure (p.P95S) führt. Beide Mutationen segregieren mit der Erkrankung. Obwohl die funktionellen Analysen keinen direkten Hinweis auf die Ursächlichkeit einer der beiden Mutationen für die Erkrankung ergaben, sprechen die bioinformatischen Analysen zusammen mit Daten aus der Literatur jedoch dafür, dass die Mutation im zentrosomalen Protein NIN die ursächliche Mutation in der vorliegenden Familie mit SEMD-JL Typ Hall darstellt. Darüber hinaus ist dies ein erster Hinweis auf eine Verbindung von Ninein mit der Skelettentwicklung. Zum anderen wurde das Selenoprotein M (SELM) funktionell charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass Selm während der Entwicklung besonders stark in Knochen und Sehnen exprimiert wird. Dabei wurde in den Knochen eine signifikante Co-Expression mit Osteocalcin (Bglap) und Typ I Kollagen (Col1a1) und in Sehnen mit Scleraxis (Scx) und Tenomodulin (Tnmd) nachgewiesen. Dies spricht für eine Expression in Osteoblasten und Tenozyten. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass SELM in Osteoblasten in die Unfolded Protein Response (UPR) involviert ist und ein Zielgen von XBP1(s) darstellt. Zusammen mit Daten aus der Literatur und der potentiellen Interaktion mit der Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit dafür, dass SELM eine Rolle bei der Faltung und Prozessierung sekretorischer (Matrix-)Proteine während der Skelettentwicklung spielen könnte
Molekulare Analysen zur Funktion von SPOC1 (PHF13) in der epigenetischen Regulation der Spermatogenese mit Hilfe eines Spoc1-/- -Mausmodells
No full textSpermatogenesis is a highly regulated process producing male gametes. During this process the spermatogonial stem cells either renew or undergo various differentiation steps that are essential for sustained production of the sperm cells. One critical event takes place during meiosis of the spermatocytes, when the homologous chromosomes pair along their axes and cross-over events are induced. Unsynapsed Chromatin becomes transcriptionally inactive at the zygotene-pachytene stage (meiotic silencing of unsynapsed chromatin, MSUC) and may lead to germ cell loss via apoptosis resulting in male infertility. In male meiosis the heterologous sex chromosomes pair only at their short pseudoautosomal region (PAR), while the major parts of the chromosomes remain unsynapsed. The meiotic silencing of the sex chromosomes (MSCI) during pachytene is therefore an essential step during mammalian male meiosis, silencing unpaired chromatin. The process is highly regulated via epigenetic mechanisms involving histone modification, rare histone variants, and vast chromatin remodeling.
SPOC1 (PHF13) was identified as a gene whose expression was negatively correlated with the survival time in a cohort of patients with ovarian cancer. The protein exhibits a function during mitosis and is expressed ubiquitously in all proliferating cells at a basal level. Here we could show that SPOC1 is highly abundant in the nuclei of undifferentiated spermatogonia of the murine testis and that the deletion of Spoc1 leads to male infertility in mice. Functional analyses of the Spoc1-knockout mice using whole genome expression arrays and quantitative Real time-PCR demonstrated a defect in the silencing of the sex chromosomes during meiosis. Since the induction of the XY-body, the subnuclear compartment where MSCI takes place, appeared normal in the knockout mice,
the increased level of transcription on the sex chromosomes indicates an epigenetic effect. Immunofluorescence experiments with meiocyte spreads showed specific changes of the histone modifications H3K27me2, H3K36me2/3, H3K9ac, H3K27ac and H2AK119ub within the XY-body of knockout cells. The present data demonstrate that SPOC1, which
has been shown to be an epigenetic reader of H3K4me2/3, is essential for some aspects of the epigenetic program of MSCI and is thus required for sustained spermatogenesis. Furthermore, the knockout of Spoc1 in mice leads to highly variable defects in embryonic development processes, ranging from mild abnormalities of the cranium to severe neuronal defects resulting in embryonic lethality. This shows that SPOC1 is probably involved in the epigenetic regulation of cell differentiation in a more general manner. The presented data suggest that the protein may interact with bivalent chromatin, which is crucial for spacio-temporal regulation of differentiation genes and therefore important for various differentiation processes.Die Spermatogenese ist ein fein regulierter Prozess, in dem die männlichen Gameten generiert werden. Bei diesem Prozess durchlaufen die Keimzellen eine Vielzahl von Differenzierungsschritten, die für die Aufrechterhaltung der Spermatogenese essentiell sind. Ein wichtiger Schritt findet während der Meiose statt, während die homologen Chromosomen entlang ihrer Achse paaren und ‘cross-over’-Ereignisse induziert werden. Hierbei wird ungepaartes Chromatin bei dem Übergang von Zygotän- ins Pachytänstadium transkriptionell inaktiviert (meiotic silencing of unsynapsed Chromatin, MSUC). Ungepaartes, inaktiviertes Chromatin kann bei der Meiose zur Induktion von Apoptoseprozessen und damit zum Keimzellverlust und Infertilität führen. Bei der männlichen Meiose können die heterologen Gonosomen nur an der pseudoautosomalen Region (PAR) miteinander paaren, der Großteil der Gonosomen liegt ungepaart vor. Dies führt zu einer transkriptionellen Inaktivierung der Geschlechtschronosomen, was als ‘meiotic sex chromosome inactivation’ (MSCI) während des Pachytäns erfolgt. Diese Inaktivierung ist ein essentieller Schritt in der männlichen Meiose von Säugetieren und wird über epigenetische Regulationsmechanismen gesteuert. Diese Mechanismen umfassen Histonmodifikation, den Austausch von Histone durch seltene Varianten und ‘Chromatin remodeling’. SPOC1 (PHF13) wurde ursprünglich als ein Gen identifiziert, dessen Expression mit der Überlebenszeit in einer Kohorte von Ovarialkarzinompatienten negativ korreliert war. SPOC1 hat eine Funktion in der Mitose und ist in allen proliferierenden Zellen basal exprimiert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Spoc1 stark in den undifferenzierten Spermatogonien des murinen Keimepithels exprimiert wird und der Verlust des Gens zu einer Infertilität in männlichen Mäusen führt. Die funktionelle Analyse dieser Spoc1 defizienten Mäuse mittels genomweiter Expressionsanalysen und Real Time-PCR zeigten deutlich, dass eine Defekt in der MSCI vorliegt. Die Bildung des XY-Bodys, welcher das subnukleäre Kompartiment der MSCI darstellt, schien in den Tieren jedoch normal zu verlaufen, was ein Hinweis dafür ist, dass möglicherweise epigenetische Mechanismen in den Defekt involviert sind. Immunfluoreszenz-Färbungungen an Spreitungen der Spoc1-/- -Meiozyten zeigten, dass die Histonmodifikationen H3K27me, H3K36me2/3, H3K9ac, H3K27ac und H2AK119ub deutliche Unterschiede in den XY-Bodys aufwiesen. Die vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass SPOC1, welches einen epigenetischen ‘Reader’ der Histonmodifikation H3K4me3 darstellt, eine wichtige Rolle bei der MSCI spielt und damit für die Aufrechterhaltung der Spermatogenese unverzichtbar ist. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass der Verlust von Spoc1 zu hoch variablen Defekten in der Embryonalentwicklung führten. Das Spektrum dieser Defekte reicht von milden Veränderungen des Schädels bis zu schwerwiegenden neuronalen Defekten, welche zu intrauterinen Letalität führen. Diese Entwicklungsdefekte zeigen, dass SPOC1 möglicherweise eine generelle Rolle bei der epigenetischen Regulation von Differenzierungsprozessen spielt. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass das Protein mit bivalenten Chromatin interagieren könnte, welches für die räumlich-zeitliche Regulation von Entwicklungsgenen und somit für viele Differenzierungsprozesse essentiell ist
LETM1, deleted in Wolf-Hirschhorn syndrome is required for normal mitochondrial morphology and cellular viability
No full textWolf-Hirschhorn syndrome (WHS) is a complex congenital syndrome caused by a monoallelic deletion of the short arm of chromosome 4. Seizures in WHS have been associated with deletion of LETM1 gene. LETM1 encodes for the human homologue of yeast Mdm38p, a mitochondria-shaping protein of unclear function. Here we show that human LETM1 is located in the inner membrane, exposed to the matrix and oligomerized in higher molecular weight complexes of unknown composition. Down-regulation of LETM1 did not disrupt these complexes, but led to DRP1-independent fragmentation of the mitochondrial network. Fragmentation was not associated with changes in the levels of respiratory chain complexes, or with obvious or latent mitochondrial dysfunction, but was recovered by nigericin, which catalyzes the electroneutral exchange of K+ against H+. Down-regulation of LETM1 caused 'necrosis-like' death, without activation of caspases and not inhibited by overexpression of Bcl-2. Primary fibroblasts from a WHS patient displayed reduced LETM1 mRNA and protein, but mitochondrial morphology was surprisingly unaffected, raising the question of whether and how WHS patients counteract the consequences of monoallelic deletion of LETM1. LETM1 highlights the relationship between mitochondrial ion homeostasis, integrity of the mitochondrial network and cell viability
Zur Klinik und Genetik von Skelettdysplasien mit Modellierungsstörungen, Hyperostose und Sklerose
No full textDie Homöostase des Knochengewebes wird durch das balancierte Zusammenspiel von Ossifikation und Resorption gewährleistet. Eine in Relation zur Resorption zu starke Ossifikation führt zur Modellierungsstörung, Hyperostose und Sklerose. Knochenerkrankungen mit diesen Merkmalen werden als Sklerosierende Skelettdysplasien erfasst. Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind fünf Skelettdysplasien aus dem Formenkreis der Sklerosierenden Skelettdysplasien: (1) Craniometaphysäre Dysplasie, autosomal dominante Form (MIM #123000); (2) Metaphysäre Dysplasie, Typ Braun-Tinschert (MIM *605946); (3) Caffey-Syndrom (MIM *114000); (4) McCune-Albright-Syndrom (MIM #174800); (5) Melorheostose (MIM 155950). Diese werden auf unterschiedlichen pathogenetischen Ebenen charakterisiert, die den Etappen des Weges entsprechen, der mit der Analyse des Phänotyps beginnt und zu einer Aufklärung des Basisdefektes führt. Die Arbeit gliedert sich ein in die Reihe von Bemühungen, zum molekularen Verständnis von Erkrankungen des Skelettsystems beizutragen.Homeostasis of bone tissue is maintained by the balanced process of bone formation and resorption. Increased ossification in relation to resorption gives rise to conditions with modelling defects, hyperostosis and sclerosis. Skeletal diseases with these signs are classified as sclerosing bone dysplasias. The work presented here focuses on five skeletal dysplasias from the group of sclerosing bone dysplasias: (1) Craniometaphyseal dysplasia, autosomal dominant form (MIM #123000); (2) Metaphyseal dysplasia, Braun-Tinschert type (MIM *605946); (3) Caffey syndrome (MIM *114000); (4) McCune-Albright syndrome (MIM #174800); (5) Melorheostosis (MIM 155950). They were investigated at different pathogenetic levels that represent different steps on the path from phenotypic characterisation to clarification of the respective basic molecular defect. This work has contributed to our understanding of the molecular basis of skeletal diseases
Role of the chromatin remodelers SPOC1 and the HUSH complex during lytic HCMV infection
No full textHuman cytomegalovirus (HCMV) exhibits pronounced adaptability, modulating a variety of cellular pathways to promote its propagation within the host, while host cells have evolved a multifaceted repertoire of antiviral mechanisms to combat the virus. Consequently, chromatin remodelers, playing a pivotal role in orchestrating molecular processes by exerting control over gene expression, frequently become targets of both viral and cellular regulatory mechanisms. The present work delves into the role of such chromatin remodeling proteins in the context of lytic HCMV infection. Specifically, the function of SPOC1 was explored, already known to serve as a critical restriction factor against HCMV.
Intriguingly, with the present work, we demonstrate that it exerts an additional antiviral mechanism that is still functional if the first defense mechanism is overcome by high viral loads. Our results suggest that SPOC1 increases the chromatin compaction of viral genes during later times of infection, resulting in strongly diminished viral transcription, replication and release. Further, we provide evidence that this regulatory mechanism is supported by the PRC2 complex and that the proteins might directly interfere with viral DNA. A known interaction partner of SPOC1, KAP1, exhibits a dual role in HCMV infection: while we can confirm that it facilitates the repression of immediate-early genes, it appears to be important for viral progression during later infection stages. Our investigation of KAP1, alongside the HUSH complex — both recognized for their repressing functions of transposable elements and viral genomes — surprisingly reveals proviral roles for HCMV. We demonstrate in different systems that the absence of both KAP1 and HUSH attenuates
viral replication and release. Our investigations revealed potentially altered DNA damage responses in host cells and a significant upregulation of retrotransposons and associated pathways. While a direct influence of the proteins on the induction of interferon-stimulated genes could not be verified, RNA-seq analysis revealed the upregulation of several antiviral processes already under mock conditions in the absence of HUSH and KAP1. In summary,
our results emphasize the critical antiviral functions of SPOC1 while highlighting the unexpected reliance of HCMV on the repressive activities of the HUSH complex and KAP1. These factors appear to create a cellular environment conducive to active viral replication, with each protein modulating different and distinct signaling pathways, suggesting a complex regulatory network
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